Luận văn thạc sĩ Công nghệ thực phẩm: Nghiên cứu cố định Enzyme Lipase Porcine Pancreas trên các chất mang Hydrotalcite để thủy phân dầu dừa

Kết quả thử nghiệm thủy phân của enzyme lipase tự do, enzyme lipase cố định lên chất mang đã nung và enzyme lipase cố định lên chất mang chưa nung: kết quả cho thấy, mức độ thủy phân đạt

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

-

NGUYỄN THỊ THANH TUYỀN

NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH ENZYME LIPASE PORCINE

PANCREAS TRÊN CÁC CHẤT MANG HYDROTALCITE

ĐỂ THỦY PHÂN DẦU DỪA

Chuyên ngành : Công Nghệ Thực phẩm và Đồ Uống

Mã số: 605402

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 01 năm 2015

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA –ĐHQG -HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học :

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký) Cán bộ chấm nhận xét 1 :

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký) Cán bộ chấm nhận xét 2 :

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký) Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM , ngày tháng năm

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ) 1

2

3

4

5 Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc Lập – Tự Do – Hạnh Phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

I TÊN ĐỀ TÀI:

Nghiên cứu cố định enzyme lipase lên các chất mang hydrotalcite để thủy phân dầu dừa

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

- Khảo sát các tính chất ban đầu của nguyên liệu: enzyme lipase Porcine pancreas,

chất mang Hydrotalcite ( chưa nung và nung 5000C) và dầu dừa

- Khảo sát các điều kiện thích hợp cho quá trình cố định enzyme lipase Porcine pancreas lên 2 chất mang

- Khảo sát các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân dầu dừa bằng enzyme

lipase Porcine pancreas - Xác định mức độ thủy phân dầu dừa bằng enzyme lipase Porcine pancreas,

enzyme cố định trên LDHs chưa nung và enzyme cố định trên LDHs nung 5000C - Phân tách sản phẩm sau khi thủy phân dầu dừa, và xác định thành phần acid béo có

trong từng phân đoạn Thử nghiệm khả năng chống oxi hóa của acid béo có trong từng phân đoạn

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 15/08/2014 IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 08/12/2014 V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS PHAN NGỌC HÒA

TP Hồ Chí Minh, ngày tháng năm CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO (Họ tên và chữ ký) (Họ tên và chữ ký)

PHAN NGỌC HÒA LÊ VĂN VIỆT MẪN

TRƯỞNG KHOA (Họ tên và chữ ký)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

oOo oOo

NHẬN XÉT LUẬN VĂN THẠC SĨ

(Nhận xét của CB hướng dẫn  Nhận xét của CB phản biện  )

Họ và tên học viên: NGUYỄN THỊ THANH TUYỀN

Đề tài luận văn: NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH ENZYME LIPASE TRÊN CÁC CHẤT MANG HYDROTALCITE ĐỂ THỦY PHÂN DẦU DỪA

Chuyên ngành: Công nghệ Thực phẩm – Đồ uống

Người nhận xét (họ tên, học hàm , học vị) :

Cơ quan công tác (nếu có):

Ý KIẾN NHẬN XÉT 1- Về nội dung & đánh giá thực hiện nhiệm vụ nghiên cứu của đề tài:

3- Về kết quả khoa học của luận văn:

6 Ý kiến kết luận (mức độ đáp ứng yêu cầu đối với LVThS; cho điểm đánh giá LV):

LỜI CẢM ƠN

Hoàn thành luận văn này, bên cạnh sự nổ lực hết mình của chính bản thân, tôi còn nhận được những ý kiến đóng góp hết sức quý báu và sự giúp đỡ, động viên nhiệt tình của Quý Thầy/Cô, gia đình cùng các bạn Tuy nhiên, do kiến thức có giới hạn nên tôi không thể tránh khỏi những sai sót Kính mong Quý Thầy/Cô góp ý và sửa chữa để luận văn được hoàn thiện hơn

Với tấm lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn đến: Cô: Phan Ngọc Hòa, giảng viên trường Đại học Bách Khoa, đã hướng dẫn tận tình và động viên tôi trong suốt thời gian dài thực hiện luận văn, đồng thời hỗ trợ phần lớn kinh phí để tôi hoàn thành luận văn này

Cô: Nguyễn Thị Nguyên, giảng viên trường Đại học Bách Khoa, đã động viên, hổ trợ dụng cụ thiết bị và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn tại phòng thí nghiệm

Quý Thầy/Cô trong Bộ môn đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong việc thực hiện luận văn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ba mẹ, anh chị em và bạn bè đã ủng hộ tôi về mặt vật chất lẫn tinh thần trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn

TP Hồ Chí Minh, ngày tháng 01 năm 2015 Người viết

NGUYỄN THỊ THANH TUYỀN

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn này đều là trung thực

Học viên thực hiện Luận văn tốt nghiệp

NGUYỄN THỊ THANH TUYỀN

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Ngày nay, enzyme cố định đang được các nhà khoa học nghiên cứu nhiều hơn để ứng dụng vào qui mô công nghiệp, thay thế cho enzyme tự do bởi chúng có những ưu điểm sau: khả năng chịu nhiệt tốt, bền với pH, giá thành rẻ, dễ dàng tách ra khỏi sản phẩm,…

Trong luận văn này, chúng tôi tập trung nghiên cứu những nội dung chính như sau:

1 Nghiên cứu tính chất của enzyme lipase Porcine pancreas, dầu dừa và vật

liệu hydrotalcite:

Tính chất của enzyme lipase Porcine pancreas: có phân tử lượng khoảng

50KDa, pHpzc là 4.4, hoạt độ riêng là 178 U/mg protein, hàm lượng protein chiếm 44.06%

Dầu dừa: chỉ số acid là 0.13mg KOH/g, chỉ số peroxyt là 2meq/kg, hàm lượng lipid tổng là 99.25%, hàm lượng acid béo tự do ( tính theo acid oleic) là 0.06%, không chứa tạp chất

Tính chất của hydrotalcite: pHpzc của chất mang chưa nung là 8.16 và pHpzc của chất mang nung 500oC là 8.67

2 Nghiên cứu quá trình thủy phân dầu dừa của enzyme lipase Porcine pancreas: tỉ lệ dầu/đệm: 1/1(v/v), tỉ lệ enzyme/cơ chất : 0.22(%w/w), pH 8.5, 40oC Với điều kiện này, hoạt độ của enzyme lipase tự do là 266.6 U/mg enzyme

3 Nghiên cứu quá trình cố định enzyme lipase lên 2 chất mang hydrotalcite: Đối với chất mang chưa nung: tỉ lệ enzyme/chất mang là 0.07 (w/w), pH 7.0, nhiệt độ 40oC, thời gian cố định là 6h Hiệu suất cố định theo protein đạt được là 75.51%, và hiệu suất cố định theo hoạt độ là 83% Với điều kiện trên, chế phẩm enzyme lipase cố định lên chất mang chưa nung có hoạt độ là 3612 U/g enzyme

Đối với chất mang đã nung 500oC : tỉ lệ enzyme/chất mang là 0.08 (w/w), pH 7.5, nhiệt độ 40oC, thời gian cố định là 6h Hiệu suất cố định theo protein đạt được là 86.94%, và hiệu suất cố định theo hoạt độ là 85.1% Với điều kiện trên, chế phẩm enzyme lipase cố định lên chất mang đã nung có hoạt độ là 4368 U/g enzyme

4 Kết quả thử nghiệm thủy phân của enzyme lipase tự do, enzyme lipase cố định lên chất mang đã nung và enzyme lipase cố định lên chất mang chưa nung: kết quả cho thấy, mức độ thủy phân đạt được lần lượt là: 55.27%, 35.85%, 7.17%, sau 5h thủy phân trên cơ chất dầu dừa Với điều kiện trên, enzyme cố định lên chất mang đã nung sau 5 lần tái sử dụng vẫn giữ được 63.3% hoạt độ ban đầu

5 Kết quả thử nghiệm khả năng chống oxi hóa của sản phẩm sau thủy phân: ta thấy rằng, trong phân đoạn phân cực chứa nhiều acid béo tự do, và hợp chất không xà phòng hóa ( tocopherol, sterol,…) nên nó có khả năng bắt gốc tự do DPPH tốt hơn so với trong phân đoạn không phân cực( chứa acid béo dưới dạng liên kết ester với glycerol), nên khả năng chống oxi hóa trong phân đoạn phân cực cao hơn

1.1.4 Cơ chế hoạt động của enzyme LPP 7

1.1.5 Ứng dụng của enzyme lipase 10

1.2 Kỹ thuật cố định enzyme 13

1.2.1 Định nghĩa về enzyme cố định 13

1.2.2 Tính chất của enzyme lipase cố định 14

1.2.2.1 Hoạt độ của enzyme cố định 14

1.2.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH 15

1.2.2.3 Động học của enzyme cố định 16

1.2.2.4 Khả năng tái sử dụng của enzyme cố định 17

1.2.3 Các phương pháp cố định enzyme 18

1.2.4 Các kỹ thuật cố định lipase Porcine pancreas 19

1.2.5 Cơ chế cố định enzyme lipase lên chất mang LDHs 24

1.2.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định enzyme lipase lên LDHs 24

ii

1.4.1 Sơ lược về dầu dừa 29

1.4.2 Thành phần hóa học của dầu dừa 30

1.4.3 Tính chất của dầu dừa 32

1.4.4 Công dụng của dầu dừa 32

1.4.5 Ứng dụng của sản phẩm thủy phân dầu dừa 34

1.5 Các công trình nghiên cứu có liên quan 36

1.5.1 Các công trình nghiên cứu thủy phân dầu dừa bằng enzyme lipase tự do và enzyme lipase cố định 36

1.5.2 Các công trình nghiên cứu thủy phân dầu dừa bằng enzyme lipase cố định trên hydrotalcite 41

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 43

2.1 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị 43

2.3.1 Khảo sát tính chất của chất mang, enzyme và dầu dừa 47

2.3.1.1 Khảo sát tính chất của chất mang LHDs-car 0.05M nung và LHDs-car 0.05M chưa nung 47

2.3.1.2 Khảo sát tính chất của enzyme 47

2.3.1.3 Khảo sát tính chất của dầu dừa 47

2.3.2 Khảo sát điều kiện thủy phân thích hợp của dầu dừa với enzyme LPP tự do 47 2.3.2.1 Ảnh hưởng tỉ lệ dầu/đệm 47

2.3.5 Phân tách sản phẩm sau thủy phân 53

2.3.6 Số lần tái sử dụng của enzyme cố định 54

2.3.7 Xác định hoạt tính chống oxi hóa 54

2.4 Công thức tính toán 55

2.4.1 Hiệu suất cố định enzyme 55

2.4.2 Xác định tốc độ thủy phân của enzyme 57

2.4.3 Xác định mức độ thủy phân của enzyme 57

2.5 Phương pháp xử lý số liệu 58

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 59

3.1 Khảo sát tính chất của chất mang, enzyme và dầu dừa 59

3.1.1 Khảo sát tính chất của chất mang LHDs-car 0.05M nung và LHDs-car 0.05M chưa nung 59

3.1.2 Khảo sát tính chất của enzyme lipase Porcine pancreas 59

3.1.3 Khảo sát tính chất ban đầu của dầu dừa 62

3.2 Khảo sát quá trình thủy phân dầu dừa của enzyme LPP tự do 63

3.3.2 Xác định pH cho quá trình cố định enzyme 73

3.3.3 Xác định nhiệt độ cho quá trình cố định enzyme 77

3.3.4 Xác định thời gian cố định 79

iv

3.4 Mức độ thủy phân của enzyme LPP tự do, LDHs-car 0.05M chưa nung và

LDHs-car 0.05M nung 82

3.5 Phân tách sản phẩm sau thủy phân 84

3.6 Số lần tái sử dụng của enzyme cố định 90

3.7 Hoạt tính chống oxi hóa 91

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 93

4.1 Kết luận 93

4.1.1 Tính chất của LDHs và enzyme lipase Porcine pancreas 93

4.1.2 Điều kiện thủy phân dầu dừa của hệ enzyme lipase Porcine pancreas 93

4.1.3 Điều kiện cố định enzyme lipase Porcine pancreas lên chất mang LDHs-car 0.05M nung và LDHs-car 0.05M chưa nung 93

4.1.4 Kết quả thử nghiệm thủy phân dầu dừa 94

4.1.5 Kết quả thử nghiệm khả năng chống oxi hóa 94

4.2 Kiến nghị 94

TÀI LIỆU THAM KHẢO 96

PHỤ LỤC

v

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH tới hoạt độ của enzyme lipase 6

Bảng 1.2: Ảnh hưởng của ion kim loại tới hoạt độ của enzyme lipase 7

Bảng 1.3: Ưu và nhược điểm của các phương pháp cố định 19

Bảng 1.4: Các kỹ thuật cố định lipase từ Porcine pancreas và các ứng dụng tiềm năng 21

Bảng 1.5: Các kỹ thuật cố định lipase từ Porcine pancreas và các ứng dụng tiềm năng (tt) 22

Bảng 1.6: Thành phần chất béo của dầu dừa 31

Bảng 1.7: Tính chất hóa lý của dầu dừa 32

Bảng 2.1: Chỉ tiêu chất lượng dầu dừa do nhà sản xuất cung cấp 43

Bảng 3.1: pHpzc của 2 vật liệu LDHs 59

Bảng 3.2: Kết quả đo độ hấp thu của LPP tại 620nm 61

Bảng 3.3: Kết quả thí nghiệm khảo sát tính chất dầu dừa 62

Bảng 3.4: Sản phẩm sau khi thủy phân dầu dừa bằng enzyme lipase Porcine pancreas 85

Bảng 3.5: Sản phẩm sau khi thủy phân dầu dừa bằng enzyme LDHs-car 0.05M nung 5000C 86

Bảng 3.6: Sản phẩm sau khi thủy phân dầu dừa bằng enzyme lipase LDHs-car 0.05M chưa nung 87

Bảng 3.7: Thành phần acid béo có trong phân đoạn phân cực 88

Bảng 3.8: Thành phần acid béo có trong phân đoạn không phân cực 89

vi

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cấu trúc lipase và mô hình trung tâm xúc tác của chúng 4

Hình 1.2: Mô hình đóng và mở của nắp trong lipase 4

Hình 1.3: Sơ đồ về cơ chế thủy phân của lipase trên triglyceride 9

Hình 1.4 Các kỹ thuật cố định enzyme lên chất mang 18

Hình 1.5: Cấu trúc hydrotalcite và một đơn vị bát diện của nó 27

Hình 1.6: Sơ đồ tái cấu trúc hydrotalcite 28

Hình 1.7: Trái dừa và dầu dừa 30

Hình 3.1: Kết quả chạy điện di trên SDS-PAGE 60

Hình 3.2: Ảnh hưởng của tỉ lệ dầu/đệm đến tốc độ thủy phân của enzyme lipase tự do 63

Hình 3.3: Ảnh hưởng của tỉ lệ enzyme/cơ chất đến tốc độ thủy phân của enzyme lipase tự do 65

Hình 3.4: Ảnh hưởng của pH đến tốc độ thủy phân của enzyme lipase tự do 67

Hình 3.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ thủy phân của enzyme lipase tự do 68 Hình 3.6: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỉ lệ enzyme/LDHs-car 0.05M chưa nung (w/w) đến hiệu suất cố định theo protein và hiệu suất cố định theo hoạt độ của enzyme lipase cố định 70

Hình 3.7: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỉ lệ enzyme/LDHs-car 0.05M nung (w/w) đến hiệu suất cố định theo protein và hiệu suất cố định theo hoạt độ của enzyme lipase cố định 72

Hình 3.8: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH đến hiệu suất cố định theo protein và hiệu suất cố định theo hoạt độ của enzyme LDHs-car 0.05M chưa nung 74

Hình 3.9: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH đến hiệu suất cố định theo protein và hiệu suất cố định theo hoạt độ của enzyme LDHs-car 0.05M nung 75

Hình 3.10: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ hiệu suất cố định theo protein và hiệu suất cố định theo hoạt độ của enzyme LDHs-car 0.05M chưa nung 77

Hình 3.11: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất cố định theo protein và hiệu suất cố định theo hoạt độ của enzyme LDHs-car 0.05M nung 78

vii

Hình 3.12: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của thời gian cố định đến hiệu suất cố định theo protein và hiệu suất cố định theo hoạt độ của enzyme LDHs-car 0.05M chưa nung 79 Hình 3.13: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của thời gian cố định đến hiệu suất cố định theo protein và hiệu suất cố định theo hoạt độ của enzyme LDHs-car 0.05M đã nung 81 Hình 3.14: Mức độ thủy phân của enzyme lipase tự do, enzyme LDHs-car 0.05M nung và enzyme LDHs-car 0.05M chưa nung trên cơ chất dầu dừa 82 Hình 3.15: Số lần tái sử dụng của enzyme LDHs-car 0.05M nung 90 Hình 3.16: Hoạt tính chống oxi hóa của sản phẩm sau khi thủy phân dầu dừa……92

viii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

BSA: Bovine serum albumin

LPP: lipase Porcine pancreas

LDHs: Layered Double Hydroxides (Hydrotalcite) LDHs-car: hydrotalcite (Mg/Al: 2/1) với lớp anion xen cài là -CO32- pHpzc: pH đẳng điện

PZC: điểm đẳng điện TEM: Transmission Electron Microscope

Lipase (triacylglycerol acylhydrolases, EC 3.1.1.3) là xúc tác thủy phân và tổng hợp các ester được hình thành từ triglycerol và các acid béo Đặc tính kỹ thuật của lipase là hoạt động tại liên pha dầu–nước Lipase được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như: thực phẩm (thủy phân chất béo, tăng hương vị cho thực phẩm, ); dược phẩm, khoa học y sinh và công nghiệp hóa chất Lipase được thu nhận từ nhiều

nguồn: động vật, thực vật, vi sinh vật, trong đó, enzyme lipase Porcine pancreas là

enzyme lipase được thu nhận từ tuyến tụy của lợn Theo một số nghiên cứu, enzyme này có tính ổn định cao Bất lợi chính cho việc sử dụng lipase trong sản xuất công nghiệp là giá của enzyme quá cao, enzyme hòa tan lẫn trong sản phẩm, gây khó khăn trong việc tinh sạch, do đó không mang lại hiệu quả về mặt kinh tế

Để khắc phục các nhược điểm trên, kỹ thuật cố định lipase lên chất mang là một phương pháp rất cần thiết và có nhiều ưu điểm như sau:

Các chất mang thường dùng để cố định lipase là các polyme như: agaroza, chitin, collagen, keratin, polyurethan, các dẫn xuất N-vinylpyrolidin, celite, kaolin, oxit kim loại, silica gel, chitosan, các hydrotalcide, Trong số các vật liệu dùng để cố định trên, thì hydrotalcite là chất mang có các tính chất rất phù hợp để làm chất mang cho các enzyme có pH tối thích trong khoảng bazơ như lipase

Có 4 phương pháp cố định enzyme lên chất mang: hấp phụ, cố định enzyme bằng liên kết cộng hóa trị, phương pháp nhốt (bẫy), phương pháp cố định bằng liên kết chéo Mỗi phương pháp đều có ưu và nhược điểm riêng

Trong luận văn này, chúng tôi sử dụng enzyme lipase Porcine pancreas cố định

lên các vật liệu hydrotalcite khác nhau bằng phương pháp hấp phụ trao đổi ion để đưa ra những qui luật chung đối với chất mang này và đánh giá khả năng tái sử dụng của hệ enzyme cố định này, sau đó ứng dụng chúng để thủy phân dầu dừa và so sánh mức độ thủy phân của hệ enzyme cố định với enzyme tự do để ứng dụng chúng trong công nghiệp

1.1.2 Cấu trúc của enzyme lipase Porcine pancreas (LPP):

Enzyme lipase Porcine pancreas là một protein hình cầu bao gồm một chuỗi

đơn của 449 amino acid Cấu trúc không gian của chúng gồm hai vùng xác định Vùng N – terminal là một mắt lưới của xoắn α và các sợi song song β, là đoạn amino acid 1 – 336 Bộ ba xúc tác Ser, Asp và His lần lượt ở tại vị trí amino acid 153, 177 và 264 Vùng C – terminal hầu hết là các gấp β, chứa amino acid 337 – 349, vùng này tương tác với colipase Colipase là một protein cofactor nhỏ, với khối lượng phân tử khoảng 10 kDa

Cấu trúc tinh thể của enzyme LPP có một vài chỗ võng bao phủ bộ ba xúc tác

Vị trí của các võng cản trở sự tiếp xúc của cơ chất với bộ ba xúc tác Vùng võng rộng nhất trong số các vùng võng được hình thành là do cầu nối disulfide giữa Cys238 và Cys262 Một võng khác được hình thành bởi phần 76 – 85 (gọi là “nắp”), thuộc vùng N – terminal, bao phủ trung tâm hoạt động ngăn không cho cơ chất đi vào tâm hoạt động Nắp được mở ổn định bởi các liên kết hydro giữa nắp và colipase Khi nắp này mở, cho phép cơ chất đi vào tiếp xúc với tâm hoạt động [1],[10],[35]

4

Hình 1.1 Cấu trúc lipase và mô hình trung tâm xúc tác của chúng[10]

Hình 1.2 Mô hình đóng và mở của nắp trong lipase[10]

1.1.3 Tính chất của LPP:

– Phân tử lượng của LPP:

Enzyme lipase Porcine pancreas có khối lượng phân tử khoảng 50 – 52 kDa

[6],[10]

– pH đẳng điện của enzyme LPP (pI):

5 pI của enzyme là pH mà tại đó phân tử enzyme trung hòa về điện, do enzyme không mang điện nên không thể liên kết được với các micelle (nước) làm cho enzyme bị kết tủa Tại pIcủa enzyme thì kết tủa đạt cực đại Cũng như các enzyme

khác, enzyme lipase Porcine pancreas cũng có một giá trị pH đẳng điện nhất định

pI của enzyme là một thông số có ảnh hưởng đáng kể đến hiệu suất cố định của enzyme lên chất mang LDHs [6],[10]

– Hoạt độ của enzyme LPP:

Có rất nhiều định nghĩa về hoạt độ của enzyme, nhưng thông thường hoạt độ của enzyme được định nghĩa như sau: một đơn vị hoạt độ của enzyme là lượng enzyme chuyển hóa một micromol cơ chất hoặc một micromol sản phẩm tạo thành sau một khoảng thời gian phản ứng tại một nhiệt độ và pH xác định Kí hiệu: U [6],[10]

– Ảnh hưởng của pH lên tính chất của LPP:

pH của môi trường có ảnh hưởng lớn đến phản ứng enzyme, vì nó ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, enzyme và ảnh hưởng đến độ bền protein của enzyme Enzyme LPP thể hiện hoạt độ cao nhất tại môi trường pH kiềm, trong giới hạn 7.3 – 9.0 Với cơ chất là dầu oliu, pH tối ưu cho hoạt động của LPP nằm trong giới hạn là 7.5 – 9.0; với ethyl acetate, pH tối ưu là 7.5

pH tối ưu của lipase tái tổ hợp LipA chủng Ralstonia sp M1 là 10,75 và enzyme có độ bền ở dải pH kiềm từ 8,0 đến 10,5 Lipase tự nhiên chủng Ralstonia sp M1 cũng có pH tối ưu tương tự, là pH10 và bền ở dải pH rộng hơn từ 7.5 đến 11

Lipase từ Acinetobacter sp RAG-1 bền ở dải pH từ 5,8 đến 9,0 với hoạt độ tối đa ở pH 9.0 Lipase từ Acinetobacter sp SY-01 có hoạt độ tối đa ở pH 10 và bền ở dải pH từ 9 đến 11 Lipase từ B.thermocatenulatus BTL2 cho thấy hoạt độ tối đa ở

pH trong khoảng 7.5 – 9.0 và độ bền ở dải pH từ 7 đến 11 Độ bền pH và pH tối ưu là một trong những cơ sở khi chọn lipase để xúc tác phản ứng mong muốn Ví dụ như lipase có độ bền ở dải pH kiềm chính là một trong những điều kiện khi chọn loại lipase này làm phụ gia trong bột giặt [6],[10]

6 – Ảnh hưởng của nhiệt độ lên tính chất của LPP:

Vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác chỉ tăng theo nhiệt độ trong một giới hạn xác định mà ở đó phân tử enzyme vẫn còn bền, chưa bị biến tính Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của LPP là 35 – 400C Với cơ chất là triacylglycerol, LPP thể hiện hoạt độ cao nhất khi nhiệt độ nằm trong khoảng 35 – 400C, pH dao động từ 6.7 – 7.5; với triacetin thì nhiệt độ tại 350

C, pH 7.0 [6],[10] Bảng 1.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến hoạt độ của lipase từ các nguồn khác nhau [18]

Ảnh hưởng của pH, nhiệt độ Nguồn gốc pH tối ưu Nhiệt độ tối ưu (0C)

7 Bảng 1.2 Ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt độ của lipase từ các nguồn khác nhau [18]

Ảnh hưởng của các ion kim loại Nguồn gốc Chất hoạt hóa Chất ức chế

Bacillus sp FH5

Fe2+,Mn2+, Ca2+, Hg2+ , Mg2+, Ba2+ Cu2+, Co2+, Na+,Zn2+

1.1.4 Cơ chế hoạt động của enzyme LPP:

Khi một phân tử triacylglycerol đến trung tâm hoạt động (vùng kỵ nước), nó đi vào tiếp xúc với bộ ba xúc tác Ser152, His263 và Asp176 Lúc này, bộ ba xúc tác sẽ thực hiện phản ứng thủy phân Bộ ba được định hướng khi một trong số các nguyên tử oxy ở phần cuối của Asp176 liên kết với một nguyên tử nitơ trong vòng Histidin bằng liên kết hydro, giúp cho His263 được định vị để nguyên tử nitơ khác của nó tạo liên kết hydro với nhóm hydroxyl của Ser152 Liên kết hydro thứ hai này kéo hydro ra xa từ liên kết cộng hóa trị với oxy của nó một cách tương đối, với định vị này thì enzyme sẵn sàng để hoạt động

8 Bước đầu tiên của phản ứng xảy ra dựa trên phản ứng thế ái nhân của serin và của cacbon glycerol thứ nhất của chuỗi ở bên cạnh Ser152 Tác nhân ái nhân là nhóm OH- của serin mang điện tích âm tấn công vào trung tâm tích điện dương của cacbon glycerol thứ nhất, làm cho liên kết giữa Cacbon glycerol thứ nhất và Oxy của este yếu đi Oxy trong liên kết este trở thành nhóm linh động (leaving group) và nó được thêm một proton H+ vào từ nhóm OH- của Ser152 để trung hòa điện tích âm của nó Khi oxy nhận được H+, sản phẩm acid béo từ vị trí đầu tiên được hình thành và hoàn toàn tự do Lúc này, phần đang chứa glycerol vẫn giữ liên kết với oxy của Ser152, tuy nhiên liên kết này phải bị phá vỡ để enzyme duy trì chức năng của nó

Bước thứ hai của cơ chế thủy phân liên quan đến sự hình thành và di chuyển của diglyceride từ nửa đang chứa glycerol Để giải phóng ra phân tử glycerol, cần một nhóm hydroxyl để liên kết với cacbon đầu tiên của glycerol và một ion H+

để thêm một proton trở lại vào oxy của Ser152 Một phân tử nước ở môi trường ngoài cung cấp các thành phần cần thiết này Thông qua tương tác hydro, phân tử nước bị phân ly thành H+ vàOH- Do sự hình thành cầu nối hydro giữa H+ với OH- của hai phân tử nước khác nhau, ion hydronium (H3O+) được hình thành Ion hydronium có một momen lưỡng cực rất lớn và hoạt động như một tác nhân ái nhân lên cacbon glycerol đầu tiên Thời điểm này, oxy của Ser152 rời khỏi nhóm Chuỗi bên cạnh tích điện âm của Ser152 nhanh chóng thêm một proton vào bởi ion H+ từ nước Lúc này, sản phẩm diglyceride được hình thành Liên kết hydro giữa nitơ thơm của His263 và nhóm hydroxyl trên Ser152 được phục hồi trở lại và trở về cấu trúc ban đầu của nó, sẵn sàng cho phản ứng khác (xem hình 1.3)

Phản ứng thủy phân tiếp theo xảy ra để xúc tác diglyceride vừa mới hình thành thành một acid béo và một monoglyceride Cơ chế trong trường hợp này giống hai bước như với thủy phân triglyceride, ngoại trừ các tấn công ái nhân lên cacbon thứ ba của glycerol Cơ chế này cho ra một monoglyceride và acid béo mới từ trung tâm hoạt động, và enzyme chuẩn bị tiến đến triglyceride khác [5],[35]

9

Hình1.3 Sơ đồ về cơ chế thủy phân của lipase trên triglyceride [35]

10

1.1.5 Ứng dụng của enzyme lipase:

Lipase có nhiều ứng dụng trong công nghiệp như: chất tẩy rửa, trong thực phẩm, dược phẩm, da, dệt may, mỹ phẩm và các ngành công nghiệp giấy

1.1.5.1 Trong công nghiệp sản xuất các chất tẩy rửa: Hiện nay thị trường lớn nhất cho các loại lipase là việc sử dụng nó như những chất cấu thành trong các loại bột giặt ở công nghệ giặt khô Ngày nay lipase được dùng trong bột giặt để thuỷ phân các vết dầu mỡ mà con người tiết ra quần áo, chăn đệm trong điều kiện nhiệt độ thấp và pH cao với những chất hoá học có hoạt tính bề mặt [Gormen & Malmos, 1991] Một số lipase ở dạng thương phẩm đã được sử dụng trong ngành thuốc tẩy là: Lipase humicola của Novo Nordisk, lipolase hoặc lipase P.glumace của Unilever [Estell và cộng sự, 1985] được sử dụng trong ngành công nghiệp tẩy rửa Nhưng những lipase dùng làm bột giặt cho những hộ gia đình giữ ổn định với các protease và hoạt động có hiệu quả trong điều kiện kiềm [5], [58]

1.1.5.2 Trong công nghiệp thực phẩm: Lipase được sử dụng để thủy phân chất béo trong bơ, sữa, phomai nhằm làm tăng các chất tạo hương của các sản phẩm này

Ví dụ: Lipozyme (Novo) được dùng để sản xuất bơ Cocoa tương đương từ dầu cọ và các axit stearic để sử dụng trong công nghiệp chế biến đồ hộp [Bjorkling, 1991]

Đối với thực phẩm được chế biến từ sữa, lipase được sử dụng rộng rãi để làm tăng mùi vị, làm tăng độ chín của phomat, hoặc chế biến những sản phẩm như phomat và phân giải lipid [Bech, 1992] Những axit béo tự do mạch ngắn (chủ yếu là C4, C6) được thuỷ phân ra do tăng lipase vào sữa béo dẫn đến sự tăng hương vị đặc trưng cho sữa Trong khi đó nếu các axit béo mạch trung bình (C12, C14) được tạo ra sẽ có xu hướng tạo ra mùi vị tựa như xà phòng cho sản phẩm Thêm vào đó những axit béo tự do này có thể tham gia vào các phản ứng hoá học đơn giản với vi sinh vật dẫn đến việc tổng hợp những gia vị có mùi thơm khác nhau Những nguồn

11 lipase dùng cho việc tăng hương vị ở phomat trên mô của những loài động vật nhai lại (dê non, cừu, bê) Một số chế phẩm lipase được sử dụng làm tăng mùi vị và làm

chín phomat được thu từ một số chủng như: M.miehei, A.niger hay A oryzae

Lipase được sử dụng để làm tăng những chất béo nhờ việc chuyển este hoá tới một triglycerit có giá trị cao, bơ cocoa, có một hỗn hợp 1,3-2-oleoyl-glycerol chưa no (palmitic, streraic và axit oleic) có thể được chiết xuất từ loại dầu rẻ tiền chiết xuất tổng hợp ở thân cây cọ (1,3-dipalmitoy 1-2-oleoyl-glycerol) với axit tritearrin hay axit stearic lần lượt là 1, 3 số lipase đặc trưng [Mastuao và cộng sự, 1981], trong khi phương pháp chuyển đổi este hoá hoá học dưới những điều kiện kiềm có thể dẫn đến sự tạo thành sản phẩm mang tính ngẫu nhiên và tạo thành sản phẩm phụ không mong muốn Bằng việc sử dụng phương pháp chuẩn bị giống khác nhau (axit palmitic hầu như không có trong hai vị trí với 1, 3- dioleoyl- 2palmitoyl-glycerol) có thể được thay thế bằng những chất thay thế sữa béo được chiết xuất phần nhiều từ cây cọ, dầu palmitoyl glycerides với những axit béo không no [King & Padly, 1990] Triglycerides cùng với axit octanoic và axit decanoic ở vị trí 1,3- và một axit béo cần thiết ở vị trí 2- có thể được sản xuất theo cách này dành cho những bệnh nhân không đủ dịch tuỵ hoặc kém hấp thụ

Lipase còn được sử dụng để cải thiện hương thơm và chất lượng của đồ uống , bánh và các sản phẩm từ thịt, cá

Ngoài ra, lipase còn được sử dụng trong các loại gia vị thực phẩm nhằm cải thiện chất lượng của chúng như: mayonnaise, sốt

Đặt biệt, ngày nay các nhà nghiên cứu đang quan tâm đến việc tạo ra các sản phẩm thực phẩm chức năng như: ω-3, ω-6, ω-9, bằng việc sử dụng enzyme lipase thủy phân các chất béo như: dầu gan cá, mỡ cá và các acid béo từ dầu thực vật: dầu dừa, dầu oliu, [32],[36],[49]

Derya Kahveci và cộng sự (2010) khi nghiên cứu thủy phân dầu cá hồi thu nhận acid béo chứa - 3 (PUFA) bởi các loại enzyme lipase khác nhau cũng ghi nhận

12 mức độ thủy phân của LCR tăng nhanh từ lúc bắt đầu thủy phân và đạt đến 80% sau 8 giờ, sau 12 giờ thì mức độ thủy phân hầu như không tăng [40]

Kriti Bhandari và cộng sự (2013) nghiên cứu thủy phân dầu cá ngừ thu nhận acid béo chứa DHA bằng LCR đã tiến hành thí nghiệm tại pH=7.0, nhiệt độ 35oC thu được kết quả tối ưu cho tỉ lệ dầu/nước là 1:10 (w/v) và tỉ lệ dầu/dung môi là 1:1(w/v) cho mức độ thủy phân sau 24h là 86.5%.[52]

Tomoko Okada và cộng sự (2007) đã nghiên cứu sử dụng lipase xúc tác thủy phân dầu chiết xuất từ cá mòi Thái Bình Dương để sản xuất acid béo - 3 Lipase

vi sinh vật thương mại có sẵn là Candida rugosa, Candida cylindracea, Mucor javanicus, và Aspergillus niger đã được sử dụng cho thủy phân dầu cá mòi ở 37°C khuấy từ liên tục trong 1.5, 3, 6 và 9 giờ Dầu cá mòi được thủy phân nhanh chóng trong 1.5 giờ đầu tiên Sau đó, quá trình thủy phân chỉ tăng ít trong suốt khoảng thời

gian 3, 6 và 9 giờ Với Candida rugosa 250 U, hàm lượng EPA tăng lên đáng kể từ

26.87% đến 33.74 % sau 1.5 h và duy trì ở mức tương đối ổn định sau 3, 6 và 9 giờ

( 33.45 % , 34.45 % và 33.17 %) Candida rugosa 500U cho kết quả tương tự Lượng DHA cũng tăng đáng kể sau 1.5 h từ 13.63 % đến 23.12% với Candida rugosa 250 U và 23.78 % với Candida rugosa 500 U Nồng độ DHA không có sự

khác biệt đáng kể sau 1.5 h và thời gian phản ứng lâu hơn [55] Yuji Shimada và cộng sự (1998) nghiên cứu về sản xuất γ -linolenic acid

(GLA) bằng cách thủy phân dầu cây lưu ly bởi LCR trên 2 yếu tố ảnh hưởng là

thời gian và nồng độ enzyme/cơ chất Nghiên cứu này được thực hiện ở 35oC với thời gian là 15h cho kết quả như sau: với nồng độ enzyme là 100 U/g mẫu thì cho mức độ thủy phân là cao nhất tới 80% với thời gian là 15h và sau 8h phản ứng thì mức độ thủy phân tăng không đáng kể , trong khi đó hàm lượng GLA sinh ra là 45% với nồng độ enzyme là 20 U/g mẫu trong 4h và không tăng thêm khi tăng nồng độ enzyme và thời gian phản ứng [46]

1.1.5.3 Trong dược phẩm: Trong những năm gần đây enzyme ngày càng được sử dụng nhiều và rộng rãi trong y học, để sản xuất một số thuốc và dùng trực tiếp để chữa bệnh như:

13 Metoprolol,1-(isopropylamino)-3-[4-(2-methoxyethyl) phenoxy] propan-2-ol được sử dụng để điều trị cao huyết áp và đau thắt ngực (đau ngực), loạn nhịp tim, đau nửa đầu và các rối loạn khác liên quan đến thần kinh giao cảm [10]

Lipase được ứng dụng rộng rãi trong quá trình sản xuất các loại hóa chất bảo vệ thực vật (thuốc trừ sâu, trừ cỏ) như: Sorbitol và đường monoester của acid lauric và stearic có tính chất kháng u và ức chế sự tăng trưởng của thực vật [42]

1.1.5.4 Trong công nghiệp mỹ phẩm: Lipase được sử dụng để tạo ra các loại hương liệu tổng hợp hoặc tự nhiên từ thực vật để làm nước hoa thông qua phản ứng este hóa Các mono-, di-, triglycerid của acid octanoic và decanoic có thể hoạt động như thuốc nhuộm và nước hoa trong mỹ phẩm [42]

1.1.5.5 Trong sản xuất giấy, thuộc da và nhiên liệu: Quá trình thuộc da đòi hỏi phải loại bỏ chất béo và thường sử dụng môi trường kiềm trong phản ứng Vì vậy việc ứng dụng lipase kiềm chịu nhiệt trong quá trình thuộc da đem lại hiệu quả kinh tế lớn

Trong công nghiệp giấy, sáp và các triglyceride gây trở ngại cho quá trình sản xuất Do vậy, việc loại bỏ các chất này là rất cần thiết Hiện nay, lipase được coi như một tác nhân sinh thái để loại bỏ các tạp chất trên

Hiện nay, lipase thu hút các nhà nghiên cứu trong việc ứng dụng tạo ra dầu diesel sinh học sử dụng cho động cơ đốt trong [10],[46]

1.2 Kỹ thuật cố định enzyme:

1.2.1 Định nghĩa về enzyme cố định:

Enzyme cố định (enzyme không tan) là những enzyme bị giữ hoặc được cố định trong một vùng, một khoang nhất định, không bị hòa tan trong các điều kiện bình thường, vẫn giữ được khả năng xúc tác, có thể sử dụng lặp lại nhiều lần[4]

14

1.2.2 Tính chất của enzyme lipase cố định:

Theo các tác giả : Bagi K., (1997), Bailey và cộng sự (1986), Barbara A.K và cộng sự (1994), cho rằng enzyme lipase cố định có một số tính chất đặc trưng sau:

1.2.2.1 Hoạt độ của enzyme lipase cố định:

Theo kết quả nghiên cứu của các tác giả về enzyme cố định, nhìn chung enzyme cố định đa số đều có hoạt độ thấp hơn so với enzyme tự do, như:

Zorica Knezevic và cộng sự (2002) đã cố định lipase từ Candida rugosa trong

các hạt alginate cho phản ứng thủy phân dầu cọ Hiệu quả cố định là 98.2 – 99.2% Dưới các điều kiện cố định tối ưu (hiệu điện thế 4.9 kV, dung dịch sodium alginate 21,2% tạo được các hạt alginate – enzyme có đường kính 0.65 mm, hoạt độ tương đối của enzyme cố định đạt được 75% so với so với lipase tự do Tốc độ phản ứng của lipase cố định thấp hơn so với lipase tự do nhưng sự chuyển hóa cuối cùng xấp xỉ bằng nhau (khoảng 74%) [60]

Li Yanjing và cộng sự (2009) đã cố định enzyme lipase Porcine pancreas lên

vật liệu xốp SBA – 15 dạng sợi để thủy phân triacetin Kết quả cho thấy hoạt độ của lipase cố định giảm nhiều, chỉ đạt được 40% so với hoạt độ của lipase tự do [32]

Nguyên nhân làm cho hoạt độ của enzyme cố định giảm là do: Khi enzyme gắn lên chất mang, cấu trúc của enzyme bị thay đổi, trung tâm hoạt động của enzyme có thể bị che khuất, làm cho khả năng tiếp xúc của enzyme và cơ chất giảm

Do enzyme bị che chắn bởi chất mang, làm cho khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất giảm, dẫn đến hoạt độ của enzyme cố định giảm

Trong phương pháp cố định bằng liên kết cộng hóa trị, thường có chất lạ sinh ra do một số chất kết hợp với nhau, làm enzyme bị biến tính một phần, dẫn đến hoạt độ enzyme cố định giảm

15 Do sự keo tụ của protein, làm cho cấu trúc của enzyme bị thay đổi, enzyme giảm hoạt độ

Bên cạnh đó, cũng có một số ít nghiên cứu cho thấy enzyme cố định có hoạt độ cao hơn so với enzyme tự do, như:

Lee Dong-Geun và cộng sự (2008) cố định lipase Porcine pancreas lên các hạt

nano từ tính kỵ nước để thủy phân dầu oliu Hoạt độ riêng của enzyme cố định đạt 9.87 U/mg protein ở tại nồng độ enzyme lipase ban đầu là 0.8 mg/ml, trong khi đó hoạt độ riêng của lipase tự do chỉ đạt 6.37 U/mg protein [28] Như vậy, hoạt độ của enzyme lipase cố định cao hơn so với hoạt độ của enzyme tự do

Othman S.S và cộng sự (2001) cố định lipase từ Candida rugosa lên LDHs của

Mg – Al – CO3 đã nung ở 2000C và Mg – Al – CO3 chưa nung Hoạt độ riêng của lipase cố định trên Mg – Al – CO3 đã nung, Mg – Al – CO3 chưa nung và lipase tự do lần lượt là: 14, 12, 3 mol/phút/mg protein [45] Rõ ràng, hoạt độ của lipase trong trường hợp cố định cao hơn nhiều so với lipase tự do

Hoạt độ của enzyme cố định trong trường hợp này tăng có thể là do chất mang có những tính chất phù hợp với đặc tính của enzyme, làm tăng hoạt độ của enzyme cố định

1.2.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH:

Enzyme rất nhạy cảm với pH và nhiệt độ của môi trường Phần lớn các nghiên cứu cho thấy enzyme cố định có tính ổn định với nhiệt độ và pH cao hơn so với enzyme tự do

Li Yanjing và cộng sự (2009) cố định enzyme lipase Porcine pancreas lên vật

liệu xốp SBA – 15 dạng sợi để thủy phân triacetin Nhiệt độ tối ưu của enzyme tự do ở 350C, còn với lipase cố định, nhiệt độ tối ưu cao hơn (450C) Tại 500C, hoạt độ tương đối của lipase tự do chỉ đạt 50%, trong khi đó, hoạt độ tương đối của lipase

16 cố định là 80% Điều đó chứng tỏ enzyme lipase cố định có khả năng chịu nhiệt tốt hơn so với lipase tự do[31]

Lei Lin và cộng sự (2010) đã cố định lipase từ Candida rugosa lên các hạt nano

từ tính Fe3O4/SiOx có phủ polyme của glycidyl methacrylate lên bề mặt, thủy phân trên dầu oliu Kết quả cho thấy, cả enzyme tự do và cố định đều có giá trị pH và nhiệt độ tối ưu giống nhau, lần lượt là 7.0 và 370C, nhưng tại pH kiềm thì enzyme cố định có hoạt độ tương đối cao hơn so với enzyme tự do (khoảng 10%) Trong khoảng nhiệt độ từ 70 – 800C, hoạt độ tương đối của lipase cố định đạt khoảng 50%, trong khi đó, hoạt độ tương đối của lipase tự do chỉ còn khoảng 10 – 25% [29]

Mustafa Y và cộng sự (2010) đã cố định enzyme lipase từ Candida rugosa lên

sợi polyeste có hoạt hóa bởi glutaraldehyde, ứng dụng thủy phân một số dầu thực vật Kết quả cho thấy, khi thủy phân dầu oliu, pH tối ưu của enzyme tự do là 6.0, trong khi đó đối với lipase cố định pH tối ưu đạt được tại pH 7.0 Khi pH tăng từ 8 – 9, hoạt độ tương đối của lipase cố định cao hơn hoạt độ của lipase tự do (khoảng 30%) Nhiệt độ tối ưu của lipase tự do và cố định bằng nhau (800

C), tuy nhiên khi nhiệt độ tăng từ 50 – 550C, hoạt độ tương đối của lipase cố định cao hơn lipase tự do (khoảng 20%) [41]

Điều đó chứng tỏ lipase cố định có khả năng bền với pH và kháng nhiệt tốt hơn so với lipase tự do

1.2.2.3 Động học của enzyme cố định:

Hai thông số quan trọng trong việc xác định động học của enzyme là: hằng số phân ly biểu kiến của phức enzyme – cơ chất (Km) và vận tốc phản ứng (Vm) Km cho biết một cách gần đúng ái lực của enzyme đối với cơ chất: Km càng nhỏ thì ái lực của enzyme đối với cơ chất càng lớn và ngược lại

17 Đa số các nghiên cứu về động học của lipase cố định cho thấy: lipase cố định có hằng số phân ly biểu kiến của phức enzyme – cơ chất lớn hơn so với lipase tự do Kết quả này tuân theo định luật Michaelis–Menten [12],[13],[14]

Mustafa Y và cộng sự (2010) cố định enzyme lipase từ Candida rugosa lên sợi

polyeste có hoạt hóa bởi glutaraldehyde, ứng dụng thủy phân dầu oliu Kết quả như sau: Km của lipase cố định (151.6mg/ml) cao hơn so với lipase tự do (42.2 mg/ml), do đó, vận tốc phản ứng Vm của lipase cố định (10.9 U/mg protein) thấp hơn so với lipase tự do (48.1 U/mg protein)[41]

Chiou Shao-Hua và cộng sự (2003) cố định lipase từ Candida rugosa lên

chitosan Kết quả cho thấy, hệ số Km của lipase cố định là 0.039% cao hơn so với Km của lipase tự do (0.013%) [15]

Giá trị Km tăng có thể là do sự thay đổi cấu trúc enzyme gây ra bởi phương pháp cố định, hoặc do khả năng tiếp cận của cơ chất với trung tâm hoạt động của enzyme cố định và cơ chất giảm do khả năng khuếch tán của enzyme giảm

1.2.2.4 Khả năng tái sử dụng của enzyme cố định:

Khả năng tái sử dụng của enzyme cố định là một thông số rất quan trọng trong nghiên cứu enzyme cố định Nó quyết định khả năng ứng dụng của enzyme cố định trong công nghiệp Kết quả nghiên cứu của các tác giả về số lần tái sử dụng của enzyme cố định cho thấy: enzyme cố định có khả năng tái sử dụng được rất nhiều lần với hoạt độ tương đối ổn định

Kuo Chia-Hung và cộng sự (2011) đã cố định enzyme lipase từ Candida rugosa

lên chitosan có phủ các hạt nano từ tính Fe3O4, kết quả sau 20 lần tái sử dụng, enzyme cố định vẫn giữ được 83% hoạt độ so với enzyme ban đầu [26]

Li Yanjing và cộng sự (2009) cố định enzyme Porcine pancreas lên vật liệu

xốp SBA-15 hình que để thủy phân triacetin Kết quả cho thấy, sau 5 lần tái sử dụng, hoạt độ của enzyme vẫn giữ được 32% so với hoạt độ ban đầu.[32]

18

Lei Lin và cộng sự (2010) đã cố định lipase từ Candida rugosa lên các hạt nano

từ tính Fe3O4/SiOx có phủ polyme của glycidyl methacrylate lên bề mặt, thủy phân trên dầu oliu, sau 6 lần tái sử dụng, enzyme vẫn giữ được 83% hoạt độ so với ban đầu[29]

1.2.3 Các phương pháp cố định enzyme:

Có 4 nhóm phương pháp cố định enzyme lên chất mang: hấp phụ, cố định enzyme bằng liên kết đồng hóa trị, phương pháp nhốt, phương pháp cố định bằng

liên kết chéo

Mỗi phương pháp cố định đều có ưu và nhược điểm riêng [40]

Hình 1.4 Các kỹ thuật cố định enzyme lên chất mang [40]

19 Bảng 1.3 Ưu và nhược điểm của các phương pháp cố định [53]

Phương pháp Ưu điểm Nhược điểm

Hấp phụ

Các điều kiện chuẩn bị mềm, dễ dàng và giá cả thấp, chất mang có thể thu hồi để tái sử dụng

Tương tác giữa enzyme lipase và chất mang yếu, vì vậy enzyme đã cố định nhạy với pH, lực ion và nhiệt độ, Khả năng hấp phụ là nhỏ và protein có thể bị tách ra khỏi chất mang

Liên kết cộng hóa trị

Enzyme đã cố định ổn định hơn vì lực liên kết giữa protein và chất mang mạnh

Các điều kiện chuẩn bị nghiêm ngặt, vì vậy enzyme lipase có thể mất đi hoạt tính của nó trong suốt quá trình cố định Một vài chất phản ứng, kết hợp lại với nhau, gây độc

Liên kết chéo

enzyme và chất mang mạnh, enzyme đã cố định ổn định

Các điều kiện cho liên kết ngang này rất khắc khe và độ bền cơ học của enzyme lipase đã cố định thấp

Phương pháp bẫy (nhốt)

Các điều kiện thực hiện ôn hòa Phương pháp cố định có thể áp dụng phạm vi rộng của chất mang và enzyme

Các enzyme đã cố định luôn có sự chuyển khối bị giới hạn trong suốt quá trình xúc tác, vì vậy enzyme lipase chỉ xúc tác hiệu quả đối với các cơ chất có khối lượng lượng phân tử thấp

1.2.4 Các kỹ thuật cố định lipase Porcine pancreas:

Cho đến nay, các nhà nghiên cứu đã sử dụng những kỹ thuật cố định lipase

Porcine pancreas chính lên chất mang là: hấp phụ vật lý, liên kết cộng hóa trị, hấp

phụ vật lý và liên kết cộng hóa trị, bẫy (bảng 1.3, 1.4) [10]

Bảng 1.4 Các kỹ thuật cố định lipase từ Porcine pancreas và các ứng dụng tiềm năng [10]

Tổng hợp butyl butyrate

Tổng hợp dầu diesel sinh học từ dầu hoa hướng dương và các rượu chuổi ngắn

Chitosan

Zeolit MCM 22 với các tỷ lệ Si/ Al khác nhau

Este hóa acid oleic và ethanol Các hạt nano từ tính

có phủ Alkyl benzenesulfonate

Thủy phân dầu oliu

phân dầu hướng dương Liên kết

cộng hóa trị Hạt poly acryamide (Akrilex C 100)

Ma trận của hỗn hợp silica và polyvinyl acohol

ba-ba-su và các rượu chuổi ngắn

ngón biển và các methanol

22Hỗn hợp poly urethane ưa nước Các nhóm Isocyanate Thủy phân các triacylglycerol

Bảng 1.5 Các kỹ thuật cố định lipase từ Porcine pancreas và các ứng dụng tiềm năng [10]

Liên kết cộng hóa trị

Các hạt vi cầu từ tính được tổng hợp bởi phương pháp trùng hợp glycidyl methacrylate, acid methacrylic và divinylbenzene, có sự hiện diện của acid oleic đã phủ các hạt nano Fe3O4

Các nhóm có vòng oxy

Thủy phân dầu oliu và tổng hợp hexyl acetate

acid octanoic Cyanuric chloride Thủy phân tributyrin

Hấp phụ vật lý và liên kết cộng hóa trị

polyethyleneimine

Glutaraldehyde Thủy phân Enantioselective của glycidyl butyrate

chuyển este hóa dầu hướng dương với ethanol

alcohols