Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của sữa ong chúa và phấn hoa

Luận văn : Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của sữa ong chúa và phấn hoa

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Dương Ngọc Tú

Hà Nội - 2010

Lời cảm ơn

Trước hết Em xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc TS Dương Ngọc Tú, đã giao đề tài và tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thiện khoá luận văn này

Em xin được gửi lời cảm ơn tới GS.TSKH.NGND Phan Tống Sơn cùng toàn thể các thầy cô trong Khoa Hoá học, Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên - Đại học Quốc Gia Hà Nội đã tạo nhiều điều kiện giúp đỡ em trong quá trình học tập ở Trường và hoàn thiện bản luận văn này

Em xin chân thành cảm ơn tới toàn thể anh chị em tại Phòng Sinh Dược , Viện Hoá học - Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam đã giúp đỡ, động viên em hoàn thành khoá luận

Em xin chân thành cảm ơn các anh chị đồng nghiệp, bạn bè và đặc biệt là gia đình thân yêu đã luôn động viên, giúp đỡ em trong suốt thời gian qua

Nhân đây em cũng bày tỏ lời cảm ơn tới công ty Techbio đã hỗ trợ kinh phí nghiên cứu và công ty Ong mật Đắc Lắc đã cung cấp các mẫu sữa ong chúa và phấn hoa trong nghiên cứu này

Hà nội, tháng 12 năm 2010

mục lục

Mở đầu 1

chương 1 Tổng quan 3

1.1 Sữa Ong chúa 3

1.1.1 Nguồn gốc và đặc điểm sữa ong chúa 3

1.1.2 Thành phần hoá học của sữa ong chúa 4

1.1.3 Thu hoạch sữa ong chúa 6

1.1.4 Tác dụng của sữa ong chúa 7

1.1.5 Một số kết quả nghiên cứu về thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của sữa ong chúa 8

1.2 Phấn hoa 12

1.2 1 Giới thiệu về phấn hoa 12

1.2 2 Cấu trúc của phấn hoa [1] 14

1.2 3 Thành phần hoá học của phấn hoa [51] 18

1.2.4 Cách thu hoạch phấn hoa 18

1.2.5 Tác dụng của phấn hoa ong 19

1.2 6 Lớp chất flavonoit, thành phần hoá học có trong phấn hoa 20

1.2.7 Một số kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của phấn hoa 21

Chương 2: Thực Nghiệm 24

2.1 Đối tượng và kỹ thuật thực nghiệm 24

2.1.1 Nguyên liệu 24

2.1.2 Hoá chất 24

2.1.3 Các dụng cụ và trang thiết bị nghiên cứu 24

2.2.1 Quy trình phân lập chất trong sữa ong chúa 31

2.2.2 Chiết mẫu phấn hoa và phân lập hợp chất 2 (7-O-β – naringenin) 35

Xyloside-Chương 3: Kết quả và thảo luận 37

3.1 Kết quả nghiên cứu về Sữa ong chúa 37

3.1.1 Hàm lượng protein trong sữa ong chúa 37

3.1.2 Kết quả phân tích thành phần axít amin từ sữa ong chúa 38

3.1.3 Kết quả xỏc định cấu trỳc hợp chất 1……… … 41

3.1.4 Kết quả thử hoạt tính độc tế bào 44

3.2 Kết quả nghiên cứu từ phấn hoa 45

3.2.1 Phân lập các dịch chiết 45

3.2.2 Kết quả xác định cấu trúc hợp chất 2 (7-O- β – Xyloside-naringenin) 45

3.2.3 Kết quả thử hoạt tính chống oxy hoá 52

Kết luận 55

Kiến Nghị 56

Tài liệu tham khảo 57

Danh môc viÕt t¾t

10- HDA: AxÝt 10-hydroxy-2-decenoic

C –NMR: Phæ céng h−ëng tõ h¹t nh©n proton 13 (

13C Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy)

H-NMR: Phæ céng h−ëng tõ h¹t nh©n proton (

H Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy)

Danh mục bảng

Bảng 1.3: Hàm lượng một số thành phần hoá học có trong phấn hoa Brazil

22

Chương 2

Chương 3

Bảng 3.3: Kết quả thử độc tính với tế bào ung thư biểu mô của sữa ong chúa

44

Danh môc h×nh

H×nh 1.3: C¸c dÉn xuÊt hydroxy vµ este cña 10 – HDA thu ®−îc tõ s÷a ong chóa

Ch−¬ng 2

Ch−¬ng 3

H×nh 3.8: Phæ UV – Pik 2 46

naringenin

52

Mở đầu

Như chúng ta đã biết, Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, độ ẩm cao trên 80%, lượng mưa lớn, nhiệt độ trung bình khoảng 15oC đến 27oC Đó là điều kiện rất thích hợp cho thực vật phát triển Do vậy hệ thực vật Việt Nam vô cùng phong phú, đa dạng với khoảng 12000 loài, trong đó có tới 4000 loài được nhân dân ta dùng làm thảo dược [2] Điều này thực sự có ý nghĩa quan trọng cho sự phát triển của ngành y dược, ngành hoá học và một số ngành khác Hệ thực vật phong phú trên được coi là tiền đề cho sự phát triển ngành hoá học các hợp chất thiên nhiên ở nước ta

Từ ngàn xưa, ông cha ta đã sử dụng nhiều phương thuốc dân gian từ cây cỏ để chữa bệnh, bồi bổ cơ thể hay tạo mùi thơm như lá tía tô để giải cảm, nhân sâm để tăng cường sức đề kháng, sả để tạo mùi thơm… Các phương thuốc y học cổ truyền đã thể hiện những mặt mạnh trong điều trị bệnh là ít độc tính và tác dụng phụ Do có nhiều ưu điểm như trên nên ngày nay con người ngày càng quan tâm đến các hợp chất có hoạt tính sinh học cao trong thực vật và động vật Về lâu dài đối với sự phát triển của các dược phẩm mới thì các hợp chất có hoạt tính sinh học đóng vai trò quan trọng, nó là khởi đầu cho việc tổng hợp các loại thuốc mới có tác dụng tốt hơn

Sữa ong chúa và phấn hoa là những sản phẩm thu được từ ong Sữa ong chúa được sản sinh từ tuyến hạch miệng của ong thợ Phấn hoa được ong thu về là tổng hợp của nhiều loài hoa của các loại thực vật khác nhau Cả hai sản phẩm đã được biết đến như những loại sản phẩm chức năng có nhiều tác dụng trong phòng chống lại nhiều loại bệnh tật khác nhau và tăng cường sức khoẻ Sữa ong chúa và phấn hoa là những sản phẩm có hoạt tính sinh học cao, chứa nhiều thành phần hoá học và có nhiều tác dụng dược lý

Việc nghiên cứu, khảo sát về thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của sữa ong chúa và phấn hoa ở Việt Nam nhằm đặt cơ sở khoa học cho việc

sử dụng chúng một cách hợp lý và có hiệu quả là rất quan trọng Do đó chúng

tôi đã chọn đề tài “Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học

của sữa ong chúa và phấn hoa” Việc nghiên cứu thành phần hoá học và cấu

trúc của các hợp chất cũng như hoạt tính sinh học từ sữa ong chúa và phấn hoa sẽ tạo cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực tìm kiếm các phương thuốc mới cũng như giải thích được tác dụng của các đối tượng nghiên cứu trên Do đó, các kết quả thu được sẽ là yếu tố quan trọng đóng góp cho nhân loại những phát hiện mới có ý nghĩa thực tiễn cũng như đóng góp cho sự phát triển nền y học dân tộc Việt Nam

chương 1 Tổng quan 1.1 Sữa Ong chúa

1.1.1 Nguồn gốc và đặc điểm sữa ong chúa

Sữa ong chúa là thức ăn duy nhất của ong chúa và các ấu trùng ong, được sản sinh từ tuyến hạch miệng của ong thợ [19] Sữa ong chúa có màu trắng sữa, hơi vàng, vị hơi chua Ong chúa sử dụng loại thức ăn này cả cuộc đời, còn những ấu trùng ong được ăn sữa ong chúa trong 3 ngày đầu của cuộc đời Chính vì thế mà gây ra sự khác biệt giữa ong chúa và ong thợ [16]: Tuổi thọ của ong chúa khoảng 5-6 năm, gấp 40 lần so với ong thợ là chỉ sống được từ 30-40 ngày Vào thời gian sinh sản, ong chúa có thể đẻ lên đến 2000 quả trứng trong 1 ngày (lớn hơn cả trọng lượng cơ thể của nó) Kích thước cơ thể của ong chúa lớn gấp rưỡi ong thợ, không có giỏ phấn hoa trên chân sau của mình và cũng không có tuyến sáp như ong thợ Vai trò của ong chúa là duy trì nòi giống và ổn định tổ chức trong tổ do vậy nó có hình dạng cơ thể thích hợp với vai trò đó Hình ảnh của sữa ong chúa và ấu trùng ong được trình bày ở hình 1.1 và hình 1.2

Hình 1.1: Sự phát triển của ấu trùng ong bởi sữa ong chúa [61]

Hình 1.2: Sữa ong chúa tươi [61]

Quá trình phát triển của ong chúa và ong thợ được trình bày ở bảng 1.1

Bảng 1.1: Quá trình phát triển của ong chúa và ong thợ

Ong chúa ngày 1-3 ngày 4-9 ngày 10-15 ngày 16 5-6 năm Ong thợ ngày 1-3 ngày 4-9 ngày 10-20 ngày 21 30-40 ngày

1.1.2 Thành phần hoá học của sữa ong chúa

Thành phần hoá học trong sữa ong chúa rất phong phú và đa dạng với hàm lượng khác nhau, gồm khoảng 60 -70% nước, 12-15% protein, 10-16% đường, 3-6% chất béo, còn lại là các vitamin, muối, và các axit amin tự do, enzyme… [14, 17, 40]

Sữa ong chúa thu hoạch ở mỗi vùng khác nhau thì tỉ lệ phần trăm các nhóm chất thu được cũng khác nhau, nhưng thành phần chính hầu như không thay đổi [6]

Nước: hàm lượng nước trong sữa ong chúa khá ổn định với những

nguồn thu hoạch ở nhiều nơi khác nhau, nó chiếm khoảng trên 60% và có hoạt độ (aw là lượng nước tồn tại trong sản phẩm hoặc vật chất) trên 0,92 mặc dù trong sữa ong chúa có sự xuất hiện đáng kể lượng ổn định vi sinh vật ở bên trong các tổ ong, sữa ong chúa liên tục được tạo ra bởi các chú ong thợ cùng với sự hút ẩm từ môi trường xung quanh và khả năng hoà tan của một số hợp chất Do đó độ ẩm trong sữa ong chúa hầu như không thay đổi

Protein: Theo một số quan điểm, protein chiếm khoản 27 – 41% là một

trong những phần quan trọng nhất của sữa ong chúa khô Các axit amin có mặt với hàm lượng phần trăm cao nhất là: prolin, lysin, axít glutamic, β-alanin, phenylalanin, aspartate và serin [11] Nồng độ của axít amin nhóm D rất ít,

trong điều kiện thuận lợi, một số enzym protein hoạt động liên tục kể cả khi sữa ong chúa được bảo quản một nơi cố định

Cacbonhydrat: Chiếm khoảng 30% trong sữa ong chúa khô

Lipit và axít 10-hydroxy-2-decenoic(10-HDA): Thành phần này xuất

hiện trong sữa ong chúa khá khiêm tốn chỉ khoảng 8-19% trong thành phần sữa ong chúa khô Nhưng không thể phủ nhận nó là thành phần quan trọng nhất của sữa ong chúa Trong thực tế, phần lipit bao gồm chủ yếu là các axít hữu cơ (chiếm khoảng 80-90%), hầu hết dưới dạng tự do, với cấu trúc hiếm gặp trong tự nhiên Thực tế chúng là các mono-, axít đihydroxy và axít đicacboxylic với 8 đến 10 nguyên tử các bon, có sự sắp xếp đặc trưng riêng [39]

Axít hydroxy với 10 nguyên tử các bon (như 10-HDA) có thể tìm thấy với nồng độ cao hơn tất cả các axít khác Nó không chỉ gây ra điểm khác biệt của sữa ong chúa (chỉ sữa ong chúa so với các sản phẩm khác từ ong mới có thành phần 10-HDA) mà nó còn được xác định là chất có hoạt động sinh học quan trọng gắn liền với chất lượng sản phẩm của sữa ong chúa [59] Hàm lượng 10-HDA được cho là chỉ tiêu để đánh giá độ tươi của sữa ong chúa Theo một nghiên cứu của nhóm tác giả người Pháp vào năm 2003 cho thấy lượng 10-HDA giảm từ 0,4-0,6% trong hai mẫu sữa ong chúa được lưu giữ ở nhiệt độ phòng trong vòng 12 tháng [7]

Các muối khoáng: chiếm khoảng 0,8-3% trong sữa ong chúa Các

khoáng chất này giảm dần theo thứ tự: K, Ca, Na, Mg, Zn, Fe, Cu và Mn

Các vitamin: Vitamin B- complex, vitamin B1 (thiamin), vitamin B2

(riboflavin), axit pantothenoic, biotin, niacin, axít folic, inositol, axetincolin, một lượng nhỏ vitamin C Các vitamin tan trong chất béo, A, D, E, K thường không có, hoặc nếu có hàm lượng cũng ít [24,33]

Bảng 1.2 Thành phần hóa học của sữa ong chúa [6]

Sữa ong chúa tươi Sữa ong chúa đã làm khô

1.1.3 Thu hoạch sữa ong chúa

Sữa ong chúa là một tặng phẩm thiên nhiên mà khoa học chỉ có thể phân tích, xác minh mà “không thể tái tạo” Do đó điều mà các nhà khoa học có thể làm là nghiên cứu cặn kẽ mọi sinh hoạt của loài ong để rồi lợi dụng vào đó lấy sản phẩm phục vụ con người

Trong công nghệ nuôi ong lấy mật con người đã vô tình nhưng may mắn biết cách tạo nhiều sữa ong chúa qua chu trình tạo ong chúa giống Ngày nay, sữa ong chúa được bán trên khắp thế giới chủ yếu là sản phẩm thu được

từ công nghệ nuôi ong Còn sữa ong chúa được lấy từ tự nhiên hầu như không được làm sản phẩm thương mại Sau đây là trình bày sơ lược về quy trình sản xuất và thu hoạch sữa ong chúa:

a Quy trình bắt cóc ong chúa

Là quy trình tạo ong chúa mới qua việc bắt đi ong chúa đang trong nhiệm kỳ Theo đặc tính của loài ong, để cho đàn ong được tồn tại, khi các chú ong thợ thấy mất đi ong chúa, chúng lập tức chọn một trong những ấu trùng ong thúc dưỡng để trở thành chúa Việc bắt cóc, biệt lập hay giết đi ong chúa đương nhiệm nhằm thúc đẩy ong thợ sớm chọn và thúc dưỡng nhiều ấu trùng ong để trở thành ong chúa Quy trình này chỉ thích hợp dưới dạng tiểu sản xuất, lượng sữa ong chúa thu được ít

b Quy trình làm giả tổ ong chúa

Là quy trình tạo hàng loạt tổ ong chúa bằng cách lấy enzym và những mùi vị từ tổ ong chúa đem trét vào những tổ mới đã chuẩn bị sẵn Mùi vị của các tổ ong giả đã đánh lừa các chú ong thợ Khi các chú ong thợ khám phá ra tổ ong đang bị trống chúng liền chọn lựa những con ấu trùng ong và thúc dưỡng để trở thành những con ong chúa mới Quy trình này hiện đại hơn so với quy trình bắt cóc ong chúa và mang nhiều tính khoa học hơn như việc lấy enzym, tạo mùi vị… Nhiều nhà sản xuất với quy mô dạng xuất khẩu, họ có thể tạo hàng loạt ấu trùng ong và đặt máy hút tự động tại các tổ ong chúa lúc còn là ấu trùng ong Sự hút sữa liên tục gây thiếu dinh dưỡng cho ấu chúa làm cho các ong thợ phải liên tục tiết ra sữa để nuôi ong chúa Do vậy con người thu được nhiều sữa ong chúa hơn

1.1.4 Tác dụng của sữa ong chúa

Từ xa xưa, con người đã biết sử dụng sữa ong chúa như một dạng thuốc bổ để bồi bổ sức khoẻ, chống lão hoá, làm đẹp da… Ngày nay, người ta vẫn tiếp tục nghiên cứu tìm hiểu tác dụng sữa ong chúa đối với con người Với

thành phần hoá học đa dạng phong phú nó có nhiều tác dụng tốt với cơ thể con người ở mọi lứa tuổi Sữa ong chúa giàu protein, chứa tất cả các axít amin thiết yếu, các axít béo cần thiết, đặc biệt là axít pantothenic (B-5) và pyridoxin (B-6), các khoáng chất và vitamin Sữa ong chúa còn chứa nhiều collagen; lecithin và các vitamin A, E… tất cả đều có lợi cho da [38] Nếu thoa sữa ong chúa lên da hàng ngày có thể làm da trắng mịn và chống viêm da [29, 33] Ngoài ra sữa ong chúa còn chứa nhiều hợp chất có thể làm giảm hàm lượng cholesterol Một đánh giá của các nghiên cứu trên cơ thể người kết luận rằng sử dụng 50-100mg sữa ong chúa mỗi ngày có thể giảm 14% cholesterol và 10% triglycerit [58] Sử dụng sữa ong chúa thường xuyên có thể ngăn ngừa và làm chậm sự phát triển của xơ vữa động mạch [15]

Sữa ong chúa chứa 10-HDA là một loại axít không no tự nhiên có thể ức chế các tế bào ung thư, cụ thể là ung thư máu và ung thư vú Nghiên cứu gần đây cho thấy rằng 10-HDA làm tăng khả năng miễn dịch hiệu quả 10- HDA có giá trị đáng kể trong lĩnh vực y tế và chăm sóc sức khoẻ

Trong một số công trình khoa học đã công bố, sữa ong chúa được báo cáo như một tác nhân làm thay đổi miễn dịch trong bệnh Badơdô [21] Nó cũng được báo cáo là có tác dụng đối với hệ thần kinh đệm [26] và các tế bào tuỷ sống trong hệ thần kinh [21]

Ngoài ra sữa ong chúa còn được sử dụng như một loại thực phẩm chức năng có khả năng chống mệt mỏi, chống dị ứng, chống lão hoá, chống vi khuẩn … [60] rất có lợi cho cơ thể của chúng ta Sữa ong chúa còn làm tăng khả năng sinh dục ở cả hai giới… Tóm lại, sữa ong chúa rất tốt cho cơ thể của con người, nếu dùng thường xuyên thì sẽ đem lại một sức khoẻ dẻo dai và phòng chống lại nhiều loại bệnh tật

1.1.5 Một số kết quả nghiên cứu về thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của sữa ong chúa

1.1.5.1 Một số kết quả nghiên cứu về thành phần hoá học của sữa ong chúa a Phân lập 10-HDA từ sữa ong chúa

• Năm 2005, Naoki Noda và các đồng nghiệp phát hiện ra trong dịch

chiết clorofom/metanol chứa nhiều axít béo có giá trị Bằng việc sử dụng phương pháp HPLC điều chế pha đảo với 70% CH3CN và 80% CH3CN, ông và các cộng sự đã tách được 10- HDA và một số dẫn xuất hydroxy béo, este của nó từ dịch chiết clorofom/metanol của sữa ong chúa [46] Sau đây là cấu trúc của 13 chất mà Naoki Noda và cộng sự đã xác định được (trong đó chất 1 là 10 –HDA, còn lại là các dẫn xuất hyđroxy và este của 10 – HDA)

Hình 1.3 Các dẫn xuất hydroxy và este của 10 – HDA thu được từ sữa ong chúa

chiết với CHCl3

chiết với CH3OHCosmosil 75C18-OPN

HPLC (70% CH3CN)

HPLC (80% CH3CN)

chiết với CHCl3/ CH3OH, 2:1 (v/v)chiết với CHCl3

chiết với CHCl3/ CH3OH, 2:1 (v/v)chiết với CHCl3

Silicagel Chiết với CH3OH Cosmosil 75C18-OPN

Chiết với CHCl3/ CH3OH, 2:1 (v/v)Chiết với CHCl3

Và dưới đây là quy trình phân lập ra các dẫn xuất hyđroxy và este của 10 –HDA trong sữa ong chúa Quy trình phân lập theo sơ đồ sau:

Cặn chiếtDịch chiết CHCl3

Sữa ong chúa đã được động khô

Dịch chiết CHCl3/CH3OH

Fr.I

Cặn chiếtDịch chiết CHCl3

Sữa ong chúa đã được động khô

Fr.II Dịch chiết

CHCl3/CH3OH

Fr.I

Cặn chiếtDịch chiết CHCl3

Sữa ong chúa đã được động khô

Lớp CH3OH lớp H2O

13

Phần kém phân cực

Fr.II Dịch chiết

CHCl3/CH3OH

Fr.I

Cặn chiếtDịch chiết CHCl3

Sữa ong chúa đã được động khô

1-6

Lớp H2O

13

Phần kém phân cực

Fr.II Dịch chiết

CHCl3/CH3OH

Fr.I

Cặn chiếtDịch chiết CHCl3

Sữa ong chúa đã được đông khô

• Năm 2009, Hiroko Tani và cộng sự cũng phân lập được 10-HDA và một số axít béo khác bằng phương pháp sử dụng chạy sắc ký cột thường và dùng HPLC điều chế [28]

b Phân lập các thành phần hoá học khác

- Năm 2003, Boselli và cộng sự sử dụng máy GC-MS đã xác định được các axit amin tự do trong sữa ong chúa Các axít amin xác định được là: prolin, lysin, glutamat, β-alanin, phenylalanin, aspartat and serin [11]

- Năm 1998, Schmitzova và cộng sự đã xác định được hơn 80% protein có trong sữa ong chúa là các protein chủ đạo (được gọi là major royal jelly proteins và thường được viết tắt là MRJPs) Năm 2009, Shougo Tamura và các cộng sự sử dụng HPLC và các phương pháp phân tích khác đã tách ra được các protein chính trong sữa ong chúa [50]

Hàm lượng nước trong sữa ong chúa tươi đã được xác định bởi Ferioli và các cộng sự [22] Năm 2006, Benfenati xác định được các khoáng chất có trong sữa ong chúa [10]

Ngoài ra còn rất nhiều công trình nghiên cứu về xác định các thành phần hoá học có trong sữa ong chúa [6]

1.1.5.2 Một số nghiên cứu về hoạt tính sinh học của sữa ong chúa trên thế giới

a Hoạt tính chống oxi hoá của sữa ong chúa

Trong một nghiên cứu của Aziza A., và cộng sự đã kết luận rằng sữa ong chúa có tiềm năng chống lại các nguy hiểm độc hại từ FB (chất được sản sinh từ nấm, là chất độc hại cho người và động vật) Nếu sử dụng sữa ong chúa sẽ làm giảm các thông số sinh hoá có lợi cho cơ thể của người và động vật, đồng thời cũng điều hoà được các phản ứng hoá học trên các mô của gan và

thận Nghiên cứu cũng khẳng định sữa ong chúa có đặc tính chống oxi hoá [8]

b Hoạt tính chống ung thư của sữa ong chúa

Cách đây khoảng vài chục năm, người ta đã bắt đầu nghiên cứu về hoạt tính chống u biếu của sữa ong chúa Vào năm 1959, trên tạp chí Nature Publishing Group, Gordon F., đã khẳng định sữa ong chúa có khả năng chống u biếu Nguyên nhân là vì trong sữa ong chúa có chứa nhiều loại axít béo, đặc biệt là 10-HDA

Trong một nghiên cứu khác vào năm 2005, L.A Salazar Olivo và cộng sự cũng đã khẳng định sữa ong chúa có hoạt tính sinh học đa dạng, nó có thể ảnh hưởng tới sự phát triển tế bào, có khả năng chống lại sự phát triển của các tế bào ung thư [35]

Năm 2003, Iwao Okamoto và cộng sự đã chỉ ra rằng trong sữa ong chúa có chứa các protein có khả năng chống dị ứng [31]

1.2 Phấn hoa

1.2 1 Giới thiệu về phấn hoa

Phấn hoa là tế bào sinh dục đực của hoa, cần thiết cho việc thụ phấn của các loài thực vật có hoa Các hạt phấn hoa có kích thước nhỏ, đường kính khoảng 15 đến 100 àm [47] Chúng được hình thành ở đỉnh của các nhị hoa là trung tâm của các hoa Tế bào phấn hoa không những là cơ sở vật chất di truyền của thực vật, là “tinh tử” của thực vật, là thai nghén của sự sống, mà còn chứa toàn bộ dinh dưỡng tốt nhất trong thực vật Dưới đây là hình ảnh một số loại phấn hoa

a) Hạt phấn hoa Cỏ b) Phấn hoa của cây Sồi.

c) Hạt phấn hoa Bạch Dương d) Hạt phấn hoa Chuối

Hình 1.5: Hình ảnh của một số loại phấn hoa dưới kính hiển vi điện tử quét [62]

Phấn hoa có thể chia làm hai loại [1]:

- Thứ nhất, phấn hoa gió là phấn hoa được phát tán đi nhờ gió - Thứ hai, phấn hoa được phát tán nhờ côn trùng (trong đó có ong) Ong là loài vật được con người để ý tới và đã dùng làm vật nuôi kinh tế Mật ong và sữa ong chúa có nhiều tác dụng đã được nhiều nghiên cứu khẳng định Gần đây người ta đã bắt đầu nghĩ đến việc nghiên cứu về phấn hoa vì phấn hoa là nguồn thức ăn của ong nên sẽ có những tính chất giống sữa ong chúa và mật ong Nguồn phấn hoa được thu từ ong mật dễ dàng hơn thu các côn trùng khác Hiện nay ở nước ta có rất nhiều vùng nuôi ong như Sơn La,

Đắc Lắc… ngoài việc thu mật ong và sữa ong chúa ra, người ta còn lợi dụng để thu phấn hoa ong Tuỳ mỗi vùng khác nhau mà thành phần hoá học trong phấn hoa khác nhau

1.2 2 Cấu trúc của phấn hoa [1]

Phấn hoa là phần trên các nhị hoa (chứa giao tử đực) của thực vật có hoa Kiểu chung nhất của nhị đực ở thực vật hạt kín là gồm bao phấn gồm hai túi phấn hay là túi tiểu bào tử được đính liền trên một cuống có gân mảnh là chỉ nhị Mỗi túi phấn có các lớp vách và ô phấn trong đó các tiểu bào tử được tạo nên Bao phấn của đa số thực vật hạt kín có bốn túi bào tử, nghĩa là mỗi thuỳ bên có hai ô phấn, ở một số ít cây có bao phấn với hai ô phấn, trong đó mỗi ô phấn ở một nửa bao phấn ở trạng thái trưởng thành trước khi bao phấn mở, phần giữa các ô phấn có thể bị vỡ ra và bằng cách đó mà bao phấn bốn túi bào tử giống như hai ô, còn bao phấn hai túi bào tử thì như là bao phấn một ô

Một số cây hai lá mầm nguyên thuỷ có nhị đực hình lá, ba gân mang các túi bào tử ở mặt lưng giữa gân giữa và các gân hai bên Các nhị đực một gân là dạng tiến hoá và đến nay có đến 95% thực vật hạt kín có nhị đực một gân Cấu trúc hạt phấn hoa được mô tả trong hình 1.6

Chỉ nhị đực có cấu tạo tương đối đơn giản Mô mềm bao quanh bó mạch, bó mạch kiểu phloem bao quanh Bó mạch kéo dài suốt chỉ nhị và kết thúc ở gốc bao phấn hoặc trong mô trung đới ở giữa hai nửa của bao phấn

Bao phấn thường được mở ra ở nhiều loài bao phấn được mở ra bởi đường nứt của các vách giữa các ô, về sau mô phía ngoài của vùng đó mà đôi khi chỉ là một lớp biểu bì cũng bị vỡ và hạt phấn tung ra ngoài Lớp dưới biểu bì có đường dày thứ cấp có dạng đai góp phần làm mở bao phấn do sự co khác nhau khi bao phấn khô Một số loài bao phấn có thể mở bằng lỗ ở phía bên hoặc ở tận cùng của bao phấn

Túi phấn và hạt phấn:

Nhị đực hay lá tiểu bào tử mang các túi phấn hay túi tiểu bào tử để hình thành nên hạt phấn hay là tiểu bào tử Túi tiểu bào tử gồm các mô sinh bào tử mà về sau là tiểu bào tử trong các ô của túi phấn có vỏ bọc bao quanh ở trạng thái một thuỳ phân sinh của túi phấn những lần phân chia đầu tiên đã hình thành nên các tế bào sinh bào tử sơ cấp ở phía trong và các lớp thứ cấp bao quanh ở phía ngoài Lớp ngoài cùng phân chia tạo nên ba lớp: Lớp trong (endothecium) ở phía dưới biều bì, lớp giữa và lớp dinh dưỡng (tapetum) ở trong cùng

Hình 1 6: Cấu trúc hạt phấn [63]

Trong khi các lớp vách được hình thành thì những tế bào sinh bào tử sơ cấp phân chia hoặc chuyên hoá như tế bào mẹ của bào tử Các tế bào này tiến hành giảm phân và hình thành nên tiểu bào tử đơn bội Các tế bào mẹ của tiểu bào tử được gọi là tế bào mẹ của hạt phấn vì rằng hạt phấn ở trạng thái một nhân là tiểu bào tử

Vách túi phấn:

Lớp dinh dưỡng là lớp chuyên hoá phát triển đồng thời với mô sinh bào tử ở dưới đó Lớp dinh dưỡng nằm bao quanh ô phấn Tế bào của lớp này có chất tế bào đông đặc trước khi phát sinh bào tử và có thể là đa bội hoặc nhiều nhân Lớp này như tên gọi cung cấp dinh dưỡng cho hạt phấn phát triển Có hai kiểu lớp dinh dưỡng: lớp tiết (tuyến tiết) và lớp amíp (chất nhầy) Lớp tiết gặp ở các họ thực vật hạt kín nhiều hơn là lớp amíp Sau quá trình giảm phân, lớp tiết bắt đầu bị phân huỷ Vách tế bào của chúng bị hoà tan và chất tế bào được tung vào trong ô của túi phấn và tạo thành lớp áo bao quanh các hạt phấn Lipit là thành phần chính của lớp này

Trong lớp dinh dưỡng kiểu amíp thì chất nguyên sinh vẫn được giữ lại khi vách của chúng bị hoà tan và chen vào các hạt phấn đang phát triển Chất nguyên sinh dính với nhau quanh ô phấn tạo thành thể nguyên hình bao quanh Chất nhầy (thể nguyên hình) này tiếp tục kết dính với các hạt phấn cho đến khi hạt phấn chín Trong thời gian bao phấn khô, trước khi hoa nở một thời gian ngắn chất nhầy bị mất nước và lắng đọng trên bề mặt hạt phấn

Lớp giữa thường là một lớp sớm bị tiêu huỷ và bị ép dẹp giữa lớp dinh dưỡng và lớp trong, cuối cùng bị lớp dưới đó hấp thụ

Lớp trong là lớp chủ yếu của vách bao phấn thực vật hạt kín ngoại trừ những bao phấn mở bằng lỗ Đặc điểm của lớp này là có đường dày thứ cấp thành đai hay thành dải Tại vùng bao phấn mở (stomium), đường dày thứ cấp của lớp trong không phát triển Do đặc điểm của đường dày ở lớp trong mà lớp này có tên gọi là lớp sợi

Hạt phấn:

Hình thái của hạt phấn cũng giống như bào tử của thực vật khuyết hạt nổi bật là vách của nó với các đặc điểm kiến trúc bề mặt theo các kiểu rất khác nhau cũng như sự bền vững rất cao về tổ chức, hoá học và sự phát triển Vách hạt phấn hay vỏ hạt phấn điển hình gồm một lớp vỏ ngoài (sexine) và

một vỏ trong (nexine) Lớp màng ngoài là lớp có kiến trúc bề mặt lớp này đính với màng trong bởi các que

Hạt phấn có các lỗ, tức là những vùng có phần vỏ ngoài mỏng qua đó ống phấn nảy mầm và làm cho hạt phấn tăng khối lượng khi thay đổi độ ẩm Lỗ có thể tròn (hạt phấn có lỗ tròn-porus) hoặc bình thường (hạt phấn có rãnh dài-colpus) và với số lượng thay đổi Hình ảnh hạt phấn được mô tả hình 1.7 dưới đây

Hình 1.7: Cấu tạo hạt phấn hoa [63]

Thành phần hoá học của vỏ hạt phấn là chất sporopollenin gồm các

polyme oxy hoá của carotenoit và các este của carotenoit Sporopollenin đặc

biệt bền vững với nhiều hoá chất, nhiệt độ cao và các yếu tố phân huỷ tự nhiên khác Chính vì vậy mà nó bảo vệ hạt phấn hoa tồn tại được trong thời gian dài ở các điều kiện khắc nghiệt khác nhau trong khi các bộ phận của thực vật khác đã bị phân huỷ ở cùng điều kiện Silicon, chất có trong vỏ ngoài của hạt phấn một số cây hai lá mầm làm tăng thêm tính bền vững cho vỏ hạt phấn qua các biến đổi khí hậu địa chất cũng như sự phân huỷ sinh học

Hạt phấn hoa có nhiều hình dạng (thường là hình cầu), kích cỡ và dấu hiệu bề mặt đặc trưng tuỳ từng loài Kích thước hạt phấn hoa nhỏ nhất có

đường kính là 6 àm (ở loài lưu ly), còn những hạt phấn hoa được phát tán nhờ gió thì kích thước đường kính có thể lên tới 90-100 àm [47]

1.2 3 Thành phần hoá học của phấn hoa [51]

Thành phần hoá học của phấn hoa phụ thuộc vào nguồn gốc và vị trí địa lý của giới thực vật mà ong thu về Nhìn chung phấn hoa chứa rất nhiều chất, có giá trị dinh dưỡng cao, giàu chất đường, protein, lipit, vitamin, flavonoit, carotenoit…[23, 55]

- Vitamin [30]: Provitamin A, B-1 thiamin, riboflavin B-2, B-3 Nancin,

B-5, B-6 Pyridoxin, B-12 (cyanocobanamine), axit pantothenic, vitamin C, F, D, vitamin E, vitamin H, vitamin K, vitamin PP, axit folic, cholin, Inositol, Rutin…

- Khoáng chất: Ca, P, K, Fe, Cu, I, Zn, S, Na, Cl, Mg, Mn, Mo, Se, Bo,

Si, Ti…

- Phấn hoa chứa ít nhất 22 axít amin, 18 vitamin, 25 khoáng chất, 59 nguyên tố, 11 enzim hoặc đồng enzim, 14 axit béo, 11 cacbonhiđrat và protein khoảng 25% Hàm lượng caroten cao [36] Phấn hoa ong chứa hàm lượng protein cao trong khi hàm lượng chất béo thấp

1.2.4 Cách thu hoạch phấn hoa

Trong quá trình đi tìm mật, ong đem các hạt phấn hoa về tổ bằng chân sau cùng với sự giúp đỡ của lông trên cơ thể Phấn hoa sẽ được ong cất trong một hang riêng rẽ với các ô mật hoa Con người thu hoạch phấn hoa bằng cách đặt một cái bẫy trước tổ ong Khi bay về tổ, ong phải chui qua bẫy và hạt phấn đã rơi ra, con người thu lại [9, 20, 34, 43] Hình 1.8 dưới đây thể hiên hạt phấn hoa được thu bằng hai chân sau của con ong thợ

Hình 1.8: Ong thu hạt phấn hoa

1.2.5 Tác dụng của phấn hoa ong

Phấn hoa ong được hình thành từ những hạt phấn hoa tự nhiên trộn với dịch được tiết ra từ mật ong và ong, chứa nhiều chất có đặc tính quý, đóng vai trò quan trọng với đời sống của con người Các ứng dụng của phấn hoa được nghiên cứu trong nhiều lĩnh vực

Từ xa xưa con người đã biết sử dụng phấn hoa với những đặc tính và dược tính của nó Phấn hoa ong có tất cả các thành phần thiết yếu của cuộc sống, cung cấp nhiều loại vitamin và khoáng chất, các loại axít amin [12] Nó có thể bổ sung hoặc cân bằng chất dinh dưỡng trong các cơ quan, nâng cao sức sống, kéo dài tuổi thọ, phục hồi bệnh mãn tính, phòng chống và tăng cường cho hệ tiêu hoá… Đến nay chưa có bằng chứng khoa học nào bác bỏ các công bố tác dụng của phấn hoa đối với con người [13]

Trong y học, phấn hoa được sử dụng rất rộng rãi Theo đông y, phấn hoa thường để chữa các chứng như:

- Hoa mắt, chóng mặt, đau lưng, mỏi gối - Mất ngủ, ăn kém, tiểu đêm nhiều lần - Mệt mỏi rã rời, bồn chồn bực bội

- Dùng trong sức khoẻ tình dục như: suy giảm tình dục, liệt dương, di tinh, xuất tinh sớm, muộn con, tắt kinh sớm…

Ngày nay, nhiều nghiên cứu cho thấy phấn hoa có tác dụng chống một số bệnh như: tăng huyết áp, xơ vữa động mạch, đái tháo đường, viêm dạ đày, viêm gan…

Một đặc điểm quan trọng mà hiện nay người ta đã và đang nghiên cứu đó là khả năng chống oxy hoá và chống ưng thư của phấn hoa [53] Trong thành phần hoá học của phấn hoa có chứa flavonoit là lớp chất có khả năng chống oxi hoá mạnh [42]

1.2 6 Lớp chất flavonoit, thành phần hoá học có trong phấn hoa

1 2.6 1 Giới thiệu chung [ 5, 25, 27,44, 54]

Các flavonoit là lớp chất phổ biến có trong thực vật Chúng là hợp chất có cấu tạo gồm hai vòng benzen A, B được kết nối bởi một dị vòng C với khung cacbon C6-C3-C6

Các flavonoit là dẫn xuất của 2 – phenyl chroman (flavan)

Các flavonoit có ở trong tất cả các bộ phận của cây long nha thảo, bao gồm quả, phấn, hoa, rễ … Một số flavonoit có hoạt tính sinh học thể hiện ở khả năng chống oxi hoá

B A

C

Hình 1 9: Flavan (2 – phenyl chroman)

1.2.6.2 Các nhóm flavonoit [ 5, 25, 27, 44, 54]

a Flavon và flavonol: Flavon và flavonol rất phổ biến trong tự nhiên

Công thức cấu tạo của chúng chỉ khác nhau ở vị trí cac bon số 3

b Flavanon: Các flavanon nằm trong cân bằng hỗ biến với các chalcon

do vòng dihydropyron của flavanon kém bền nên dễ xảy ra mở vòng chuyển thành chalcon

c Flavanonol-3: Có hai nguyên tử cac bon bất đối là C-2 và C-3 nên

chúng có tính quang hoạt Các hợp chất thường gặp là aromadendrin, fustin và taxifolin

d Chalcon: Chalcon có thể bị đồng phân hoá thành flavanon khi đun

nóng với axit clohydric (HCl)

e Auron: Có màu vàng đậm và không tạo màu khi thực hiện phản ứng

shinoda

f Anthoxianidin: Thường gặp trong tự nhiên ở dạng glycozit dễ tan

trong nước Màu sắc của nó thay đổi theo pH

g Leucoantoxianidin: Các hợp chất này mới chỉ tìm thấy ở dạng

aglycon, chưa tìm thấy ở dạng glycozit

h Catechin: Catechin là các dẫn xuất flavan-3-ol Do có 2 trung tâm

cacbon bất đối nên chúng tồn tại dưới dạng 2 cặp đồng phân đối quang

i Isoflavonoit: Bao gồm các dẫn xuất của 3-phenyl chroman

j Rotenoit và neoflavonoit: Các rotenoit có quan hệ chặt chẽ với các

isoflavon về mặt cấu trúc cũng như sinh tổng hợp

1.2.7 Một số kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của phấn hoa

1.2.7.1 Một số kết quả nghiên cứu về thành phân hoá học của phấn hoa

Năm 1993, bằng các phương pháp sắc kí cột với các hệ dung môi phù hợp mà Jean - Claude Dauguet và cộng sự đã phân lập các hợp chất flavonoit từ phấn hoa là: aglycone 8-methoxykaempferol (sexangularetin); flavonoit glycozit sexangularetin 3-glucozit, sexangularetin 3-neohesperidoside và kaempferol3-neohesperidoside [32]

Năm 2005, L.B Almeida-Muradian và cộng sự đã đưa ra được một số thành phần hoá học có trong phấn hoa Brazil như sau [36]:

Bảng 1.3 Hàm lượng một số thành phần hoá học có trong phấn hoa Brazil [36]

Phấn hoa tuơi Phấn hoa khô

1.2.7.2 Một số kết quả về hoạt tính chống oxi hoá của phấn hoa

Năm 2007, Các nhà khoa học Mexico đã nghiên cứu về hoạt tính chống oxi hoá của phấn hoa Kết quả thu được cho thấy phấn hoa là một tác nhân chống oxi hoá tự nhiên vì có chứa hàm lượng flanonoit cao Họ cũng đã kết luận rằng phấn hoa có hoạt động chống oxi hoá có liên quan đến nồng độ

flavonol, nếu ở nồng độ cao thì phấn hoa có tác dụng chống oxi hoá mạnh mẽ [37]

Năm 2009, Ana Saric và cộng sự cũng đã khẳng định rằng, trong phấn hoa có chứa hàm l−ợng flavonoit cao Mặc dù flavonoit có khả năng hấp thu kém trong cơ thể, nh−ng sau khi hấp thu vào máu chúng nhanh chóng chuyển hoá ở ruột và gan, trở thành chất chống oxi hoá hoạt động mạnh hoặc ngăn chặn các gốc tự do có độc tính, chống sự căng thẳng

- Phấn hoa được công ty cổ phần Ong mật Đắc Lắc cung cấp Mẫu trước khi đem nghiên cứu được bảo quản khô trong tủ nơi thoáng mát và tránh ánh sáng

2.1.2 Hoá chất

- Dung môi hữu cơ: Axeton, điclometan, etannol, etylaxetat, n-hexan, metanol, clorofom… Các dung môi này đều là hoá chất công nghiệp Trung Quốc Trước khi sử dụng các dung môi đều được làm khan và chưng cất lại Sau đó pha hệ dung môi theo tỷ lệ phù hợp với yêu cầu sử dụng trong sắc ký Dùng đũa thuỷ tinh khuấy cho các dung môi trộn đều vào nhau rồi đưa lên chạy cột Nếu chạy sắc ký lớp mỏng thì phải đợi dung môi đến khi bão hoà mới được sử dụng

- Hoá chất khác: ADC, RB, H2O2 0,2N, Indigo 0,1N, DMSO 20 mg/ml, Natriaxetat, TCA, Abumin huyết thanh bò, OPA, FMOC, HCl, Phenol, H2SO4, vanilin, CeSO4, các dung môi chuẩn cho HPLC

2.1.3 Các dụng cụ và trang thiết bị nghiên cứu

Dụng cụ và trang thiết bị nghiên cứu được trình bày ở bảng 2.1

B¶ng 2.1: C¸c dông cô vµ thiÕt bÞ nghiªn cøu

- B¶n máng tr¸ng s½n TLC (AluO, silica Gel

Silica Gel 60, 0,04-0,063 mm mesh size Merck Sephadex LH 20,25 – 100 mm mesh size Merck Metanol for HPLC, MeOH LiChrosolv HPLC Merck

Detector: Photodiode Array Detector UVD 340 S

Column thermostat: STH 585 Autosampler: ASI-100T HPLC/MS – Aglient 1100 ThermoFinnigan LCQ Deca M¸y quay cÊt ch©n kh«ng Büchi Rotavap RE111

2.1.4 C¸c ph−¬ng ph¸p ph©n tÝch, ph©n t¸ch vµ ph©n lËp c¸c hîp chÊt

a C¸c ph−¬ng ph¸p chiÕt mÉu

* Chọn dung môi chiết

Thường thì các chất chuyển hoá thứ cấp trong thực vật có độ phân cực khác nhau Tuy nhiên những thành phần tan trong nước ít khi được quan tâm Dung môi dùng cho quá trình chiết cần phải được lựa chọn rất cẩn thận Điều kiện của dung môi là phải hoà tan được những chất chuyển hoá thứ cấp đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng với chất nghiên cứu), không độc, không dễ bốc cháy Những dung môi này nên được chưng cất để thu được dạng sạch trước khi sử dụng

Sau khi chiết dung môi được cất ra bằng máy cất quay ở nhiệt độ không quá 400- 450C, với một vài hoá chất chịu nhiệt có thể thực hiện ở nhiệt độ cao hơn

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC – Alufolien 60 F254 (Merck) Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 368 nm hoặc dùng thuốc thử, sấy khô hơ nóng trên bếp điện từ từ đến khi hiện màu

Cách đưa chất lên TLC: Lấy một lượng nhỏ mẫu chất hoà tan bằng 2-3 giọt dung môi thích hợp, sau đó dùng capila chấm chất lên lớp mỏng

Dung môi: Pha hệ dung môi thích hợp, lắc kỹ cho các dung môi trộn đều nhau trong hệ rồi cho vào bình khai triển đáy bằng có nắp nhám Đậy nắp lại và đợi đến khi dung môi bão hoà thì cho bản mỏng vào chạy

Chất cần phân tách bằng sắc ký cột được hoà tan trong dung môi, thêm một lượng nhỏ chất hấp phụ Trộn đều hỗn hợp và làm bay hơi hết dung môi thu được hỗn hợp ở dạng bột tơi Khi đưa chất lên cột chất hấp phụ phải dàn đều và dùng bông thuỷ tinh phủ lên bề mặt chất

Nhồi cột sắc ký theo phương pháp nhồi khô hoặc nhồi ướt, trong quá trình nhồi cột phải loại bỏ triệt để các bọt khí bằng cách cho dung môi chảy qua cột nhiều lần và gõ nhẹ vào thân cột Khi cột đã ổn định có thể tiến hành chạy sắc ký cột

* Sắc ký lỏng hiệu năng cao – phân tích (HPLC – phân tích)

Đối với kỹ thuật HPLC phân tích, hiệu năng phân tách đạt được dựa trên việc sử dụng bơm áp suất cao để đẩy dung môi pha động qua cột sắc ký Kỹ thuật phân tích HPLC được sử dụng để nhận dạng các pic từ các dịch chiết hoặc các phân đoạn Các thành phần khác nhau được đưa qua cột với các tốc độ dòng tuỳ theo sự phân bố giữa dung môi pha động và pha tĩnh Hệ dung môi được dùng dưới dạng gradient là MeOH : nước (nanopure) có sử dụng đệm pH=2 bằng axít photsphoric với sự tăng dần của MeOH đến 100% trong

thời gian 45 phút Các hợp chất được phát hiện bằng UV- VIS diode array detector

* Sắc ký lỏng hiệu năng cao - điều chế (HPLC – preparative)

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao điều chế là phương pháp hiện đại nhất để phân lập các hợp chất có độ phân cực cao đối với các phân đoạn đã qua xử lý bằng các cột sắc ký thích hợp Các hợp chất được phát hiện trên UV – VIS diode array detector

2.1.5 Các phương pháp các định cấu trúc hoá học các hợp chất

* Phổ khối lượng (ESI – MS)

Phổ khối lượng phun mù điện tử (Electronspray Ionization Mass Spectra) được đo trên máy AGILENT 1100 LC – MSD trap của Viện Hoá học,Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

* Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): 1H- NMR (500MHz) và 13C-NMR (125 MHz) được đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer, Viện Hoá học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

* Tiến hành

ODđốí chứng (-)- ODmẫuODđối chứng (-)- ODđốichứng(+)

- Máu tươi được chống đông bằng ADC (Citrat dextrozơ adenin), pha loãng 1/500 lần bằng dung dịch NaCl 0.9%

- Phản ứng bao gồm:

+ 50àl đệm natri axetat 0,1N có pH 4,7 + 10 àl mẫu pha trong DMSO và đệm + 60 àl enzym pha loãng 500 lần + 60 àl H2O2 0,2N hay 2% + 20 àl indigocacmin 0,001N + 50 àl TCA 20%

- Giếng đối chứng âm không có enzym, không có chất khử, giếng đối chứng dương enzym hoạt động 100%, không có chất khử

- Để thời gian phản ứng 20-25 phút ở nhiệt độ phòng, dừng các phản ứng bằng TCA Đọc kết quả ở bước sóng 600 nm Dùng chất tham khảo là Resveratrol IC50 = 5,24 àg/ml

* Xử lý kết quả

Tính hoạt động của enzym peroxydaza được tính theo công thức sau:

AE% = 100%

ODmẫu - ODđớí chứng (+)ODđối chứng (-)- ODđốichứng(+)

Phần trăm kìm hãm hoạt động của enzym được tính bằng công thức: IC =100% - AE%

Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50%) được tính dựa trên tương quan của nồng độ chất thử và giá trị IC được tính theo công thức trên

b Phương pháp xác định hoạt tính ung thư

Dòng tế bào ung thư được nuôi cấy trong môi trường nuôi cấy phù hợp có bổ sung thêm 10% huyết thanh phôi bò (FBS) và các thành phần khác ở điều kiện tiêu chuẩn Dòng tế bào ung thư biểu mô KB (Human epidermic carcinoma) ở người được cung cấp bởi ATCC

C, 5% CO2 trong 3 ngày, thêm 50 àl MTT, ủ 370C trong 4 giờ

+ Loại bỏ môi trường, thêm 10 àl DMSO lắc đều, đọc kết quả ở bước sóng 540 nm trên máy Spectrophotometer Genios Tecan

Phần trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào:

IC50=

Giá trị IC50 được tính dựa trên kết quả số liệu phần trăm kìm hãm (IC50)

sự phát triển của tế bào bằng phần mềm máy tính table curve

2.2 Quy trình phân lập chất trong sữa ong chúa và phấn hoa

2.2.1 Quy trình phân lập chất trong sữa ong chúa

2.2.1.1 Xác định hàm lượng protein * Nguyên tắc

Xác định hàm lượng protein trong sữa ong chúa bằng phương pháp Bradford là phương pháp phổ biến nhất và có độ nhạy cao Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thụ cực đại của thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức với protein Trong dung dịch mang tính axit, khi chưa kết nối với protein thì thuốc nhuộm có bước sóng hấp thụ cực đại 465 nm; khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp thụ cực đại ở bước sóng 595 nm Độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm có liên hệ một cách trực tiếp tới nồng độ protein

Hình 2.1: Công thức của phân tử Coomassie Brilliant Blue

* Phương pháp tiến hành

Trước tiên xây dựng một đường chuẩn với dung dịch protein chuẩn đã biết trước nồng độ Dung dịch protein chuẩn là albumin huyết thanh bò Sau khi cho dung dịch protein vào dung dịch thuốc nhuộm, màu sẽ xuất hiện sau 2 phút và bền tới 1 giờ Tiến hành đo dung dịch bằng máy quang phổ kế ta được