BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Tuấn Anh
NGHIÊN CỨU PHẦN LẬP TỪ NGUỒN THIÊN NHIÊN CỦA VIỆT NAM VÀ CHUYỂN HOA CHAT DIEU HOA SINH
TRƯỞNG THUC VAT n-TRIACONTAN-1-OL
Chuyên ngành: HOÁ HỮU CƠ
màn Mã số: 01-04-02
Tóm tắt luận án Tiến sĩ Hoá học
Trang 2Cơng trình này được hồn thành iại bộ mơn Hố Hữu cơ, khoa Hoá, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà nội
Người hướng dẫn khoa học:
GS TS PHAN TONG SON Người nhận xét 1:
Người nhận xét 2:
Người nhận xét 3:
Luận án sẽ được bảo vệ tại Hội đẳng chấm luận án Nhà nước, họp tai
Đại học Quốc gia Hà nội, vào hồi ngày tháng năm 1999
Có thể tìm hiểu thêm luận án tại Thư viện Khoa Hoá, Trường Đại
học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà nội và thư viện Quốc
Trang 3A - Giới thiệu luận án
1- Ý nghĩa luận án:
Cùng với sự phát triển nhanh chóng của các ngành khoa học tự nhiên nói chung, ngành Hoá học các hợp chất thiên nhiên cũng đang có những bước tiến lớn và đã đạt được những thành tựu quan
trọng
Việt Nam là một nước nhiệt đới có thẩm thực vật phong phú
và đa dạng Việc nghiên cứu để sử đụng hợp lý nguồn tài nguyên thiên
nhiên quý giá này là có ý nghĩa quan trọng về khoa học và thực tiễn,
nên cũng là nguyên nhân thu bút sự chú ý của nhiều nhà khoa học trong và ngoài nước Trong những năm qua, từ nguồn thực vật Việt
Nam, nhiều hợp chất thiên nhiên có giá trị đã được phân lập và ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như làm thuốc, làm chất thơm và chất phụ gia cho hương liệu, mỹ phẩm, v.v
Ở nước ta nông nghiệp luôn là một ngành kinh tế mũi nhọn
Vấn để tăng năng suất cây trồng một cách có hiệu quả đã và đang được nhiều nhà khoa học và sản xuất quan tâm Vì vậy việc nghiên cứu các chất có tác dụng điều hoà sinh trưởng thực vật từ nguồn thiên nhiên là một vấn để có ý nghĩa Trone số các chất điều hoà sinh
trưởng thực vật có trong nguồn thiên nhiên chúng tôi lưu ý đến n-
triacontan-I-ol (triacontanol, TRIA), là một aneol béo no bậc một
chứa 30C với mạch không phân nhánh Triaeontanol đã chứng tổ có tác dụng tăng trưởng và tăng hiệu suất mạnh mẽ đối với nhiều loài cay
trồng
2- Mục đích và nhiệm vụ luận án
Trang 4mật trong phần sấp của nhiều loài thực vật và nhiều sáp thiền nhiề
Khác-một nguồn nguyên liệu phong phú của Hước ta Tuy nhiên cho
đến nav các nghiên cứu nhằm thu nhận triacontanol từ nguồn nguyên
liệu này còn chưa dược đây mạnh Trong luận án nay chúng tôi có
nhiệm vụ:
2.1- Nghiên cứu phương pháp phân lập n-triacontan-l-ol từ một số nguồn nguyên liệu thiền nhiên đễ kiếm ở Việt nam như sắp ong cám của một số loại gạo đang phố biến, sáp cây mía
Do hoạt tính của triacontanol phụ thuộc nhiều vào độ tỉnh khiết, nên
chúng tôi đã đặt nhiệm vụ tìm kiếm phương pháp để thu nhận
triacontanol có độ tính khiết cao
Mặt khác chúng tôi cũng nghiên cứu ứng dụng các chất xúc tác
chuyển pha vào việc thu nhận hoạt chất này
2.2- Nghiên cứu phương pháp xác định triacontanol trong nguyên liệu
và sản phẩm bảng sắc ký khí và sắc ký lỏng hiệu lực cao
2.3- Nghiên cứu oxi hoá triacontanol thành triacontanal và chuyển hoá
triacontanol thành mnột số dẫn xuất este, etc, và ølycozjl
2.4- Thử sơ bộ một số hoạt tính sinh học trên một số đối tượng cây nông nghiệp hiện trồng phổ biến ở Việt Nam như lúa, đậu tương, đậu
xanh nhằm bước đầu đánh giá tác dụng và chất lượng của sản phẩm triacontanol thu nhận được từ các nguồn nêu trên, mặt khác thu thập
thông tin về một số tác dụng của các sản phẩm chuyển hoá nhận được 3 Những điểm mới và giá trị thực tiễn của luận án
3.1 Với việc sử dụng kết hợp tác nhân xã phòng hoá ém địu K„CO; và chất xúc tác chuyén pha benzyl trietyl amoni clorua (BTEAC) da dua ra các qui trình chung mới cho việc thu nhận triacomtanol từ các sáp
thiên nhiên
Trang 5(96%) từ các nguyên liệu: cám gạo nếp, cám gạo 203, cám sạo N-Q2, cám gạo Bông Hồng và sáp cây mía của Việt Nam
3.3 Áp dụng qui trình chung của chúng tôi vào việc thu nhận
†riacontanol từ sáp ong mat Apis mellifera ligustica (Apidae) cha Viét Nam đã thu được một sản phẩm thô chỉ gồm bởi n- triacontan-1-ol và
pentacosan, từ đó có thể để đàng nhận được n- triacontan-i-ol có độ
tỉnh khiết 96% trở lên
3.4 Lân đầu tiên đã nghiên cứu và đẻ ra được phương pháp xác định nhanh n-triacontan-1-ol bằng sắc ký lỏng hiệu lực cao (HPLC) với kỹ thuật tạo dân xuất trước khi bơm mẫu vaò cột
3.5 Đã điều chế các dân xuất mới của triacontanol: benzoat, 3,5 đinitro benzoat và tetrahydropyranyl ete
3.6 Với việc sử dụng các glycal (glucal, galactal, maltal) làm tác nhân
glycozyl hoá đã lần đâu tiên điều chế được một dấy mới các
tnacontanyl glycozIt không no
3.7 Kết quả thử sơ bộ hoạt tính đã cho thấy sản phẩm triacontanol của
luận án có các ảnh hưởng đến sự nảy mầm, chiều cao cây, trọng lượng tươi và khô, hàm lượng sắc tố quang hợp ở lúa "CR203”, đậu xanh và đậu tương tương đương với máu triacontanol 96% cla hang SIGMA Kết quả này gợi mở triển vọng ứng dụng triacontanol từ các nguồn thiên nhiên của Việt Nam, thí dụ các phụ phẩm của sân xuất nông nghiệp, vào thực tiễn
3.8 Kết quả thử sơ bộ cho thấy một số sản phẩm chuyển hoá triacontanol thu nhận được thể hiện một số hoạt tính đáng lưu ý, thí dụ
triacontanyl tetrahydropyranyl ete và triacontanyl glucozit no làm tăng
trọng lượng khô của cây đậu xanh, triacontanyl glucozit no và không
Trang 64 Bố cục của luận án
Luận án gồm 133 trang 1§ bảng số liệu, được phân bố như sau:
-Phần mở đầu : 2 trang,
-Phần tốne quan : 19 trang,
-Phần nội đụng và phương pháp nghiền cứu: 36 trans, -Phần kết quá và bàn luận: 56 trang,
-Phần kết luận : 2 trang,
-Tai liéu tham khao —:: 18 trang, dan 147 tai Héu
Ngoài ra có phản phụ lục gồm 54 phố của các sản phẩm
Š Phương pháp thực nghiệm
Sản phẩm n- triacontan-1-ol được phân lập chủ yếu bằng phương pháp
xã phòng hoá, chiết chọn lọc, kết tỉnh, sắc ký cột và sắc ký cột nhanh (flash chromatography)
Thanh phan và độ tỉnh khiết của các sản phẩm được kiểm tra bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng, sắc ký khí và sác ký lỏng hiệu lực cao
(HPLC)
Cấu trúc của các hợp chất được xác định bằng các phương pháp phổ
khối lượng, phổ hồng ngoại, phổ cộng hưởng từ proton và cộng hưởng
từ hạt nhân ĐC,
6 Các công trình đã công bố có liên quan đến luận án
-1 bai báo đã được đăng trên Tạp chí Khoa học, ĐHQG Hà Nội,
~1 bài báo đã được đăng trên Tạp chí Hoá học của Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia,
~1 bài báo đã được đăng trên Tuyển tập các công trình khoa học, Hội
nghị khoa học trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG Hà Nội, -2 bài báo đã được đăng trên Tạp chí Hoá học và Cơng nghiệp hố chất của Hội Hoá học Việt Nam,
Trang 7Medicinal Plants, Spices and Other Natural Products, ASOMPS
IX", duge t6 chtte tai HA Noi, Việt Nam, 24-28/ 9/ 1998
B Nội dung luận án
1 Tổng quan: Đã tổng kết các tư liệu quốc tế và trong nước về:
*Sáp thiên nhiên,
*Các kết quả nghiên cứu thu nhận n-triacontan~]-ol từ các nguồn thiền
nhiên (các sáp thực vật; các sáp thiền nhiên và nguồn thiên nhiên khác)
*Các kết quả nghiên cứu phân tích n-triacontan-1-ol, * Các nghiên cứu tổng hợp n-triacontan-1-ol,
* Tác dung sinh hoc va ting dung cia n-triacontan-1-ol
2 Kết quả nghiên cứu và thảo luận
2.1 Phân lập n-triacontan-I -ol từ một số nguyên liệu của Việt Nam
2.1.1 Phan lap n- triacontan-1-ol từ sáp ong
Nguyên liệu dùng là sáp Joai ong mat Apis mellifera ligustica (Apidae) của Bảo Lộc và Gia Lai-Kon Tum Để phân lập được
triacontanol, trước hết cần phải xà phòng hoá sáp ong để giải phóng các thành phần ancol cao ra khổi este của chúng Chúng tôi đã sử
dụng bốn phương án khác nhau để xà phòng hoá sáp ong: *PA1: KOH-H;O-C,H,, dun hồi lưu 15 giờ
*PA2: KOH-etanol-C,H,, đun hồi lưu 15 giờ
*PA3: K;CO;-H,O-C¿H¿ đun hồi lưu 15 giờ *PA4: K;CO;-elano]-C;H,, đun hồi lưu 15 giờ
Với việc dùng kali cacbonat làm tác nhân xà phòng hoá (PA3) và
(PA4), phan ứng điễn ra trong các điều kiện em địu hơn Sản phẩm xà phòng hoá sáp ong là một hôn hợp nhão sột, rất khó xử lý Chúng tôi
đã ding CaCl, dé kết tủa các axit mỡ dưới dạng muối của chúng các
muối này kết tủa cùng với các ancol béo của phần không xà phòng
Trang 8hoá được Từ hỗn hợp kết tủa này triacontanol đã được chiết ra chọn lọc bằng các dung môi như etanol và axeton Kết quả chúng tôi đã thu
được triacontanol Kỹ thuật (điểm nóng chây: 79C) Các kết quả phân tích đã cho thấy thành phần sáp ong khá phức tạp Tuy nhiên thông qua việc xử lý sáp one theo qui trình của chúng tới, chúng tôi đã thu
được triacontanol kỹ thuật mà thành phần chỉ gồm bởi hai thành phần với tỉ lệ (65:33), can cứ vào các kết quá khảo sát sắc ký lớp
mỏng.Chúng tôi đã tỉnh chế triacontanol kỹ thuật bàng cách chạy sắc
ký cột trên silica gel Kêt quả thu được hai thành phần: Thành phản 1
La n-triacontan-1-o] tinh khiết với: Điểm nóng chảy: 86°C
Trang 9Từ đó có thể nhận biết thành phần này là n- C.:H„; (n-pentacosan) Thông qua bốn phương án khác nhau đề phân lập triacontanol từ sáp ong, chúng tôi nhận thấy việc sử dụng kalicacbonat-etanol-benzen cho hiệu suất cao hơn cả
2.1.2 Phan lap n- triacontan-1-ol tir cam gạo
Chúng tôi đã dùng bốn mẫu cám gạo của Việt Nam làm nguyên liệu
đầu: cám gạo nếp, cám gạo N-02, cám gạo Bông hồng, cám gạo 203 Chiết cám gạo bàng etanol, cất loại dung môi thu được phản chiết
etanol Bước xà phòng hoá phần chiết etanol có ảnh hưởng rất lớn đến hiệu suất và chất lượng của sản phẩm rriacontanol Chúng tôi đã tiến
hành xà phòng hoá phần chiết này với một số tác nhân khác nhau (KOH, K;CO:) ở nhiệt độ sôi hồi lưu của dung môi Với kali cacbonat
phản ứng xà phòng hoá điễn ra êm dịu hơn Việc xử lý tiếp để thu
triacontanol được tiến hành tương tự như ở 2.1.1 Kết quả được ghi ở bảng 1 Bang It Kết quả thu nhận triacontanol từ một số loại cám gạo
Mẫu Phương phán Lượng TRIA | Điểm nóng
(i kg) xà phòng hóa thu được(mg) | chảy (“C) Cám gao | KOH-etanoi-benzen 45 86 203 K.CO,-etanol- benzen 50 855 Cám gạo | KOH-etanol-benzen 50 86 nép K;CO:-etanol- benzen 65 85,5 Cám gạo | KOH-etanol-benzen 40 85,5 (N-02) K.CO,-etanol- benzen 50 85,5 Cám gao | KOH-etanol-benzen 30 86 Bong Hong K,CO,-etanol- benzen 50 85,5
Hiệu suất trịacontanol nhận được theo phương án ding kali cacbonat
đạt cao nhất , và sản phẩm thu được cũng đạt được độ tĩnh khiết cao
Trang 10Lần đâu tién triacontanol tinh khiét (dnc: 86°C) được phân lập từ cám gạo của Việt Nam Bảng trên cũng cho ta thấy cám gạo nếp cho hiệu suất triacontanol cao hơn cả
2.1.3 Phân lập n- triacontan-1-oÌ từ sáp cây mía
Đối với sáp cây mía chúng tôi cũng dùng các tác nhân xà phòng hoá là KOH hoặc K;CO; trong etanol-benzen Cũng như đối với sấp ong và cám gạo, sản phẩm triacontanol thu nhận bởi phương án dùng tác nhân K;CO; đạt hiệu suất cao hơn cả Đây cũng là lần đầu tiên triacontanol tỉnh khiết được thu nhận từ sấp cây mía của Việt Nam
2.1.4 Phân lập n- triacontan-1-ol từ cây Cúc liên chỉ dại
Cây Cúc liên chỉ đại (Parthenium hysterophorus L., Asteraceac) là một loài cây mọc hoang ở khấp nơi ở nước ta Nguyên liệu được lấy vào thời kỳ cây đang ra hoa, được sấy khô ở 40PC, rồi xay thành bột
mịn Nguyên liệu khô (gồm bột lá và bột hoa) được ngâm chiết bằng
ete đầu hoả Phần cặn địch chiết ete đầu hoả đã được xà phòng hoá bằng K;CO;-etanol-benzen để thu được “phần khơng xà phịng hố”
của cặn ete đầu hoả Phần sáp xà phòng hoá này đã được xử lý với CaC1 để kết tủa các axit mỡ dưới dạng muối của chúng, các muối này kết tủa cùng với các ancol béo của phần không xà phòng hoá được Rửa chất rấn bàng benzen với sự có mặt của natrietylat, sau đó lọc
nóng thu được kết tủa Từ hỗn hợp kết rủa này triacontanol kỹ thuật đã được chiết ra chọn lọc bằng axeton Tiếp đó triacontanol kỹ thuật được kết tỉnh phân đoạn bằng các đung môi như benzen, dieTyl ete, sau đó là sắc ký trên cột silica gel chúng tôi đã thu được triacontanol tĩnh
khiết, điểm nóng chảy: 86- 88°C
2.1.5 Phân lập n- triaconfan-l-ol từ các nguôn nguyên liệu của Việt Nam với việc sử dụng chất xúc tác chuyển pha
Trang 11©ste với các axit mỡ mạch đài, nên trong các bước của qui trình phân lập bước xà phòng hoá có một vai trò rất quan trọng Trong các phản ứng thế nucleophil, nói chung trong nhiều trường hợp khả năng phan
ứng được tăng lên nếu hỗn hợp phản ứng được thêm các chất xúc tác
chuyển pha, thông dụng nhất là các muối tetraankyl amoni va tetraankyl photphoni Luén án này nghiên cứu tác dụng của các chất xúc tác chuyến pha benzylrieyl amom clorua (BTEAC), dodexyltnmetyl amoni bromua hoac phenyltrimetyl amoni clorua trong bước xà phòng hoá đến kết quả phân lập triacontanol từ sáp ong, sáp cám gạo và sáp cây mía của Việt Nam
a-Sử dụng chất xúc tác chuyển pha vào việc phân lập triacontanol từ sáp ong
Chúng tôi vẫn sử dụng các tác nhân xà phòng hoá kali
hidroxit- etanol; kali hidroxit- nudc; kali cacbonat- etanol hay kali
cacbonat- nước như đã nêu ở phần 2.1.1, tuy nhiên tiến hành thí nghiệm trong sự có mặt của chất xúc tác chuyển pha Sau khi tiến hành thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy với cả ba loại chất xúc tác chuyển pha nêu trên thì các môi trường kali cacbonat-nước và kali cacbonat- etanol cho hiệu suất cao hơn cá Trong số ba chất đã sử dụng thì BTEAC cho hiệu suất cao nhất và sản phẩm cũng dễ tỉnh chế hơn Kết quả được nêu ở bảng 2
Với việc sử dụng chất xúc tác chuyển pha BTEAC trong môi trường kali cacbonat- nước hay kah cacbonat- etanol, chúng tôi đã đưa ra các qui trình mới để phân lập triacontanol từ các sáp thiên nhiên Với phenyltrrmetyl amoni clorua hiệu suất thu nhận triacontanol là thấp nhất, thậm chí còn thấp hơn khi không sử dụng chất này Như vậy qua thực tế chúng tôi thấy phenyltrimetyl amoni clorua không thể là
Trang 12Bảng? Kết quả thu nhận triacontanol từ 100g sáp sử dụng chất xúc tác chuyển pha ong với việc
Chất xúc tác Tác nhân/môi trường | Lượng TRIA | Điểm nóng
(Phương án) thu duge (mg) | chav (°C) Không sử dụng | KOH - HO-benzen 72 | 85.5 chất xúc tác KOH - etanol- benzen 74 86
chuyển pha K;CO, - H,O- benzen 80 86
K.CO, - etanol- benzen 100 85.5
KOH - H.O 95 86
Benzyltrietyl KOH - etanol 100 83.5
amomi clorua K.CO,- HO 105 86
K,CO, - etanol 140 85.5
KOH - H.O 80 86
Dodecyltrimety] | KOH - etanel 85 85,5
amoni bromua K.CO, - H.O 90 86
K,CO, - etanol 112 85,5
KOH - H,O 55 86
Phenyltrimety} KOH - etanol 68 85,5
amoni clorua K;CO;- H.O 65 86
K,CO, - etanol VW &6
b- Sử dụng chất xúc tác chuyển pha vào việc phan lap
triacontanol từ cám gạo
Chúng tôi đã tiến hành các nghiên cứu với bốn mẫu cám gạo: cám gạo nếp, cám gạo tẻ N-02, cám gạo Bông hồng, cám gạo 203 và tiến hành
xà phòng hoá phần chiết etanol của cám với K.CO;-H,O-BTEAC hay
Trang 13Bảng 3 Kết quả thu nhận triacontanol từ 1kg cám gạo với việc sử dụng chất xúc tác chuyển pha BTEAC
Mẫu Phương pháp xà Lượng TRIA | Điểm nóng phòng hoá thu được ng) | chảy (°C)
Cám gạo | K,CO, - H;O- BTEAC 75 85 nếp K,CO, - etanol- BTEAC 105 86
Camgao | K;CO,- HạO- BTEAC 70 86
N-02_ | K,CO,-etanol- BTEAC 85 85,5
Cảm gạo | K,CO,- HO- BTEAC 65 85,5
203 K,CO, - etanol- BTEAC 75 86
C4m gao_ | K,CO,- H.O- BTEAC 65 85,5
Bong héng | K,CO,- etanol- BTEAC 80 86
Bảng trên cho ta thấy trong điều kiện xúc tác chuyển pha cám gạo nếp cũng cho hiệu suất thu triacontanol cao hơn cả
c- Sử dụng chất xúc tác chuyển pha vào việc phân lập
triacontanol từ sáp cây mía
Chúng tôi đã tiến nành phân lập triacontanol từ sáp cây mía theo một
qui trình tương tự đã tiến hành với cám gạo Kết quả nêu ở bảng 4
Bảng + Kết quả thu nhận triacontanol từ 1kg sáp cây mía
với việc sử dụng chất xúc tác chuyển pha BTEAC ˆ
Mẫu Phương pháp xà Lượng TRIA Điểm nóng phòng hoá thu được (mg) chay (°C)
Sap K,CO, - H,O- BTEAC 38 85
mia | K;CO;- etanol- BTEAC 55 85,5
2.2 Nghiên cứu oxi hoá triacontanol thành triacontanal
Nhiều andehit tham gia vào các quá trình trao đổi chất trong thực vật
Để có duoc triacontanal dùng vào việc nghiên cứu một số hoạt tính,
Trang 14
chúng tôi đã tìm phương pháp oxi hoá chọn lọc triacontanol thành tracontanal Chúng tôi đã sử dụng một số tác nhân oxi hoá mới của
Crôm (VỊ) cho mục đích này
#Pyridin dicromat ((C;H;NH”)„Cr.O;?' (PDC))
* Amoni clorocromat trén nhom oxit,
* Quinolini bromocromat ((C,H;NHCrO,Br); QBC),
V6i ca ba t4c nhén ox: hod nay san phaém th6 gém triacontanal va tnacontanol khéng phan ting (SKLM) Bang phuong phap séc ky cot
nhanh (flash chromatography) trén silica gel, chúng tôi đã phân tách được triacontanal tình khiết Kết quả nêu ở bảng 5
Bảng 5: Kết quả thu nhận triacontanal từ 50mgtriacontanol bằng các tác nhân oxi hoá khác nhau Tác nhân Điểm nóng | Rf | Khối lượng | Hiệu suất chay (°C) (mg) (%LT) Pyridin dicromat 66 0,6 38 76 (PDC)/ CH.Cl, Amom clorocromat/ 66.5 0,6 35 7] nhômoxit/xiclohexan Quinolinbromocromat 66 0,6 27 55 (QBC)/ CH.Cl, Phổ hồng ngoại của triacontanal có các dinh đặc trưng: 2930; 2851; 1720; 1471; 1464; 729; 719 cm”
2.3 Điêu chế một số este và tetrahydropyranylete của triacontanol Trong việc nghiên cứu chuyển hố triacontanol, chúng tơi đã điều chế triacontanyl-axetat, và lần đầu tiên diéu ch€ benzoat, 3,5- đimtrobenzoat cùng với tetrahydropvranyl ete của triacontanol Các dân xuất này có thể có tính ñpophil và tính tan khác biệt đáng kể so
Trang 15với triacontanol, và cũng có thể phân biệt với triacontanol về hoạt tính
điều hoà sinh trưởng thực vật 2.3.1 Triacontanyl axetat
Cho triacontanol tac dung véi anhidnt axetic trong môi trường pyridin khan Sản phẩm phản ứng được chiết bằng ete và dịch chiết được rửa bang dung dich axit clohidric 10%, réi bang nước đến trung tinh Cat
loại đung môi cho sản phẩm thô ở dạng rắn Kết tính lại sản phẩm thô
trong clorofoc cho triacontanyl axetat (hiệu suất : §2% theo lý thuyết) Dne: 63°C SKLM Gilica gel, hệ dung môi benzen-clorofoc = 4:1 v/v, thuốc hiện là dung dịch KMnO, 1%) Rf = 0,42 Phổ HN (KBr): cm”: 2940, 2§49; 1742; 1474; 1464; 1367; 1244; 729, 720 Phổ CHT 'H & (ppm, CDCI,): 0.90 t J=6.0Hz 3H -CH, 132 bs 56H = 28x(-CH,-) 2.01 s 3H CH,-COO- 4.04 t I=60Hz 2H ~-CH,-O 2.3.2 Triacontanyl benzoat
Cho triacontanol tác dụng với benzoyl clorua trong pyridin Sản phẩm phản ứng được chiết với ete, dịch chiết được rửa bằng nước cho đến
trung tính, rồi làm khan Cất loại dung môi, thu sản phẩm thô là một
chất rấn Kết tỉnh lại trong metanol thu được triacomanyl benzoat
(hiệu suất : 79% theo ly thuyét) Dne: 65°C
SKLM (silica gel, hệ dung môi benzen-clorofoc = 4:1 v/v, thuốc hiện là dung dich KMnO, 1%) Rf = 0,69
Phổ HN (KBr): cm: 2940, 2894; 1721; 1600; 1474; 1464;
1380; 1277; 1113; 731; 719
Trang 16Phé CHT 'H 8 (ppm, CDCI,): 0.90 t J=60Hz 3H -CH, 1.32 bs 56H 28x(-CH„) 4,32 t J=60H 2H -CH,-O 7.24-8.06t m SH (CGH) 2.3.3 Triacontanyl 3,5-dinitrobenzoat
Cho triacontanol tác dụng với 3,5-dinitrobenzoyl clorua trong pyridin
Sản phẩm phản ứng được chiết với ete, dịch chiết được rửa bằng nước
đến trung tính, rồi làm khan Sau khi cất loại dung môi chúng tôi đã thu được sản phẩm thô là một chất rấn Tiến hành kết tỉnh lại sản phẩm trong metanol thu được sản phẩm triacontanyÌ 3,5dinitrobenzoat
thiệu suất: 81% theo lý thuyết) Đnc: 759C
SKLM (silica gel, hé dung môi benzen-clorofoc = 4:1 v/v, thuốc hiện
là dung dịch KMnO, 1%) Rf = 0,69
Phổ HN (KBr): cm: 2918; 2849; 1686; 1508; 1454; 1425; 1327;
1294; 1186; 728; 719; 669
2.3.4 Triacontanyl tetrahydropyranyl ete
Cho triacontanol phản ứng với 3,4-dihidro-2H-pyran (trước khi
dùng cất lại, đs: §6°C) ở nhiệt độ phòng, thêm vài giọt HCI đậm đặc
vào, lắc kỹ Để yên ở nhiệt độ phòng 4 giờ, thỉnh thoảng lắc Chiết sản phẩm bang ete, rita dich chiết ete bằng nước rồi bằng NaOH 10% tồi lại bằng nước đến trung tính, rồi làm khan Cất loại dung môi cho sản
phẩm là một chất lỏng sệt Kết tỉnh lại sản phẩm trong clorofoc, cho
triacontanyl tetrahydropyranyl ete (hiệu suất : 77% theo lý thuyết)
Đnc: 56C
SKLM (siica gel, hệ dung mời benzen-clorofoc = 4:1 v/v, thuốc hiện
1A dung dich KMnO, 1%) Rf = 0,49
Phé HN (KBr): cm‘': 2820; 1200; 1124; 820
Trang 172.4 Glycozyl hoá triacontanol
Nhằm mục đích làm tăng thêm tính hoà tan được trong nước của
triaconianol, giúp cho sự vận chuyển hoại chất này trong cây đến nơi nó tác dụng được dễ đàng hơn, chúng tôi đã nghiên cứu điều chế các glycozit cia triacontanol (glycozit no, va glycozit không no với nối
đôi C=C ở phần cacbohidrat) Chưa có công trình nào nghiên cứu về
các glycozit không no của n- triacontan-1-ol với nối đôi C=C ở phần cacbohidrat
2.4.1 Glycozit no
Chúng tôi đã nghiên cứu điều ché triacontanylglucozit,
triacontanylegalactozil , triacontanyimaltozit, sir dung glucoza,
galactoza va maltoza làm nguyên liệu cho phần cacbohidrat Thí dụ sơ
đồ phân ứng giữa triacontano] và glucoza nhu sau: Ac ene CC, Fi(Chig OH deaxetyl had A Be { tae) OH OAc oH giucoze axetotromglLcoza triacortarnyigiucozt Cũng theo sơ đồ tương tự, chúng tôi đã điều chế triacontanylealactozit va tnacontanylmaltozit H H m HQ —9 O(CH,j;CH, > OFA oH OH OH (OH L Ằ -=d HO 1 ° OH OH triacontanylgalactozit triacontanylmaltozit
Chúng tôi đã axetyl hoá các monosaccarit bằng anhidrit axelc (axit pecloric làm xúc tác) Tiếp đó xử lý hỗn hợp nhận được với
Trang 18hidrobromua sinh ra trong môi trường phản ứng từ photpho, brom và
nước Cho ancol tác dung với dân suất axetohromo của đường tương
ứng trong nirobenzen ở 120°C (có mật Ag,O) Các axetylglycozit
hình thành được deaxetv] hoá bằng natri metylat để cho các glycozit
Trang 196 mn 3S b-Axetylgalactozit Hiéu sual dat 47% theo ly thuyét Dnc: 79°C, Phé HN (KBr): em? 2940, 2849; 1748; 1474; 1464; 1372; 1233; 1051; 724,714 c-Sản phẩm galactozit Hiệu suất đạt 42% theo lý thuyết Đnc: 970C Phổ HN (KBr): cm: 3400; 2918, 2849; 1473;1461; 1385; 729,719 2.4.1.3 Điều chế triacontanyl glycozit no từ maltoza a-Axetobromomaltozo Hiệu suất đạt 68% theo lý thuyét Pne: 81°C Phổ HN (KBr): cm”: 2964; 1750; 1374; 1250; 1050; 602 b-Axetylmaltozit Hiệu suất đạt 35% theo ly thuyét Dne: 77°C Phổ HN (KBr): cm’: 2940, 2849; 1748; 1474; 1464; 1373; 1348; ‘ 71232; 1068; 725,714 c-Sản phẩm maltozit Bị Hiệu suất đạt 32% theo lý thuyết Đnc: 969C Phổ HN (KBr): cm': 3400; 2918, 2849; 1474; 1464; 1380; 1040; 731,720 2.4.2 Glycozit khong no
Nếu sử dụng giycal làm tác nhân glycozyl hod vA tén hanh trong điều kiện vắng mặt các axit có proton, ta có thể nhận được các glycozit kh6ng no cé néi d6i C=C & phan cacbohidrat Véi viéc sit dung cdc #lyca! (glucal, galactal, maltal) lam téc nhan glycozyl hod, chting t6i đã lần đầu tiên điều chế được một dãy mới các triacontanyl glycozit không no Thí dụ sơ đồ phản ứng điều chế glucozit không no đi từ glucoza nhu sau:
Trang 20Pore Q
wre ST (osc) Sco, HH oe
HO AO! AcO Gructéc) AcOk= on OAc gucoza axetobromghicoza OH OR deaxety] hoá cà" Cyn, HOT - O(CH2;¿CH; HO=
traontanv] guoozt không no
Cũng theo sơ đồ này chúng tôi đã điều chế triacontanyl galactozit
không no va triacontany] maltozit khong no OH OH HO /—° ° (CHa) aC OH À ‘ O(CHa)20CH3 — HỖ t œ=«-2 N= OH
triaconlany Igalactozit không no †riacontanyimaliozil khong no
Chúng tôi đã điều chế các glycal (ølucoza, galactoza, maltoza) bang cách khử hoá dân xuất axetobrơmo của đường bằng Zn trong
CH;COOH/H;O với sự có mặt của CuSO,và CH;COONa Từ các poly-
O-axervi-glvcal này chúng tôi đã điều chế các poly-O-axetyl-
triacontanyl-glycozit không no theo một qui trình chung được tiến
hành với chất xúc tác botrifluorua eterat trong benzen ở nhiệt độ phòng Các poly-O-axety]-p]ycozit hình thành được deaxetyl hod bang
Trang 21b-Axetylglucozit không no Hiệu suất đạt 51% theo lý thuyết Đnc: 81°C Phé HN (KBr): cm': 2940 2849:1736: 1682; 1474; 1464; 1377; 731.720 c-Sản phẩm glucozit không no Hiệu suất đạt 31% theo lý thuyết ĐÐnc: 99C Phố HN (KBn: cm': 3400: 2940, 2849; 1636; 1474: 1464:1380: 1084; 1037: 730.720 Phổ khối lượng: pic rất đặc trưng cho phần dudng 6 m/z 97, là của mảnh: <> GH Phổ cộng hưởng từ proton Š ( ppm, DMSO ): 0.94 3H -CH, 1.0-3.5 nhóm metylen của gốc triacontany] 41 H-5, H-6, H-6° 5.1 1H HI 7
6.1 2H các proton vinylic của gốc đường
Trang 22c-Sản phẩm galactozit không no Hiệu suất đạt 47% theo lý thuyết Đnc: 97,5%C Phổ HN (KBr): cm”: 3400; 2940 2§51; 1640; 1473: 1464: 1379; 1060; 1024; 725,719 2.4.2.3 Diév ché triacontanyl glucozit khong no tt maltoza a- Hexaaxetyl-d-maltal Hiệu suất đạt 10% theo lý thuyết Đnc: 130C, Phổ HN (KBr): cm'': 2939: 1728; 1375; 1250:1067 b- Axetylmaltozit khong no Hiệu suất đạt 27% theo ly thuyét Dne: 79°C Phổ HN (KBr): cm`:2940, 2855; 1740; 1640; 1474; 1464; 1380; 1281; 731,720
c- Sản phẩm maltozit không nơ
Hiệu suất đạt 26% theo lý thuyết Đnc: 97C
Phổ HN (KBr): cm”: 3400; 2940, 2851; 1641;146§; 1464; 1380; 720 2.5 Nghiên cứu phương pháp phân tích n-triacontan-1-ol bàng sắc
ký khí (GC) và sắc ký lòng hiệu lực cao (HPLC)
2.5.1 Sắc ký khí
Theo nhiều tác giả và cũng theo kinh nghiệm của chúng tôi, việc
phân tích triacontanol và các ancol béo mạch dài nói chung bằng
phương pháp sắc ký khí không dễ đàng vì những chất này đo có điểm
sôi cao và khả năng hấp phụ vào chất mang lớn Để khắc phục khó
khăn đó, chúng tơi đã chuyển hố triacontanol thành dẫn xuất silyl
hóa, nhờ phản ứng giữa triacontanol và N.O-Bis(rimetylsilyl) trfluoaxetamit (CH;;F;NOSI,) (BSTFA) trong pyndin Các dẫn xuất
silyl hod của triacontanol chuẩn và sản phẩm triacontanol thô tách
được từ sáp ong, cám gạo, sáp cây mía, đã được khảo sát sắc ký khí ở
các điều kiện cột OV-17, chạy chương trình nhiệt độ 709-325 %C
Trang 23(10C / phút) Pic của dẫn xuất sily] hoá triacontanol xuất hiện ở vùng
có thời gian lưu gần 24 phút
2.5.2 Sác ký lỏng hiệu hực cao (HPLC)
Phương pháp Sắc ký lỏng hiệu lực cao đế xác định tmacontanol cho đến nay chưa được đê cập đến, có thể do chất này thiếu các nhốm mang màu (chromophor) để có thể theo đối được bane
etectơ trắc quang tử ngoại Lần đầu tiên chúng tôi đã nghiên của và đề ra được phương pháp xác định nhanh triacontanol bằng sắc ký lông
hiệu lực cao (HPLC) với kỹ thuật tạo dân xuất trước khi bơn mẫu vaò
cội Phương pháp này có thể dùng để định lượng triacontanoi trong
các nguyên liệu, thí dụ trong cdc sáp thực vật hoặc sáp ong, hoặc trong các tủa của phần khơng xà phịng hố của các sáp này
Đầu tiên triacontanol được chuyến qua dẫn xuất benzoal Chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm với triacontanol chuẩn (loại 1-
triaconlanol, approx 96% của hãng SIGMA) và các kết tủa của phần
không xà phòng hoá của sáp on, cám gạo nếp, cám gạo 203, cám sạo N-02, cám gạo Bông hồng và sáp cây mía Triacontanol có trong các
mẫu nói trên lần lượt duge este hod véi benzoyl clorua trong pvridin Sau đó chạy HPLC với các mẫu benzoat này và thu được các sắc đồ
tương ứng Dựa vào diện tích pic và lượng triacomanol chuẩn dem
phản ứng chúng tôi đã xây đựng được đường chuẩn
Trên cơ sở đường chuẩn và diện tích pic thu được từ các sân
phẩm benzoat tạo ra từ các kết tủa của phần không xà phòng hoá ở các
mẫu nguyên liệu Khác nhau, chúng tôi đã xác định được lượng
triacontanol có trong 10g kết tủa của phần không xà phòng hoá của
từng nguồn nguyên liệu khác nhau Từ đó có thể tính được hàm lượng
phần trăm của triacontanol trong kết tủa của phần không xà phòng hoá
Trang 24xà phòng hoá và khối lượng của nguyên liệu đầu cho phếp “ước lượng” được phần trăm triacontanol trone nguyên liệu ban đầu Kết
quả nều ở bảng 6
Bang 6 Ham lượng triacontanol (TRIA) trong các kết tủa của phan không xà phòng hoá và nguyên liêu đầu
Nguyên liệu | Lượng Diện | Lượng TRIA | % TRIA % TRIA đầu (1kg) kết tủa tích | trong 10g trong két trong
cha phan pc | kết tủa của tủa của mẫu
không xà | (em) | phần không | phản nguyên
phòng xa phong khong xà liệu đầu
hoa(g} hoa (mg) phòng hoá | (%) (4) Sáp ong 300 17,1 6,9 0,069 0,021 Cám gạo nếp 121 16,6 6,6 0,066 0,008 Cám gạo 158 10,5 41 0,041 0,0065 N-02 Cám gạo 171 10,1 3,8 0,038 0,0064 Bông hồng Cám gạo 203 132 13,5 s3 0,053 0,007 Sáp cây mía | 120 | 9,6 3.6 0,036 | 0/0043 2.6 Thử hoạt tính sinh học
2.6.1 Thử hoạt tính sinh học với triacontanol
Chúng tôi đã tiến hành thử sơ bộ hoạt tính sinh học đối với sản phẩm triacontanol do chúng tôi phân lập được đến:
*Sự nây mầm của lúa và đậu tương,
*Chiểu cao cây, trọng lượng tươi và khô của mạ lúa và đậu xanh *Hàm lượng sắc tố quane hợp của lúa và đậu xanh
Kết quả cho thấy tương đương với mẫu triacontanol chuẩn 96% của hãng SIGMA Kết quá đó gợi mở triển vọng ứng dụng triacontanol từ các nguồn thiên nhiên của Việt Nam
Trang 252.6.2 Thử hoạt tính sinh học với các dẫn xuất của triacontanol Chúng tôi đã tiến hành thử sơ bộ hoạt tính sinh học đối với các sản phẩm chuyển hoá từ triacontanol đến:
*TỶ lệ nảy mầm của lúa, đậu xanh và đậu tương,
*Chiéu cao cây, trong lượng tươi, khô của cây lúa,
*Chiéu cao cây, trọng lượng tươi, khô của cáy đậu xanh
am lượng sắc tố của câv lúa *Ham lượng sác tố của cây: đậu xanh
KẾT LUẬN
Qua thời gian thực hiện luận án, chúng tơi đã hồn thành các nhiệm vụ và thu được các kết quả chủ yếu sau đây:
Ì Dựa trên sự sử dụng kết hợp tác nhân xà phòng hoá dịu đàng kalicacbonat và chất xúc tác chuyển pha, đã xây dựng được các qui trình mới để phân lập triacontanol từ các sáp thiên nhiên Các quy trình này tăng được hiệu suất triacontanol và cho sản phẩm
thô lẫn ít tạp chất và dễ tinh chế hơn so với các quy trình trước đây: sử dụng kiểm hoặc không đùng chất xúc tác chuyển pha
2 Lần đầu tiên triacontanol được phân lập từ các nguyên liệu cám
gạo và sấp cây mía của Việt Nam, trong đó hiệu suất cao nhất đã đạt được với cám gạo nếp (0,105g từ lks cám) Sản phẩm triacontanol có điểm nóng chảy §6°C độ tỉnh khiết dat 96%
3 Áp đụng các qui trình phân lập triacontanol của chúng tôi vào sắp
ong mật của Việt Nam, đã nhận được sản phẩm thó chỉ gồm hai
thành phần chính là triacontanol (65%) và pentacosan (34%), và từ đó có thể đễ dàng tỉnh chế để nhận được triacontanol có độ tỉnh khiết 96%
4 Lần đầu tiên đã nghiên cứu và ầm ra phương pháp xác định triacontanol bằng sắc ký lông hiệu lực cao (HPLC) với kỹ
Trang 26in
10
Bis(tnmetyisilyl)Trifluoroacetamide (BSTFA) ciing da cd thé xc dinh triacontanol trong các sẵn phẩm và nguyên liệu bằng phương
pháp sắc ký khí
Lan dau tiên đã điều chế các dẫn xuất mới benzoat, 3,5- dinitrobenzoat và tetrahydropyrany] ete của triacontanol
Với việc ứng dụng các tác nhân oxi hóa méi cha Cr(VD (pynidini
dicromat, amoni clorocromat và quinolini bromocromat), da oxi hóa được một cách chọn lọc triacontanol thanh triacontanal dat
hiệu suất cao, thí dụ với pyridin dicromat đạt 76% hiệu suất lý
thuyết
Với việc sử dụng các glycal (glucal, galactal, maltal) làm tác nhân
glycozyl hoá, một dãy mới các glycoz không no của n- triacontan-1-ol đã lần đầu tiên được điều chế Để điều chế các
triacontanyl gÌycozIt no tương ứng, đã đưa ra một phương pháp
thuận tiện và thu hiệu suất cao, chủ yếu nhờ điều chế các dẫn xuất
axetobromo theo cách cải tiến
Kết quả bước đầu thử hoạt tính đã cho thấy triacontanol nhận được
từ các nguồn nguyên liệu trên có tác dụng kích thích sinh trưởng
rõ rệt đối với lúa CR203, đậu xanh và đạu tương, nói chung tương đương mẫu triacontanol 96% của hãng SIGMA Kết quả đó gợi
mở một triển vọng cho việc ứng dụng của triacontanol thu nhận
được từ các nguồn thiên nhiên của Việt Nam, nhất là triacontanol
thể hiện hoạt tính ở những nồng độ rất thấp (0,1mg/), và vì là chất
thiên nhiên nên thích hợp với môi trường
Từ các kết quả thử sơ bộ hoạt tính của các sản phẩm chuyển hoá
triacontanol thu được đã có thể rút ra một số thông tin gợi mở cho
các nghiên cứu sâu tiếp theo, thf du cdc dẫn xuất
tetrahydropyranyl ete va glucozit no lam tăng rõ rệt trọng lượng
khô của cây đậu xanh 7 ngày tuổi; các glucozit no và không no làm tăng hàm lượng sắc tố ở cây đậu xanh
Trang 27D- Những công trừnh có liên quan đến luận án đã công bố ,
1/ Nguyễn Tuấn Anh, Nguyễn Bích Ngọc, Phan Tống Sơn, Nghiên cứu chất điều tiết sinh trưởng thực vật n- triacontan-1-ol, Tạp chí Hoá
hoc, T.35, No3b, 93-98 (1997)
2/ Nguyễn Tuấn Anh, Phan Tống Sơn, Lê Phương Lan, Nghiên cứu chat diéu tiết sinh trưởng thực vật n- triacontan-l-olI Phân lập n- triacontan-1-ol từ nguồn sáp one của Việt Nam, Tạp chí Khoa học,
ĐHQGHN, KHTN, t.XIYV No4, 44-49 (1998)
3/ Phan Tống Sơn, Nguyễn Tuấn Ảnh, Triacontanol-Miột chất điều hoà sinh trưởng thực vái nguồn gốc thiên nhiên, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Tuyển tập các công trình khoa học, Hội nghị khoa học
trường ĐHKHTN, 1998, 118-122
4/ Phan Tống Sơn, Nguyên Tuấn Anh, Xác định triacontanol bằng sắc ký lỏng hiệu lực cao (HPLC) với kỹ thuật tạo dẫn xuất trước khi bơm chất vào cột, Tạp chí Hố học và Cơng nghiệp hoá chất, 1998, Noó,
6-9
5/ Nguyễn Tuấn Anh, Phan Tống Sơn, Triacontanol from natural
sources of Vietnam, “Ninth Asean Symposium on Medicinal Plants,
Spices and Other Natural Products * (ASOMPS Ix), 153 (1998)
6/ Nguyễn Tuấn Anh, Phan Tống Sơn, Nghiên cứu chất điều hoà sinh