2.2.1.1 Xác định hàm l−ợng protein * Nguyên tắc
Xác định hàm l−ợng protein trong sữa ong chúa bằng ph−ơng pháp Bradford là ph−ơng pháp phổ biến nhất và có độ nhạy cao. Ph−ơng pháp này dựa trên sự thay đổi b−ớc sóng hấp thụ cực đại của thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức với protein. Trong dung dịch mang tính axit, khi ch−a kết nối với protein thì thuốc nhuộm có b−ớc sóng hấp thụ cực đại 465 nm; khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp thụ cực đại ở b−ớc sóng 595 nm. Độ hấp thụ ở b−ớc sóng 595 nm có liên hệ một cách trực tiếp tới nồng độ protein.
Hình 2.1: Công thức của phân tử Coomassie Brilliant Blue
* Ph−ơng pháp tiến hành
Tr−ớc tiên xây dựng một đ−ờng chuẩn với dung dịch protein chuẩn đã biết tr−ớc nồng độ. Dung dịch protein chuẩn là albumin huyết thanh bò. Sau khi cho dung dịch protein vào dung dịch thuốc nhuộm, màu sẽ xuất hiện sau 2 phút và bền tới 1 giờ. Tiến hành đo dung dịch bằng máy quang phổ kế ta đ−ợc
ODx, độ hấp thụ sẽ tỷ lệ với l−ợng trong mẫu. Thực hiện một đối chứng với n−ớc cất (OD0). Lấy giá trị OD = ODx – OD0. L−ợng protein mẫu trong dung dịch đo đ−ợc xác định bằng cách chấm trên đ−ờng chuẩn theo OD, lấy giá trị của điểm đó trên trục hoành. Đó chính là hàm l−ợng Protein mẫu trong dung dịch đo.
Dựng đ−ờng chuẩn Albumin:
- Pha loãng dung dịch albumin gốc 10% ra nồng độ 0.1% và cứ tiếp tục pha loãng 2 lần thu đ−ợc các nồng độ: 0,1%, 0,05%, 0,025%, 0,0125%, 0,00625%, 0,003125%.
- Cho 90 àl dung dịch thuốc thử Bradford vào các giếng trên đĩa 96 giếng.
- Tiếp tục cho 10 àl albumin đã pha loãng, tính thời gian, mỗi nồng độ lặp lại hai lần
- Sau 5 phút, tiến hành đo độ hấp thụ của dung dịch ở b−ớc sóng 595 nm
- Tiến hành xây dựng đ−ờng tuyến tính giữa nồng độ albumin chuẩn và giá trị OD595
Tiến hành t−ơng tự đối với mẫu sữa ong chúa cần định l−ợng protein: - Cân 6 mg sữa ong chúa và hoà tan trong 6 ml n−ớc cất.
Đồ thị thể hiện mối t−ơng quan giữa nồng độ protein và OD595 đ−ợc trình bày ở hình 2.2.
y = 0.0034x + 0.0069 R2 = 0.9881 y = 0.0034x + 0.0069 R2 = 0.9881 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0 20 40 60 80 100 120 Series1 Linear (Series1)
Hình 2.2 : Đ−ờng chuẩn t−ơng quan giữa nồng độ protein và OD595
Nh− vậy ph−ơng trình biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ Protein và giá trị OD là: Y = 0.0034X + 0.0069
2.2.1.2 Ph−ơng pháp phân tích axit amin * Nguyên tắc
- Các ph−ơng pháp phân tích axít amin dựa trên nguyên lý: Thuỷ phân protein thành peptit, dẫn xuất hoá và phân tích các dẫn xuất axít amin.
- Độ chính xác của việc phân tích phụ thuộc vào tính lặp lại của ph−ơng pháp mà còn phụ thuộc vào hiệu quả của phản ứng phân cắt và quá trình dẫn xuất hoá.
- Ph−ơng pháp này sử dụng OPA (o-phthaldialdehyd) và FMOC ( 9- Fluorenylmethyl chloroformate) tạo dẫn xuất của chúng trên hệ HP aminoquant series II. OPA là một chất không phát quang nh−ng kết hợp với axít amin bậc một tạo nên isoindoles có khả năng phát quang cao. Còn chất FMOC có khả năng phản ứng nhanh với các axít amin, dễ tạo sản phẩm phát quang bền vững.
- Sử dụng ph−ơng pháp thuỷ phân mẫu sữa ong chúa bằng HCl 6N có chứa 0.5% phenol ở điều kiện 110°C và 24 giờ. Sau khi thuỷ phân xong làm sạch dung dịch bằng ly tâm và lọc bỏ tủa.
- Sau đó lấy một l−ợng dung dịch mẫu đem đi cô bằng máy speed vac đến khô.
- Cặn khô đ−ợc hoà tan bằng HCl 0.1N để chuẩn bị cho lên cột sắc kí. - Mẫu lọc sạch đ−ợc cho vào ống microvial cùng với axit amin chuẩn nồng độ 250 pmol. Dẫn xuất hoá tiền cột đ−ợc tiến hành tự động theo trình tự: đệm borat, OPA, FMOC, trộn đều, bơm vào cột. Quá trình sắc kí đ−ợc tiến hành tự động ở 40°C.
2.2.1.3 Chiết mẫu sữa ong chúa và phân lập axít 10 – HDA
- Mẫu sữa ong chúa (30g) đã đ−ợc sấy đông khô để loại n−ớc rồi tiến hành chiết siêu âm trong CH2Cl2; CH2Cl2:MeOH (2:1) và MeOH.
- Loại dung môi thu đ−ợc các cặn cần thiết.
- Chạy sắc kí cột sử dụng Sephadex LH-20; silicagel 0,04-0,06 mm. Các phân đoạn sau khi tách ra đ−ợc kiểm tra bằng HPLC phân tích ở b−ớc sóng 214 nm để định h−ớng tinh chế tiếp, cuối cùng thu đ−ợc hợp chất 1 (10 – HDA) ở dạng vô định hình mầu trắng.
* Dữ kiện phổ của chất 1 (10-HDA)
ESI-MS m/z: [M+H]+ 186,8; kết quả tính toán lí thuyết cho công thức C10H18O3.
1
H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ (ppm) 5,81 (dt; 1,5 Hz; 17Hz, H-2), δ
6,97 (dt; 7Hz; 17Hz; H-3); δ 3,56 (t; 6,5 Hz; H-10); δ 2,25 (t; H-4); δ 2,30 (H- 9), δ 1,55(m, H-5, H-6) và δ 1,50 (m, H-7, H-8).