Nghiên cứu phân loại xạ khuẩn biến sinh kháng sinh phân lập từ các vùng ven biển Việt Nam : Luận văn ThS. Sinh học: 60 42 70

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - HỒ VĂN HOÀN NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI XẠ KHUẨN BIỂN SINH KHÁNG SINH PHÂN LẬP TỪ CÁC VÙNG VEN BIỂN VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÀ NỘI – 2013 i ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - HỒ VĂN HOÀN NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI XẠ KHUẨN BIỂN SINH KHÁNG SINH PHÂN LẬP TỪ CÁC VÙNG VEN BIỂN VIỆT NAM Chuyên ngành: Mã số: Di truyền học 60.42.70 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS Nguyễn Phƣơng Nhuệ HÀ NỘI – 2013 ii CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN CKS Chất kháng sinh CW Cell wall DAP Diaminopienat DNA Deoxyribose nucleic axit ĐHSP Đại học sƣ phạm KHKT Khoa học kĩ thuật KTCC Khuẩn ti chất KTKS Khuẩn ti khí sinh NXB Nhà xuất PG Peptidoglycan RNA Ribonucleoic axit TNTĐCNG Thí nghiệm trọng điểm cơng nghệ gene VKK Vịng kháng khuẩn v DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Các chất kháng sinh từ xạ khuẩn biển Bảng 2.1 Các thiết bị sử dụng đề tài Bảng 3.1 Hoạt tính đối kháng vi sinh vật kiểm định chủng xạ khuẩn Bảng 3.2 Mầu sắc chủng xạ khuẩn môi trƣờng ISP khác Bảng 3.3 Khả sử dụng nguồn nitơ chủng xạ khuẩn Bảng 3.4 Khả sử dụng nguồn cacbon chủng xạ khuẩn Bảng 3.5 Khả sinh trƣởng xạ khuẩn nồng độ NaCl khác Bảng 3.6 Khả sinh trƣởng chủng xạ khuẩn NA113 NA115 điều kiện nhiệt độ khác Bảng 3.7 Khả sinh trƣởng xạ khuẩn điều kiện pH khác Bảng 3.8 So sánh đặc điểm phân loại chủng xạ khuẩn NA113 với chủng xạ khuẩn S scabies ISP 5058 Bảng 3.9 So sánh đặc điểm phân loại chủng xạ khuẩn NA115 với chủng chuẩn S tendae ISP 5101 Bảng 3.10 Kết so sánh trình tự gene mã hóa 16S-rRNA chủng NA113 với gene tƣơng ứng chủng vi khuẩn đƣợc đăng ký GenBank Bảng 3.11 Kết so sánh trình tự gene mã hóa 16S-rRNA chủng NA115 với gene tƣơng ứng chủng vi khuẩn đƣợc đăng ký GenBank Bảng 3.12 Khả sinh chất kháng sinh môi trƣờng lên men khác chủng xạ khuẩn NA113 NA115 Bảng 3.13 Ảnh hƣởng nguồn cacbon nitơ đến hoạt tính kháng khuẩn chủng NA113 NA115 Bảng 3.14 Ảnh hƣởng pH ban đầu độ thống khí đến hoạt tính kháng sinh Bảng 3.15 Phổ hoạt tính kháng sinh hai chủng xạ khuẩn NA113 NA115 vi DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1 Cấu trúc Abyssomicin C Trioxacacin Hình 1.2 Cấu trúc Diazepinomicin Hình 1.3 Cấu trúc deoxynyboquinone (1) pseudonocardian A-C (2-4) Hình 3.1 Tỉ lệ chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Hình 3.2 Hoạt tính kháng khuẩn chủng xạ khuẩn Hình 3.3 Hình thái khuẩn lạc chủng NA113 mơi trƣờng ISP2, ISP3 Hình 3.4 Hình thái khuẩn lạc chủng NA115 mơi trƣờng ISP2, ISP3 Hình 3.5 Cuống sinh bào tử (A) bề mặt bào tử (B) chủng NA113 Hình 3.6 Cuống sinh bào tử (A) bề mặt bào tử (B) chủng NA115 Hình 3.7 Khả sinh trƣởng chủng NA113 môi trƣờng có pH khác Hình 3.8 Khả sinh trƣởng chủng NA115 mơi trƣờng có pH khác Hình 3.9 Kết điện di DNA tổng số hai chủng xạ khuẩn gel agarose 1% Hình 3.10 Kết điện di sản phẩm PCR gel agarose 1% Hình 3.11 Cây phân loại chủng NA113 số chủng xạ khuẩn Hình 3.12 Cây phân loại chủng NA115 số chủng xạ khuẩn vii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i LỜI CAM ĐOAN iv CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN v DANH MỤC BẢNG BIỂU vi DANH MỤC HÌNH VẼ vii MỤC LỤC viii MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan xạ khuẩn 1.1.1 Phân bố xạ khuẩn tự nhiên 1.1.2 Đặc điểm sinh học xạ khuẩn 1.1.3 Sự hình thành bào tử xạ khuẩn 1.2 Phân loại xạ khuẩn 1.2.1 Phân loại theo đặc điểm hình thái tính chất ni cấy 1.2.2 Đặc điểm hóa phân loại (Chemotaxonomy) 1.2.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 1.2.4 Phân loại số (Numerical Taxonomy) 1.2.5 Phân loại xạ khuẩn phương pháp giải trình tự gene 16SrDNA 1.3 Các chất kháng sinh từ xạ khuẩn biển 10 1.3.1 Nhóm chất kháng sinh polyketide 10 1.3.2 Nhóm kháng sinh Non-ribosomal peptide 11 1.3.3 Nhóm kháng sinh phức hợp Polyketide-Nonribosomal peptide 12 1.3.4 Nhóm kháng sinh isoprenoid 12 1.3.5 Các chất kháng sinh khác 13 1.4 Sự tạo thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn 15 1.4.1 Cơ chế hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn 15 1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh từ xạ khuẩn 16 1.5 Tình hình nghiên cứu vi sinh vật biển sinh kháng sinh 17 1.5.1 Tình hình nghiên cứu vi sinh vật biển sinh kháng sinh nước 17 1.5.2 Tình hình nghiên cứu vi sinh vật biển sinh kháng sinh giới 18 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Vật liệu hóa chất dùng nghiên cứu 21 2.1.1 Vật liệu 21 2.1.2 Hóa chất thiết bị 21 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 22 viii 2.2.1 Phương pháp lấy mẫu 22 2.2.2 Phương pháp xác định thành phần số lượng vi sinh vật mẫu 22 2.2.3 Tuyển chọn chủng vi sinh vật sinh kháng sinh 23 2.2.4 Nghiên cứu đặc điểm sinh học để phân loại xạ khuẩn 24 2.2.5 Phân loại xạ khuẩn phương pháp sinh học phân tử 26 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Phân lập tuyển chọn chủng xạ khuẩn biển sinh kháng sinh 29 3.2 Đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn 32 3.2.1 Đặc điểm nuôi cấy 32 3.2.2 Đặc điểm hình thái 34 3.3 Đặc điểm sinh lí - sinh hóa 35 3.3.1 Khả sử dụng nguồn nitơ 35 3.3.2 Khả đồng hóa nguồn cacbon 36 3.3.3 Khả chịu muối NaCl 38 3.3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh trưởng 38 3.3.5 Ảnh hưởng độ pH 39 3.4 Kết phân loại chủng xạ khuẩn NA113 NA115 40 3.4.1 Phân loại dựa vào đặc điểm hình thái, sinh lí-sinh hóa 40 3.4.2 Phân loại chủng xạ khuẩn phương pháp sinh học phân tử 43 3.5.1 Lựa chọn môi trƣờng lên men 48 3.5.2 Ảnh hưởng nguồn cacbon nguồn nitơ 49 3.5.3 Ảnh hưởng pH môi trường độ thống khí 51 3.6 Phổ hoạt tính kháng sinh chủng xạ khuẩn nghiên cứu 52 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 53 KẾT LUẬN 53 ĐỀ NGHỊ 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 PHỤ LỤC 1: VỊ TRÍ LẤY MẪU VÙNG VEN BIỂN 58 PHỤ LỤC 2: CÁC LOẠI MÔI TRƢỜNG DÙNG TRONG ĐỀ TÀI 59 PHỤ LỤC 3: VI SINH VẬT KIỂM ĐỊNH 61 PHỤ LỤC 4: TRÌNH TỰ GENE MÃ HĨA 16S-rRNA 62 ix MỞ ĐẦU Vùng biển Việt Nam có diện tích khoảng 1.000.000 km2 3.260 km bờ biển (khơng tính đảo), với điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa, tạo cho nƣớc ta tính đa dạng cảnh quan tự nhiên nguồn lợi thuỷ sinh vật Với mong muốn khám phá, khai thác sử dụng hợp lý nguồn tài nguyên phong phú biển, nhiều nghiên cứu khoa học gần đây, công nghệ sản xuất sinh học chuyển dần từ khai thác sang tìm hiểu, ứng dụng đƣa vào sản xuất nguồn nguyên liệu từ vùng nƣớc ngập mặn, biển xa bờ, chí đáy biển sâu để sinh trƣởng bền vững dựa sở công nghệ Xạ khuẩn (Actinomycetes) nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rộng rãi tự nhiên Xạ khuẩn đƣợc quan tâm nghiên cứu nhiều có khả sản xuất sản phẩm trao đổi chất quan trọng Trong số 8000 chất kháng sinh đƣợc biết giới có 80% có nguồn gốc từ xạ khuẩn chủ yếu từ chi Streptomyces Micromonospora Giai đoạn năm 1980 trở trƣớc nhà nghiên cứu chủ yếu tập trung vào khám phá chủng xạ khuẩn mặt đất Từ vài thập kỷ trở lại nhà khoa học phát chủng xạ khuẩn biển có nhiều đặc tính q nhƣ: khả sản xuất kháng sinh có phổ kháng khuẩn rộng, ức chế tế bào ung thƣ… có ý nghĩa ứng dụng y học [1] Cùng với sinh trƣởng công nghệ sinh học đại, nghiên cứu ứng dụng xạ khuẩn biển thu đƣợc nhiều thành tựu to lớn sản xuất sinh khối, dƣợc phẩm… đƣợc sử dụng ngành công nghiệp, y dƣợc học, nông nghiệp… Trong lĩnh vực y dƣợc, sản xuất chất kháng sinh có ý nghĩa lớn đời sống, góp phần đẩy lùi bệnh tật nâng cao sức khỏe cộng đồng Tuy nhiên, việc lạm dụng thuốc kháng sinh dẫn đến tƣợng nhờn thuốc làm ảnh hƣởng đến kết điều trị bệnh Việc tìm chất kháng sinh có hoạt tính kháng khuẩn cao từ nguồn khác nhau, đặc biệt từ biển, trở thành nhu cầu cấp thiết Bên cạnh đó, nghiên cứu phân loại chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh quan trọng, nghiên cứu giúp định hƣớng sản xuất sản phẩm hữu ích từ chủng xạ khuẩn biển, góp phần đánh giá đa dạng vi sinh vật biển Xuất phát từ định hƣớng trên, thực đề tài: “Nghiên cứu phân loại xạ khuẩn biển sinh kháng sinh phân lập từ vùng ven biển Việt Nam” Mục tiêu: Tuyển chọn phân loại chủng xạ khuẩn biển có khả tổng hợp kháng sinh cao định hƣớng ứng dụng y dƣợc Nội dung nghiên cứu: - Phân lập tuyển chọn xạ khuẩn sinh kháng sinh từ nƣớc, bùn vùng biển Bắc, Trung, Nam - Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn lựa chọn - Phân loại chủng xạ khuẩn tuyển chọn theo phƣơng pháp giải trình tự gene 16S-rRNA - Nghiên cứu số điều kiện thu nhận chất kháng sinh từ chủng xạ khuẩn tuyển chọn phịng thí nghiệm CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan xạ khuẩn 1.1.1 Phân bố xạ khuẩn tự nhiên Xạ khuẩn (Actinomycetes) nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria), phân bố rộng rãi tự nhiên: đất, nƣớc, phần bùn chất hữu khác, chí chất mà vi sinh vật khác không sinh trƣởng đƣợc Số lƣợng xạ khuẩn đất không phụ thuộc vào loại đất mà phụ thuộc vào mức độ canh tác đất khả bao phủ thực vật Đất giàu dinh dƣỡng lớp đất bề mặt thƣờng có số lƣợng lớn xạ khuẩn Trong gam đất canh tác phân lập đƣợc triệu mầm xạ khuẩn, đất hoang hóa có 10 – 100 nghìn mầm Số lƣợng xạ khuẩn đất thay đổi theo thời gian năm [7] Xạ khuẩn thƣờng sống hoại sinh xác sinh vật (cây chết, rơm rạ) nhƣng kí sinh thân, củ rễ Xạ khuẩn biển thƣờng đƣợc phân lập từ cát biển, đất ngập mặn, trầm tích biển độ sâu khác sinh vật khác nhƣ san hơ, rong biển Trƣớc đó, ngƣời ta tin xạ khuẩn biển có nguồn gốc từ cạn Tuy nhiên, sau có nhiều nghiên cứu rằng, nhiều nhóm xạ khuẩn có nguồn gốc từ biển Xạ khuẩn biển thƣờng có khả chịu mặn cao, đặc biệt có chủng Streptomyces ssp sinh trƣởng đƣợc nồng độ NaCl 16% nhiều loài thuộc chi Streptomyces Nocardia sinh trƣởng tốt nồng độ NaCl 10%, Micromonospora sp Salinospora sp có khả chịu mặn cao [24, 25] 1.1.2 Đặc điểm sinh học xạ khuẩn Ở môi trƣờng đặc, xạ khuẩn sinh trƣởng thành khuẩn lạc khơ, kích thƣớc khuẩn lạc thay đổi tùy loài điều kiện ngoại cảnh Khuẩn lạc xạ khuẩn không trơn, ƣớt nhƣ vi khuẩn, nấm men mà thƣờng có dạng thơ ráp, có nếp tỏa theo hình phóng xạ Do có tên gọi xạ khuẩn (Actinomycetes, Bảng 3.12 Hoạt tính kháng khuẩn chủng xạ khuẩn NA113 NA115 môi trƣờng lên men khác Chủng xạ khuẩn Mơi trƣờng lên men, Đƣờng kính vịng kháng khuẩn (mm) 48 MT7 79 M1-ASW A4H MPM MPG NA113 23 17 14 14 NA115 12 - 16 23 22 - - Chủng NA113 có hoạt tính mạnh lên men mơi trƣờng MT7 với vịng kháng khuẩn 23 mm, chủng NA115 sinh chất kháng sinh có hoạt tính mạnh mơi trƣờng M1-ASW với vịng kháng khuẩn 23 mm, mơi trƣờng MT7, MPG MPM chủng NA115 khơng có hoạt tính Mơi trƣờng MT7 M1-ASW đƣợc lựa chọn để lên men chủng xạ khuẩn nghiên cứu 3.5.2 Ảnh hưởng nguồn cacbon nguồn nitơ Những hiểu biết thành phần môi trƣờng lên men (nồng độ nguồn cacbon, nitơ, photphat vô cơ, chất kích thích kìm hãm sinh tổng hợp chất kháng sinh) nhƣ ảnh hƣởng điều kiện nuôi cấy khác (nhƣ pH, nhiệt độ, độ thơng khí, đặc điểm chủng giống) có ý nghĩa to lớn điều khiển trình lên men nhằm trì trạng thái hoạt động kéo dài pha sinh tổng hợp chủng sản xuất Trên sở môi trƣờng lên men lựa chọn đƣợc, tiến hành nghiên cứu ảnh hƣởng nguồn cacbon nitơ tới khả sinh tổng hợp chất kháng sinh chủng xạ khuẩn Chủng vi sinh vật kiểm định sử dụng thí nghiệm B subtilis ATCC 6630 49 Bảng 3.13 Ảnh hƣởng nguồn cacbon nitơ đến hoạt tính kháng khuẩn chủng NA113 NA115 Khả sinh trƣởng sinh chất kháng khuẩn (D-d, mm) Nguồn cacbon NA113 NA115 Glucose ++ 18 ++ 17 Maltose + 21 + 20 Tinh bột ++ 23 ++ 24 Dextrose + 19 + 20 Saccarose + 20 + 19 NH4Cl ± 10 - (NH4)2SO4 - - Yeast extract + 20 ++ 21 Casein ++ 23 ++ 20 Pepton + 19 ++ 25 Trypton + 19 ++ 21 Cao ngô ± 11 ± Bột đâu tƣơng ++ 23 ++ 23 Khô lạc ± 10 ± 10 Malt extract ± 10 ± Nguồn nitơ Ghi chú:+ Sinh trưởng bình thường; - Không sinh trưởng; ± Sinh trưởng yếu; ++ Sinh trưởng tốt Kết cho thấy chủng xạ khuẩn NA113 triển tốt mơi trƣờng có nguồn cacbon tinh bột, glucose Nguồn cacbon tốt để tạo chất kháng sinh tinh bột với vòng kháng khuẩn 23 mm hoạt tính kháng sinh sử dụng nguồn cacbon glucose với vòng kháng khuẩn 18 mm Bột đậu tƣơng casein nguồn nitơ thích hợp cho sinh trƣởng tổng hợp chất kháng sinh chủng NA113 với vòng kháng khuẩn 23 mm Trên môi trƣờng nitơ vô cơ, chủng sinh trƣởng yếu hoạt tính kháng sinh yếu khơng có Tinh bột nguồn cacbon thích hợp cho sinh trƣởng tổng hợp chất kháng sinh chủng NA115 (VKK 24 mm); nguồn nitơ thích hợp pepton 50 với vòng kháng khuẩn 25 mm Chủng khơng sinh trƣởng mơi trƣờng có nitơ vơ 3.5.3 Ảnh hưởng pH môi trường độ thống khí Độ thống khí pH ban đầu có vai trị quan trọng q trình tạo chất kháng sinh Chủng xạ khuẩn đƣợc nuôi môi trƣờng lên men lựa chọn trên, với pH khác (từ - 9) Để xác định ảnh hƣởng độ thống khí tới sinh tổng hợp chất kháng sinh, chúng tơi thay đổi thể tích dịch ni bình có dung tích 500ml để ơxi khuếch tán vào trong, từ xác định đƣợc thể tích mơi trƣờng ni cấy thích hợp Bảng 3.14 Ảnh hƣởng pH ban đầu độ thống khí đến đến hoạt tính kháng khuẩn chủng NA113 NA115 pH NA113 NA115 15 13 22 19 28 27 20 15 15 11 10 15 13 15 22 19 20 28 27 25 26 27 30 15 19 Độ thống khí (%, v/v) Kết cho thấy hai chủng có hoạt tính kháng sinh mạnh mơi trƣờng có pH 7, chủng NA113 có hoạt tính kháng B subtilis ATCC6633 với đƣờng kính vòng kháng khuẩn 28 mm vòng kháng khuẩn chủng NA115 27 mm Thể tích mơi trƣờng chiếm 20 – 25% thể tích bình ni cho hiệu tổng hợp chất kháng sinh cao Chủng NA113 có vịng kháng khuẩn 28 mm có lƣợng dịch mơi trƣờng chiếm 20% 26 mm với lƣợng dịch môi trƣờng chiếm 25% 51 thể tích bình Chủng NA115 có hoạt tính mạnh lƣợng dịch ni chiếm 20 – 25% thể tích bình lên men với vịng kháng khuẩn 27 mm 3.6 Phổ hoạt tính kháng sinh chủng xạ khuẩn nghiên cứu Kiểm tra phổ kháng sinh chủng xạ khuẩn NA113 NA115 cho thấy, dịch chiết sinh khối hồn tồn khơng ức chế vi sinh vật kiểm định, chứng tỏ chủng xạ khuẩn sinh tổng hợp chất kháng sinh tiết vào môi trƣờng nuôi cấy Dịch chiết từ dịch lên men chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định mức độ khác Cả hai chủng NA113 NA115 sinh chất kháng sinh kháng đƣợc nhiều chủng vi sinh vật kiểm định bao gồm B subtilis ATCC 6633, B cereus ATCC 21778, S epidermidis ATCC 12228, S typhi IFO14193, E coli ATCC 11105 C albicans ATCC 10321; khơng kháng đƣợc chủng vi sinh vật kiểm định A faecallis P auroginosa Với vi sinh vật kiểm định E aerogenes ATCC 13048 có chủng NA113 kháng đƣợc với vịng kháng khuẩn 13 mm Kết thu đƣợc phổ kháng khuẩn chủng xạ khuẩn S scabies NA113 S tendae NA115 mở tiềm ứng dụng sản xuất thuốc dùng y dƣợc Bảng 3.15 Phổ kháng khuẩn chủng xạ khuẩn S scabies NA113 S tandae NA115 Đƣờng kính vịng đối kháng (mm) Chủng vi sinh vật kiểm định NA113 NA115 B subtilis ATCC 6633 25 24 B cereus ATCC 21778 14 21 S epidermidis ATCC 12228 26 22 E coli ATCC 11105 22 17 E aerogenes ATCC 13048 13 - - - 15 19 P auroginosa - - C albicans ATCC 10231 15 A faecallis S typhi IFO 14193 52 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN Từ mẫu đất, nƣớc, bùn thu thập từ vùng biển Hải Phòng, Quảng Ninh Nghệ An phân lập đƣợc 40 chủng xạ khuẩn, 30 chủng có khả sinh chất kháng sinh Chủng NA113 NA115 có hoạt tính kháng sinh cao đƣợc chọn tiếp tục nghiên cứu Nghiên cứu đặc điểm sinh học, kết hợp giải trình tự gene mã hóa 16SrRNA, phân loại đƣợc chủng NA113 thuộc loài S scabies đặt tên S scabies NA113 Chủng có khả sinh trƣởng tốt với nguồn nitơ hữu nhƣ cao nấm men, trypton, pepton pH thích hợp từ – 10 Chủng sinh trƣởng tốt nồng độ NaCl từ – 5% nhiệt độ 30oC Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa giải trình tự gene 16SrRNA, phân loại đƣợc chủng NA115 thuộc loài S tendae đặt tên S tandae NA115 Chủng thích hợp với pH – 10, nồng độ NaCl – 3% nhiệt độ 30oC Hai chủng S scabies NA113 S tendae NA115 có khả kháng lại chủng vi sinh vật kiểm định B subtilis ATCC 6633, B cereus ATCC 11778, S epidemidis ATCC 12228, C albicans ATCC 10231 E coli ATCC 11105, S typhi IFO 14193 Ngồi chủng NA113 cịn kháng đƣợc vi khuẩn E aerogenes ATCC 13048 Mơi trƣờng thích hợp để chủng NA113 sinh chất kháng sinh môi trƣờng MT7; pH thể tích mơi trƣờng ni cấy chiếm 20% thể tích bình Trong mơi trƣờng thích hợp cho chủng NA115 M1-ASW; pH thể tích mơi trƣờng ni cấy chiếm 20 – 25% thể tích bình thích hợp cho q trình lên men ĐỀ NGHỊ Khảo sát điều kiện lên men thích hợp cho tổng hợp chất kháng sinh Nghiên cứu tách chiết chất kháng sinh từ chủng xạ khuẩn biển S scabies NA113 S tendae NA115, thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣ chất kháng sinh thu đƣợc 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Ngơ Đình Quang Bính (2005), Vi sinh vật học công nghiệp – chất kháng sinh Viện Khoa học Việt Nam, Hà Nội Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mƣợu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty (1972), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học – tập 1, NXB KH KT, Hà Nội Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thanh Hiền, Lê Đình Lƣơng, Đồn Xuân Mƣợu, Phạm Văn Ty (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học - tập 3, NXB KH KT, Hà Nội Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2001), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục, Hà Nội Nguyễn Thành Đạt (2005), Cơ sở sinh học vi sinh vật, tập 1, NXB ĐHSP, Hà Nội Nguyễn Nhƣ Hiền (2006), Giáo trình Sinh học tế bào, NXB Giáo Dục, Hà Nội Lê Gia Hy (1994), Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh đạo ôn thối rễ phân lập Việt Nam, Luận án phó tiến sĩ khoa học Sinh học, viện CNSH, Trung tâm KHTN CN Quốc Gia, Hà Nội Lê Gia Hy cs (2005), “Nghiên cứu số đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn biển HT0523”, Những vấn đề nghiên cứu khoa học sống định hướng y học, 549-552, NXB KHKT, Hà Nội Bùi Minh Lý, Ngô Quyền Bƣu, Nguyễn Duy Nhứt, Phạm Đức Thịnh, Trần Thị Thanh Vân (2007), “Nghiên cứu sản xuất Fucoidan từ rong nâu Việt Nam”, Tuyển tập báo cáo khoa học, Hội nghị khoa học Biển Đông 54 10 Chu Văn Mẫn (2011), Tin học Công nghệ Sinh học, NXB Giáo Dục Việt Nam, Hà Nội 11 Nguyễn Phƣơng Nhuệ (2010), Nghiên cứu quy trình lên men sản xuất kháng sinh vancomycin từ xạ khuẩn Streptomyces orientalis 4912, Luận án tiến sĩ Sinh học, viện CNSH, viện KH CN Việt Nam, Hà Nội 12 Nguyễn Duy Nhứt cộng sự, (2009), “Bƣớc đầu nghiên cứu tính kháng khuẩn số lồi rong biển Khánh Hịa”, Hội nghị Cơng nghệ sinh học tồn quốc, 825- 830 13 Nguyễn Xuân Thành, Nguyễn Bá Hiên, Hồng Hải, Vũ Thị Hoan (2005), Vi sinh vật cơng nghiệp, NXB Giáo dục, Hà Nội TIẾNG ANH 14 Carlos O., Carmen M., José A S (2009), “Antitumor Compounds from Marine Actinomycetes”, Marine Drugs, 7, 210-248 15 Demain A L (1981), Industrial Microbiology, Science 214, 987 – 995 16 George P R (2008), Encyclopedia of Genetics, Genomics, Proteomics and Informatics, 3rd, Springer, 1709 – 1712 17 Isoken Nekpen Henrietta Ogunmwonyi (2010), Assessment of antibiotic production by some marine Streptomyces isolated from the Nahoon beach, Master of Science in Microbiology, Department of biochemistry and microbiology faculty of science and agriculture, University of for Hare, Alice, South Africa 18 James B M., Arjun H B., Romila D C., Gerhard S., Emmanuel Z., Mahmood P., Jeffrey J., Valerie S B., Mustapha A., Chris M F., Xidong F., Zhizi Z., Guy T C (2008), “Biosynthesis of Diazepinomicin/ECO-4601, a Micromonospora Secondary Metabolite with a novel ring system”; J Nat Prod, 71, 1585-1590 55 19 Jin Xiong (2006), Essential Bioinformatics, Cambridge University press, New York 20 Kamerua Masahiro and Moris Kates (1999), “Structural diversity of membrane lipits in member of Halobacteriaceae”, Bioscience Biotechnology Biochem, 63(6), 969-972 21 Keswanit J and Whitman W.B (2001), “Relationship of 16S rRNA sequence similarity to DNA hybridization in prokaryotes”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 51, 667 – 678 22 Kin S Lam (2006), “Discovery of novel metabolites from marine actinomycetes”, Current Opinion in Microbiology, 245-251 23 Krishnaraj M., Mathivanan N (2009), “Antimicrobial potential of marine actinomycetes isolated from the Bay of Bengal” Envis centre newsletter, vol 7, issue 24 Nor Ainy Mahyudin (2008), “Actinomycetes and Fungi associated with marine Invertebrates: A potential source of bioactive compounds”, Doctor of Philosophy in Microbiology at the University of Canterbury, New Zealand 25 Paul R Jensen, Dwight R., and Fenical W (1991), “Distribution of Actinomycetes in Near-Shore Tropical Marine Sediments”, Applied and Environmental Microbiology, Vol 57, No 4, 1102-1108 26 Paul R Jensen, Tracy J Mincer, Philip G Williams, William Fenical (2005), “Marine actinomycete diversity and natural product discovery”, Antonie van Leeuwenhoek, 43-48 27 Robert S., E G D Murray, Nathan R (1957), Bergey’s Mannual of determinative bacteriology, 7th, Williams & Wilkins , 744-822 28 Rofiq Sunaryanto, Bambang Marwoto (2010), “Marine actinomycetes screening of Banten west coast and their antibiotics purification” Biodiversitas, volume 11, 4, 176-181 56 29 Sambrook J and Rusell W.D (2001), Molecular cloning – Laboratory manual, vol 2, 3nd, pp 8.4 – 8.25, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Newyork 30 Shirling E.B., Gottlieb D (1966) International of systematic bacteriology: Method for characterization of Streptomyces species Derpartment of Botany and Bacteriology Ohio Wesleyan University, Delaware, Ohio and Derpartment of Plant Pathology University of Illinois, Urbana, Illinois 31 Stanley T Williams et al (1989), Bergey’s Mannual® of Systematic Bacteriology Williams & Wilkins Vol 4, 2452-2492 32 Sumei Li, Xinpeng Tian, Siwen Niu, Wenjun Zhang, Yuchan Chen, Haibo Zhang, Xianwen Yang, Weimin Zhang, Wenjun Li, Si Zhang, Jianhua Ju, Chángheng Zhang (2011) “Pseudonocardians A-C, New diazaanthraquinone derivatives from a deap-sea actinomycete Pseudonocardia sp SCSIO 01299” Marine Drugs, 9, 1428-1439 33 Turk biol (2003), Investigaion of the Antimicrobial Activity of some Streptomyces Isolates, No 27, 79-84 34 Valli S, Suvathi Sugasini S, Aysha OS, Nirmala P, Vinith Kumar P Reena A (2012), “Antimicrobial potential of actinomycetes species isolated from marine environment”, Asian Pacific Journal og Tropical Biomedicine, 469-473 35 Vijaya Baskara Sethubathi G and Ashok Prabu V (2010), “Antibacterial activity of Cyanobacterial species from Adirampattinam coast southeast coast of Palk bay”, Current research Journal of Biological Sciences 2(1), 2426 36 Waksman, S.A (1961), “Classification, identification and description of genera and species”, The Actinomycetes, vol 2, The Williams and Wilkins Co., Baltimore 57 PHỤ LỤC 1: VỊ TRÍ LẤY MẪU VÙNG VEN BIỂN STT Ký hiệu mẫu HLN1 HLN2 HLN3 10 11 12 13 14 15 16 HLN4 HLB1 HLB2 HLB3 HLC1 HLC2 VD1 VD2 VD3 VD4 HLS1 HLS2 BB1 17 18 19 20 21 HPB4 HPB5 HPN5 HPN6 HPC3 22 HPC4 23 24 IM1 IM2 25 IM3 26 IM4 27 IM5 Mẫu vị trí lấy mẫu Mẫu nƣớc mặt sâu 50cm Hạ Long Mẫu nƣớc mặt sâu m vịnh Hạ Long Mẫu nƣớc mặt sâu 50cm ven đảo vịnh Hạ Long Mẫu nƣớc biển xa bờ vịnh Hạ Long Mẫu bùn đất đảo vịnh Hạ Long Mẫu bùn đất đảo vịnh Hạ Long Mẫu đất ven bờ đảo vịnh Hạ Long Mẫu đất ven bờ đảo vịnh Hạ Long Mẫu đất cát ven bờ đảo vịnh Hạ Long Mẫu nƣớc mặt xa bờ Vân Đồn Mẫu nƣớc ven bờ Vân Đồn Mẫu đất bùn xa bờ Vân Đồn Mẫu cát ven bờ Vân Đồn Mẫu cát sỏi vịnh Hạ Long Mẫu cát sỏi vịnh Hạ Long Mẫu bọt biển ven đảo thuộc vịnh Hạ Long Mẫu đất bùn bãi rừng ngập mặn Cát Bà Mẫu đất bùn bãi rừng ngập mặn Cát Bà Mẫu nƣớc ven bờ đảo đảo Cát Bà Mẫu nƣớc xa bờ đảo Cát Bà Mẫu nƣớc chân đê biển Ngọc Hải, Đồ Sơn Mẫu đất bùn chân đê biển Ngọc Hải, Đồ Sơn Mẫu bọt biển Cát Bà Mẫu bùn rừng ngập mặn nằm cạnh đê biển Ngọc Hải Mẫu nƣớc rừng ngập mặn nằm cạnh đê biển Ngọc Hải Mẫu nƣớc rừng ngập mặn nằm cạnh đê biển Ngọc Hải Mẫu nƣớc xa bờ đảo Hòn Dáu, Đồ Sơn 58 Địa điểm Số mẫu Quảng Ninh Quảng Ninh Quảng Ninh Quảng Ninh Quảng Ninh Quảng Ninh Quảng Ninh Quảng Ninh Quảng Ninh Quảng Ninh Quảng Ninh Quảng Ninh Quảng Ninh Quảng Ninh Quảng Ninh Quảng Ninh 1 2 2 2 Hải Phòng Hải Phòng Hải Phòng Hải Phòng Hải Phòng 2 Hải Phòng Hải Phòng Hải Phòng Hải Phòng Hải Phòng Hải Phòng 2 2 2 2 28 29 30 31 32 33 34 IM6 CBD1 CBD2 CBD3 CBS3 VK1-2 VK2-2 35 VK3-1 36 VK4-1 37 NA1 38 NA2 39 VK1-1 Mẫu đất ven bờ đảo Hòn Dáu, Đồ Sơn Mẫu nƣớc ven bờ đảo Cát Bà Mẫu nƣớc xa bờ đảo Cát Bà Mẫu đất sỏi ven bờ đảo Cát Bà Mẫu đất sỏi ven bờ đảo Cát Bà Mẫu nƣớc rừng ngập mặn nằm cạnh đê biển Ngọc Hải Mẫu nƣớc rừng ngập mặn nằm cạnh đê biển Ngọc Hải Mẫu nƣớc rừng ngập mặn nằm cạnh đê biển Ngọc Hải Mẫu nƣớc rừng ngập mặn nằm cạnh đê biển Ngọc Hải Mẫu nƣớc mặt xa bờ Diễm Châu, Cửa Lò Mẫu nƣớc mặt ven bờ Diễm Châu, Cửa Lò Mẫu đất, bùn ven bờ Diễm Châu, Cửa Lò Hải Phòng Hải Phòng Hải Phòng Hải Phòng Hải Phòng Hải Phòng Hải Phòng Hải Phòng Hải Phòng Nghệ An Nghệ An Nghệ An 2 2 2 1 2 2 PHỤ LỤC 2: CÁC LOẠI MÔI TRƢỜNG DÙNG TRONG ĐỀ TÀI (đơn vị g/l) Môi trƣờng Gause 1: Tinh bột – 10; (NH4)2SO4 – 1; MgSO4.7H2O – 1; CaCO3 – 3; pH ± 0,3 Môi trƣờng Gause (g/l): Nƣớc chiết thịt – 30 ml; Pepton – 5; NaCl – 5; Glucose – 10; pH – 7,2 Môi trƣờng ISP1: Triptone – 5; yeast extract – 3; pH Môi trƣờng ISP2: Yeast extract – 4; Malt extract – 10; Destrose– 4; pH 7,3 Môi trƣờng ISP3: Bột lúa mạch – 20; dung dịch khoáng A – 1ml; pH 7,2 Môi trƣờng ISP4: Tinh bột – 10; K2HPO4.2H2O – 1; MgSO4.7H2O – 1; NaCl – 1; (NH4)2SO4 – 2; CaCO3 – 2; dung dịch khoáng A – 1ml; pH 7,2 - 7,4 Môi trƣờng ISP5: L-Asparagine – 1; Glycerol – 10ml; K2HPO4 – 1; dung dịch khoáng A - 1ml; pH 7,0 – 7,4 59 Môi trƣờng ISP6: Pepton – 19,7; Feric amonium citrat – 0,49; Na2S2O4 – 0,97; K2HPO4 - 0,98; Yeast extract – 1; pH = ± 0,2 Môi trƣờng ISP7: Glycerol – 15; L-Tyrozine – 0,5; L-Asparagine – 1; K2HPO4 – 0,5; MgSO4.7H2O – 0,5; NaCl – 0,5; FeSO4.7H2O – 0,01; dung dịch khoáng A – 1ml; pH 7,2 – 7,4 10 Môi trƣờng ISP8: D-Glucose – 10; MgSO4.7H2O – 0,5; NaCl – 0,5; FeSO4.7H2O – 0,01; K2HPO4 – 1; nguồn nitơ – 1% 11 Môi trƣờng ISP9: (NH4)2SO4 – 2,64; KH2PO4 – 2,38; K2HPO4.3H2O – 5,65; MgSO4.7H2O – 1; dung dịch khoáng B – 1ml; nguồn đƣờng – 1%; pH 6,8 – 12 Môi trƣờng SCA: Tinh bột – 10; Casein – 1; KH2PO4 – 0,5; MgSO4 – 0,5; NaCl – 3; pH 7,6 13 Môi trƣờng MPA: Meat extract – 3; Pepton – 5; NaCl – 5; pH 6,5 – 14 Môi trƣờng LB: Yeast extract – 5; Tryptone – 10; NaCl – 5; pH 15 Môi trƣờng Hansen: Glucose – 20; Pepton – 10; KH2PO4 – 2; MgSO4 – 2; Yeast extract – 16 Môi trƣờng xạ khuẩn: Malt extract – 10; Yeast extract – 4; Glucose – 4; pH ± 0,2 17 Môi trƣờng nƣớc biển: Meat extract – 10; Pepton – 10; nƣớc cất – 250ml; nƣớc biển – 750ml 18 Môi trƣờng 7: Tinh bột – 10; Glucose – 5; Pepton – 6; (NH4)2SO4 – 2,5; CaCO3 – 19 Môi trƣờng 79: Glucose – 10; Pepton – 10; Casein – 2; Yeast extract – 2; NaCl – 6; K2HPO4 – 0,2 20 Môi trƣờng A4: Glucose – 10; Bột đậu tƣơng – 10; NaCl – 5; CaCO3–1 21 Môi trƣờng A4H: Glucose – 15; Bột đậu tƣơng – 15; NaCl – 5; CaCO3-1 22 Môi trƣờng TH4-47: Tinh bột – 15; Glucose – 10; Lactose – 30; Bột đậu tƣơng – 30; (NH4)2SO4 – 23 Môi trƣờng MN1-ASW: Glucose – 0,25; Yeast extract – 0,25; Malt extract – 0,64 60 24 Môi trƣờng M1-ASW: Tinh bột – 10; Yeast extract – 4; Pepton – 25 Môi trƣờng 48: Yeast extract – 2; Tinh bột – 10 26 Môi trƣờng MPG: Pepton – 3; Glucose – 10; Casein – 2; Tinh bột – 27 Môi trƣờng MPM: Pepton – 5; Manitol – 10 28 Môi trƣờng khoai tây: Khoai tây - 20 29 Bennett cải tiến: Meat extract – 1; Glucose – 10; Bactocasaminoacid – 2; Yeast extract – 1; pH 7,3 30 Dung dịch khoáng A: FeSO4.7H2O – 1; MnCl2.4H2O –1; ZnSO4.7H2O–1 31 Dung dịch khoáng B: FeSO4.7H2O – 1,1; CuSO4.5H2O – 6,4; MnCl2.4H2O – 7,9; ZnSO4.7H2O – 1,5 PHỤ LỤC 3: VI SINH VẬT KIỂM ĐỊNH Tên chủng vi sinh vâ ̣t kiể m đinh ̣ Gram Điề u kiêṇ Escherichia coli ATCC 11105 - Hiế u khí không bắ t buô ̣c Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 + Hiế u khí không bắ t buô ̣c Bacillus subtilis ATCC 6633 + Hiế u khí Alcaligenes faecallis - Hiế u khí Enterobacter aerogenes ATCC 13048 - Hiế u khí không bắ tt buô ̣c Bacillus cereus ATCC 11778 + Kị khí khơng bắt buộc Sarcina lutea M5 + Kị khí khơng bắt buộc Klebsiella pneumoniae - Kị khí khơng bắt buộc Candida albicans ATCC 10231 61 PHỤ LỤC 4: TRÌNH TỰ GENE MÃ HĨA 16S-rRNA Chủng NA115 cattcacgga gagtttgatc ctggctcagg acgaacgctg gcggcgtgct taacacatgc 61 aagtcgaacg atgaaccact tcggtgggga ttagtggcga acgggtgagt aacacgtggg 121 caatctgccc tgcactctgg gacaagccct ggaaacgggg tctaataccg gatactgacc 181 ctcgcaggca tctgcgaggt tcgaaagctc cggcggtgca ggatgagccc gcggcctatc 241 agcttgttgg tgaggtaatg gctcaccaag gcgacgacgg gtagccggcc tgagagggcg 301 accggccaca ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtggggaat 361 attgcacaat gggcgaaagc ctgatgcagc gacgccgcgt gagggatgac ggccttcggg 421 ttgtaaacct ctttcagcag ggaagaagcg aaagtgacgg tacctgcaga agaagcgccg 481 gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtagggcgc aagcgttgtc cggaattatt 541 gggcgtaaag agctcgtagg cggcttgtca cgtcggttgt gaaagcccgg ggcttaaccc 601 cgggtctgca gtcgatacgg gcaggctaga gttcggtagg ggagatcgga attcctggtg 661 tagcggtgaa atgcgcagat atcaggagga acaccggtgg cgaaggcgga tctctgggcc 721 gatactgacg ctgaggagcg aaagcgtggg gagcgaacag gattagatac cctggtagtc 781 cacgccgtaa acggtgggca ctaggtgtgg gcaacattcc acgttgtccg tgccgcagct 841 aacgcattaa gtgccccgcc tggggagtac ggccgcaagg ctaaaactca aaggaattga 901 cgggggcccg cacaagcggc ggagcatgtg gcttaattcg acgcaacgcg aagaacctta 961 ccaaggcttg acatacaccg gaaagcatca gagatggtgc cccccttgtg gtcggtgtac 1021 aggtggtgca tggctgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga 1081 gcgcaaccct tgtcccgtgt tgccagcagg cccttgtggt gctggggact cacgggagac 1141 cgccggggtc aactcggagg aaggtgggga cgacgtcaag tcatcatgcc ccttatgtct 1201 tgggctgcac acgtgctaca atggccggta caatgagctg cgataccgca aggtggagcg 1261 aatctcaaaa agccggtctc agttcggatt ggggtctgca actcgacccc atgaagtcgg 1321 agtcgctagt aatcgcagat cagcattgct gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac 1381 accgcccgtc acgtcacgaa agtcggtaac acccgaagcc ggtggcccaa ccccttgtgg Chủng NA113 cattcacgga gagtttgatc ctggctcagg acgaacgctg gcggcgtgct taacacatgc 61 aagtcgaacg atgaaccact tcggtgggga ttagtggcga acgggtgagt aacacgtggg 121 caatctgccc ttcactctgg gacaagccct ggaaacgggg tctaataccg gatacgacac 181 tctcgggcat ccgatgagtg tggaaagctc cggcggtgaa ggatgagccc gcggcctatc 241 agcttgttgg tgaggtaacg gctcaccaag gcgacgacgg gtagccggcc tgagagggcg 301 accggccaca ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtggggaat 361 attgcacaat gggcgaaagc ctgatgcagc gacgccgcgt gagggatgac ggccttcggg 421 ttgtaaacct ctttcagcag ggaagaagcg aaagtgacgg tacctgcaga agaagcgccg 481 gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtagggcgc gagcgttgtc cggaattatt 541 gggcgtaaag agctcgtagg cggtctgtcg cgtcggatgt gaaagcccgg ggcttaaccc 601 cgggtctgca ttcgatacgg gcagactaga gtgtggtagg ggagatcgga attcctggtg 661 tagcggtgaa atgcgcagat atcaggagga acaccggtgg cgaaggcgga tctctgggcc 721 attactgacg ctgaggagcg aaagcgtggg gagcgaacag gattagatac cctggtagtc 62 781 cacgccgtaa acggtgggaa ctaggtgttg gcgacattcc acgtcgtcgg tgccgcagct 841 aacgcattaa gttccccgcc tggggagtac ggccgcaagg ctaaaactca aaggaattga 901 cgggggcccg cacaagcagc ggagcatgtg gcttaattcg acgcaacgcg aagaacctta 961 ccaaggcttg acatacaccg gaaacggcca gagatggtcg cccccttgtg gtcggtgtac 1021 aggtggtgca tggctgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga 1081 gcgcaaccct tgttctgtgt tgccagcatg cccttcgggg tgatggggac tcacaggaga 1141 ctgccggggt caactcggag gaaggtgggg acgacgtcaa gtcatcatgc cccttatgtc 1201 ttgggctgca cacgtgctac aatggcaggt acaatgagct gcgaagccgt gaggcggagc 1261 gaatctcaaa aagcctgtct cagttcggat tggggtctgc aactcgaccc catgaagtcg 1321 gagttgctag taatcgcaga tcagcattgc tgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca 1381 caccgcccgt cacgtcacga aagtcggtaa cacccgaagc cggtggccta acccgtaagg 63