Phân lập một số vi khuẩn có hoạt tính kitinaza và xác định một số đặc tính của enzym : Luận văn ThS. Sinh học: 60 42 40

Luận văn Thạc sĩ Khoa học ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Phạm Thị X PHÂN LẬP VI KHUẨN CĨ HOẠT TÍNH KITINAZA VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA ENZYM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2012 Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học Luận văn Thạc sĩ Khoa học ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Phạm Thị Xoè PHÂN LẬP VI KHUẨN CÓ HOẠT TÍNH KITINAZA VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA ENZYM Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: GS TS NGUYỄN ĐÌNH QUYẾN Hà Nội - 2012 Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học Luận văn Thạc sĩ Khoa học MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 SƠ LƯỢC VỀ KITIN 1.1.1 Nguồn gốc tồn kitin tự nhiên 1.1.2 Cấu trúc đặc tính kitin 1.1.3 Ơ nhiễm mơi trường có nguồn gốc kitin 11 1.1.4 Một sốquy trình sản xuất kitin 12 1.1.4 Quy trình sản xuất kitin Hackman [17] 12 1.1.4.2 Phương pháp điều chế kitin Capozza [34] 12 1.1.4 Quy trình sản xuất kitin tác giả Trần Thị Luyến [1,2] 13 1.1.5 Một số ứng dụng kitin 13 1.2 SƠ LƯỢC VỀ KITINAZA 16 1.2.1 Phân loại kitinaza 16 1.2.2 Cơ chế tác động kitinaza 19 1.2.3 Ảnh hưởng số yếu tố đến hoạt tính kitinaza 20 1.2.4 Các nguồn thu nhận kitinaza 21 1.2.5 Ứng dụng kitinaza.[9, 24] 24 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 26 2.1 VẬT LIỆU 26 2.1.2 Hoá chất, dụng cụ 26 2.1.3 Môi trường 27 Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học Luận văn Thạc sĩ Khoa học 2.2 PHƢƠNG PHÁP 30 2.2.1 Phân lập vi khuẩn 30 2.2.2 Xác định khả sinh kitinaza 31 2.2.3 Phương pháp xác định số lượng tế bào 32 2.2.4 Ảnh hưởng số điều kiện nuôi cấy đến khả sinh kitinaza chủng lựa chọn 33 2.2.5Xác định khả kháng nấm 34 2.2.6 Một số đặc tính sinh học chủng lựa chọn 34 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1 XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG SINH KITINAZA 36 3.2 ẢNH HƢỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN KHẢ NĂNG SINH KITINAZA CỦA CÁC CHỦNG LỰA CHỌN 39 3.2.1 Lựa chọn môi trường nuôi cấy 39 3.2.2 Ảnh hưởng nhiệt độ 40 3.2.3 Ảnh hưởng pH 43 3.2.4 Ảnh hưởng nồng độ chất 46 3.2.5 Ảnh hưởng thời gian bảo quản 49 3.3 HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM CỦA CHỦNG NGHIÊN CỨU 50 3.4 ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA CHỦNG NGHIÊN CỨU 51 KẾT LUẬN 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 PHỤ LỤC 60 Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học Luận văn Thạc sĩ Khoa học MỞ ĐẦU Vi sinh vật nhóm sinh vật có số lƣợng nhiều có khả chuyển hóa vật chất thiên nhiên mạnh Hiện ngƣời ta khai thác nhiều enzym từ vi sinh vật đƣợc ứng dụng nhiều đời sống, sản xuất So với nguồn khai thác enzym từ động vật thực vật, nguồn enzym từ vi sinh vật có nhiều ƣu điểm nhƣ hoạt tính enzym cao, thời gian tổng hợp enzym từ vi sinh vật ngắn (chỉ vài ngày), nguyên liệu sản xuất rẻ tiền sản xuất hồn tồn theo qui mô công nghiệp Nhiều enzym đƣợc khai thác từ vi sinh vật đƣợc tập trung nghiên cứu có nhiều ứng dụng thời gian qua nhƣ proteaza, amylaza, cellulaza,… Những năm sau ngƣời ta ý nhiều loại enzym khác kitinaza, enzym thủy phân kitin Kitinaza phổ biến sống đƣợc tìm thấy loài bao gồm vi khuẩn cổ, vi khuẩn, nấm, thực vật động vật Kitinaza phân huỷ kitin, polysaccarit dồi thứ hai tự nhiên sau xenlulơzơ Do đó, kitinaza quan trọng để trì cân cacbon nitơ bị mắc kẹt kitin, dạng khơng hịa tan Vì vậy, kitinaza công nghệ sinh học lớn đƣợc giới khoa học quan tâm lý do: thứ nhất, enzym đƣợc sử dụng để chuyển đổi phế liệu giàu kitin thành sản phẩm hữu ích; thứ hai, khai thác kitinaza dùng cho kiểm sốt mầm bệnh nấm trùng; thứ ba, kitinaza chất ức chế khả tăng trƣởng có chứa kitin (thực vật) mầm bệnh trùng bệnh dịch hạch cần kitinaza cho phát triển bình thƣờng [12, 19] Bên cạnh đó, Việt Nam nƣớc có điều kiện thiên nhiên ƣu đãi đặc biệt cho ngành nuôi trồng thuỷ sản Trong năm qua có Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học Luận văn Thạc sĩ Khoa học phát triển vƣợt bậc song song với phát triển đó, hàng năm nhà máy chế biến thuỷ sản nƣớc ta thải lƣợng phế liệu giàu kitin lớn Nguồn phế liệu thuỷ sản phần đƣợc sử dụng làm thức ăn gia súc số lại phần nhỏ sử dụng để sản xuất kitin chủ yếu thải gây nhiễm mơi trƣờng Vì nghiên cứu cơng nghệ tạo sản phẩm hữu ích từ nguồn phế liệu vấn đề ý nghĩa lí luận mà cịn có ý nghĩa thực tiễn thiết thực Tuy nhiên việc ứng dụng kitin kitinaza cho sản xuất sản phẩm có ý nghĩa việc không dễ dàng Dù kitin đƣợc sản xuất hàng năm với số lớn nhƣng khó tinh chế có mặt prơtêin CaCO3 Thêm vào q trình xử lý cần trung hồ bazơ axit, q trình tẩy rửa gây nhiễm mơi trƣờng nƣớc Vì sử dụng trình sinh học để tách chiết kitin điều cần thiết [40] Thêm vào vi sinh vật phân giải kitin có nhiều nhƣng việc phân lập xác định hoạt tính kitinaza chúng cịn nhiều khó khăn đặc biệt việc xác định điều kiện tối ƣu Trong trình xác định hoạt tính có nhiều yếu tố ảnh hƣởng, đồng thời khoảng giới hạn hoạt động yếu tố ảnh hƣởng thƣờng lớn thay đổi lồi vi sinh vật Với ý nghĩa thực tiễn thực đề tài “ Phân lập số vi khuẩn có hoạt tính kitinaza xác định số đặc tính enzym” nhằm góp phần cung cấp thêm vào bảo tàng giống số chủng vi khuẩn có hoạt tính kitinaza cao, nghiên cứu số đặc tính chúng để ứng dụng vào thực tiễn sản xuất tạo chế phẩm vi sinh có hiệu cao mang lại lợi ích cho ngƣời Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học Luận văn Thạc sĩ Khoa học Chƣơng I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 SƠ LƢỢC VỀ KITIN 1.1.1 Nguồn gốc tồn kitin tự nhiên Kitin polysaccarit tồn tự nhiên với sản lƣợng lớn (đứng thứ sau xenlulơzơ) Kitin phổ biến tự nhiên đƣợc tìm thấy nhƣ vật liệu cấu trúc loài sinh vật sống [41] Ở số động vật nguyên sinh có tiêm mao, roi amip kitin cấu tạo nên vỏ bào xác Một số tảo (nhƣ tảo silic, tảo cát) nấm (nhƣ Candida albicans, Neurospora crassa,…) kitin thành phần thành tế bào Động vật khơng xƣơng sống nhƣ giun trịn, chân đốt, thân mềm côn trùng,…kitin thành phần chủ yếu xƣơng Trong động vật bậc cao monome kitin thành phần chủ yếu mơ da giúp cho tái tạo găn liền vết thƣơng da [29, 44] Trong lồi thủy sản đặc biệt vỏ tơm, cua, ghẹ hàm lƣợng kitin cao Vì vậy, vỏ tơm, cua, ghẹ thƣờng ngun liệu để sản xuất kitin Kitin có khối lƣợng phân tử lớn, cấu trúc phức tạp, tập hợp monosaccarit ( N-acetyl- β-D-glucôzamine) liên kết với cầu nối glucôzit hình thành mạng sợi có tổ chức Hơn nữa, kitin tồn trạng thái tự hầu nhƣ luôn nối cầu nối đẳng trị với prôtêin, CaCO3 hợp chất phản ứng khác.[29, 44] Về mặt lịch sử, kitin dƣợc Henry Braconnot phát vào năm 1811 cặn dịch chiết từ loại nấm Năm 1823 Galier phân lập đƣợc chất từ bọ cánh cứng mà ông gọi kitin Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học Luận văn Thạc sĩ Khoa học 1.1.2 Cấu trúc đặc tính kitin 1.1.2.1 Cấu trúc kitin Qua nghiên cứu thuỷ phân kitin enzym hay HCl đậm đặc ngƣời ta thấy kitin chuỗi polysaccarit N- acetyl-D- glucozamin đƣợc tạo lên mối liên kết β (1-4) glicozit với công thức tổng quát (C8H15O5N)n Các chuỗi kitin riêng rẽ dạng xoắn phân tử đƣờng bị đảo ngƣợc so với phân tử đƣờng cạnh, dẫn đến ổn định cấu trúc chúng [15] Hơn nữa, cấu trúc kitin gần giống với xenlulozơ, khác vị trí C2 nhóm (- OH) monome đƣợc thay nhóm acetyl amin (- NHCOCH3) Chính khác biệt tăng cƣờng liên kết hiđrơ polyme liền kề, tăng độ bền ma trận kitin Cấu trúc hoá học kitin đƣợc thể qua hình Hình Cấu trúc hoá học kitin Bằng phƣơng pháp nhiễu xạ tia X ngƣời ta chứng minh đƣợc kitin có ba dạng cấu trúc dị hình α, β γ- kitin dạng phổ biến α - kitin Các dạng kitin xếp khác hƣớng mắt xích (N- acetyl- Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học Luận văn Thạc sĩ Khoa học D glucozamin) mạch Có thể biểu diễn mắt xích mũi tên cho phần đầu mũi tên nhóm (- CH2OH), phần mũi tên nhóm ( NHCOCH3), cấu trúc α, β γ kitin đƣợc mô tả nhƣ sau.[13, 28, 36, 45] Dạng α- kitin Dạng β- kitin Dạng γ- kitin Dạng α- kitin đƣợc tìm thấy khoang thuỷ tức,bộ xƣơng ngồi động vật chân đốt, vỏ giun trịn, bào động vật thân mềm Do cách xếp nhƣ vậy, ngồi có liên kết hiđrơ lớp cịn có liên kết hiđrơ lớp, xếp theo nguyên tắc đối song song tạo kitin bền vững Dạng βkitin tìm thấy tảo silic, xƣơng ngồi trùng, kén thành phần thành tế bào nấm, vỏ động vật thân mềm số động vật chân đốt Dạng γkitin hỗn hợp hai dạng α β- kitin có dày mực ống, hai dạng β γ- kitin xếp chiều monome khác biệt so với dạng α- kitin nhƣ miêu tả dẫn đến dạng bền dễ thối hố 1.1.2.2 Đặc tính kitin.[29] Kitin có mầu trắng hay trắng phớt hồng, khơng mùi, khơng vị, khơng tan nƣớc, mơi trƣờng kiềm, axít lỗng dung mơi hữu nhƣ rƣợu, ete,…nhƣng tan số dung dịch kiềm đặc nóng Kitin ổn định với chất ơxi hố mạnh nhƣ thuốc tím( KMnO4) ơxi già (H2O2), nƣớc ja ven,…lợi dụng tính chất ngƣời ta sử dụng chất oxi hoá để khử màu cho kitin Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đun nóng dung dịch NaOH đậm đặc (40-50%) nhiệt độ cao kitin bị gốc acetyl trở thành kitosan dung dịch HCl đậm đặc kitin bị cắt mạch thu đƣợc glucozamin Kitin dễ dàng bị phân huỷ việc phân cắt liên kết glicôzit dƣới tác dụng kitinaza đƣợc tiết số vi sinh vật, thực vật động vật [7, 16, 2014] Kitin Kitin Deacetylaza Kitinaza (GlcNAc)2 Kitosan N- Acetyl Glucozamindaza kitosanaza GlcNAc (GlcN)2 Deacetylaza Glucozamindaza GlcN Hình 2: Con đƣờng phân giải kitin Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 10 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Cũng giống nhƣ loại chất, cho dù sử dụng hai phƣơng pháp khác để xác định điều kiện sinh kitinaza kết không thay đổi 3.2.5 Ảnh hưởng thời gian bảo quản Sau ngày nuôi cấy lắc, đem li tâm thu dịch enzym bảo quản 40 C Cứ sau tuần tiến hành thử hoạt tính enzym theo phƣơng pháp nhỏ dịch Kết thu đƣợc bảng Thời gian tuần tuần tuần tuần Hoạt tính kitinaza ( mm) HD1 HD5 Kitin tinh 24 25 Kitin thô 20 21 Kitin tinh 23 24 Kitin thô 20 21 Kitin tinh 22 22 Kitin thô 19 19 Kitin tinh 22 21 Kitin thơ 19 18 Bảng 7: Hoạt tính phân giải kitin chủng HD1 HD5 dƣới ảnh hƣởng thời gian bảo quản Nhƣ vậy, thời gian bảo quản có ảnh hƣởng khơng đáng kể đến hoạt tính enzym Tính ổn định enzym sau nhiều tuần bảo quản tạo chế phẩm sinh học đảm bảo Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 49 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Từ kết nghiên cứu thấy rằng, chủng HD1 HD5 đƣợc phân lập từ mẫu đất có bổ sung nguồn chất ( kitin) hoạt động mạnh dải nhiệt độ từ 30- 400 C, dải pH từ 6,5- 7,5 nồng độ chất 5‰ - 15‰ Tuy tiến trình làm thí nghiệm có sử dụng phƣơng pháp đơn giản nhƣng kết đảm bảo độ xác so với phƣơng pháp đại ngồi nƣớc nay.[3, 42] 3.3 HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM CỦA CHỦNG NGHIÊN CỨU Từ chủng nấm đƣợc tách thể bọ xít ( phụ lục 04 ), tiến hành nghiên cứu khả kháng loại nấm chủng HD1 HD5 Khả kháng nấm đƣợc xác định phƣơng pháp nhỏ dịch môi trƣờng Czapek có bổ sung 18 gam thạch xác định hoạt tính cách đo đƣờng kính vịng phân giải Kết thu đƣợc bảng Môi trƣờng Hoạt tính kháng nấm ( mm) HD1 HD5 Kitin tinh 25 28 Kitin thơ 19 20 Bảng 8: Hoạt tính phân giải kitin chủng HD1 HD5 Từ kết thấy rằng, chủng có khả kháng nấm kí sinh vỏ trùng Điều giải thích rằng, vỏ trùng với thành phần kitin, nấm hại trùng có hoạt tính kitinaza kí sinh gây chết trùng Thành phần cấu tạo thành tế bào nấm chứa kitin, kitinaza chủng HD1 HD5 phân giải kitin nấm tạo vòng phân giải Phƣơng pháp đƣợc nhiều nƣớc giới áp dụng để xác định khả kháng nấm, Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 50 Luận văn Thạc sĩ Khoa học phƣơng pháp đơn giản nhƣng không ảnh hƣởng đến kết nghiên cứu định tính [32] 3.4 ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA CHỦNG NGHIÊN CỨU Các chủng nghiên cứu đƣợc tiến hành kiểm tra đặc điểm sinh học để bƣớc đầu phân loại theo phƣơng pháp vi sinh thông thƣờng Kết bảng Nội dung Hình dạng khuẩn lạc Hình thái tế bào Nhuộm Gram Hình thành nội bào HD1 HD5 Trịn, nhẵn bóng, trắng Trịn, khơng bóng, đục, nhầy trắng đục, mép nhăn Que, ngắn, rời rạc Que, ngắn, rời rạc xếp chuỗi ngắn xếp chuỗi ngắn Gram dƣơng Gram dƣơng Có Có tử Bảng 9: Một số đặc tính sinh học chủng nghiên cứu Căn đặc điểm đối chiếu với bảng phân loại Bergeycó thể khẳng định chủng nghiên cứu có khả thuộc chiBacillus Từ sở lý thuyết thực tiễn nhận thấy, công tác bảo vệ trồng việc sử dụng loại thuốc hoá học ngày khiến cho môi trƣờng bị ô nhiễm trầm trọng Kéo theo hệ sinh thái bị suy thoái, cân sinh Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 51 Luận văn Thạc sĩ Khoa học học Nhƣ việc thay loại thuốc hoá học chế phẩm sinh học công việc cấp thiết Một tác nhân gây hại cho thực vật phải kể đến loại nấm, trùng chích hút giun ăn rễ Đặc điểm chung tác nhân gây hại chúng có thành tế bào lớp vỏ kitin, loại polysaccarit phổ biến tự nhiên Thêm vào đó, thân thực vật, vi sinh vật đất chứa lƣợng kitinaza lớn Vì vậy, nghiên cứu chế phẩm sinh học có hoạt tính kitinaza để ứng dụng cơng tác bảo vệ thực vật nói riêng bảo vệ mơi trƣờng nói chung cần thiết Một thực tiễn cho thấy, năm qua, dịch ốc bƣơu vàng bùng phát nƣớc ta, bà nông dân thu thập ốc làm nguồn thức ăn cho chăn nuôi, nhƣng ngƣợc lại vỏ ốc chất đống gây nhiễm môi trƣờng trầm trọng Với hàm lƣợng cao sản phẩm phế liệu này, không tận dụng chúng để tạo sản phẩm hữu ích Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 52 Luận văn Thạc sĩ Khoa học KẾT LUẬN Từ mẫu đất làm giàu, phân lập đƣợc 35 chủng vi khuẩn Tiến hành thử hoạt tính có 11 chủng có hoạt tính kitinaza Chọn lọc chủng sinh kitinaza cao xác định đƣợc nhiệt độ tối ƣu chủng HD1 400C, chủng HD5 là350 C PH tối ƣu chủng HD1 là7,0; chủng HD5 là7,5 nồng độ chất tối ƣu hai chủng HD1 HD5 15‰ Thử hoạt tính kitinaza chủng kitin thô kitin tinh chế thấy nhiệt độ, pH nồng độ chất tối ƣu khơng đổi Hoạt tính enzym tƣơng đối ổn định sau tuần bảo quản 40C Nếu điều kiện khơng có kitin tinh chế sử dụng kitin thơ độ xác đảm bảo Cả chủng có hoạt tính kháng nấm Có thể khẳng định chủng thuộc chi Bacillus Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 53 Luận văn Thạc sĩ Khoa học KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu tạo chế phẩm kitinaza sinh học ứng dụng vào sản xuất góp phần giảm nhiễm mơi trƣờng từ nguồn phế liệu giàu kitin Tiếp tục nghiên cứu ứng dụng cơng nghệ chuyển gen có hoạt tính kitinaza để tăng lồi sinh vật có khả phịng trừ nấm hại Nghiên cứu ứng dụng sản phẩm kitin thô bảo vệ thực vật Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 54 Luận văn Thạc sĩ Khoa học TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Đặng Văn Luyến, “Chitin/Chitosan” Các giảng báo cáo chuyên đề, tập 2, tr 27-35, 1995 Trần Thị Luyến, Huỳnh Nguyễn Duy Bảo số cộng “ Hồn thiện quy trình sản xuất Chitin-Chitosan chế biến số sản phẩm công nghiệp từ phế liệu vỏ tôm, cua” Báo cáo khoa học, Đề tài cấp Nha Trang.2000 Isolation and Characterization of Halophilic Alkaliphilic Bacteria Producing Protease and their Use to Accelerate Fish Sauce Fermentation Nguyễn Văn Lâm1, Nguyễn Phƣơng Nhuệ2, Trịnh Thị Ngọc Tài liệu nƣớc Anand A, Lei ZT, Sumner LW, Mysore KS, Arakane Y, Bockus WW, Muthukrishnan S 2004 Mol Plant Microbe In 17 (12): 1306-1317 Baneriee U.C., Sani R.K.,Azmi W.,Soni R (1999), “ Thermostable alkaline chitinase from Bacillus brevis and its characterization as a laundry detergent additive”, Biochemistry, 35 (1-2), pp 213-19 Cottrell MT, Moore JA, Kirchman DL 1999 Appl Environ Microb, 65 (6): 2553-2557 Davis, B., and Eveleigh , D E., 1984, Chitosanase: Occurrence, production and immobilization, in: Chitin, Chitosan and Related Enzymes ( J P Zikakis, ed), pp 161- 179, Academic Press, Orlando Deshpande, MV 1986 Journal of Scientific and Industrial Research 45:273281 Enzymology, RAA Muzzarelli (ed) Atec Edizioni, Italia 2:125- 133 10 Flach J., Pilet PE, and Jolles P.1992 Experientia 48, pp-701-716 Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 55 Luận văn Thạc sĩ Khoa học 11.Fergus G.Priest, Extraccellular Enzyme Synthesis in the genus Bacillus, Bacteriologycal Reviews, 41 (3), p 711- 753 12.Fuchs, RL, McPherson, SA and Drahos, DJ1986 Appl Environ Microbiol 51, 504 13.Gardner, H H., and Blackwell, J., 1975, Refinement of the structure of βchitin, Biopolymers 14: 1581- 1595 14 Gokul, B Lee, JH Song, KB Rhee, SK Kim, CH Panda, T 2000, Bioprocess Eng 23(6):691-694 15.Gooday, G.W., 1983, The microbial synthesis of cellulose, chitin and chitosan, Pro Ind Microbiol 18: 85- 127 16.Goorich, T D., and Morita, R Y., 1977a, Incidence and estimation of chitinase activity associated with marine fish and other estuarine sample, Mar Biol 41: 349- 353 17.Hackman R.H (1962) Studies on Chitin Action of Mineral Acids on Chitin Australian Journal of Biological Sciences 15 (3): 526- 532 18 Henrissat BI and Bairoch A 1993 Biochem J., 293, 781-788 19.Herrera-Estrella A & Chet, I 1999 EXS 87, 171 20.Hillman, K., Gooday, G W., and prosser, J I., 1989, A simple model system for small scale in vitro study of estuarine sediment ecosystems, Lett Appl Microbiol 8: 41- 44 21.Kenneth J.Ryan (2004), Bacillus, Shrris Medical Microbiology 22 Koga D, Hoshika H, Matsushita M, Tanaka A, Ide A, Kono M 1996 Biosci Biotech Bioch 60 (2): 194-199 23 Linden, J., Stoner, R., Knutson, K Gardner-Hughes, C "Organic Disease Control Elicitors" Agro Food Industry Hi-Te p12-15 Oct 2000 Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 56 Luận văn Thạc sĩ Khoa học 24.Lorito M, Sheridan I., Woo, Gary EH, Sposato P., Muccifora S and Scala F.1996 Genes enconding for chitinolytic enzymes from biocontrol fungi: applications for plant disease control In: Chitin Enzymology RAA Muzzarelli (ed) Atec Edizioni, Italia.2:95-101 25.Lutz, MP, Wenger S., Maurhofer, M., Dèfago G., Duffy B 2004 FEMS Microbiol Ecol 48:447-455 26 Mayer RT, McCollam TG, Niedz RP, Hearn CJ, McDonald RE, Berdis E, Doostdar H 1996 Planta 200 (3): 289-295.(25cũ) 27.Melchers, LS & Stuiver, MH 2000.Curr Op Plant Biol 3, 147.(26cũ) 28.Minke, R., and Blackwell, J., 1978, The structure of α- chitin, J Mol Biol 120: 167- 181 29.Mitchen, R., and Alexander, M., 1962, Microbiological processes associated with the use of chitn for biological control, soil Sci Soc Am Proc 26: 556558 30.Natural Photonics Group Dr Peter Vukusic, Roy Sambles University of Exeter "Wing scales diffract and scatter light: Morpho butterflies" The Biomimicry Institute Retrieved April 8, 2012 31.Patil R, Ghormade V, Deshpande M 2000 Enzyme Microb Technol, 26:473- 483.37 Adams, DJ 2004 Microbiology, 150:2029-2035 32.Perez C and C Anesini 1993 In vitro antimicrobial activity of Argentine folk medicinal plants against Salmonella typhii Journal of Ethnopharmacology 44: 41-46 33.Revah-Moiseev, S and Carroad, PA 1981 Biotechnol Bioeng, 23:10671078 34.Richard Carl Capozza, US Pat N04074713 Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 57 Luận văn Thạc sĩ Khoa học 35 Rojas-Avelizapa LI, Cruz-Camarillo R, Guerrero MI, Rodriguez-Vazquez R, Ibarra JE 1999 World J Microb Biot 15 (2): 299-308 36.Rudall, K M., and Kenchington, W , 1973, The chitin system, Biol Rev 48: 597- 636 37.Rudrapatnam N., Tharanathan and Farooqahmed S Kittur 2003 Crit Rev Food Sci Nutr, 43(1):61.87 38.Sahai, AS and Manocha, MS 1993 FEMS Microbiol Rev., 11:317-338 39.Salzer P, Feddermann N, Wiemken A, Boller T, Staehelin C 2004 Planta 219 (4): 626-638 40.Simpson, BK; Gagne, N and Simpson, MV 1994 Bioprocessing of chitin and chitosan In: Fisheries Processing: Biotechnological applications AM Martin (Ed.) Chapman and Hall London.155-173 41.Shirai, K., Guerrero, I and Hall, GM 1996 La quitina, ocurrencia, propiedades yaplicaciones Ciencia 47 (4):317-328 42.S.Kavi Karunya, D.Reetha, P.Saranraj and D John Milton Department of Microbiology,Annamalai University,Chidambaram – 608 002, India Received 24 Aug 2011; Revised 26 Oct 2011; Accepted 07 Nov 2011 43.Smucker, R.A., 1984, Biochemistry of the streptomyces spore sheath, in: Biologycal, Biochemical and Biomedical Aspects of Actinomycetes ( L Ortiz- Ortiz, L F Bojalib, and V Yakoleff, eds.), pp 171- 177, Academic Press, Orlando 44.Smucker, R.A., and Dawson, R., 1986, products of phytosynthesis by marine phytoplankton: chitin in CTA „ protein‟ precipitase, J Exp Mar Biol Ecol 104: 397- 408 45.Sundheim, L., Poplawsky, AR & Ellingboe, AH 1988 Phys Mol Plant Path 33, 483 Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 58 Luận văn Thạc sĩ Khoa học 46.S.Kavi Karunya, D.Reetha, P.Saranraj and D John Milton Department of Microbiology,Annamalai University,Chidambaram – 608 002, India Received 24 Aug 2011; Revised 26 Oct 2011; Accepted 07 Nov 2011 47.Todar‟s online Textbook of bacteriology ( 2008), Gram positive aerotic or faculative endospore forming bacteria ( formerly, „the genus Bacillus”) Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 59 Luận văn Thạc sĩ Khoa học PHỤ LỤC Phụ lục 01 Nhiệt độ C Số lƣợng tế bào ( x 108 CFU/ ml) 25 30 35 40 45 50 HD1 HD5 Kitin tinh 14 12 Kitin thô Kitin tinh 18 16 Kitin thô 10 10 Kitin tinh 22 18 Kitin thô 15 14 Kitin tinh 30 Kitin thô 16 Kitin tinh 10 Kitin thô 4 Kitin tinh 4 Kitin thô 2 Bảng 10:Số lƣợng tế bào chủng nghiên cứu nhiệt độ khác Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 60 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Phụ lục 02 Số lƣợng tế bào pH ( x 108 CFU/ ml) 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 HD1 HD5 Kitin tinh Kitin thô Kitin tinh 12 Kitin thô Kitin tinh 16 10 Kitin thô 10 Kitin tinh 18 14 Kitin thô 14 10 Kitin tinh 10 16 Kitin thô 12 Kitin tinh 6 Kitin thô 4 Bảng 11:Số lƣợng tế bào chủng nghiên cứu pH khác Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 61 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Phụ lục 03 Nồng độ chất (%) 5‰ 10‰ 15‰ 20‰ 25‰ Hoạt tính enzym (mm) HD1 HD5 Kitin tinh 24 20 Kitin thô 22 18 Kitin tinh 30 30 Kitin thô 24 26 Kitin tinh 36 34 Kitin thô 28 28 Kitin tinh 34 34 Kitin thô 28 28 Kitin tinh 34 34 Kitin thô 28 26 Bảng 12:Số lƣợng tế bào chủng nghiên cứu nồng độ chất khác Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 62 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Phụ lục 04 Hình 10: Nguồn nấm Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 63