2.1.1. Nguyên liệu
- Sữa ong chúa t−ơi đ−ợc công ty cổ phần Ong mật Đắc Lắc cung cấp, đ−ợc bảo quản lạnh ở -20oC. Mẫu tr−ớc khi đem nghiên cứu đ−ợc làm khô bằng sấy đông khô.
- Phấn hoa đ−ợc công ty cổ phần Ong mật Đắc Lắc cung cấp. Mẫu tr−ớc khi đem nghiên cứu đ−ợc bảo quản khô trong tủ nơi thoáng mát và tránh ánh sáng.
2.1.2. Hoá chất
- Dung môi hữu cơ: Axeton, điclometan, etannol, etylaxetat, n-hexan, metanol, clorofom… Các dung môi này đều là hoá chất công nghiệp Trung Quốc. Tr−ớc khi sử dụng các dung môi đều đ−ợc làm khan và ch−ng cất lại. Sau đó pha hệ dung môi theo tỷ lệ phù hợp với yêu cầu sử dụng trong sắc ký. Dùng đũa thuỷ tinh khuấy cho các dung môi trộn đều vào nhau rồi đ−a lên chạy cột. Nếu chạy sắc ký lớp mỏng thì phải đợi dung môi đến khi bão hoà mới đ−ợc sử dụng.
- Hoá chất khác: ADC, RB, H2O2 0,2N, Indigo 0,1N, DMSO 20 mg/ml, Natriaxetat, TCA, Abumin huyết thanh bò, OPA, FMOC, HCl, Phenol, H2SO4, vanilin, CeSO4, các dung môi chuẩn cho HPLC.
2.1.3. Các dụng cụ và trang thiết bị nghiên cứu
Bảng 2.1: Các dụng cụ và thiết bị nghiên cứu
- Bản mỏng tráng sẵn TLC (AluO, silica Gel
60 F254, 0.2mm) Merck
Silica Gel 60, 0,04-0,063 mm mesh size Merck
Sephadex LH 20,25 – 100 mm mesh size Merck
Metanol for HPLC, MeOH LiChrosolv HPLC Merck
Cột sắc ký Schot
Cân phân tích Sartorious RC 210P
Tủ sấy Heraeus T5050
Máy hứng phân đoạn ISCO Cygnet
HPLC – Water
Pump:Dionex P580A LPG HPLC program:Chromeleon (V.6.3)
Detector: Photodiode Array Detector UVD 340 S
Column thermostat: STH 585 Autosampler: ASI-100T
HPLC/MS – Aglient 1100 ThermoFinnigan LCQ Deca
Máy quay cất chân không Bỹchi Rotavap RE111 Siêu âm Bendelin Sonorex RK 102
Đèn tử ngoại Camag (254 and 366 nm)
Máy NMR Brucker 500 MHz
2.1.4. Các ph−ơng pháp phân tích, phân tách và phân lập các hợp chất
* Chọn dung môi chiết
Th−ờng thì các chất chuyển hoá thứ cấp trong thực vật có độ phân cực khác nhau. Tuy nhiên những thành phần tan trong n−ớc ít khi đ−ợc quan tâm. Dung môi dùng cho quá trình chiết cần phải đ−ợc lựa chọn rất cẩn thận. Điều kiện của dung môi là phải hoà tan đ−ợc những chất chuyển hoá thứ cấp đang nghiên cứu, dễ dàng đ−ợc loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng với chất nghiên cứu), không độc, không dễ bốc cháy. Những dung môi này nên đ−ợc ch−ng cất để thu đ−ợc dạng sạch tr−ớc khi sử dụng.
Sau khi chiết dung môi đ−ợc cất ra bằng máy cất quay ở nhiệt độ không quá 400- 450C, với một vài hoá chất chịu nhiệt có thể thực hiện ở nhiệt độ cao hơn.
* Quá trình chiết
Quá trình chiết đơn giản đ−ợc phân loại nh− sau: - Chiết ngâm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Xoclet.
- Chiết sắc với dung môi n−ớc. - Chiết lôi cuốn theo hơi n−ớc. - Chiết siêu âm.
Tuỳ thuộc mục đích cần chiết lấy chất gì để lựa chọn dung môi cho thích hợp và thực hiện qui trình chiết hợp lí để đạt hiệu quả cao.
b. Các ph−ơng pháp sắc ký * Sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng đ−ợc thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC – Alufolien 60 F254 (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai b−ớc sóng 254 nm và 368 nm hoặc dùng thuốc thử, sấy khô hơ nóng trên bếp điện từ từ đến khi hiện màu.
Cách đ−a chất lên TLC: Lấy một l−ợng nhỏ mẫu chất hoà tan bằng 2-3 giọt dung môi thích hợp, sau đó dùng capila chấm chất lên lớp mỏng.
Dung môi: Pha hệ dung môi thích hợp, lắc kỹ cho các dung môi trộn đều nhau trong hệ rồi cho vào bình khai triển đáy bằng có nắp nhám. Đậy nắp lại và đợi đến khi dung môi bão hoà thì cho bản mỏng vào chạy.
* Sắc ký cột (CC)
Sắc ký cột đ−ợc tiến hành với hợp chất hấp phụ là silica Gel có cỡ hạt là 0,04 -0,063 mm.
Dung môi đ−ợc dùng trong sắc ký cột là: metanol, diclometan, n-hexan, etylaxetat, axeton… Các dung môi đều đ−ợc làm khan, ch−ng cất lại và bảo quản trong chai kín.
Chất cần phân tách bằng sắc ký cột đ−ợc hoà tan trong dung môi, thêm một l−ợng nhỏ chất hấp phụ. Trộn đều hỗn hợp và làm bay hơi hết dung môi. thu đ−ợc hỗn hợp ở dạng bột tơi. Khi đ−a chất lên cột chất hấp phụ phải dàn đều và dùng bông thuỷ tinh phủ lên bề mặt chất.
Nhồi cột sắc ký theo ph−ơng pháp nhồi khô hoặc nhồi −ớt, trong quá trình nhồi cột phải loại bỏ triệt để các bọt khí bằng cách cho dung môi chảy qua cột nhiều lần và gõ nhẹ vào thân cột. Khi cột đã ổn định có thể tiến hành chạy sắc ký cột.
* Sắc ký lỏng hiệu năng cao – phân tích (HPLC – phân tích)
Đối với kỹ thuật HPLC phân tích, hiệu năng phân tách đạt đ−ợc dựa trên việc sử dụng bơm áp suất cao để đẩy dung môi pha động qua cột sắc ký. Kỹ thuật phân tích HPLC đ−ợc sử dụng để nhận dạng các pic từ các dịch chiết hoặc các phân đoạn. Các thành phần khác nhau đ−ợc đ−a qua cột với các tốc độ dòng tuỳ theo sự phân bố giữa dung môi pha động và pha tĩnh. Hệ dung môi đ−ợc dùng d−ới dạng gradient là MeOH : n−ớc (nanopure) có sử dụng đệm pH=2 bằng axít photsphoric với sự tăng dần của MeOH đến 100% trong
thời gian 45 phút. Các hợp chất đ−ợc phát hiện bằng UV- VIS diode array detector.
* Sắc ký lỏng hiệu năng cao - điều chế (HPLC – preparative)
Ph−ơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao điều chế là ph−ơng pháp hiện đại nhất để phân lập các hợp chất có độ phân cực cao đối với các phân đoạn đã qua xử lý bằng các cột sắc ký thích hợp. Các hợp chất đ−ợc phát hiện trên UV – VIS diode array detector.
2.1.5. Các ph−ơng pháp các định cấu trúc hoá học các hợp chất
* Phổ khối l−ợng (ESI – MS)
Phổ khối l−ợng phun mù điện tử (Electronspray Ionization Mass Spectra) đ−ợc đo trên máy AGILENT 1100 LC – MSD trap của Viện Hoá học,Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
* Phổ cộng h−ởng từ hạt nhân (NMR)
Phổ cộng h−ởng từ hạt nhân (NMR): 1H- NMR (500MHz) và 13C-NMR (125 MHz) đ−ợc đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer, Viện Hoá học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.1.6. Ph−ơng pháp thử hoạt tính sinh học
a.Ph−ơng pháp xác định hoạt tính chống ôxy hóa * Nguyên tắc
Dựa trên cơ sở xác định hoạt động của enzym peroxydaza máu ng−ời xúc tác cho phản ứng oxi hoá indigocacmin khi có mặt H2O2 trong môi tr−ờng axít yếu. Hoạt động của enzym đ−ợc đánh giá bằng việc làm giảm màu của indigocacmin và đ−ợc đo hấp thụ ở b−ớc sóng 600 nm trên máy quang phổ Genios Tecan (áo).
ODđốí chứng (-)- ODmẫu ODđối chứng (-)- ODđốichứng(+)
- Máu t−ơi đ−ợc chống đông bằng ADC (Citrat dextrozơ adenin), pha loãng 1/500 lần bằng dung dịch NaCl 0.9%.
- H2O2 0,2N hay 2%
- Indigo: chuẩn bị dung dịch stock -80oC: 0,1N. Pha loãng 100 lần thành dung dịch phản ứng có nồng độ 0,001N.
- Mẫu phấn hoa pha loãng trong DMSO 100% và dung dịch đệm phản ứng đ−ợc thêm vào phản ứng sao cho nồng độ cuối cùng đạt 128 àg/ml; 32 àg/ml; 8 àg/ml; 2 àg/ml; 0,5 àg/ml. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Phản ứng bao gồm:
+ 50àl đệm natri axetat 0,1N có pH 4,7. + 10 àl mẫu pha trong DMSO và đệm + 60 àl enzym pha loãng 500 lần + 60 àl H2O2 0,2N hay 2% + 20 àl indigocacmin 0,001N + 50 àl TCA 20%
- Giếng đối chứng âm không có enzym, không có chất khử, giếng đối chứng d−ơng enzym hoạt động 100%, không có chất khử.
- Để thời gian phản ứng 20-25 phút ở nhiệt độ phòng, dừng các phản ứng bằng TCA. Đọc kết quả ở b−ớc sóng 600 nm. Dùng chất tham khảo là Resveratrol IC50 = 5,24 àg/ml.
* Xử lý kết quả
Tính hoạt động của enzym peroxydaza đ−ợc tính theo công thức sau:
ODmẫu - ODđớí chứng (+) ODđối chứng (-)- ODđốichứng(+)
Phần trăm kìm hãm hoạt động của enzym đ−ợc tính bằng công thức: IC =100% - AE%
Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50%) đ−ợc tính dựa trên t−ơng quan của nồng độ chất thử và giá trị IC đ−ợc tính theo công thức trên.
b. Ph−ơng pháp xác định hoạt tính ung th−
Dòng tế bào ung th− đ−ợc nuôi cấy trong môi tr−ờng nuôi cấy phù hợp có bổ sung thêm 10% huyết thanh phôi bò (FBS) và các thành phần khác ở điều kiện tiêu chuẩn. Dòng tế bào ung th− biểu mô KB (Human epidermic carcinoma) ở ng−ời đ−ợc cung cấp bởi ATCC.
- Thử độc tế bào:
+ 200 àl dung dịch tế bào pha ở log nồng độ 3.104 tế bào/ml vào mỗi giếng (đĩa 96 giếng) trong môi tr−ờng RPMI 1640.
+ Mẫu sữa ong chúa đ−ợc xử lý với các tế bào ở các nồng độ pha loãng khác nhau sao cho đạt đến nồng độ cuối cùng là 256 àg/ml; 128 àg/ml; 32 àg/ml; 8
àg/ml; 2 àg/ml; 0,5 àg/ml. ủ ở 370C, 5% CO2 trong 3 ngày, thêm 50 àl MTT, ủ 370C trong 4 giờ.
+ Loại bỏ môi tr−ờng, thêm 10 àl DMSO lắc đều, đọc kết quả ở b−ớc sóng 540 nm trên máy Spectrophotometer Genios Tecan.
Phần trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào:
IC50=
Giá trị IC50 đ−ợc tính dựa trên kết quả số liệu phần trăm kìm hãm (IC50) sự phát triển của tế bào bằng phần mềm máy tính table curve.
2.2. Quy trình phân lập chất trong sữa ong chúa và phấn hoa phấn hoa
2.2.1 Quy trình phân lập chất trong sữa ong chúa
2.2.1.1 Xác định hàm l−ợng protein * Nguyên tắc
Xác định hàm l−ợng protein trong sữa ong chúa bằng ph−ơng pháp Bradford là ph−ơng pháp phổ biến nhất và có độ nhạy cao. Ph−ơng pháp này dựa trên sự thay đổi b−ớc sóng hấp thụ cực đại của thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức với protein. Trong dung dịch mang tính axit, khi ch−a kết nối với protein thì thuốc nhuộm có b−ớc sóng hấp thụ cực đại 465 nm; khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp thụ cực đại ở b−ớc sóng 595 nm. Độ hấp thụ ở b−ớc sóng 595 nm có liên hệ một cách trực tiếp tới nồng độ protein.
Hình 2.1: Công thức của phân tử Coomassie Brilliant Blue
* Ph−ơng pháp tiến hành
Tr−ớc tiên xây dựng một đ−ờng chuẩn với dung dịch protein chuẩn đã biết tr−ớc nồng độ. Dung dịch protein chuẩn là albumin huyết thanh bò. Sau khi cho dung dịch protein vào dung dịch thuốc nhuộm, màu sẽ xuất hiện sau 2 phút và bền tới 1 giờ. Tiến hành đo dung dịch bằng máy quang phổ kế ta đ−ợc
ODx, độ hấp thụ sẽ tỷ lệ với l−ợng trong mẫu. Thực hiện một đối chứng với n−ớc cất (OD0). Lấy giá trị OD = ODx – OD0. L−ợng protein mẫu trong dung dịch đo đ−ợc xác định bằng cách chấm trên đ−ờng chuẩn theo OD, lấy giá trị của điểm đó trên trục hoành. Đó chính là hàm l−ợng Protein mẫu trong dung dịch đo.
Dựng đ−ờng chuẩn Albumin:
- Pha loãng dung dịch albumin gốc 10% ra nồng độ 0.1% và cứ tiếp tục pha loãng 2 lần thu đ−ợc các nồng độ: 0,1%, 0,05%, 0,025%, 0,0125%, 0,00625%, 0,003125%. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Cho 90 àl dung dịch thuốc thử Bradford vào các giếng trên đĩa 96 giếng.
- Tiếp tục cho 10 àl albumin đã pha loãng, tính thời gian, mỗi nồng độ lặp lại hai lần
- Sau 5 phút, tiến hành đo độ hấp thụ của dung dịch ở b−ớc sóng 595 nm
- Tiến hành xây dựng đ−ờng tuyến tính giữa nồng độ albumin chuẩn và giá trị OD595
Tiến hành t−ơng tự đối với mẫu sữa ong chúa cần định l−ợng protein: - Cân 6 mg sữa ong chúa và hoà tan trong 6 ml n−ớc cất.
Đồ thị thể hiện mối t−ơng quan giữa nồng độ protein và OD595 đ−ợc trình bày ở hình 2.2.
y = 0.0034x + 0.0069 R2 = 0.9881 y = 0.0034x + 0.0069 R2 = 0.9881 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0 20 40 60 80 100 120 Series1 Linear (Series1)
Hình 2.2 : Đ−ờng chuẩn t−ơng quan giữa nồng độ protein và OD595
Nh− vậy ph−ơng trình biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ Protein và giá trị OD là: Y = 0.0034X + 0.0069
2.2.1.2 Ph−ơng pháp phân tích axit amin * Nguyên tắc
- Các ph−ơng pháp phân tích axít amin dựa trên nguyên lý: Thuỷ phân protein thành peptit, dẫn xuất hoá và phân tích các dẫn xuất axít amin.
- Độ chính xác của việc phân tích phụ thuộc vào tính lặp lại của ph−ơng pháp mà còn phụ thuộc vào hiệu quả của phản ứng phân cắt và quá trình dẫn xuất hoá.
- Ph−ơng pháp này sử dụng OPA (o-phthaldialdehyd) và FMOC ( 9- Fluorenylmethyl chloroformate) tạo dẫn xuất của chúng trên hệ HP aminoquant series II. OPA là một chất không phát quang nh−ng kết hợp với axít amin bậc một tạo nên isoindoles có khả năng phát quang cao. Còn chất FMOC có khả năng phản ứng nhanh với các axít amin, dễ tạo sản phẩm phát quang bền vững.
- Sử dụng ph−ơng pháp thuỷ phân mẫu sữa ong chúa bằng HCl 6N có chứa 0.5% phenol ở điều kiện 110°C và 24 giờ. Sau khi thuỷ phân xong làm sạch dung dịch bằng ly tâm và lọc bỏ tủa.
- Sau đó lấy một l−ợng dung dịch mẫu đem đi cô bằng máy speed vac đến khô.
- Cặn khô đ−ợc hoà tan bằng HCl 0.1N để chuẩn bị cho lên cột sắc kí. - Mẫu lọc sạch đ−ợc cho vào ống microvial cùng với axit amin chuẩn nồng độ 250 pmol. Dẫn xuất hoá tiền cột đ−ợc tiến hành tự động theo trình tự: đệm borat, OPA, FMOC, trộn đều, bơm vào cột. Quá trình sắc kí đ−ợc tiến hành tự động ở 40°C.
2.2.1.3 Chiết mẫu sữa ong chúa và phân lập axít 10 – HDA
- Mẫu sữa ong chúa (30g) đã đ−ợc sấy đông khô để loại n−ớc rồi tiến hành chiết siêu âm trong CH2Cl2; CH2Cl2:MeOH (2:1) và MeOH.
- Loại dung môi thu đ−ợc các cặn cần thiết.
- Chạy sắc kí cột sử dụng Sephadex LH-20; silicagel 0,04-0,06 mm. Các phân đoạn sau khi tách ra đ−ợc kiểm tra bằng HPLC phân tích ở b−ớc sóng 214 nm để định h−ớng tinh chế tiếp, cuối cùng thu đ−ợc hợp chất 1 (10 – HDA) ở dạng vô định hình mầu trắng.
* Dữ kiện phổ của chất 1 (10-HDA)
ESI-MS m/z: [M+H]+ 186,8; kết quả tính toán lí thuyết cho công thức C10H18O3.
1
H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ (ppm) 5,81 (dt; 1,5 Hz; 17Hz, H-2), δ
6,97 (dt; 7Hz; 17Hz; H-3); δ 3,56 (t; 6,5 Hz; H-10); δ 2,25 (t; H-4); δ 2,30 (H- 9), δ 1,55(m, H-5, H-6) và δ 1,50 (m, H-7, H-8).
2.2.2. Chiết mẫu phấn hoa và phân lập hợp chất 2 (7-O-β – Xyloside-naringenin) Xyloside-naringenin)
- Mẫu phấn hoa (450g) đ−ợc đem đi xay nghiền nhỏ rồi lần l−ợt chiết bằng ba dung môi có độ phân cực tăng dần là n-hexan, etyl axetat và metanol.
- Hợp chất 2 đ−ợc phân lập theo 2 cách sau đây:
*Cách 1: Lấy 3,2 gam dịch chiết trong metanol tổng của phấn hoa đã thu đ−ợc ở trên, tẩm silicagel 60, 0,04 - 0,06 mm mesh size (Merck) rồi quay khô đ−a lên cột ϕ3 theo ph−ơng pháp nhồi khô. Pha tĩnh đ−ợc dùng cũng là silicagel 60, 0,04 - 0,06 mm mesh size (Merck) với l−ợng gấp 30 lần khối l−ợng của chất đ−ợc đ−a lên cột. Chọn dung môi nhồi cột là etylaxetat và pha động chạy cột là hệ dung môi gradient etylaxetat - metanol. Sau khi chạy xong thu đ−ợc 63 phân đoạn, kiểm tra bản mỏng TLC và tiến hành gộp thu đ−ợc 5 phân đoạn chính ký hiệu là F1-F5. Phân đoạn F4 đ−ợc chạy TLC điều chế thu đ−ợc chất 2.
*Cách 2: Lấy 10 gam dịch chiết phấn hoa trong metanol đ−a lên cột Sephadex ϕ 3 theo ph−ơng pháp nhồi −ớt, với pha tĩnh là Sephadex LH 20, 25 - 100 mm mesh size (Merck), dung môi pha động đ−ợc sử dụng là 100% metanol thu đ−ợc 40 phân đoạn. Kiểm tra bản mỏng TLC tiến hành gộp các phân đoạn giống nhau thu đ−ợc 6 phân đoạn ký hiệu là F1-F6. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phân đoạn F4 (đ−ợc gộp từ phân đoạn 28 đến phân đoạn 32) đ−ợc chạy trên cột ϕ 1 để tách tiếp, sử dụng pha tĩnh là silicagel 60, 0,04 - 0,06 mm mesh size (Merck) và hệ dung môi gradient diclometan-metanol thu đ−ợc 36