Trong lĩnh vực Công Nghệ Thông Tin nói riêng, yêu cầu quan trọng nhất của người học đó chính là thực hành. Có thực hành thì người học mới có thể tự mình lĩnh hội và hiểu biết sâu sắc với lý thuyết. Với ngành mạng máy tính, nhu cầu thực hành được đặt lên hàng đầu. Tuy nhiên, trong điều kiện còn thiếu thốn về trang bị như hiện nay, người học đặc biệt là sinh viên ít có điều kiện thực hành. Đặc biệt là với các thiết bị đắt tiền như Router, Switch chuyên dụng
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y NGÔ THU HẰNG NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ ĐẦU CỔ CỦA VIRUS VACCINE SỞI PHỐI HỢP VỚI NIMOTUZUMAB TRÊN THỰC NGHIỆM Chuyên ngành : Khoa học y sinh Mã số : 9720101 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI - 2020 CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI HỌC VIỆN QN Y Hướng dẫn khoa học: GS TS NGUYỄN LĨNH TOÀN PGS.TS HỒ ANH SƠN Phản biện 1: GS TS VĂN ĐÌNH HOA Phản biện 2: PGS TS TRỊNH TUẤN DŨNG Phản biện 3: PGS TS PHẠM TUẤN CẢNH Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp trường họp Học viện Quân y vào hồi Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia - Thư viện Học viện Quân y ngày tháng năm 2020 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh ung thư vấn đề sức khỏe lớn, ngày quan tâm tất nước giới Ung thư đầu cổ (UTĐC) khối u ác tính phát triển khu vực thể, 90% UTĐC có mơ bệnh học ung thư biểu mô tế bào vảy Trên giới, UTĐC đứng hàng thứ với 4,8% tổng số ca ung thư chẩn đoán Trị liệu virus ly giải tế bào (Oncolytic virus –OLV) dựa chế OLV có khả xâm nhập nhân lên đặc hiệu tế bào ung thư khối u gây ly giải tế bào, kích thích tế bào ung thư chết theo chương trình, kích thích đáp ứng miễn dịch chống ung thư Nimotuzumab kháng thể đơn dịng hướng đích thụ thể tăng trưởng biểu bì (EGFR) có tác dụng chống tăng sinh mạch, kìm hãm tăng sinh tế bào, cảm ứng tế bào chết theo chương trình (apoptosis), làm tế bào tăng nhạy cảm với xạ trị hóa trị liệu Chúng tơi tiến hành đề tài “Nghiên cứu tác dụng kháng ung thư đầu cổ virus vaccine sởi phối hợp với Nimotuzumab thực nghiệm” nhằm mục tiêu: Đánh giá tác dụng kháng ung thư virus vaccine sởi phối hợp với Nimotuzumab in vitro Đánh giá tác dụng kháng ung thư virus vaccine sởi phối hợp với Nimotuzumab mơ hình chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối ung thư đầu cổ (in vivo) Tính cấp thiết: Nghiên cứu tác dụng kháng UTĐC người virus vaccine sởi (MeV) phối hợp Nimotuzumab in vitro mơ hình cấy ghép chuột thiếu hụt miễn dịch, làm tiền đề cho nghiên cứu chế tác dụng phối hợp MeV Nimotuzumab kháng u, tiến tới thử nghiệm lâm sàng sử dụng phối hợp MeV Nimotuzumab điều trị bệnh nhân ung thư nói chung UTĐC nói riêng Đóng góp luận án: Luận án nghiên cứu đánh giá tác dụng kháng ung thư đầu cổ người dòng tế bào Hep2 phối hợp MeV Nimotuzumab in vitro mô hình cấy ghép chuột thiếu hụt miễn dịch Từ làm sở cho nghiên cứu tiến tới thử nghiệm lâm sàng điều trị ung thư Bố cục luận án: Luận án có 150 trang, bao gồm: Đặt vấn đề (2 trang), Chương 1: Tổng quan (36 trang), Chương 2: Đối tượng phương pháp nghiên cứu (27 trang), Chương 3: Kết (47 trang), Chương 4: Bàn luận (35 trang), Kết luận (2 trang), Kiến nghị (1 trang) Luận án có 175 tài liệu tham khảo (tiếng Anh: 171) CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cương ung thư đầu cổ Ung thư đầu cổ (UTĐC) khối u ác tính phát sinh vùng đầu cổ như: ung thư khoang miệng, mũi, xoang cạnh mũi, lưỡi, họng, tuyến nước bọt quản Tỉ lệ mắc UTĐC ngày gia tăng Việt Nam số khu vực giới Đây bệnh ác tính có tiên lượng xấu, nguy hiểm có nhiều biến chứng lớn Các yếu tố nguy liên quan đến UTĐC bao gồm sử dụng thuốc lá, uống rượu, nhiễm HPV - ung thư họng miệng, nhiễm EBV- ung thư vòm họng Các gen gây ung thư HNSCC thường liên quan đến đường chức chính: tăng sinh tế bào, biệt hóa biểu mơ vảy, tồn tế bào xâm lấn/di 1.2 Liệu pháp hướng đích thụ thể yếu tố phát triển biểu bì 1.2.1 Vai trị EGFR ung thư biểu mơ vảy đầu cổ Thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (Epidermal growth factor receptor - EGFR) có trọng lượng phân tử 170 kiloDaltons (kDa) Khi yếu tố tăng trưởng biểu mô (EGF) liên kết vào thụ thể (EGFR), hai phân tử EGFR kết hợp với (dimer hóa) từ tự phosphoryl hóa vùng tyrosine kinase gây hoạt hố tyrosin đặc hiệu protein tín hiệu nội bào phụ thuộc thụ thể EGFR gây phiên mã gen đích thúc đẩy q trình tăng sinh tế bào, sống sót (ức chế chết tế bào theo chương trình - apoptosis), xâm lấn di tế bào EGFR đặc biệt quan trọng bệnh sinh ung thư biểu mô tế bào vảy đầu cổ (HNSCC) Sự biểu EGFR gặp 92% khối HNSCC Hơn nữa, biểu EGFR tăng cao khối u giai đoạn tiến triển khối u biệt hóa 1.2.2 Nimotuzumab điều trị ung thư đầu cổ Nimotuzumab kháng thể đơn dịng có khả gắn kết đặc hiệu với EGFR, ngăn chặn kích hoạt thụ thể Nó nhận miền ngoại bào EGFR cạnh tranh vị trí gắn yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGF), ngăn ngừa EGF liên kết kích hoạt EGFR tiếp theo, ức chế hoạt tính tyrosin kinase, ức chế tăng trưởng tế bào khối u Ngoài để đáp ứng với EGFR bị phong tỏa Nimotuzumab, tế bào khối u giảm khả tiết yếu tố tăng sinh mạch máu, yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu (VEGF), dẫn đến giảm hình thành mạch máu tăng số lượng tế bào apotosis Nimotuzumab (Cimaher) chứng minh có hiệu điều trị HNSCC tiến triển không phẫu thuật Nimotuzumab chứng minh an toàn biến chứng nặng 1.3 Virus vaccine Sởi (MeV) liệu pháp virus điều trị ung thư 1.3.1 Virus sởi Virus sởi virus có đường kính khoảng 100-300 nm, với lõi RNA sợi đơn (-), thuộc chi Morbillivirus họ Paramyxoviruses, bao quanh capsid xoắn Các glycoprotein vỏ bọc MeV protein hemagglutinin (H) fusion (F) làm trung gian cho gắn hòa hợp virus với tế bào Trong liệu pháp OLV nay, sử dụng chủng vaccine MeV thuộc dòng Edmonston bao gồm số chủng biến đổi thích nghi thí nghiệm, liên quan chặt chẽ nguồn gốc từ chủng lâm sàng lấy từ họng em bé có tên David Edmonston (năm 1954) cấy truyền tế bào khác nhau, tạo chủng MeV giảm độc lực không gây bệnh 1.3.2 Thụ thể MeV MeV sử dụng ba thụ cảm thể CD46, CD150 nectin-4 để xâm nhập vào tế bào đích, quan trọng thụ thể CD46 CD46 glycoprotein xuyên màng type biểu phổ biến tất tế bào có nhân Thụ thể CD46 tìm thấy biểu mức cao tế bào ung thư Ở tế bào bình thường có biểu CD46 thấp, MeV có khả lây nhiễm hình thành hợp bào khơng đáng kể Ở tế bào ung thư có biểu thụ thể CD46 cao, nhiễm MeV dẫn đến phản ứng hợp bào mạnh mẽ: MeV gắn với thụ thể xâm nhập vào tế bào, tăng sinh tế bào, hình thành hợp bào tiêu diệt tế bào qua trung gian CD46 tăng lên rõ rệt 1.3.3 Tính an tồn vaccine sởi giảm độc lực MeV đáp ứng đầy đủ tiêu chuẩn OLV lý tưởng phải có tính lựa chọn khối u cao, khơng gây bệnh cho mô lành thể, ổn định mặt di truyền khơng có nguy gây bệnh cho cộng đồng 1.3.4 Các chế gây ly giải tế bào ung thư 1.3.4.1 MeV trực tiếp giết chết tế bào u qua hình thành hợp bào Sự hợp tế bào nhiễm virus tế bào bình thường lân cận tạo thành hợp bào Một tế bào bị nhiễm virus hợp 50100 tế bào lân cận với tạo thành hợp bào Đây chế lây lan virus mà không cần giải phóng hạt virus trưởng thành khỏi tế bào Quá trình hợp tế bào làm cho virus giảm tiếp xúc với kháng thể trung hòa thể vật chủ, virus tránh kiểm soát hệ miễn dịch 1.3.4.2 Ly giải tế bào u qua trung gian kích thích miễn dịch đặc hiệu kháng u MeV tạo loại tín hiệu nguy hiểm tín hiệu nguy hiểm nội sinh (DAMP), tín hiệu nguy hiểm ngoại sinh (PAMP), chúng kích hoạt đáp ứng miễn dịch đặc hiệu góp phần quan trọng ly giải tế bào u như: sản xuất IFN, cytokine, hoạt hóa tế bào NK, đại thực bào, tế bào DC, tế bào lympho T 1.4 Sử dụng phối hợp virus vaccine sởi kháng thể đơn dòng Nimotuzumab điều trị ung thư Có thử nghiệm sử dụng MeV có khả nhắm mục tiêu EGFR để xâm nhập ly giải tế bào ung thư nguyên bào thần kinh thử nghiệm với đối tượng tế bào HNSCC Cả thử nghiệm cho thấy khả ức chế gây chết tế bào ung thư MeV nhắm mục tiêu EGFR in vitro in vivo Nimotuzumab kháng thể đơn dòng ức chế EGFR chứng minh có hiệu điều trị HNSCC Từ sở trên, tiến hành phối hợp MeV với kháng thể đơn dịng Nimotuzumab nhằm mục đích cộng hợp tác dụng điều trị ung thư theo chế hai liệu pháp để đem lại hiệu tốt điều trị HNSCC in vitro in vivo CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng vật liệu nghiên cứu 2.1.1 Động vật: Chuột nhắt thiếu hụt miễn dịch chủng BALB/c, - tuần tuổi, trọng lượng từ 18-22g, đủ tiêu chuẩn thí nghiệm 2.1.2 Vaccine sởi (MeV): virus vaccine sởi chủng Edmonton 2.1.3 Các dịng tế bào: Tế bào ung thư biểu mơ vảy đầu cổ người dòng Hep2, tế bào thận khỉ (tế bào Vero) 2.1.4 Kháng thể đơn dòng Nimotuzumab:chế phẩm CIMAher 2.1.5 Trang thiết bị sử dụng cho nghiên cứu 2.1.5.1 Thiết bị sử dụng: Thước kẹp NSK 150mm, cân điện tử TE3102S Sartorius, phịng ni chuột, phịng ni cấy tế bào, máy li tâm, máy đo mật độ quang, máy realtime PCR, máy flow cytometry, pipet kích cỡ khác 2.1.5.2 Các dụng cụ thí nghiệm tiêu hao: Phiến 6, 96 giếng, đầu côn, đĩa nuôi cấy, lọc vi khuẩn, ống falcon, eppendorf 2.1.5.3 Hóa chất: Mơi trường ni cấy tế bào M199, EMEM, kít làm thử nghiệm MTT, Annexin V/PI Fluorescein isothiocyanate; kít tách RNA, chuyển cDNA, primers, master Mix, cồn 70, 900 2.2 Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu tiến hành theo phương pháp thực nghiệm, tiến cứu, chọn thời điểm so sánh đánh giá trước, sau điều trị 2.2.1 Đánh giá khả ức chế tế bào chết theo chương trình virus vaccine sởi phối hợp Nimotuzumab dòng tế bào ung thư đầu cổ người Hep2 2.2.1.1 Các tiêu đánh giá - Xác định nồng độ virus phương pháp chuẩn độ CCID50 - Đánh giá khả ức chế tế bào Hep2 thử nghiệm MTT - Đánh giá tỉ lệ tế bào chết theo chương trình hoại tử phương pháp flow cytometry - Đánh giá tế bào chết theo chương trình (sự tăng cường biểu phiên mã gen STAT3 ISG15) kỹ thuật Realtime PCR 2.2.1.2 Các kỹ thuật thực a, Kỹ thuật nuôi cấy dòng tế bào ung thư Tế bào Hep2 Vero lấy từ nguồn bảo quản âm sâu (80 C), rã đông thật nhanh (