Nghiên Cứu Thành Phần Hoá Học Và Hoạt Tính Sinh Học Của Sữa Ong Chúa Và Phấn Hoa

I HC QUC GIA H NI TRNG I HC KHOA HC T NHIấN - NGUYN TH THIU NGHIấN CU THNH PHN HO HC V HOT TNH SINH HC CA SA ONG CHA V PHN HOA Chuyờn ngnh: Hoỏ Hu c Mó s: 60 44 27 LUN VN THC S KHOA HC Ngi hng dn khoa hc: TS Dng Ngc Tỳ H Ni - 2010 Nguyễn Thị Thiều - K19 Chuyên ngành: Hoá Hữu mục lục Mở đầu chơng Tổng quan 1.1 Sữa Ong chúa 1.1.1 Nguồn gốc đặc điểm sữa ong chúa 1.1.2 Thành phần hoá học sữa ong chúa 1.1.3 Thu hoạch sữa ong chúa 1.1.4 Tác dụng sữa ong chúa 1.1.5 Một số kết nghiên cứu thành phần hoá học hoạt tính sinh học sữa ong chúa 1.2 Phấn hoa 12 1.2 Giới thiệu phấn hoa 12 1.2 Cấu trúc phấn hoa [1] 14 1.2 Thành phần hoá học phấn hoa [51] 18 1.2.4 Cách thu hoạch phấn hoa 18 1.2.5 Tác dụng phấn hoa ong 19 1.2 Lớp chất flavonoit, thành phần hoá học có phấn hoa 20 1.2.7 Một số kết nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học phấn hoa 21 Chơng 2: Thực Nghiệm 24 2.1 Đối tợng kỹ thuật thực nghiệm 24 2.1.1 Nguyên liệu 24 2.1.2 Hoá chất 24 Luận văn thạc sỹ khoa học Nguyễn Thị Thiều - K19 Chuyên ngành: Hoá Hữu 2.1.3 Các dụng cụ trang thiết bị nghiên cứu 24 2.1.4 Các phơng pháp phân tích, phân tách phân lập hợp chất 25 2.1.5 Các phơng pháp định cấu trúc hoá học hợp chất 28 2.1.6 Phơng pháp thử hoạt tính sinh học 28 2.2 Quy trình phân lập chất sữa ong chúa phấn hoa 31 2.2.1 Quy trình phân lập chất sữa ong chúa 31 2.2.2 Chiết mẫu phấn hoa phân lập hợp chất (7-O- Xylosidenaringenin) 35 Chơng 3: Kết thảo luận 37 3.1 Kết nghiên cứu Sữa ong chúa 37 3.1.1 Hàm lợng protein sữa ong chúa 37 3.1.2 Kết phân tích thnh phần axít amin từ sữa ong chúa 38 3.1.3 Kt qu xỏc nh cu trỳc hp cht 41 3.1.4 Kết thử hoạt tính độc tế bào 44 3.2 Kết nghiên cứu từ phấn hoa 45 3.2.1 Phân lập dịch chiết 45 3.2.2 Kết xác định cấu trúc hợp chất (7-O- Xyloside-naringenin) 45 3.2.3 Kết thử hoạt tính chống oxy hoá 52 Kết luận 55 Kiến Nghị 56 Tài liệu tham khảo 57 Luận văn thạc sỹ khoa học Nguyễn Thị Thiều - K19 Chuyên ngành: Hoá Hữu Danh mục viết tắt 10- HDA: 13 C NMR: H-NMR: Axít 10-hydroxy-2-decenoic Phổ cộng hởng từ hạt nhân proton 13 (13C Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) Phổ cộng hởng từ hạt nhân proton (1H Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) CC: Sắc ký cột (Column Chromatography) DEPT: Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DMSO: Dimethyl Sunfoxide EtOH: Etanol HPLC: HPLC-pre: EI-MS: Sắc ký lỏng hiệu cao (High-performance liquid chromatography) Sắc ký lỏng hiệu cao - điều chế (High-performance liquid chromatography preparative) Phổ khối lợng va chạm điện tử (Electron Impact-Mass spectroscopy) ESI - MS Phổ khối bụi điện tử (Electron Spray Ionization Mass Spectra) TLC: Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography) Luận văn thạc sỹ khoa học Nguyễn Thị Thiều - K19 Chuyên ngành: Hoá Hữu Danh mục bảng Chơng Trang Bảng 1.1: Quá trình phát triển ong chúa ong thợ Bảng 1.2: Thành phần hóa học sữa ong chúa Bảng 1.3: Hàm lợng số thành phần hoá học có phấn hoa 22 Brazil Chơng Bảng 2.1: Các dụng cụ thiết bị nghiên cứu 25 Chơng Bng 3.1: Hm lợng axít amin sữa ong chúa 39 Bảng 3.2: Số liệu phổ 1H NMR chất 43 Bng 3.3: Kt qu thử độc tính với tế bo ung th biu mô sữa 44 ong chúa Bảng 3.4: Số liệu phổ 1H NMR chất 49 Bảng 3.5: Kết thử hoạt tính chống oxi hoá phấn hoa 53 Luận văn thạc sỹ khoa học Nguyễn Thị Thiều - K19 Chuyên ngành: Hoá Hữu Danh mục hình Chơng Trang Hình 1.1: Sự phát triển ấu trùng ong sữa ong chúa Hình 1.2: Sữa ong chúa tơi Hình 1.3: Các dẫn xuất hydroxy este 10 HDA thu đợc từ sữa ong chúa Hình 1.4: Sơ đồ phân lập 10- HDA, dẫn xuất hydroxy este 10 10-HDA Hình 1.5: Hình ảnh số loại phấn hoa dới kính hiển vi 13 điện tử quét Hình 6: Cấu trúc hạt phấn 15 Hình 1.7: Cấu tạo hạt phấn hoa 17 Hình 1.8: Ong thu hạt phấn hoa 19 Hình 9: Flavan (2 phenyl chroman) 20 Chơng Hình 2.1: Công thức phân tử Coomassie Brilliant Blue 31 Hình 2.2: Đờng chuẩn tơng quan nồng độ protein OD595 33 36 Hình 2.3: Sơ đồ phân lập chất Chơng Hình 3.1: Sắc ký đồ thnh phần axít amin sữa ong chúa 38 Hình 3.2: Biểu đồ biểu thị hàm lợng axít amin sữa ong chúa 40 Hình 3.3: Phổ 1H-NMR chất (10-HDA) 41 Hình 3.4: Phổ ESI-MS chất (10-HDA) 42 Hình 3.5: Cấu trúc hợp chất (10-HDA) 42 Hình 3.6: Sắc ký đồ HPLC chất 45 Hình 3.7: Phổ UV pik 46 Luận văn thạc sỹ khoa học Nguyễn Thị Thiều - K19 Chuyên ngành: Hoá Hữu Hình 3.8: Phổ UV Pik 46 Hình 3.9: Phổ 1H- NMR chất 47 Hình 3.10: Phổ ESI MS chất 48 Hình 3.11: Cấu trúc chất (7-O - Xyloside-naringenin) 48 Hình 3.12: Sơ đồ trình sinh tổng hợp Flavonoit 51 Hình 3.13: Sơ đồ sinh tổng hợp O- Xyloside 52 naringenin Hình 3.14: Biểu đồ hoạt tính phấn hoa Luận văn thạc sỹ khoa học 53 Nguyễn Thị Thiều - K19 Luận văn thạc sỹ khoa học Chuyên ngành: Hoá Hữu Nguyễn Thị Thiều - K19 Chuyên ngành: Hoá Hữu Mở đầu Nh biết, Việt Nam nằm khu vực nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, độ ẩm cao 80%, lợng ma lớn, nhiệt độ trung bình khoảng 15oC đến 27oC Đó điều kiện thích hợp cho thực vật phát triển Do hệ thực vật Việt Nam vô phong phú, đa dạng với khoảng 12000 loài, có tới 4000 loài đợc nhân dân ta dùng làm thảo dợc [2] Điều thực có ý nghĩa quan trọng cho phát triển ngành y dợc, ngành hoá học số ngành khác Hệ thực vật phong phú đợc coi tiền đề cho phát triển ngành hoá học hợp chất thiên nhiên nớc ta Từ ngàn xa, ông cha ta sử dụng nhiều phơng thuốc dân gian từ cỏ để chữa bệnh, bồi bổ thể hay tạo mùi thơm nh tía tô để giải cảm, nhân sâm để tăng cờng sức đề kháng, sả để tạo mùi thơm Các phơng thuốc y học cổ truyền thể mặt mạnh điều trị bệnh độc tính tác dụng phụ Do có nhiều u điểm nh nên ngày ngời ngày quan tâm đến hợp chất có hoạt tính sinh học cao thực vật động vật Về lâu dài phát triển dợc phẩm hợp chất có hoạt tính sinh học đóng vai trò quan trọng, khởi đầu cho việc tổng hợp loại thuốc có tác dụng tốt Sữa ong chúa phấn hoa sản phẩm thu đợc từ ong Sữa ong chúa đợc sản sinh từ tuyến hạch miệng ong thợ Phấn hoa đợc ong thu tổng hợp nhiều loài hoa loại thực vật khác Cả hai sản phẩm đợc biết đến nh loại sản phẩm chức có nhiều tác dụng phòng chống lại nhiều loại bệnh tật khác tăng cờng sức khoẻ Sữa ong chúa phấn hoa sản phẩm có hoạt tính sinh học cao, chứa nhiều thành phần hoá học có nhiều tác dụng dợc lý Việc nghiên cứu, khảo sát thành phần hoá học hoạt tính sinh học sữa ong chúa phấn hoa Việt Nam nhằm đặt sở khoa học cho việc Luận văn thạc sỹ khoa học Nguyễn Thị Thiều - K19 Chuyên ngành: Hoá Hữu sử dụng chúng cách hợp lý có hiệu quan trọng Do chọn đề tài Nghiên cứu thành phần hoá học hoạt tính sinh học sữa ong chúa phấn hoa Việc nghiên cứu thành phần hoá học cấu trúc hợp chất nh hoạt tính sinh học từ sữa ong chúa phấn hoa tạo sở cho nghiên cứu lĩnh vực tìm kiếm phơng thuốc nh giải thích đợc tác dụng đối tợng nghiên cứu Do đó, kết thu đợc yếu tố quan trọng đóng góp cho nhân loại phát có ý nghĩa thực tiễn nh đóng góp cho phát triển y học dân tộc Việt Nam Luận văn thạc sỹ khoa học Nguyễn Thị Thiều - K19 Chuyên ngành: Hoá Hữu royal jelly against the oxidative stress of fumonisin in rats, Toxicon 50, p 256269 Barth, O.M, Luz, C.F.P., (1998) Melissopalynological data obtained from a mangrove area near to Rio de Janeiro, Brazil Journal of Apicultural Research 37 (2), 155163 10 Benfenati, L; Sabatini, A G; Nanetti, A (1986) Composizione in sali minerali della gelatina reale, Apicoltura 2: 129-143 11 Boselli E., Caboni M F., Sabatini A G., Marcazzan G L., Lercker G., (2003), Determination and changes of free amino acids in royal jelly during storage Apidologie 34: 1-7 12 Campos M, Cunha A and Markham KR (1996) Beepollen composition, properties, and applications In: Mizrahi A AND LENSKY Y (Eds), Bee products Plenum Press: New York 13 Campos M, Markham KR, Mitchell KA and Da Cunha A, (1997), An approach to be properties of bee pollen via flavonoid/phenolic profiles Phytochem Anal 8: 181-185 14 Chen, C., Chen, S., (1995), Changes in protein components and storage stability of royal jelly under various conditions Food Chemistry 54, 195200 15 Cheng PC., Wong G., (1996) Honey bee propolis: prospects in medicine Bee World; 77:8-14 16 Colin C.Lucas, (1942), Chemical Fxamination of Royal jelly, The Canadian medical association journal, 406-409 17 Crane, E., (1990), Bees and BeekeepingScience, Practice and World Resources, Heinemann Newnes, Oxford, UK Luận văn thạc sỹ khoa học 58 Nguyễn Thị Thiều - K19 Chuyên ngành: Hoá Hữu 18 Dinesh Simkhada, EuiMin Kim, Hei Chan Lee, and Jae Kyung Sohng, (2009), Metabolic Engineering of Escherichia coli for the Biological Synthesis of 7-O-Xylosyl Naringenin, Mol Cells 28: 397-401 19 Dragana Vucevic , Eleni Melliou, Sasa Vasilijic, Sonja Gasic, Petar Ivanovski ,Ioanna Chinou , Miodrag Colic, (2007), Fatty acids isolated from royal jelly modulate dendritic cell-mediated immune response in vitro, International Immunopharmacology 20 Dutra, V.M.L., Barth, O.M., (1997) Anlalise palinol ogica de amostras de mel da regiao de Bananal (SP/RJ), Brasil Revista Universidade de Guarulhos, Geociencias II, Numero especial: 174183 21 Erem C, Deger O, Ovali E, Barlak Y, (2006) , The effects of royal jelly on autoimmunity in Graves' disease Endocrine 30(2):175-83 22 Ferioli, F; Marcazzan, G L; Caboni, M F, (2007), Determination of (E)10-hydroxy-2-decenoic acid content in pure royal jelly: a comparison between a new CZE method and HPLC, Journal of separation Science 30: 1061 1069 23 Gohan Eraslan, Murat Kanbur, Sibel Silici, (2009), Effect of carbaryl on some biochemical changes in rats: The ameliorative effect of bee pollen, Food and Chemical Toxicology 47: 8691 24 Graham, J (ed.) (1992), The Hive and the Honey Bee (Revised Edition) Dadant & Sons 25 Harborn J.B., (1994), The flavonoids advance in research since 1986, Chapman & Hall, 26 Hattori N, Nomoto H, Fukumitsu H, Mishima S, Furukawa S, (2007) , Royal jelly and its unique fatty acid, 10-hydroxy-trans-2-decenoic acid, Luận văn thạc sỹ khoa học 59 Nguyễn Thị Thiều - K19 Chuyên ngành: Hoá Hữu promote neurogenesis by neural stem/progenitor cells in vitro Biomed Res 28(5):261-6 27 Hayerman A.E., Butler I.G., (1994), Assay of caondensed tanin or flavonoid oligomers and related flavonoid in plant, Meth, Enz, 234: 249 28 Hiroko Tani, Shunya Takahashi, Keiko Hasumi, Tomoki Tatefuji, Yayoi Hongo, Hiroyuki Koshino, (2009), Isolation of (E)-9,10-dihydroxy-2decenoic acid from royal jelly and determination of the absolute configuration by chemical synthesis, Tetrahedron: Asymmetry 20: 457 460 29 Iannuzzi J.,(1990), Royal Jelly: mystery food, in three parts Am Bee J , 8:532-4, 587-9, 659-62 30 Illana Louise Pereira de Melo; Ligia Bicudo de Almeida Muradian, (2010), Stability of antioxidants vitamins in bee pollen samples Faculdade de Ciencias Farmacouticas Universidade se Soo paulo, Av Prof Lineu Prestes, 580, Bl 14, 05: 508-900 Sao Paulo - SP, Brasil 31 Iwao Okamoto, Yoshifumi Taniguchi, Toshio Kunikata, Keizo Kohno, Kanso Iwaki, Masao Ikeda, Masashi Kurimoto, (2003), Major royal jelly protein modulates immune responses in vitro and in vivo , Life Sciences 73: 20292045 32 Jean-Claude Dauguet, Maryse Bert, Jean Dolley, Anain bekaer, Guy Lenwin, (1993), 8-Methoxykaempferol 3-neohesperidoside and other flavonoids from bee pollen or crataegus monogyna , Phytochemistr Vol 33,(6): 1503-1505 33 Krell R (1996) Value-added products from bee keeping FAO Agricultural Services Bulletin 124 Luận văn thạc sỹ khoa học 60 Nguyễn Thị Thiều - K19 Chuyên ngành: Hoá Hữu 34 Krell, R., (1996) Value-added products from beekeeping FAO Agricultural Services Bulletin 124, Food and Agriculture Organization, Rome: 87113 35 L.A Salazar-Olivo, V Paz-Gonzalez, (2005), Screening of biological activities present in honeybee (Apis mellifera) royal jelly, Toxicology in Vitro (19): 645651 36 L.B Almeida-Muradian, Lucila C Pamplonaa, S!lvia Coimbra, Ortrud Monika Barth, (2005) Chemical composition and botanical evaluation of dried bee pollen pellets, Journal of Food Composition and Analysis 18: 105111 37 Laura silvia G V.,Norma A A., et al, (2007), Antioxidant activity of polyphenolic extract of monofloral honeybeecollected pollen from mesquite (Prosopis juliflora, Leguminosae), Journal of Food Composition and Analysis 20: 119124 38 Lecker G, et al (1982), Components of royal jelly II: the lipid fraction, hydrocarbons and sterols J Apic Res 21:178-84 39 Lercker G., Caboni M F., Vecchi M A., Sabatini A G., Nanetti A., (1993), Caratterizzazione dei principali costituenti della gelatina reale, Apicoltura 8: 27-37 40 Lercker, G., Capella, P., Conte, L.S., Ruini, F., Giordani, G., (1981) Components of royal jelly, I Identification of the organic acids Lipids 12: 912919 41 Liang Guang-Yi, Alexander I Gray and Peter G Waterman, (1989), Pentacyclic triterpenes from the fruits of Rosa sterilis, Journal of Natural Products, Vol 52(1): 162-167 Luận văn thạc sỹ khoa học 61 Nguyễn Thị Thiều - K19 Chuyên ngành: Hoá Hữu 42 Liviu A Marghitas, Oltica G Stanciu, Daniel S Dezmirean, Otilia Bobis, Olimpia Popescu, Stefan Bogdanov, Maria Graca Campos, (2009), In vitro antioxidant capacity of honeybee-collected pollen of selected floral origin harvested from Romania, Food Chemistry 115: 878883 43 Luz, C.F.P., Barth, O.M., (2001) Melissopalynological observations in a mangrove area next to Rio de Janeiro, Brazil In: Goodman, D.K., Clarke, R.T (Eds.), Proceedings of the IX Palynological Congress American Association of Stratigraphic Palynologists Foundation, Houston, pp 489492 44 Mabry F.J., Markman R.B., Thomas M.B., (1970), The syrematic identification of flavonoids, Springer Verlag - Berlin - Heidelberg - New York 45 Murat Kucuk, Sevgi Kolayl, Sengul Karaoglu, Esra Ulusoy, Cemalettin Baltac, Ferda Candan, (2007), Biological activities and chemical composition of three honeys of different types from Anatolia, Food Chemistry 100 (2007): 526534 46 Naoki Noda, Kazue Umebayashi, Takafumi Nakatani, Kazumoto Miyahara, and Kaori Ishiyama, (2005), Isolation and Characterization of Some Hydroxy Fatty and Phosphoric Acid Esters of 10-Hydroxy-2decenoic Acid from the Royal Jelly of Honeybees (Apis mellifera) , Lipids 40: 833838 47 Pleasants, Jm; Hellmich, Rl; Dively, Gp; Sears, Mk; Stanley-horn, De; Mattila, Hr; Foster, Je; Clark, P et al (October 2001) "Corn pollen deposition on milkweeds in and near cornfields" , Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 98 (21): 1124 Luận văn thạc sỹ khoa học 62 Nguyễn Thị Thiều - K19 Chuyên ngành: Hoá Hữu 48 S B Mahato and A P Kundu, (1994), 13C-NMR spectra of pentacyclic triterpenoids-A compilantion and some salient features, Phytochemistry, Vol 37: 1517-1575 49 S P Shrivastava, (1982), A flavanone glycoside from PR Unus Cerasoides, Phytochemistry Vol 21, No 6: 1464-1465 50 Shougo Tamura, Toru Kono, Chika Harada, Kikuji Yamaguchi, Takanori Moriyama, (2009), Estimation and characterisation of major royal jelly proteins obtained from the honeybee Apis merifera , Food Chemistry 114: 14911497 51 Takashi Echigo, Tetsuo Takenaka and Kazuhisa Yatsunami, (1986), Comparative Studies on chemical composition of Honey, Royal Jelly and Pollen Loads, Bull Fac Agr., Tamagawa No.26: 1-12 52 Tania Maria Sarmento Silva, Celso Amorim Camara, Antonio Claudio da Silva Lins, Jose Maria Barbosa-Filho, Eva Monica Sarmento da Silva, Breno Magalhaes Freitas, Francisco de Assis Ribeiro dos Santos, (2006), Chemical composition and free radical scavenging activity of pollen loads from stingless bee Melipona subnitida Ducke, Journal of Food Composition and Analysis 19: 507511 53 Tania Maria Sarmento Silvaa, Celso Amorim Camaraa, Antonio Claudio da Silva Linsa, Jose Maria Barbosa-Filhoa, Eva Mo nica Sarmento da Silvab, Breno Magalha es Freitasb, Francisco de Assis Ribeiro dos Santos, (2006), Chemical composition and free radical scavenging activity of pollen loads from stingless bee Melipona subnitida Ducke, Journal of Food Composition and Analysis 19: 507511 54 Ternai B., Markham K.R., (1976), C13 - NMR of flavonoids - I Flavones and flavonols Tetrehedron 32:pp 565 Luận văn thạc sỹ khoa học 63 Nguyễn Thị Thiều - K19 Chuyên ngành: Hoá Hữu 55 Tomaslorente F., Garciagrau MM, Nieto JL and Tomasbarberan FA, (1992) Flavonoids from CistusLadanifer bee pollen , Phytochemistry 31: 2027-2029 56 Tetsuya Kodai, Kazue Umebayashi, Takafumi Nakatani, Kaori Ishiyama, and Naoki Noda, (2007), Compositions of Royal Jelly II Organic Acid Glycosides and Sterols of the Royal Jelly of Honeybees (Apis mellifera) , Chem Pharm Bull 55(10) 15281531 57 Tsutomu Nakanishi, Naoki Iida, Yuka Inatomi, Hiroko Murata, Akira Inada, Jin Murata, Frank A Lang, Munekazu Iinuma, Toshiyuki Tanaka, (2004), Neolignan and flavonoid glycosides in Juniperus communis var depressa, Phytochemistry 65: 207 -213 58 Vittek J (1995) , Effect of royal jelly on serum lipids in experimental animals and humans with atherosclerosis Experientia 51:927-35 59 Wu.G., Li Y., Liu G., (1991), The immunoregulative effect of royal jelly acid, Zhongguo Yaoke Daxue Xuebao 22 (2): 117-118 60 Xin-Yu Yang, De-sheng Yang, Wei-Zhang, Jian-Min Wang, Chun-Yang Li , Hui-Ye, Kang-Fu Lei , Xiu-Fang Chen, Nian-Han Shen, Li-Qin Jin , Jian-Guang Wang, (2010) , 10-Hydroxy-2-decenoic acid from Royal jelly: A potential medicine for RA , Journal of Ethnopharmacology 128: 314321 Tài liệu trang WEB 61 http://en.wikipedia.org/wiki/Royal_jelly 62 http://www.worcester.ac.uk/businessandresearch/specialist/14506.html 63.http://www.tutorvista.com/biology/structure-of-the-stamen-and-a-pollengrain Luận văn thạc sỹ khoa học 64 Nguyễn Thị Thiều - K19 Chuyên ngành: Hoá Hữu Phụ lục : HPLC & ESI-MS chất Luận văn thạc sỹ khoa học 65 Nguyễn Thị Thiều - K19 Chuyên ngành: Hoá Hữu Phụ lục 2: Phổ 1H-NMR chất Luận văn thạc sỹ khoa học 66 Nguyễn Thị Thiều - K19 Chuyên ngành: Hoá Hữu Phụ lục 3: Phổ 1H-NMR chất Luận văn thạc sỹ khoa học 67 Nguyễn Thị Thiều - K19 Chuyên ngành: Hoá Hữu Phụ lục 4: Phổ 13C-NMR chất Luận văn thạc sỹ khoa học 68 Nguyễn Thị Thiều - K19 Luận văn thạc sỹ khoa học Chuyên ngành: Hoá Hữu 69 Nguyễn Thị Thiều - K19 Chuyên ngành: Hoá Hữu Phụ luc 5: Phổ dept chất Luận văn thạc sỹ khoa học 70 Nguyễn Thị Thiều - K19 Chuyên ngành: Hoá Hữu phụ lục 6: Phổ EI-ms CủA CHấT Luận văn thạc sỹ khoa học 71 Nguyễn Thị Thiều - K19 Luận văn thạc sỹ khoa học Chuyên ngành: Hoá Hữu 72