Nghiên cứu thành phần hóa học cây cỏ mực (eclipta prostrata (L.)L.) ở thành phố Đà Nẵng

Header Page of 126 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Công trình ñược hoàn thành ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG PHAN HIỀN LƯƠNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY CỎ MỰC (ECLIPTA PROSTRATA (L.)L.) Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Đào Hùng Cường Phản biện 1: PGS.TS Lê Tự Hải Ở THÀNH PHỐ ĐÀ NẴNG Phản biện 2: PGS.TS Lê Thị Liên Thanh Chuyên ngành: Hóa Hữu Mã số: 60 44 27 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Luận văn ñược bảo vệ Hội ñồng bảo vệ chấm Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khoa học họp Đại học Đà Nẵng vào ngày 30 tháng năm 2012 Đà Nẵng - Năm 2012 Có thể tìm hiểu luận văn tại: - Trung tâm thông tin - Học liệu - Đại học Đà Nẵng - Thư viện trường Đại học Sư Phạm, Đại học Đà Nẵng Footer Page of 126 Header Page of 126 MỞ ĐẦU Lý chọn ñề tài Việt Nam nằm vùng khí hậu nhiệt ñới quanh năm nên Để tiêu chuẩn hóa nguyên liệu cỏ mực góp phần thêm cho nghiên cứu cỏ mực Đà nẵng Việt Nam giới, chọn ñề tài "Nghiên cứu thành phần hóa thích hợp cho việc trồng trọt phát triển nhiều loại cỏ thuốc học cỏ mực (Eclipta prostrata(L.)L.) thành phố Đà nẵng" quý Cha ông ta hay dùng cỏ ñể chữa bệnh thông Mục ñích nghiên cứu thường mà hay mắc phải như: nóng, sốt, ho, cảm cúm, ñau - Xác ñịnh số tiêu vật lý, hóa học cỏ mực bụng, ñau răng, chảy máu,…Và ñược lưu truyền từ ñời sang ñời - Khảo sát ñiều kiện chiết tách, cô lập, tinh chế ñịnh danh khác trở thành thuốc cổ truyền dân tộc Ngày với phát triển khoa học, y học ñại, người ñã ñi sâu vào nghiên cứu loài cỏ chữa bệnh cổ truyền ñể tìm chất có ích phục vụ cho nhiều lĩnh vực khoa học mà ñặc biệt y học Một số loài ñược sử dụng nhiều dân gian ñó có cỏ mực Cỏ mực, thuốc nam thông thường mọc cấu trúc số hợp chất tinh khiết cỏ mực thu hái Đà Nẵng Đối tượng phạm vi nghiên cứu - Cây cỏ mực ñược thu hái Đà nẵng Phương pháp nghiên cứu Để thực ñề tài sử dụng phương pháp sau: 4.1 Nghiên cứu lý thuyết Thu tập, tổng hợp tài liệu, tư liệu, sách báo nước hoang khắp nơi, dược liệu ñang ñược nghiên cứu nước có liên quan ñến ñề tài khả bảo vệ gan trừ ñược nọc ñộc số loài rắn nguy 4.2 Phương pháp thực hành hiểm Cỏ mực ñược dùng trị xuất huyết nội tạng như: ho máu, xuất + Lấy mẫu, xử lý, sơ chế mẫu huyết ruột, chảy máu răng, nướu, lợi, trị sưng gan, sưng bàng quang, + Xác ñịnh số tiêu hóa lý sưng ñường tiểu, trị mụn nhọt ñầu ñinh, bó giúp liền xương Đã có nhiều công trình nghiên cứu cỏ mực nước - Xác ñịnh ñộ ẩm, hàm lượng tro phương pháp trọng lượng - Xác ñịnh kim loại nặng phương pháp quang phổ hấp thụ như: Ấn Độ, Trung Quốc, Pakistan, Thái Lan, Banglades,… Còn nguyên tử AAS Việt Nam có công trình nghiên cứu Tại Đà nẵng - Tìm ñiều kiện chiết tách, phân lập, tinh chế chất cỏ chưa có công trình nghiên cứu cỏ mực mực phương pháp chiết với dung môi sắc ký cột Hiện công ty cổ phần Dược Danapha ñang sử dụng cỏ -Xác ñịnh cấu trúc hóa học chất tinh chế ñược phương pháp mực nguyên liệu sản xuất thuốc VG5 (thuốc có cộng hưởng từ hạt nhân(NMR), quang phổ hồng ngoại(IR), sắc kí tác dụng hỗ trợ ñiều trị viêm gan, giải ñộc gan) Rất cần có chất khối phổ LC-MS chuẩn chất ñánh dấu nhằm kiểm soát chất lượng nguyên liệu Ý nghĩa khoa học thực tiễn ñề tài tiến tới kiểm soát chất lượng sản phẩm VG5 5.1 Ý nghĩa khoa học Footer Page of 126 - Header Page of 126 Cung cấp thông tin khoa học qui trình chiết tách, Chương phân lập, thành phần chất cỏ mực Cung cấp số liệu thực nghiệm cho nghiên cứu sâu TỔNG QUAN 1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ CỎ MỰC cỏ mực ñề tài 1.1.1 Đặc ñiểm cỏ mực 5.1 Ý nghĩa tực tiễn 1.1.2 Phân bố sinh thái Tìm ñược qui trình chiết tách, phân lập, tinh chế chất có 1.1.3 Tác dụng dược lý cỏ mực cỏ mực từ ñó ñịnh danh, xác ñịnh cấu trúc hóa học chất 1.2 MỘT SỐ CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU VỀ CÂY CỎ MỰC chiết ñược làm chất chuẩn chất ñánh dấu từ ñó làm tảng cho 1.2.1 Các công trình nghiên cứu Việt Nam việc xây dựng tiêu chuẩn ñánh giá ñịnh tính, ñịnh lượng chất 1.2.2 Các công trình nghiên cứu giới lượng cho cỏ mực ñang ñược sử dụng ngành dược ñông 1.2.2.1 Thành phần hóa học Cỏ mực y Cỏ mực có chất flavonoid, glycoside triterpene saponin, alkaloid Sử dụng chất ñã ñược xác ñịnh cấu trúc ñể tiêu chuẩn hóa chất lượng ñịnh tính, ñịnh lượng ñối với nguyên liệu cỏ mực 1.2.2.2 Các nghiên cứu hoạt tính sinh học Hildebert Wagner cộng ñã khảo sát hoạt tính bảo vệ ñược dùng sản xuất công ty cổ phần Dược Danapha gan mô hình gây ñộc CCl4 Wedelolactone Cấu trúc luận văn Demethylwedelolactone cho thấy hai chất ñều có hoạt tính tốt Ngoài phần mở ñầu, danh mục bảng, hình, ñồ thị, sơ ñồ, IC50 Wedelolactone 2.5 µM Ngoài ra, chất có tác kết luận kiến nghị, tài liệu tham khảo, phụ lục Trong luận ñược dụng kích thích tái sinh tế bào gan Echinocystic acid chia làm chương sau : Eclalbasaponin II ngăn chặn sinh trưởng tế bào hình Chương : Tổng quan (23 trang) Chương : Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu (10 trang) Chương : Kết thảo luận (40 trang) bệnh xơ gan Các dẫn xuất tự nhiên tổng hợp Wedelolactone có khả chống lại ñộc tố từ nọc rắn lục Nghiên cứu in vivo ñây Paulo A Melo cộng cho thấy, hiệu kháng ñộc tố chống phù 8-metoxy-coumestrol cao với ID50 0.17 mg/kg 0.14 mg/kg Tác dụng Wedelolactone tương ñương với hợp chất 1.2.2.3 Các hợp chất tiêu biểu ñã ñược phân lập từ cỏ mực Wedelolactone, Demethylwedelolactone, Luteolin, Oleanolic acid, Kaempferol, Eclalbasaponin I-IIV, Apigenin … Footer Page of 126 Header Page of 126 Chương dung môi, ñiều chế cao thô phân lập, tinh chế chất từ cao NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN LIỆU thô, xác ñịnh thành phần cấu tạo chất tinh chế 2.3 THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT 2.1.1 Thu hái nguyên liệu Chương Cây Cỏ mực ñược thu hái xã Hòa phong, huyện Hòa vang, thành phố Đà nẵng Cây Cỏ mực ñược khoảng ba tháng tuổi 2.1.2 Xử lý mẫu nguyên liệu KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU Sơ ñồ khảo sát tiêu hóa lý ñiều kiện chiết xuất Cây Cỏ mực ñược sử dụng toàn phần mặt ñất, bao Mẫu cỏ mực gồm thân, lá, hoa Mẫu nguyên liệu ñược xử lý loại cỏ dại rửa phơi khô Xay nghiền nhỏ Làm 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Xác ñịnh ñộ ẩm : Phương pháp khối lượng làm khô Sấy 2.2.2 Xác ñịnh hàm lượng tro nguyên liệu : Phương pháp tro Xay hóa hoàn toàn lò nung nhiệt ñộ 600oC ± 25oC cho ñến trọng Ether dầu hỏa n-hexan Xử lý nguyên Chlorofooc lượng không ñổi 2.2.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Kim loại nặng Phương pháp HPLC ñược sử dụng ñể ñịnh tính, ñịnh lượng, kiểm tra thành phần chất có mặt phân ñoạn chiết dung Độ ẩm mẫu Xác ñịnh tiêu Khảo sát thành phần chiết dung môi Ethyl acetat Ethanol môi khác phân ñoạn ñiều chế sắc ký cột mẫu cỏ mực 2.2.4 Phương pháp phổ hấp thu nguyên tử (AAS) Hàm lượng tro Methanol Dùng phương pháp phổ hấp thu nguyên tử ñể xác ñịnh hàm lượng Nước cất kim loại Pb, Cu, Cd, As, Hg mẫu cỏ mực 2.2.5 Phương pháp xác ñịnh cấu trúc hóa học quang phổ hồng ngoại (IR): sử dụng ñể xác ñịnh nhóm chức chất 2.2.6 Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Phương pháp NMR ño phổ 1H NMR 13C NMR , phổ Cosy,DEP, Khảo sát tỷ lệ dung môi / nguyên liệu Khảo sát thời gian chiết HMBC, HMQC ñể xác ñịnh công thức cấu tạo chất 2.2.7 Khảo sát thành phần chất chiết ñược số loại Footer Page of 126 Sơ ñồ 3.1: Sơ ñồ khảo sát ñiều kiện chiết xuất Header Page of 126 10 3.2 XỬ LÝ NGUYÊN LIỆU lâu bị hư hỏng, giữ ñược chất lượng trình làm thử 3.2.1 Thu hái nguyên liệu nghiệm.Đạt tiêu chuẩn dược ñiển Việt nam qui ñịnh không 12% Cây cỏ mực ñược thu hái xã Hòa phong, huyện Hòa vang, 3.3.2 Xác ñịnh hàm lượng tro thành phố Đà nẵng cỏ mực ñược khoảng ba tháng tuổi, khối Kết xác ñịnh hàm lượng tro mẫu cỏ mực nghiên cứu cỏ lượng mẫu 6,5 kg mực thể bảng (3.2) Bảng 3.2: Kết xác ñịnh tỉ lệ tro mẫu cỏ mực 3.2.2 Xử lý mẫu nguyên liệu Cây cỏ mực ñược sử dụng toàn phần mặt ñất, bao gồm thân, lá, hoa Mẫu nguyên liệu ñược xử lý loại cỏ dại Stt Khối lượng mẫu (g) Khối lượng tro (g) Tỉ lệ tro rửa sấy khô tủ sấy nhiệt ñộ sấy 50oC Nguyên liệu sau 2,006 0,249 12,413 sấy ñược bảo quản bao nilon có chứa chất hút ẩm silicagel 2,003 0,245 12,232 Nguyên liệu ñược nghiền nhỏ máy xay ñược dùng làm mẫu 2,002 0,244 12,187 nghiên cứu 3.3 XÁC ĐỊNH CÁC CHỈ TIÊU Trung bình Kết : Hàm lượng tro mẫu trung bình 12,187%, 3.3.1 Xác ñịnh ñộ ẩm nguyên liệu Đạt tiêu chuẩn Dược ñiển Việt nam qui ñịnh; tro toàn phần không Kết xác ñịnh ñộ ẩm mẫu nguyên cứu ñược thể vượt 20% bảng 3.1 3.3.3 Xác ñịnh hàm lượng kim loại nặng Bảng 3.1: Kết xác ñịnh ñộ ẩm cỏ mực 3.3.3.3 Kết xác ñịnh hàm lượng kim loại mẫu cỏ mực Stt KL mẫu trước Khối lượng mẫu Khối lượng nước Độ ẩm 2,0083 1,9028 0,1055 5,25 2,0045 1,9014 0,1031 5,14 2,0049 1,9267 0,0801 4,00 2,0058 1,9248 0,0810 4,04 2,0035 1,9242 0,0793 3,96 Độ ẩm bình quân 4,48 Nhận xét: Độ ẩm mẫu nguyên liệu cỏ mực khô, sau sấy 105oC ñộ ẩm trung bình mẫu 4,48 % Với ñộ ẩm thấp nguyên liệu Footer Page of 126 12,187 Kết xác ñịnh hàm lượng kim loại nặng mẫu cỏ mực ñược thể bảng 3.5 Bảng 3.5: Kết PT hàm lượng kim loại nặng QCKT quốc gia Stt Khối lượng mẫu (gam) 0,8916 0,8430 0,9899 Trung bình QCKT quốc gia Cd 1,2057 1,5925 1,4143 1,4042 1,0000 Đánh giá Không ñạt Hàm lượng (mg/kg) As Hg Pb 0,0447 0,0252 1,4917 0,0563 0,0326 0,7384 0,0556 0,0354 3,4549 0,0532 0,0323 1,8950 1,0000 0,0500 2,0000 Đạt Đạt Đạt Cu 8,3558 8,7960 8,7105 8,6208 30,0000 Đạt Header Page of 126 11 12 3.4 KHẢO SÁT THÀNH PHẦN CÁC CHẤT CHIẾT ĐƯỢC Nhận xét: Dựa màu sắc mẫu chiết ñược phổ ñồ TRONG CÁC DUNG MÔI HPLC ghi lại sau trình phân tích nhận thấy với 3.4.1 Mục tiêu dung môi chiết ether dầu hỏa, n-hexan, Trichloromethan chủ Khảo sát nhằm tìm ñược dung môi chiết xuất mẫu cỏ yếu chất màu, chất có ñộ phân cực hòa tan mực có tính chọn lọc thành phần hoạt chất có hàm lượng lớn, mẫu, ñó chất có ñộ hấp thu vùng bước sóng ñể lấy phân ñoạn chiết xuất tiếp tục dùng sắc kí cột 351nm không thấy xuất hiện, xuất với nồng ñộ nhỏ Các ñể phân lập, tinh chế tiếp tục khảo sát thành phần, cấu trúc hóa mẫu phân tích nước thành phần tan chủ yếu có nồng ñộ cao học chất, phân lập, tinh chế ñược chất có ñộ phân cực cao cao, chất có ñộ phân cực 3.4.2 Phương pháp chiết trung bình kém, tan môi trường nước có nồng ñộ thấp Dùng dung môi có ñộ phân cực khác ñể chiết mẫu Các mẫu ñược chiết môi trường methanol ethanol có màu ether dầu hỏa, n-hexan, trichloromethan, ethyl acetat, ethanol, xanh ñậm thành phần hòa tan có nhiều chất có ñộ methanol nước Chiết mẫu bể lắc siêu âm Elmasonic S100H phân cực mạnh ñến trung bình Nồng ñộ, thành phần chất hòa tan tần số 35 KHz có ñộ hấp thu bước sóng 351nm lớn khả chiết tách qua 3.4.3 Tiến hành cột gặp nhiều khó khăn ñể chia tách chất Phân ñoạn chiết 3.4.4 Kết Sau thời gian chiết mẫu lọc mẫu quan sát ethyl aceat ñược khảo sát có màu xanh, sắc kí ñồ nhìn thấy có mắt thường nhận thấy mẫu chiết có màu sắc khác tùy theo khoảng 04 chất chiết ñược dự ñoán có ñộ phân cực trung bình có loại dung môi chiết Tiến hành chạy sắc kí mẫu thu ñược ñộ hấp thu bước sóng 351 lớn ñó phân ñoạn chiết có máy HPLC theo ñiều kiện thu nhận ñược sắc kí ñồ dung thể cho phép chạy sắc kí cột ñể phân lập tinh chế số chất tinh dịch chiết khiết, xác ñịnh thành phần nhóm chức cấu tạo chất 300 mAU Mau chiet MeOH Mau chiet H2O Mau chiet Ethanol Mau chiet Ethy lAcetat Mau chiet Chlorof ooc Mau chiet n- Hexan Mau chiet Ether Dau hoa UV_VIS_1 UV_VIS_1 UV_VIS_1 UV_VIS_1 UV_VIS_1 UV_VIS_1 UV_VIS_1 WVL:351 nm Trong nghiên cứu ñề nghị sử dụng chọn phương pháp chiết xuất bể lắc siêu âm Elmasonic S100H: Chiết chất béo, chất màu ether dầu hỏa (nhiệt ñộ sôi ether dầu hỏa 250 200 nằm khoảng 60-90oC), thu hồi dung môi phân ñoạn ether dầu 150 100 hỏa máy cất cô quay, mẫu tiếp tục chiết ethyl acetat Gom - 1.223 50 4 - 9.960 dung dịch cỏ mực chiết ñược phân ñoạn ethyl acetat, cất thu hồi 2 - 7.427 - 8.647 -30 0.0 1.3 2.5 3.8 5.0 6.3 7.5 8.8 10.0 12.0 Hình 3.1: Phổ ñồ chất chiết ñược dung môi dung môi máy cất cô quay Buchi áp suất 400 mHg, nhiệt ñộ 65oC, thu ñược cao phân ñoạn ethyl acetat Tiến hành khảo sát tỷ lệ dung môi nguyên liệu chiết, thời gian chiết hợp lý ñể thu ñược Footer Page of 126 Header Page of 126 13 14 khối lượng cao chất chiết ñược Từ cao phân ñoạn ñược sử 3.6 KHẢO SÁT THỜI GIAN CHIẾT dụng ñể chạy sắc kí cột, chia tách phân ñoạn tinh chế chất 3.6.1 Mục tiêu Khảo sát khoảng thời gian tối ưu chiết mẫu ñạt hàm lượng tinh khiết 3.5 KHẢO SÁT TỶ LỆ DUNG MÔI VÀ KHỐI LƯỢNG MẪU cao chất có mẫu thời gian 10-210 phút CHIẾT XUẤT 3.6.2 Tiến hành 3.5.1 Mục tiêu 3.6.3 Kết : Kết khảo sát chiết mẫu theo thời gian ñược trình Khảo sát tỷ lệ dung môi ethyl acetat khối lượng nguyên liệu mẫu bày bảng 3.8 Bảng 3.8: Chất chiết ñược theo thời gian ñể chiết ñược hàm lượng tối ưu chất có mẫu 3.5.2 Tiến hành 3.5.3 Kết Kết khảo sát tỷ lệ dung môi khối lượng mẫu chiết ñược trình bày bảng 3.7 Bảng 3.7: Kết khảo sát tỷ lệ dung môi khối lượng mẫu sst Khối lượng mẫu(gam) Diện tích peak 0,50045 3,2192 1,00043 4,7308 1,50081 8,6553 2,00102 9,3721 2,50071 13,0489 3,00024 16,3235 5,50104 46,9498 10,01400 83,0671 14,01640 109,0231 10 15,17420 125,1621 11 17,92310 126,1621 Nhận xét : Với tỷ lệ dung môi lớn chất chiết ñược có Stt Khối lượng mẫu(gam) 10 11 12 13 14 15 Nhận xét Thời gian (phút) Diện tích peak 5,0023 10 1,4999 5,0023 20 2,1338 5,0023 30 2,1714 5,0023 40 2,4578 5,0023 50 2,5722 5,0023 60 2,6859 5,0023 70 2,7773 5,0023 80 3,0063 5,0023 90 3,5240 5,0023 100 4,4229 5,0023 110 4,9193 5,0023 120 5,8731 5,0023 150 6,6677 5,0023 180 7,0503 5,0023 210 7,1210 : Kết phân tích ñược theo diện tích peak chất có hàm lượng cao Khi tỷ lệ dung môi mẫu nguyên liệu >15g/50 thời gian lưu 4,04 phút tăng dần theo thời gian chiết Đến khoảng ml nồng ñộ tăng lên không ñáng kể Để tiết kiệm dung môi chọn thời gian 150 phút , 180 phút 210 phút hàm lượng chất tăng lên tỷ lệ dung môi nguyên liệu chiết tương ứng ethyl acetat/mẫu:3/1.( không ñáng kể Khoảng thời gian chiết tối ưu 150 phút v/m) bể siêu âm Elmasonic S100H Footer Page of 126 Header Page of 126 15 16 Căn kết khảo sát ñiều kiện dung môi chiết, 3.7.1 Mục tiêu tỷ lệ dung môi mẫu, thời gian chiết ta tìm ñược thông số hợp Chiết xuất ñược chất có phân ñoạn dung môi Ethyl lý trình chiết dựa khảo sát chất có thời gian lưu 4,04 phút acetat, phân lập tinh chế ñược chất tinh khiết có phân mẫu cỏ mực bể siêu âm Elmasonic S100H tần số 35 ñoạn cao ethyl acetat từ ñó xác ñịnh ñộ tinh khiết phương pháp ñề nghị thực qui trình chiết theo sơ ñồ 3.2 ñể chiết cao sắc kí lớp mỏng, sắc kí lỏng hiệu cao, ñộ tinh khiết ñạt lớn ethyl acetat chuẩn bị cho công ñoạn tiếp theo: Điều chế cao, chia 95%, mẫu ñược xác ñịnh thành phần nhóm chức công tách, phân lập tinh chế: Chiết mẫu cỏ mực ether dầu hỏa thức cấu tạo dựa phổ hồng ngoại, phổ khối, phổ cộng hưởng từ o (khoảng nhiệt ñộ sôi 60-90 C) ñể loại chất béo, chất mầu, tiếp hạt nhân… theo dùng dung môi chiết ethyl acetat ñể chiết tiếp mẫu, tỷ lệ dung 3.7.2 Thiết bị, dụng cụ, máy,hóa chất môi/ mẫu(v/m): 3/1 thời gian chiết: 150 phút Sau chiết ñược dịch Để thực việc chiết xuất phân lập ñược chất tinh phân ñoạn ethyl acetat, cất thu hồi dung môi thu máy cất cô quay khiết ñề tài sử dụng phương pháp chiết bể siêu âm áp suất giảm ñược cao dịch chiết phân ñoạn ethyl acetat Dùng cao Elmasonic S100H tần số 35 KHz, sắc kí ñiều chế cột pha thuận (cột phân ñoạn thực sắc ký cột pha thuận phân lập, tinh chế silicagel) cột pha ñảo C18 Cột pha thuận sử dụng cột sắc kí ñiều chất tinh khiết theo sơ ñồ 3.2 chế pha thuận Inox 25 x 300 mm, cột sắc kí ñiều chế pha thuận thủy Cỏ mực Pñ Sắc ký cột tinh 15 x 450 mm Hạt nhồi pha thuận silicagel cỡ hạt 0.040 – 0.063 EPE1 mm Merck Cột sắc kí ñiều chế pha ñảo Natpro C18 10 µm, 25 x300mm Cruse sep 141110 Bơm sắc kí lỏng hiệu cao Ether dầu hỏa Pñ Dịch chiết Ethel acetat Sắc ký cột EPE2 Shimadzu LC10A, Japan, tốc ñộ dòng max 10 ml/phút ñể bơm dung môi vào cột ñiều chế Bay dung môi phân ñoạn có Sắc ký cột Pñ Cất thu hồi Dung môi Sắc ký cột EPE3 thành phần chất giống ñược sử dụng hệ thống cất cô quay áp suất giảm Buchi Việc dò tìm phân ñoạn trình ñiều Sắc ký cột Pñ EPE4 chế phương pháp HPLC 3.7.3 Chiết xuất cao phân ñoạn ethyl acetat CAO EPE Sắc ký cột Pñ EPE5 Kết : Trong cao dịch chiết phân ñoạn ethyl acetat nhận thấy thành phần tập trung chủ yếu chất có ñộ phân cực trung bình, Sơ ñồ 3.2: Sơ ñồ chiết, phân lập, tinh chế chất tinh khiết có ñộ hấp thu cực ñại bước sóng 350- 351nm 3.7 CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP, TINH CHẾ CÁC CHẤT TINH 3.7.4 Phân lập, tinh chế chất tinh khiết phân ñoạn cao KHIẾT ethyl Acetat Footer Page of 126 Header Page of 126 17 18 3.7.4.1 Phân lập cột sắc kí ñiều chế pha thuận Nhận xét : Với phân ñoạn chất có màu xanh ñậm Điều kiện sắc kí xanh nhạt ñược tách hoàn toàn rõ ràng cột ñược gom thành Cao EPE tiến hành sắc kí cột cột sắc kí ñiều chế pha phân ñoạn riêng biệt gom phân ñoạn có màu sắc vào phân thuận Inox 25 x 300 mm, cột sắc kí ñiều chế thủy tinh 15 x 450 mm, ñoạn, cất cô quay thu hồi dung môi áp suất giảm, thu ñược cao silicagel pha thuận cỡ hạt 0.040 - 0.063 mm phân ñoạn 1: 0,110 gam, phân ñoạn 2: 0,062 gam Phân Khối lượng Silicagel : 60g 36g ñoạn sau kiểm tra có 01 peak có thời gian lưu giống Khối lượng mẫu : gam ñược gom lại phân ñoạn, cất cô quay thu hồi dung môi áp Dung môi ổn ñịnh cột : Dichloromethan suất giảm thu ñược cao phân ñoạn : 0,180 gam sắc kí ñồ nhận : 30 ml thấy chất tinh khiết lẫn màu xanh, hòa tan lại mẫu Tiến hành : Nạp silicagel vào cột, cột Inox ñược nối tiếp với ml Dichloromethan, ñể yên nhiệt ñộ phòng thí nghiệm ñược cột thủy tinh, ổn ñịnh cột dung môi dichloromethal vòng kết tinh màu trắng ngà, gạn bỏ dung môi có màu, sấy khô cắn thu 60 phút với tốc ñộ dòng bơm 3ml/phút Nạp 05 gam mẫu vào nạp ñược không khí nóng Kiểm tra lại ñộ tinh khiết chất kết mẫu, bắt ñầu rửa giải hệ pha ñộng dichloromethan sau ñó tăng tinh ta ñược chất EPE1 Chất EPE1 ñược xác ñịnh quang phổ hồng dần ñộ phân cực dung môi rửa giải hệ dung môi ngoại cộng hưởng từ hạt nhân MNR ñể xác ñịnh nhóm chức dichloromethan : methanol Thu hồi dung dịch rửa giải vào ống công thức cấu tạo chất Mỗi phân ñoạn nghiệm, ống nghiệm 30 ml (một phân ñoạn) Tổng cộng 120 Phân ñoạn 4,5 thu ñược có nhiều chất khác nằm phân ñoạn Kiểm tra phân ñoạn rửa giải quan sát trực tiếp phân ñoạn ñược tiếp tục sắc kí ñiều chế pha ñảo theo màu sắc HPLC, gom phân ñoạn có chất có thời gian 3.7.4.2 Phân lập cột sắc kí ñiều chế pha ñảo lưu giống vào phân ñoạn lớn Phân ñoạn có khối lượng 2,860 gam ñược tiếp tục sắc kí Bảng 3.9: Kết phân ñoạn sau phân lập pha thuận Phân ñoạn Hệ dung môi cột pha ñảo Natpro C18, 10 µm, 25 x 300mm Cruse sep 141110, rửa Khối lượng Số peak giải với hệ pha ñộng Acetonitrin : Nước với ñộ phân cực giảm dần (gam) HPLC (tăng dần Acetonitrin) với tín hiệu thu phân ñoạn sử dụng CH2Cl2 = 100 0,110 detector DAD bước sóng 351 nm Dựa kết tách chất CH2Cl2 = 100 0,062 sắc kí ñồ thu ñược 04 phân ñoạn riêng biệt CH2Cl2 : MeOH = 98 : 0,180 Kiểm tra phân ñoạn phương pháp sắc kí lỏng hiệu CH2Cl2 : MeOH = 95 : 2,860 nang cao, gom phân ñoạn có peak hình 3.12, cất cô quay CH2Cl2 : MeOH = 90 : 10 1,120 thu hồi dung môi áp suất giảm thu ñược phân ñoạn, kết trình bày bảng 3.10 Footer Page of 126 Header Page 10 of 126 19 20 Bảng 3.10: Kết phân ñoạn sắc kí ñiều chế pha ñảo Phân Hệ dung môi ñoạn Khối lượng Số peak (mg) HPLC ACN : H2O = 10:90 ACN : H2O = 10:90 22 ACN : H2O = 20:90 10 ACN : H2O = 20:90 60 SƠ ĐỒ CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP TINH CHẾ CHẤT EPE1, EPE2 Mẫu cỏ mực ( 400 gam) ether dầu Dịch Mẫu sau chiết ether dầu hỏa Thu hồi dung môi áp suất giảm ethyl acetat Nhận xét: Kết thu ñược phân ñoạn 1,3 có ñộ Cao EPD tinh khiết 98,01% ,98,23% có khối lượng nhỏ không ñủ mẫu ñể thực việc xác ñịnh cấu trúc, Phân ñoạn có 02 thành phần không ñược khảo sát, Phân ñoạn có ñộ tinh khiết 97,93% ta ñược chất EPE2, Chất EPE2 thu ñược cất thu hồi dung môi có Dịch chiết ethyl acetat Mẫu sau chiết ethyl Tinh chế Thu hồi dung môi áp suất giảm màu vàng xanh nhạt chất EPE2 ñược xác ñịnh quang phổ hồng ngoại tạo chất Như ta ñã thực qui trình chiết xuất phân lập chất EPE1 EPE2 theo sơ ñồ 3.3 3.8 XÁC ĐỊNH CÁC ĐẶC TRƯNG VẬT LÝ, ĐỊNH DANH CẤU TRÚC HÓA HỌC CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC 3.8.1 Chất EPE1 3.8.1.1 Các ñặc tính EPPE1 − Là chất rắn kết tinh MeOH cho dạng bột màu xám trắng, tan hỗn hợp EtOAc/MeOH − Điểm chảy: mp = 318 – 320°C − Sắc kí mỏng (TLC) màu tự nhiên • Giải ly hệ CHCl3: MeOH: Acid Acetic = 9:1:0.05 cho vết tròn Phân ñoạn Phân ñoạn cộng hưởng từ hạt nhân ñể xác ñịnh nhóm chức công thức cấu CAO EPE (6,720 Sắc ký cột silicagel Phân ñoạn EPE2 ( 22 mg) Phân ñoạn Phân ñoạn Phân ñoạn EPE1 (110 mg) Sắc ký cột C18 Phân ñoạn Phân ñoạn Sơ ñồ 3.3: Sơ ñồ chiết xuất phân lập tinh chế chất EPE1, EPE2 Độ tinh khiết peak theo diện tích ñạt 95,4%, sắc kí ñồ UV – VIS có ñỉnh hấp thu cực ñại 208,0 nm, 248,9 nm, 351,1nm 3.8.1.2 Nhận danh cấu trúc EPE1 màu xanh nhạt có Rf = 0,6 − Phổ MS cho mũi m/z [M-H]- = 313 Suy phân tử khối - Sắc kí lỏng hiệu cao sắc kí ñồ chất EPE1 có thời gian lưu 4,5 EPE1 314 ñvC ứng với công thức phân tử C16H10O7 Footer Page 10 of 126 Header Page 11 of 126 21 22 - Phổ hồng ngoại (IR) chất EPE1, 3303 cm-1 (OH), 1713 cm-1 -1 -1 (δ-lactone carbonyl -O-C=O), vòng thơm (1614 cm , 1473 cm ), -1 1281 cm (C-O) − Phổ 13C- NMR (DMSO, δ ppm) xuất tín hiệu 16 Tóm lại, dựa vào kết phổ cộng hưởng từ hạt nhân, ñặc trưng vật lý so sánh với tài liệu ñã công bố nhận danh chất EPE1 5,11,12-Trihydroxy-7-methoxycoumestan (Wedelolactone) 15 H3CO O O carbon kết hợp phổ DEPT cho thấy EPE1 có nhóm >C=O; carbon Cấu trúc hóa học EPE1: =CH-; carbon >C=; carbon =C-O-; carbon –CH3 (bảng 3.11), phổ 13C-NMR chất EPE1 − Phổ 1H-NMR (DMSO, δ ppm, 500 MHz) cho thấy có: 5, 11, 12-Trihydroxy-7-methoxycoumestan + mũi ñơn 3,82 proton nhóm OCH3 3.8.2.1 Các ñặc tính EPE2 + mũi 7,16 (s); 7,24 (s) tín hiệu proton vòng thơm vị trí - Là chất rắn dạng bột màu vàng xanh nhạt, tan hỗn hợp para EtOAc/MeOH + mũi 6,45 (d, J = 2,5 Hz) 6,61 (d, J = Hz) tín hiệu proton - Mp = 355-357°C vòng thơm - Giải ly hệ CHCl3: MeOH: Acid Acetic = 9:15:0.05 cho vết tròn màu xanh nhạt có Rf = 0,62 vị trí meta − Phổ 13C-NMR (DMSO, δ ppm) cho thấy chất EPE1 có 16 (1, 8, 9-Trihydroxy-3-methoxycoumestan) 8a 4a OH 13 12 14 OH O 11 10 OH 3.8.2 Chất EPE2 - Sắc kí lỏng hiệu cao chất EPE2 mũi tín hiệu carbon, ñó: Trên sắc kí ñồ cho peak có thời gian lưu 2.16 phút Độ tinh khiết + mũi 158,85 nhóm δ lacton peak theo diện tích ñạt 97,93% + mũi 98,08; 93,09; 98,77 104,45 tín hiệu nhóm CH 3.8.2.2 Nhận danh cấu trúc EPE2 kề nối ñôi (CH=) - Phổ IR: 3276 cm-1 (OH), 1710 cm-1 (δ-lactone carbonyl -O-C=O), + 10 mũi 101,55; 157,65; 96,65; 162,16; 148,77; 145,31; 155,19; vòng thơm (1614 cm-1, 1490 cm-1), 1286 cm-1 (C-O) 144,22 113,63 tín hiệu 10 carbon tứ cấp kề nối ñôi - Phổ MS cho mũi m/z [M−H]− = 298,9 Suy phân tử khối + mũi 55,63 cacbon nhóm OCH3 gắn vào vòng benzene Phổ HMBC cho thấy nhóm OCH3 tương tác với C7 (δ = 162,16) EPE2 300 ñvC ứng với công thức phân tử C15H8O7 - Phổ 13C- NMR (DMSO, δ ppm) xuất tín hiệu 15 carbon − Phổ HMBC (bảng 3.12) cho thấy tương tác H với Kết hợp phổ DEPT cho thấy EPE2 có nhóm >C=O; carbon =CH- C vị trí C mà H tương tác: H6→C4a, 7, 8, 8a; H8→C4a, 6, 7, 8a; H10→C9, 11, 12, 14 ; H13→C3, 9, 11, 12; H15→C7 Footer Page 11 of 126 ; carbon >C=; carbon =C-O- - Phổ 1H-NMR (DMSO, δ ppm, 500 MHz)cho thấy có: Header Page 12 of 126 23 24 − mũi ñơn δH 9,37; 9,41; 10,44 10,85 tín hiệu proton nhóm OH • Proton δH 9,37 (H11) tương tác với δC 104,51; 145,10 (C11) nên carbon có δC 144,15 vị trí C12 − mũi ñơn δH 7,14 (s); 7,22 (s) tín hiệu proton vòng thơm Tóm lại, dựa vào kết phổ cộng hưởng từ hạt nhân, vị trí para ñặc trưng vật lý so sánh với tài liệu ñã công bố [15], [19], − mũi ñơn δH 6,36 6,39 tín hiệu proton vòng thơm vị trí [34] meta 5,7,11,12-tetrahydroxycoumestan (Demethylwedelolactone) - Phổ C-NMR DEPT (DMSO, δ ppm) cho thấy chất EPE2 có 15 13 mũi tín hiệu carbon, ñó: − mũi δC 159,32 nhóm carbonyl δ-lacton nhận Cấu trúc hóa học EPE2: danh chất HO EPE2 8a O O Demethylwedelolactone OH − mũi δC 98,82; 94,54; 99,06 104,51 tín hiệu nhóm 4a 14 13 12 OH O 11 10 OH CH kề nối ñôi (CH=) − 10 mũi δC 100,85; 157,79; 95,38; 155,31; 161,01; 154,99; 148,64; 145,10; 144,15 113,81 tín hiệu 10 carbon tứ cấp kề 3.9 ỨNG DỤNG THỰC TIỄN CỦA LUẬN VĂN Sau tinh chế ñược chất EPE1 có ñộ tinh khiết cao, ñã xác nối ñôi Trong ñó có carbon tứ cấp kề nối ñôi quanh oxygen δC ñịnh 5,11,12-Trihydroxy-7-methoxycoumestan 144,15 (C12), δC 145,10 (C11), δC 148,64 (C9), δC 154,99 (C8a), δC (Wedelolactone) 155,31 (C5), δC 157,79 (C4), δC 161,01 (C7) Với chất ñã tinh chế ñược xây dựng qui trình ñịnh tính, ñịnh - Phổ HMBC cho thấy tương tác xa: lượng chất wedelolactone nguyên liệu cỏ mực sắc ký • lỏng hiệu cao Sử dụng cho kiểm tra nguyên liệu ñầu vào Proton δH 6,39 (H6) tương tác với δC 95,38 (C4a) δC 155,31; 161,01 nên carbon phải vị trí C5 C7 công ty CP Dược Danapha • Điều kiện sắc kí: Proton δH 6,36 (H8) tương tác với δC 95,38; 98,82; 154,99 δC 161,01 nên carbon C4a, C6, C8a C7 Từ ñây Cột sắc kí : Acclaim ®120 C18, 3µ 4,6x100 mm suy carbon có δC 155,31 vị trí C5 Detector DAD : 351 nm • Thể tích tiêm : 20 µl Nhiệt ñộ : Nhiệt ñộ phòng thí nghiệm Tốc ñộ dòng : 1.0 ml/phút Pha ñộng : Acetonitrin - nước cất (25:75) Proton δH 7,14 (H10) tương tác với δC 113,81; 144,15; 145,10 148,64 nên carbon C14, C12, C11 C9 • Proton δH 7,22 (H13) tương tác với δC 100,85; 148,64 δC 144,15 nên carbon C3, C9 C12 Từ ñây suy carbon có δC 113,81 vị trí C14 Footer Page 12 of 126 Chuẩn bị mẫu: Header Page 13 of 126 25 26 Cân xác 03 gam mẫu cỏ mực nguyên liệu ñã xay nhỏ có kích thước 1-2 mm vào bình ñịnh mức 50 ml, bổ sung methanol ñầy ñến vạch, lắc siêu âm bể siêu âm vòng 30 phút, ñể nguội cho dung môi hạ xuống ñế vạch, lọc qua giấy lọc, lọc qua màng lọc 0.45µm, ñược dung dịch thử Chuẩn bị mẫu chuẩn: acetat có nhóm hoạt chất có hàm lượng chất có ñộ phân cực trung bình ñộ hấp thu cực ñại bước sóng khoảng 351nm 3- Đã khảo sát ñược tỷ lệ dung môi - nguyên liệu thời gian chiết xuất phù hợp ñể thực chiết xuất 4-Từ cao ethyl acetat ñã phân lập nhận danh ñược chất Tên chất Cân xác 02 mg chất chuẩn wedelolactone vào bình ñịnh mức 50 ml, bổ sung methanol ñầy ñến vạch, lắc siêu âm bể siêu âm vòng 30 phút, ñể nguội cho dung môi hạ xuống ñế vạch, lọc qua màng lọc 0.45µm, ñược dung dịch chuẩn Tiến hành sắc kí: Lần lượt tiêm 20 µl mẫu chuẩn mẫu thử vào hệ thống CTPT Cấu trúc 15 Wedolelactone H3CO 8a C16H10O7 O (EPE1) O 4a 13 OH O 11 OH 10 Demethylwedolelactone HO C15H8O7 OH 12 14 8a O O OH 4a 14 13 12 OH O 11 10 OH (EPE2) sắc kí Ghi lại sắc kí ñồ, vào thời gian lưu peak chất 5- Đã bước ñầu xây dựng ñược qui trình phân tích ñịnh tính wedelolactone ñể ñịnh tính Nguyên liệu cỏ mực Định lượng, ñịnh lượng phương pháp HPLC cho thành phần wedelolactone vào diện tích peak mẫu chuẩn mẫu thử, hàm lượng chất chuẩn, có nguyên liệu cỏ mực khối lượng chất chuẩn mẫu thử tính nồng ñộ wedelolactone có b) Kiến nghị mẫu 1- Tiếp tục phân lập, tinh chế chất có cỏ mực KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ a) Kết luận phân ñoạn dung môi chiết Ethanol, Methnol nước Xác ñịnh cấu trúc chất tinh chế ñược Sau nhiều tháng nghiên cứu Cỏ mực có nguồn gốc Hòa 2- Tiến hành phân lập khối lượng lớn chất wedelolactone vang Thành phố Đà nẵng, ñã ñạt ñược số kết Demethylwedolelactone ñủ ñể thử hoạt tính kháng oxy hóa, kháng sau: sinh wedolelactone, Demethylwedolelactone Xác ñinh ñược hoạt 1- Đã tiến hành thực mô tả, vi phẫu, soi bột phản ứng hóa học, ñịnh danh ñúng cỏ mực có tên khoa học: Eclipta prostrata (L.)L.) ,Họ: Cúc (Asteraceae) 2- Đã tiến hành khảo sát chiết xuất cỏ mực dung o tính sinh học chất nhằm ứng dụng vào sản xuất thuốc uống dùng cho người 3- Thẩm ñịnh qui trình phân tích ñịnh tính ñịnh lượng hàm lượng Wedelolactone, Demethylwedolelactone có cỏ mực môi ether dầu hỏa (nhiệt ñộ sôi 60-90 C), n-hexan, chlorofooc, ethyl theo thời gian theo vùng, xây dựng ñược tiêu chuẩn cho dược liệu acetat, ethanol, methanol, nước Đã tìm ñược phân ñoạn chiết ethyl cỏ mực làm sở ñánh giá chất lượng dược liệu Footer Page 13 of 126  ... cứu thành phần hóa thích hợp cho việc trồng trọt phát triển nhiều loại cỏ thuốc học cỏ mực (Eclipta prostrata( L.)L.) thành phố Đà nẵng" quý Cha ông ta hay dùng cỏ ñể chữa bệnh thông Mục ñích nghiên. .. biệt y học Một số loài ñược sử dụng nhiều dân gian ñó có cỏ mực Cỏ mực, thuốc nam thông thường mọc cấu trúc số hợp chất tinh khiết cỏ mực thu hái Đà Nẵng Đối tượng phạm vi nghiên cứu - Cây cỏ mực. .. 12% Cây cỏ mực ñược thu hái xã Hòa phong, huyện Hòa vang, 3.3.2 Xác ñịnh hàm lượng tro thành phố Đà nẵng cỏ mực ñược khoảng ba tháng tuổi, khối Kết xác ñịnh hàm lượng tro mẫu cỏ mực nghiên cứu cỏ