a.Ph−ơng pháp xác định hoạt tính chống ôxy hóa * Nguyên tắc
Dựa trên cơ sở xác định hoạt động của enzym peroxydaza máu ng−ời xúc tác cho phản ứng oxi hoá indigocacmin khi có mặt H2O2 trong môi tr−ờng axít yếu. Hoạt động của enzym đ−ợc đánh giá bằng việc làm giảm màu của indigocacmin và đ−ợc đo hấp thụ ở b−ớc sóng 600 nm trên máy quang phổ Genios Tecan (áo).
ODđốí chứng (-)- ODmẫu ODđối chứng (-)- ODđốichứng(+)
- Máu t−ơi đ−ợc chống đông bằng ADC (Citrat dextrozơ adenin), pha loãng 1/500 lần bằng dung dịch NaCl 0.9%.
- H2O2 0,2N hay 2%
- Indigo: chuẩn bị dung dịch stock -80oC: 0,1N. Pha loãng 100 lần thành dung dịch phản ứng có nồng độ 0,001N.
- Mẫu phấn hoa pha loãng trong DMSO 100% và dung dịch đệm phản ứng đ−ợc thêm vào phản ứng sao cho nồng độ cuối cùng đạt 128 àg/ml; 32 àg/ml; 8 àg/ml; 2 àg/ml; 0,5 àg/ml.
- Phản ứng bao gồm:
+ 50àl đệm natri axetat 0,1N có pH 4,7. + 10 àl mẫu pha trong DMSO và đệm + 60 àl enzym pha loãng 500 lần + 60 àl H2O2 0,2N hay 2% + 20 àl indigocacmin 0,001N + 50 àl TCA 20%
- Giếng đối chứng âm không có enzym, không có chất khử, giếng đối chứng d−ơng enzym hoạt động 100%, không có chất khử.
- Để thời gian phản ứng 20-25 phút ở nhiệt độ phòng, dừng các phản ứng bằng TCA. Đọc kết quả ở b−ớc sóng 600 nm. Dùng chất tham khảo là Resveratrol IC50 = 5,24 àg/ml.
* Xử lý kết quả
Tính hoạt động của enzym peroxydaza đ−ợc tính theo công thức sau:
ODmẫu - ODđớí chứng (+) ODđối chứng (-)- ODđốichứng(+)
Phần trăm kìm hãm hoạt động của enzym đ−ợc tính bằng công thức: IC =100% - AE%
Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50%) đ−ợc tính dựa trên t−ơng quan của nồng độ chất thử và giá trị IC đ−ợc tính theo công thức trên.
b. Ph−ơng pháp xác định hoạt tính ung th−
Dòng tế bào ung th− đ−ợc nuôi cấy trong môi tr−ờng nuôi cấy phù hợp có bổ sung thêm 10% huyết thanh phôi bò (FBS) và các thành phần khác ở điều kiện tiêu chuẩn. Dòng tế bào ung th− biểu mô KB (Human epidermic carcinoma) ở ng−ời đ−ợc cung cấp bởi ATCC.
- Thử độc tế bào:
+ 200 àl dung dịch tế bào pha ở log nồng độ 3.104 tế bào/ml vào mỗi giếng (đĩa 96 giếng) trong môi tr−ờng RPMI 1640.
+ Mẫu sữa ong chúa đ−ợc xử lý với các tế bào ở các nồng độ pha loãng khác nhau sao cho đạt đến nồng độ cuối cùng là 256 àg/ml; 128 àg/ml; 32 àg/ml; 8
àg/ml; 2 àg/ml; 0,5 àg/ml. ủ ở 370C, 5% CO2 trong 3 ngày, thêm 50 àl MTT, ủ 370C trong 4 giờ.
+ Loại bỏ môi tr−ờng, thêm 10 àl DMSO lắc đều, đọc kết quả ở b−ớc sóng 540 nm trên máy Spectrophotometer Genios Tecan.
Phần trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào:
IC50=
Giá trị IC50 đ−ợc tính dựa trên kết quả số liệu phần trăm kìm hãm (IC50) sự phát triển của tế bào bằng phần mềm máy tính table curve.