Phân lập vi khuẩn khử Sulphate (SRB) để ứng dụng trong xử lý nước thải axit từ hoạt động khai thác khoáng sản : Luận văn ThS. Sinh học : 60 42 40

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Thị Hải PHÂN LẬP VI KHUẨN KHỬ SULPHATE (SRB) ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG XỬ LÝ NƢỚC THẢI AXIT TỪ HOẠT ĐỘNG KHAI THÁC KHOÁNG SẢN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2012 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Thị Hải PHÂN LẬP VI KHUẨN KHỬ SULPHATE (SRB) ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG XỬ LÝ NƢỚC THẢI AXIT TỪ HOẠT ĐỘNG KHAI THÁC KHOÁNG SẢN Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS ĐINH THÚY HẰNG Hà Nội – 2012 MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chƣơng – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 AMD (Acid Mine Drainage) vấn đề mơi trƣờng liên quan………….2 1.1.1 Sự hình thành AMD…………………………………………………… 1.1.2 Ảnh hưởng AMD tới môi trường ………………………………… 1.1.2.1 Ô nhiễm nguồn nước AMD……………………… 1.1.2.2 Ơ nhiễm đất AMD………………………………………………6 1.1.2.3 Tình trạng nhiễm AMD Việt Nam …………………………8 1.1.2.4 Hiện trạng quản lý xử lý AMD Việt Nam………………… 11 1.2 Xử lý AMD……………………………………………………………………12 1.2.1 Xử lý AMD phương pháp hóa học…………………… .12 1.2.2 Xử lý AMD phương pháp sinh học………………………………13 1.2.2.1 Cơ sở khoa học cơng nghệ………………………………… 13 1.2.2.2 Một số quy trình cơng nghệ xử lý AMD nhờ SRB………………14 1.2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới trình xử lý AMD SRB 16 1.3 Đặc tính sinh học SRB 18 1.3.1 Phân bố SRB tự nhiên 19 1.3.2 Đa dạng di truyền SRB 20 1.3.3 Đặc điểm sinh lý SRB 22 1.3.3.1 Nhu cầu dinh dưỡng SRB 22 1.3.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới sinh trưởng SRB 23 1.3.3.3 Cạnh tranh SRB với nhóm vi khuẩn khác mơi trường .24 Chƣơng – NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .26 2.1 Nguyên vật liệu……………………………………………………………….26 2.1.1 Các mẫu nước thải…………………………………………………… 26 2.1.2 Hóa chất……………………………………………………………… 26 2.1.3 Thiết bị, dụng cụ……………………………………………………….26 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu…………………………………………………….27 2.2.1 Làm giàu phân lập SRB…………………………………………….27 2.2.2 Xác định điều kiện sinh trưởng tối ưu ……………………………… 29 2.2.3 Tách DNA tổng số từ mẫu môi trường chủng khiết .30 2.2.4 Phương pháp điện di biến tính DGGE 32 2.2.5 Giải trình tự gen 16S rDNA dựng phân loại .34 2.2.6 Phân tích hóa học 35 2.2.6.1 Định lượng Fe(II) thuốc thử phenanthrolin 35 2.2.6.2 Định lượng sulfate……………………………………………………36 2.2.6.3 Xác định nồng độ sulfide…………………………………………… 37 2.2.7 Thiết kế mơ hình xử lý AMD………………………………………………37 Chƣơng - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN………………………………………39 3.1 Làm giàu phân lập vi khuẩn khử sulfate (SRB) từ mẫu nƣớc thải 39 3.2 Vị trí phân loại ba chủng SRB dựa trình tự gen 16S rDNA…….42 3.3 Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng SRB phân lập……… 44 3.3.1 Ảnh hưởng nồng độ muối môi trường………………………45 3.3.2 Ảnh hưởng pH môi trường……………………………….…46 3.3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy…………………………………… 48 3.3.4 Chất cho điện tử chất nhận điện tử………………………………….48 3.4 Thử nghiệm xử lý AMD mơ hình phịng thí nghiệm 50 3.4.1 Xử lý AMD điều kiện bổ sung methanol (10 mM) làm chất 51 3.4.2 Xử lý AMD điều kiện bổ sung nước thải giàu hữu làm chất 52 3.4.3 Biến động thành phần quần xã vi sinh vật trình xử lý AMD mơ hình phịng thí nghiệm .52 KẾT LUẬN 55 HƢỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO .56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 PHỤ LỤC .71 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AMD Acid Mine Drainage bp Base pair BSA Bovin serum albumin DNA Deoxyribonucleic acid CI Chloroform-isoamyl alcohol DGGE Denaturing gradient gel electrophoresis dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid MQ Mili-Q OD Optical density PBS Phosphate-buffered saline PCI Phenol-Chloroform-isoamyl alcohol PCR Polymerase chain reaction rDNA Ribosomal deoxyribonucleic acid SDS Sodium dodecyl sulfate SRB Sulfate reducing bacteria TAE Tris-Acetic-EDTA (đệm) TE Tris-EDTA (đệm) Taq Thermus aquaticus DNA UV Ultraviolet MỞ ĐẦU Trong năm gần đây, ngành khai thác khống sản ngày chiếm vị trí quan trọng kinh tế, đóng góp tới 5,6% GDP (Bùi Cơng Quang, 2011) Tuy nhiên, hậu suy thối mơi trường gia tăng nghiêm trọng, đặc biệt vùng mỏ khai thác than, quặng vật liệu xây dựng Nước thải axit (AMD) coi mối đe dọa lớn hoạt động khai thác khống sản tới mơi trường AMD có ảnh hưởng lâu dài nguồn nước sông, suối, sống sinh vật (động, thực vật người) liên quan đến nguồn nước Do ảnh hưởng AMD, nước nhiều dịng sơng, suối quanh khu vực khai thác có pH thấp hơn, hòa tan nhiều kim loại nặng sắt, đồng, nhơm, cadmium, arsen, chì, thủy ngân…Các kim loại này, đặc biệt sắt, phủ lên đáy sông, suối lớp bùn màu đỏ cam gọi “hạt vàng” vận chuyển xa theo dịng nước, làm nhiễm dịng sơng, suối, nguồn nước ngầm hạ lưu Đối với sống nước, AMD làm chết động thực vật thủy sinh gây ảnh hưởng tới sinh trưởng, tập tính, khả sinh sản chúng Do ảnh hưởng nghiêm trọng tới mơi trường, AMD cần phải kiểm sốt xử lý Từ lâu vi khuẩn khử sulfate (SRB) biết đến với ứng dụng xử lý AMD cách hiệu Tuy công nghệ xử lý AMD SRB triển khai thành công nhiều nước giới Việt Nam lại chưa nghiên cứu áp dụng Trong nghiên cứu luận văn thạc sỹ này, tiến hành làm giàu phân lập SRB từ nguồn khác thử nghiệm sử dụng chúng để xử lý AMD mơ hình phịng thí nghiệm Các kết thu cung cấp sở cho việc nghiên cứu ứng dụng thực tế công nghệ Việt Nam Chƣơng - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 AMD (Acid Mine Drainage) vấn đề môi trƣờng liên quan 1.1.1 Sự hình thành AMD AMD (Acid Mine Drainage) hình thành khống sulfide (như pyrite, FeS2) quặng tiếp xúc với oxy nước (Brown cs, 2002) Sự oxy hóa khống sinh axit thường kèm với nồng độ cao kim loại hòa tan (đặc biệt sắt) sulfate, AMD thường có pH thấp (2 – 3) màu vàng ion sắt bị oxy hóa (Watzlaf cs, 2003) (hình 1.1) Hình 1.1 AMD từ khu khai thác quặng kim loại Việt Nam Quá trình oxy hóa khống sulfide kể (phản ứng 1.1) xảy tác động yếu tố thiên nhiên, nhiên tăng tốc mạnh qua hoạt động khai thác khoáng sản (tạo điều kiện cho quặng nằm lòng đất tiếp xúc với oxy), sinh lượng lớn AMD, làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến môi trường khu vực khai thác mỏ (Stumm, Morgan,1996) FeS2 + 7/2O2 +H2O → Fe2+ + 2SO42- + 2H+ (1.1) Khi oxy hồ tan có mặt đủ, Fe2+ bị oxy hóa thành Fe3+ (phản ứng 1.2) Fe2+ + 1/4O2 + H+ → Fe3+ + 1/2H2O (1.2) Tuy nhiên, pH > 3,5, Fe3+ khơng hịa tan mà kết tủa dạng hydroxit sắt III (Fe(OH)3) Q trình giải phóng H+ tiếp tục làm giảm pH (phản ứng 1.3) (Brown cs, 2002) Fe3+ + 3H2O → Fe(OH)3 + 3H+ (1.3) Bên cạnh đó, pH thấp (< 3,5), Fe3+ hịa tan đóng vai trị tác nhân oxy hóa, tiếp tục oxy hóa pyrite giải phóng axit (phản ứng 1.4) FeS2 + 14Fe3+ + 8H2O → 15Fe2+ + 2SO42 + 16H+ (1.4) Quá trình tự trì lâu dài Fe2+ sinh dễ dàng bị oxy hóa trở lại thành Fe3+ tiếp tục tham gia phản ứng (Younger cs, 2002) So với oxy hịa tan, Fe3+ oxy hóa pyrite chí với tốc độ cao hơn, tốc độ trình oxy Fe2+ thành Fe3+ (phản ứng 1.2) có ảnh hưởng quan trọng q trình oxy hóa quặng pyrite (Singer, Stumm, 1970) Fe2+ oxy hóa theo đường hóa học hay sinh học, tùy thuộc vào điều kiện mơi trường Ở pH gần trung tính, oxy hóa Fe2+ chủ yếu diễn theo đường hóa học, nhiên pH – trình sinh học chiếm ưu nhờ vi khuẩn oxy hóa sắt (như Thiobacillus ferrooxidans) xúc tác phản ứng 1.2 (Brown cs, 2002) Các vi khuẩn đẩy nhanh tốc độ oxy hóa Fe2+ gấp 106 lần so với q trình hóa học (Singer, Stumm, 1970), chúng đóng vai trị việc tạo AMD mỏ (Brown cs, 2002; Younger cs, 2002) Các sulfide kim loại khác pyrite sphalerite (ZnS) galena (PbS) bị oxy hóa khơng sinh axit (phản ứng 1.5, 1.6), giải phóng ion kim loại vào mơi trường (Younger cs, 2002) ZnS + 2O2 → Zn2+ + SO42- (1.5) PbS + 2O2 → Pb2+ + SO42- (1.6) Ở pH thấp, mức hòa tan kim loại tăng, môi trường axit tạo từ oxy hóa pyrite lọc kim loại vết bao quanh vật liệu đá As, Cu, Ni, Zn, Mn Đặc biệt, nhơm silicat (fenspat mica) hịa tan mơi trường axit giải phóng ion nhơm (phản ứng 1.7, 1.8), sau tiếp tục sinh axit từ phản ứng thủy phân kết tủa (phản ứng 1.9) (Watzlaf cs, 2003) KAlSi3O8 + H+ + 29H2O → 2H4SiO4 + Al2SiO5(OH)4 (1.7) Al2SiO5(OH)4 + 6H+ → 2Al3+ + 2H4SiO4 + H2O (1.8) Al3+ + 3H2O → Al(OH)3 + 3H+ (1.9) Như AMD có hai điểm đặc trưng pH thấp hàm lượng ion kim loại nặng cao Dưới thành phần hóa học số AMD từ loại mỏ đại diện Bảng 1.1 Thành phần hóa học AMD (Tất nồng độ tính mg/l) Các mỏ khai thác khống sản Yếu tố Mỏ than Mỏ đá hóa/lý Vàng Danh (Việt Nam) Mỏ đồng Mỏ đồng – Wheal Jane loại lƣu huỳnh niken (Mỹ) Surthing Leviathan Nickel Rim (Montana) (California) (Canada) AMD Mỏ kim pH 2,99 2,58 2,8  5,9 Fe 490 161,3 15 117,167 250 - 1350 Cu 12,9 0,1 2,35 0,691 Al  12,4 29,5 37,467 130 Zn 0,834 41,9 22,7 0,715 As 0,218   0,002  Pb 0,299 0,1 0.151 0,0036  1094 591 SO42- 10 2500 - 5200 “Endosymbiontic sulphate-reducing and sulphide-oxidizing bacteria in an oligochaete worm”, Nature, 411, pp 298–302 25 Duffield S, Lucia AC, Mitchison N, Kasamas H, (2000), “Land recovery and man-made risks: a perspective from the EU accession countries”, J Hazard Mater.,78, pp 91-103 26 Elferink OSJWH, Visser A, Hulshoff-Pol LW, Stams AJM (1994), “Sulphate reduction in methanogenic bioreactors”, FEMS Microbiol Rev., 15, pp 119– 136 27 EPA (1995), Human Health and Environmental Damages from Mining and Mineral Processing Wastes, Washington DC, Office of Solid Waste, U.S Environmental Protection Agency 28 Farag, A M., D.Skaar, D.A Nimick, E MacConnell, and C Hogstrand (2003), "Characterizing aquatic health using salmonids mortality, physiology, and biomass estimates in streams with elevated concentrations of arsenic, cadmium, copper, lead, and zinc in the Boulder River Watershed, Montana", Transac Amer Fisher Soc., 132, pp 450-457 29 Felsenstein J (1985), “Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap”, Evolution, 39, pp 783-791 30 Figueroa L (2005), Microbial ecology of anaerobic biosystems treating mining influenced waters, Presented at the Mine Water Treatment Technology Conference, Pittsburgh, PA 31 Frauque, G., J.LeGall, and L L Barton (1991), “Sulphate-reducing and sulphurreducing bacteria”, Variation in Autotrophic Life, pp 271-337 32 Fromm, P O (1980), "A review of some physiological and toxicological responses of freshwater fish to acid stress", Environ Biol Fishes, 5, pp 79-93 33 Gadd G (2004), “Microbial influence on metal mobility and application for bioremediation”, Geoderma, 122, pp 109-119 66 34 Gusek JJ, Wildeman TR (2002), Passive treatment of aluminum-bearing acid rd rock drainage, Proceedings of the 23 Annual West Virginia Surface Mine Drainage Task Force Symposium, Morgantown, West Virginia, April 16-17, 2002 35 Dinh TH, Kuever J, MaBmann M, Hassel AW, Martin Stratmann and Friedrich Weddel, “Iron corrosion by novel anaerobic microorganism”, Nature, 427, pp 829832 36 Hao OJ, Chen JM, Huang L, Buglass RL (1996), “Sulphate reducing bacteria”, Crit Rev Enviro Sci Technol., 26, pp 155-187 37 Hao OJ, Huang L, Chen JM, Buglass RL (1994), “Effects of metal additions on sulphate reduction activity in wastewaters”, Toxicology and Environmental Chemistyi, 46, pp 197-212 38 Higgins JP, Hard BC, Mattes A (2003), Bioremediation of rock drainage using sulphate-reducing bacteria, Proceedings of Sudbury 2003: Mining and Environment, Sudbury, Ontario, May 25-28, 2003 39 Hill RD (1974), Mining impacts on trout habitat, Proceedings of a Symposium on Trout Habitat, Research, and Management, Boone, NC, Appalachian Consortium Press 40 Hilton BL, Oleszkiewiez JA (1988), “Sulfide induced inhibition of anaerobic digestion”, J Environ Eng., 114, pp 1377–1391 41 Hines ME, Evans RS, Genthner BRS, Willis SG, Friedman S, Rooney-Varga JN, Devereux R (1999), “Molecular phylogenetic and biogeochemical studies of sulfate-reducing bacteria in the rhizosphere of Spartina alterniflora”, Appl Environ Microbiol., 65, 2209–2216 42 Howells GD, Brown DJA, Sadler K (1983), "Effects of acidity, calcium, and aluminum on fish survival and productivity - a review", J Sci Food Agr., 34(6), pp 559-570 67 43 Itoh T, Suzuki KI, Nakase T (1998), “Thermocladium modestius gen nov., sp nov a new genus of rod-shaped, extremely thermophilic crenarchaeote”, Int J Syst Bacteriol., 48, pp 879–887 44 Itoh T, Suzuki KI, Sanches PC, Nakase T (1999), “Caldivirga maquilingensis gen nov., sp nov a new genus of rod-shaped crenarchaeote isolated from a hot spring in the Philippines”, Int J Syst Bacteriol., 49, pp 1157–1163 45 Jage CR, Zipper CE, Hendricks AC (2000), Factors affecting performance of Successive Alkalinity-Producing Systems, Presented at the American Society for Surface Mining and Reclamation 17th Annual Meeting, Tampa, Florida, June 11-15, 2000 46 Jennings SR, Neuman DR, Blicker PS (2008), Acid Mine Drainage and Effects on Fish Health and Ecology: A Review, Reclamation Research Group Publication, Bozeman MT 47 Jeanthon C, Haridon SL, Cueff V, Banta A, Reysenbach AL, Prieur D (2002), “Thermodesulfobacterium hydrogeniphilum sp nov., a thermophilic, chemolithoautotrophic sulfate-reducing bacterium isolated from a deep-sea hydrothermal vent at Guaymas Basin and emendation of the genus Thermodesulfobacterium”, Int J Syst Evol Microbiol., 52, pp 765–772 48 Jong T, Parry DL (2006), “Microbial sulfate reduction under sequentially acidic conditions in an upflow anaerobic packed bed bioreactor”, Water Res., 40, pp 2561-2571 49 Kaksonen AH, Plumb JJ, Franzmann PD, Puhakaka JA (2004a), “Simple organic electron donors support diverse sulphate- reducing communities in fluidized-bed reactors treating acid metal- and sulphate-containing wastewater”, FEMS Microbiol Ecol., 47, pp 279–289 50 Kaksonen AH, Plumb JJ, Franzmann PD, Puhakaka JA (2004b), “Effects of hydraulic retention time and sulphide toxicity on ethanol and acetate oxidation 68 in sulphate reducing metal-precipitating fluidized-bed reactor”, Biotechnol Bioeng., 86, pp 332–343 51 Kepler DA, McCleary EC (1994), “Successive alkalinity-producing systems (SAPS) for the treatment of acidic mine drainage”, Proceedings of the International Land Reclamation and Mine Drainage Conference and the Third International Conference on the Abatement of Acidic Drainage, Pittsburgh, PA, April 24-29, 1994, pp 195-204 52 Kniemeyer O, Musat F, Sievert SM, Knittel K, Wilkes H, Blumenberg M, Michaelis W, Classen A, Bolm C, Joye SB, Widdel F (2007), “Anaerobic oxidation of short-chain hydrocarbons by marine sulphate-reducing bacteria”, Nature, 449, pp 898–901 53 Kovacik WPJ (2006), “Molecular analysis of deep subsurface Cretaceous rock indicates abundant Fe(III)- and S°-reducing bacteria in a sulfate-rich environment”, Environ Microbiol., 8, 141–155 54 Kremer DR, Hansen TA (1988), “Pathway of propionate degradation in Desulfobulbus propionicus”, FEMS Microbiol Lett., 49, pp 273-277 55 Laanbroek HJ, Geerligs HJ, Sijtsma L, Veldkamp H (1984), “Competition for sulfate and ethanol among Desulfobacter, Desulfobulbus, and Desulfovibrio species isolated from intertidal sediments”, Appl Environ Microbiol., 47, pp 329–334 56 Logan MV, Reardon KF, Figueroa LA, McLain JET, Ahmann DM (2005), “Microbial community activities during establishment, performance, and decline of bench-scale passive treatment systems for mine drainage”, Water Res., 39, pp 4537-4551 57 Lopez IFR, Larrea L, Cocolin E, Orr T, Phister M, Marshall J, Gheynst V, Mills DA (2003), “Design and evaluation of PCR primers for analysis of bacterial 69 populations in wine by denaturing gradient gel electrophoresis”, Appl Environ Microbiol., 69, pp 6801–6807 58 Maillacheruvu KY, Parkin GF (1996), “Kinetics of growth, substrate utilization and sulphide toxicity for propionate, acetate and hydrogen utilisers in anaerobic systems”, Water Environ Res., 68, pp 1099–1106 59 Marmur J (1961), “A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms”, J Mol Biol, 3, pp 208-218 60 McCartney DM, Oleszkiewicz JA (1991), “Sulphide inhibition of anaerobic degradation of lactate and acetate”, Water Res., 25, pp 203–209 61 McCartney DM, Oleszkiewicz JA (1993), “Competition between methanogens and sulphate reducers: effect of COD: sulphate ratio and acclimation”, Water Environ Res., 65, pp 655–664 62 Menendez R (1978), “Effects of acid water on Shavers Fork – a case history”, Surface mining and fish/wildlife needs in the Eastern United States., U.S DOI, Fish and Wildlife Service, pp 160-169 63 Minz D, Flax JL, Green SJ, Muyzer G, Cohen Y, Wagner M, Rittmann EB, Stahl DA (1999), “Diversity of sulfate-reducing bacteria in oxic and anoxic regions of a microbial mat characterized by comparative analysis of dissimilatory sulfite reductase genes”, Appl Environ Microbiol 65, pp 4666– 4671 64 Munshower FF, Neuman DR, Jennings SR, Phillips GR (1997), “Effects of land reclamation techniques on runoff water quality from the Clark Fork River floodplain, Montana”, Washington, DC, EPA Office of Research and Development, pp 199-208 65 Mussmann M, Ishii K, Rabus R, Amann R (2005), “Diversity and vertical distribution of cultured and uncultured Deltaproteobacteria in an intertidal mud flat of the Wadden Sea”, Environ Microbiol., 7, pp 405–418 70 66 Muyzer G, Stams AJM (2008), “The ecology and biotechnology of sulphatereducing bacteria”, Nature, 6, pp 441-454 67 Nilsen RK, Beeder J, Thostenson T, Torsvik T (1996), “Distribution of thermophilic marine sulfate reducers in North Sea oil field waters and oil reservoirs”, Appl Environ Microbiol., 62, pp 1793–1798 68 Nordstrom DK, Alpers CN (1999), “Negative pH, efflorescent mineralogy, and consequences for environmental restoration at the Iron Mountain Superfund site, California”, National Acad Sci., 96, pp 3455-3462 69 Nordstrom DK, Jenne EA, Averett RC (1977), “Heavy metal discharges into Shasta Lake and Keswick Reservoir on the Sacramento River, California – a reconnaissance during low flow”, U.S Geological Survey Open-File Report, pp 76-49 70 Nordwick S, Zaluski M, Park B, Bless D (2006), “Advances in development of bioreactors applicable to the treatment of ARD”, Proceedings, 7th Int Conf on Acid Rcok Drainage, St Louis, MO, March 26-30, 2006, ed by R.I Barnhisel, pp 1410-1420 71 O’Flaherty V, Colleran E (1998), “Effect of sulphate addition on volatile fatty acid and ethanol degradation in an anaerobic hybrid reactor I: process disturbance and remediation”, Biores Technol., 68, pp 101–107 72 Ollivier B, Caumette P, Garcia JL, Mah RA (1994), “Anearobic bacteria from hypersaline enviroments”, Microbiol Rev., 58, pp 27-38 74 Peck HD, Lissolo T (1988), “Assimilatory and dissimilatorymsulphate reduction: enzymology and bio energentics”, The Ntrogen and Sulphur Cycles, pp 99-132 75 Perry RH, Green D (1984), Perry’s Chemical Engineer’s Handbook, 6th Ed McGraw-Hill Book Company, Singapore 71 76 Pfennig N, Widdel F, Truper HG (1981), “The dissimilatory sulphate reducing bacteria”, in The Prokaryotes, 2, pp 926-940 77 Postage JR (1984), The sulphate reducing bacteria, 2nd ed, Cambridge Univertsity Press, Cambridge 78 Ramsing NB, Kühl M, Jørgensen BB (1993), “Distribution of sulfate-reducing bacteria, O2 , and H2 S in photosynthetic biofilms determined by oligonucleotide probes and microelectrodes”, Appl Environ Microbiol., 59, pp 3840–3849 79 Ravenschlag K, Sahm K, Knoblauch C, Jørgensen BB, Amann R (2000), “Community structure, cellular rRNA content, and activity of sulfate-reducing bacteria in marine Arctic sediments”, Appl Environ Microbiol., 66, pp 3592– 3602 80 Reis MAM, Almeida JS, Lemos PC, Carrondo MJT (1992), “Effect of hydrogen sulphide on growth of sulphate-reducing bacteria”, Biotechnol Bioeng., 40, pp 593–600 81 Rissati JB, Capman WC, Stahl DA (1994), “Community structure of a microbial mat: the phylogenetic dimension”, Proc Nat Acad Sci USA, 91, pp 10173– 10177 82 Rodríguez L, Ruiz E, Alonso-Azcárate J, Rincón, J (2009), “Heavy metal distribution and chemical speciation in tailings and soils around a Pb–Zn mine in Spain”, J Environ Manag., 90 , pp 1106-1116 83 Rose AW, Alcorn GS, Phelps LB, Bower PR (2001), Case study of Pot Ridge Passive Treatment Systems, Cambria County, Pennsylvania, Presented at the th American Society for Surface Mining and Reclamation 18 Annual National Meeting, Albuquerque, New Mexico, June 3-7, 2001 84 Saitou N, Nei M (1987), “The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees”, Mol Biol Evol., 4, pp 406-425 72 85 Sass H, Wieringa E, Cypionka H, Babenzien HD, Overmann J (1998), “High genetic and physiological diversity of sulfate-reducing bacteria isolated from an oligotrophic lake sediment”, Arch Microbiol., 170, pp 243–251 86 Schink B, Stams AJM (2006), “The Prokaryotes”, Springer Verlag, New York, pp 309–335 87 Schönheit P, Kristjansson JK, Thauer RK (1982), “Kinetic mechanism for the ability of sulphate reducers to out-compete methanogens for acetate”, Arch Microbiol., 132, pp 285–288 88 Sen AM (2001), Acidophilic Sulphate Reducing Bacteria: Candidates for Bioremediation of Acid Mine Drainage Pollution, Thesis, Univ Wales 89 Singer P, Stumm W (1970), “Acid mine drainage: the rate determining step”, Science, 167, pp 1121-1123 90 Skousen J, Sextone A, Cliff J, Sterner P, Calabrese J, Ziemkiewicz P (1999), Acid mine drainage treatment with a combined wetland/anoxic limestone drain: greenhouse and field systems, Presented at the American Society for th Surface Mining and Reclamation 16 Annual National Meeting, Scottsdale, Arizona, August 13-19, 1999 91 Skousen J, Ziemkiewicz P (1996), Acid Mine Drainage Control and Treatment, 2nd Ed National Research Center for Coal and Energy, National Mine Land Reclamation Center, West Virginia University, Morgantown, WV, pp 362 92 Spear JR, Figueroa LA, Honeyman BD (2000), “Modeling the removal of uranium U(VI) from aqueous solution in the presence of sulfate reducing bacteria”, Environ Sci Technol., 66, pp 3711-3721 93 Speece RE (1983), “Anaerobic biotechnology of industrial wastewaters”, Environ Sci Technol., 17, pp 416A–427A 94 Stadnitskaia A, Muyzer G, Abbas B, Coolena MJL, Hopmans EC, Baas M, van Weeringa TCE, Ivanovb MK, Poludetkina E, Sinninghe Damste JS (2005), 73 “Biomarker and 16S rDNA evidence for anaerobic oxidation of methane and related carbonate precipitation in deep-sea mud volcanoes of the Sorokin Trough, Black Sea”, Mar Geol., 217, pp 67–96 95 Stams AJ, Elferink OS, Westermann P (2003), “Metabolic interactions between methanogenic consortia and anaerobic respiring bacteria”, Adv Biochem Eng Biotechnol., 81, pp 31–56 96 Stephenson SL, Studiar SM, McQuattie CJ (1995), “Effects of acidification on bryophyte communities in West Viginia moutain streams”, J Environ Qual., 24, pp 116 – 125 97 Teitzel GM, Parsek MR (2003), “Heavy metal resistance of biofilm and planktonic Pseudomonas aeruginosa”, Appl Environ Microbiol., 69, pp 2313–2320 98 Thauer RK, Jungermann K, Decker K (1977), “Energy conservation in chemotrophic anaerobic bacteria”, Bacteriol Rev., 41, pp 100-180 99 Tsukamoto TK, Killion HA, Miller GC (2004), “Column experiments for microbial treatment of acid mine drainage: low-temperature, low-pH and matrix investigations”, Water Res., 38, pp 1405-1418 100 U.S.Department of Agriculture (USDA) and EPA Region III (2000), A Handbook of Constructed Wetlands, Report# 843F00003 101 U.S.Department of Energy (US DOE) (1998), Research and Application of Permeable Reactive Barriers, Document# K0002000 102 US EPA (2004a), Nationwide Identification of Hardrock Mining Sites, Report #2004-P-00005, Office of the Inspector General 103 US EPA (2004b), Abandoned Mine Lands Team Reference Notebook 74 104 Vega FA, Covelo EF, Andrade ML (2006), “Competitive sorption and desorption of heavy metals in mine soils: Influence of mine soil characteristics”, J Colloid Interface Sci., 298, pp 582-592 105 Warner RW (1971), "Distribution of biota in a stream polluted by acid mine drainage", Ohio J Sci., 71, pp 202-215 106 Watzlaf G, Schroeder K, Kleinmann R, Kairies C, Nairn R (2003), “The passive treatment of coal mine drainage”, US Department of Energy NETL, pp 72 107 Wawer C, Jetten MS, Muyzer G (1997), “Genetic diversity and expression of the NiFe hydrogenase large-subunit gene of Desulfovibrio spp in environmental sample”, Appl Environ Microbiol., 61, pp.4360–4369 108 Webster G, Watt LC, Rinna J, Fry JC, Evershed RP, Parkes RJ, Weightman AJ (2006), “A comparison of stable isotope probing of DNA and phospholipids fatty acids to study prokaryotic functional diversity in sulfate-reducing marine sediment enrichment slurries”, Environ Microbiol., 8, pp 1575–1589 109 Weisburg WG, Barns SM, Pelletier DA, Lane DJ (1991) "16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study" J Bacteriol., 173: 697–703 110 Weijma J, Gubbels F, Hulshoff Pol LW, Stams AJM, Lens P, Lettinga G (2002), “Competition for H2 between sulphate reducers, methanogens and homoacetogens in a gas-lift reactor”, Water Sci Technol., 45, pp 75–80 111 Widdel F (1988), “Microbiology and ecology of sulphate- and sulphurreducing bacteria”, in Biology of Anaerobic Microorganism, pp 469-585 112 Widdel F, Bak F (1992), “Gram-negative mesophilic sulfate-reducing bacteria”, in The Prokaryotes, 2nd ed Spinger, Berlin Heidelberg New York, pp 3352-3378 113 Widdel F, Pfennig N (1984), “Dissimilatory sulfate- and sulfur-reducing bacteria”, Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, 1, pp 663-679 75 114 Widdel F, Hansen TA (1991), “The dissimilatory sulphate and sulphur reducing bacteria”, in The prokaryotes, pp 583-624 115 Younger PL, Banwart SA, Hedin RS (2002b), Mine water: hydrology, pollution, remediation, Dordrecht; Boston, Kluwer Academic Publishers.16, pp 442 116 Zeikus JG, Dawson MA, Thompson TE, Lugvorsen K, Hatchikian EC (1983), “Microbial ecology of volcanic sulphidogenesis: Isolation and characterization of Thermodesulfobacteria commune gen nov and sp nov J Gen Microbiol., 129, pp 1159-1169 117 Zhou J, Bruns MA, Tiedje JM (1996), “DNA recovery from soils of diverse composition”, Appl Environ Microbiol., 62, pp 316-322 76 PHỤ LỤC Phụ lục Các trình tự gen SR2 16r DNA (1444 bp), Desulfomicrobium sp GGTATCCGAGCGACTTCGGGTAGAACCGACTCTCGTGGTGTGAACGGGCGGTGTGTCACAAGG CCCGGGAACGTATTCACCCCGGCATGCTGATCCGGCGATTACTGAGCGATTCCAACTTCAGGCA GGCGAGTCGAAGACTGCAATCCGGACTATGGATGGGTTTTTTGAGATTCGCTCGACCTCACGGT TTCGCTGCCCTTTGTACCCACCATTGTAATACGTGTGGTAGCCCTAGGCGTAAGGGCCATGATG ACTTGAAGTCATCCCCACCTTCTCTCCCGGTTAACGCGGGCAGTCTCCACAGAGTGCCCACCATT ATGTGCTGGCAACTGAGAATAGGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACACCTCACGGCA CGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCGGTCTCTGGATTCCCCGAAGGGCACTCCCGCATCTCTG CAGGATTCCCAGGATGTCAAGCCTAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAAATAAACCACCATA CTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTTCTTTGAGTTTCAGCCTTGCGACCGTACTCCCCAG GCGGGATACTTAACGCGTTAGCTACGGCACCGAAGATCAAGTCCCCGACACCTAGTATCCATCG TTTACGGTGTGGACTACCACGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACACTTTCGCACCTCAACGTC AATACCTGTCCAGGTGGCCGCCTTCGCCACCGGTGTTCCTCCTGATATCTACGGATTTCACTCCT ACACCAGGAATTCCGCCACCCTCTCCAGGATTCAAGCCCTGCAGTTTCAAAGGCAGTTCCACGG TTGAGCCGTGGGATTTCACCCCTGACTTACAAGGCCGCCTACGTGCGCTTTACGCCCAGTAATTC CGAATAACGCTTGCACCCTCCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGGAGTTAGCCGGTGCTTCCTC TAAAGGTACCGTCAAAACAAAGGCCTATTACACCAATGCCCGTTCTTCCCTTCCGACATGAGGT TTACGACCCGAAAGCCTTCATCCCTCACACGGCGTTGCTGCGTCAGGCTTTCGCCCATTGCGCA ATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGACCGTGTTTCAGTTCCAGTGTGGCTGATCAT CCTCTCAGACCAGCTACTCATCGTTGCCTTGGTAGGCCATTACCCTACCAACTAGCTAATGAGA CGCGGGCTCATCCTCGGACGAATGCATATGCAGAGGCATCCTTTACCGACGTCTATTAAAAGCC AGACTATCCGGTATTAGCTCCACTTTCGCGGAGTTATTCCAAATCCAAGGGTAGATTACCCACG CGTTACTCACCCGTGCGCCACTCTACTCAGGGCCGAAGCCCCTTTCTCGTACGACTGCAAGGTG TTAGGAACGCCGCCGGCGTCTCCCATTCTGA SR3 16r DNA (1438 bp), Desulfobulbus sp GCGCATCGCAGGCGGCGATGATTATCACATGCAAATCGAACGCGAAAGGGACTTCGGTCCTGA GTAAAGTGGCGCAAGGGTGACTATTACGTGTAGATAACCCGTCTTCATGTATGGAATAATACAC CGAAAGGGGTACTAATACCGGATATTATTGCCTCATATAAGTTTTGCAAGCAAAGGTGGCATCT GATTCAAGCTACTGCATGTAGAGGCGTCTGCGTACCATGAGCTAGTAGGTAGGGTAATGGCCTA CCTAGGCAACGATGGTGAGCGGGTCTGAGAGGATGATCCGCCACACTGGCACTGGAACACGGG CCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGCGCAATGGGGGCAACCCTGACGAAGCG 77 ACGCCGCGTGAGTGAGGAAGGCCTTCGGGTCGTAAAGATCTGTCAAGAGGAAAGAAATGCATA GCGGTTAATACCCGCTATGTTTGACGGTACCTCTAAAGGAAGCACAGGCTAACTCCGTGCCAGC AGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTGTTCGGAATCACTGGGCGTAAAGGGCGCGCAGG CGGTTTGGTAAGTCAGATGTGAAAGCCCACGGCTTAACCGTGGAAGTGCATTTGATACTGCTAG ACCTGAGTACCAGAGGGGAAAGTGGAATTCCCGGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATCGGGA GGAATACCGGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGCTGAGTACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGG GAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGATGTAGGGG GGTGTTGATCCATTCTGTGTCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCA AGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCG ATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATCCCGGGAATCTTTCGGAAACGAGAGAGTGC CTTCATTAGAAGGAACCTGGAGACAGGTGCTGCATGGCAGTCGTCAGCTCGTGTCATGAGATGT TGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGCCTTTAGTTGCCAGCAGTTCGGCTGGGCACTC TAAAGGGACGGCCGGTGTCAAACCGAAGAAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCTTT ATGACCAGGGCTACACACGTACTTACAATGGCCGATACAAAGGGCAGGCCACATTGCGAAATG GAGCCAATCCCATAAAACCGCTCTCACTCCGAATTGAAGTCTGCAACTCGACTCCATGGAAGTT GGAATCCCTAGTAATCGCGGATCAGCAATGCCGCGGGGAAAACGTTCCCGGGCCTTGTACACA CCGCCCGTCACACCACCGGAATCGGTTGTACCAAAAGCAGTA SR4 16r DNA (1442 bp), Desulfovibrio sp GTTACCCCGACAGTTTTAGGTAGGAACCGACTTTCGTGGTGTAGACGGGCGGTGTGTAACAAGG CCCGGGAAAGTATTCACCCGGGACCATGCTGATCTCCGATATACAAGCGATTCCGACTTCACGG GGGTCGAATTGCAGACCCCTGATCCGGAATGGGACCGGTTTTTGGGGATTGGCTCCACCCTGCG GTCTCGCAAGCCCATTGTAACCCGCCATTGTAGTACGTGTGTAGCCCTGGGCGTAAGGCCCATG ATGACTTGACGTCGTCCCCACCTTCCTTCCCCGTTGACCGAGGCGGTCTCCCTAGAGTGCCCGAC ATTACTCGCTGGCAACTAAGGACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACCACCTCAC GGCACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCACCCCGCTCCCCGAAGGGCACTCCTCCTTT TCGGGAGGATTCGAGGGATGTCAAACCCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCAC ATACTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGCCTTGCGACCGTACTCCC CAGGCGGGATGCTTAATGCGTTAACTGCGGCACCGAAGATCGCTCCCCGACACCTAGCATCCAT CGTTTACAGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGCG TCAGTACCTGTCCAGGTGGCCGCCTTCGCCACCGGTGTTCCTCCGGATATCTACGGATTTCACTC CTACACCCGGAATTCCGCCACCCTCTCCAGGACTCAAGTCTCCCAGTATCGAACGCAGTTCCCC GGTTGAGCCGAGGGCTTTCACGTCCGACTTAAAAGACGGCCTACGCGCGCTTTACGCCCAGTGA TTCCGATTAACGCTTGCACCCTCCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGGAGTTAGCCGGTGCTTCC TCTGGAAGTACCGTCAGTCCCAAGGCTTGTTCAGCCTTGAGAGGTTCTTCCTTCCTGACAGAGGT TTACGACCCGAAAGCCTTCTTCCCTCACACGGCGTCGCTGCGTCAGGGTTTCCCCCATTGCGCAA TATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGACCGTGTTTCAGTTCCAGTGTGGCTGATCATC CTCTCAGACCAGCTACCCATCGTTGCCTTGGTGGGCCATTACCCCACCAACAAGCTAATGGGAC 78 GCGGACTCATCTCATTGCGACAGCTTGCAAGCAGAGGCCGCCTTTCCCCCAACCGAAATTGGAG CGTATCCGGTATTAGCGGCAGTTTCCCGCCGTTATCCCAAACAATGAGGGAGATAATCCACGCG TTACTCACCCGTGCGCCGCTCTACTCAGGGACCGAAGCCCCCTTTCTCGCACGACTTGCACGTGT TAAGCACGCCCCCACCGTTGATCTG 79 Phụ lục Các biểu đồ đƣờng chuẩn Đường chuẩn nồng độ sắt (II) y = 0.2733x + 0.0254 R2 = 0.9922 OD 510 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.5 1.5 2.5 Nồng độ sắt (II) (mg/l) Đường chuẩn nồng độ sulfide y = 0.0429x - 0.0098 R2 = 0.9989 OD 480 0.8 0.6 0.4 0.2 0 10 15 Nồng độ sulfide (mM) 80 20 25