Nghiên cứu cố định enzyme lipase porcine pancreas trên chất mang hydrotalcite mg AlCO3 2

I H C QU C GIA TP.HCM I H C BÁCH KHOA UNG PH NGHIÊN C U C NG TH Y NH ENZYME LIPASE PORCINE PANCREAS TRÊN CH T MANG HYDROTALCITE Mg/Al CO3 2- Chuyên ngành: : 605402 LU TP H CHÍ MINH, tháng 12 C HỒN THÀNH I H C BÁCH KHOA T I Cán b ng d n khoa h c: TS Phan Ng c Hòa Cán b ch m nh n xét 1: PGS.TS tM n Cán b ch m nh n xét 2: TS Nguy n L Hà Lu Th cb ov t HCM ngày 30 tháng 12 ih Thành ph n H h m: PGS.TS Lê Phi Nga Ch t ch H PGS.TS L ng t M n Ph n bi n TS Nguy n L Hà Ph n bi n TS Phan Ng c Hòa y viên TS Tr n Th Ng c Yên Xác nh n c a Ch t ch H ng Khoa qu n lý chuyên ngành sau lu c s a ch a CH NG KHOA K T CH H NG PGS.TS Lê Phi Nga THU T HÓA H C I H C QU C GIA TP.HCM C NG HÒA XÃ H I CH I H C BÁCH KHOA T NAM c l p - T - H nh phúc NHI M V LU MSHV: 11110219 03/01/1987 TP.HCM : 605402 I TÀI: NGHIÊN C U C NH ENZYME LIPASE PORCINE PANCREAS TRÊN CH T MANG HYDROTALCITE Mg/Al 2:1 CO3 II NHI M V VÀ N I DUNG: Nghiên c u tính ch t c a enzym lipase ch t mang hydrotalcite Mg:Al C nh enzym lipase lên ch t mang hydrotalcite Mg:Al Th y phân d u olive v i h enzym c nh III NGÀY GIAO NHI M V : 21/1/2013 IV NGÀY HOÀN THÀNH NHI M V : 30/12/2013 V CÁN B NG D N: TS PHAN NG C HÒA Tp HCM, ngày 30 tháng 12 CÁN B NG D N CH NHI M B (H tên ch ký) (H tên ch ký) NG KHOA K THU T HÓA H C (H tên ch ký) O L IC L t u tiên, em xin bày t lòng bi ng d c t i TS Phan Ng c Hịa Cơ em có th hồn thành lu Em xin chân thành c p c a ThS Châu Tr n Di m Ái Ch nhi t tình, chia s kinh nghi m su t trình em th c hi n lu xin c ba m ng h tinh th n t ch t có th dành nhi u th i gian cho vi c h c t p th c hi n nghiên c u Em xin chân thành c i H c Bách Khoa Qu c Gia TP.HCM, q th y Khoa K Thu t Hóa H B môn Công Ngh Th c Ph nghi u ki n giúp em hoàn thành t t lu c hoàn thành n u khơng có s b n sinh viên, nh Xin g i l i c c bi t th y cô t cho em nhi u ki n th c h u ích, kinh om Lu iH c chân thành c a c t p em su t nh c bi t n ThS Nguy n Qu viên su t th i gian làm lu Trâm c ng h Và cu i xin g i l i c ng n b n bên c nh su t th i gian Tp H Chí Minh, ngày 30 tháng 12 UNG PH NG TH Y 13 TÓM T T LU Trong nghiên c u này, enzyme lipase Porcine Pancreas nh lên ch t mang hydrotalcites Mg/Al-CO32các y u t kh o sát c nung ng lên ho t tính c a h enzyme c ng c a y u t sau: nhi nh enzyme cao nh t 4500C kh o sát nh Quá trình c nh , pH, t l kim lo i c a ch t mang, t l enzyme/ch t mang, v n t c l c, th i gian c hi u su t c c nghiên c u c u ki n nhi nh K t qu cho th y 300C; pH 7.5; t l enzyme : ch t mang 0.015:1 w/w; th i gian c nh gi ; v n t c l c 300v/p Th c hi n th pH 7.5; nhi t c khu y 300 v/p; cao nh t 361 UI/g enzyme u olive t 50 ml, ho t tính c a enzyme c 300C; v n t ABSTRACT This study investigated the immobilised ability of enzyme lipase Porcine Pancreas in hydrotalcites Mg/Al-CO32- carrier (which was burned at 450 0C) and the factors affected ativity of enzymatic system In the immobilisation, there were some factors which had the influence on immobilised performance sush as temparature, pH, Mg/Al ratio, enzyme/carrier ratio, shake velocity, immobilised time The result shows that immobilised performance is the highest correspondence to temparature 300C, pH 7.5, enzyme:carrier = 0.015:1 w/w, immobilised time hours, shake velocity 300 rpm In addition to immobilised performance, the activity of immobilised enzyme attained 361 UI/g enzyme when carrying out the hydrolysis at pH 7.5, temparature 300C, shake velocity 300 rpm, 50 ml substrate (olive oil emulsion) L s li u lu nghi is c ti n hành th c ng d n c a khoa h c c a TS Phan Ng c Hòa Các k t qu trung th c công b b t k nghiên c u Tơi xin hồn tồn ch u trách nhi m v nghiên c u c a H c viên th c hi n UNG PH NG TH Y M CL C DANH M C B NG i DANH M C HÌNH ii L IM U iv NG QUAN 1.1 Porcine pancreas Lipase (PPL) 1.1.1 nh ngh 1.1.2 C ho ng 1.1.3 Tính ch t c a enzyme Porcine pancreas lipase 1.1.4 ng d ng c a enzyme Porcine pancreas lipase 11 1.2 Hydrotalcite (LDHs) 14 1.2.1 nh ngh 14 1.2.2 Tính ch t 15 1.2.3 t o 16 1.2.4 ng d ng 18 1.3 Enzyme c nh 19 nh ngh 19 nh 19 1.3.3 Các k thu t c nh enzyme Porcine pancreas lipase 21 1.3.4 Tính ch t c a enzyme c 1.3.5 Các y u t nh 23 ng t i trình c nh enzyme 24 1.4 Các nghiên c u liên quan 28 30 2.1 Nguyên li u 30 2.1.1 Ch t mang Al/Mg CO32- ã nung 4500C 30 2.1.2 Enzyme Porcine Pancreas lipase 31 2.1.3 D u th c v t 31 2.2 Thi t b hóa ch t 32 2.3 N i dung thí nghi m 33 2.3.1 Kh o sát tính ch t c a nguyên li u 34 2.3.2 Kh o sát kh nh enzyme Porcine Pancreas lipase (PPL) lên ch t mang Al/Mg CO32- 35 2.3.3 Kh o sát ho t tính c a enzyme c 2.3.4 Kh 2.4 Cá 2.4 d ng c a enzyme c nh 38 nh 40 41 lý s li u 42 T QU VÀ BÀN LU N 43 3.1 Tính ch t nguyên li u 43 3.1.1 Enzyme Porcine Pancreas lipase (PPL) 43 3.1.2 Ch t mang hydrotalcite Al/Mg- CO32- ã nung 4500C 46 3.2 C nh h nh enzyme lipase ch t mang hydrotalcite (LDHs) m t s y u t ng n hi u su t c nh 52 3.2.1 ng c a t l Mg/Al 52 3.2.2 ng c a n 3.2.3 ng c a pH 55 3.2.4 ng c a nhi 3.2.5 ng c a th i gian c 3.2.6 ng c a v n t c l c 60 3.3 Kh o sát y u t enzyme 54 57 nh 58 n ho t tính enzyme c nh 62 3.3.1 ng c a pH 62 3.3.2 ng c a nhi 3.3.3 ng c a v n t c khu y 65 3.3.4 ng c a t l 3.4 Kh 64 d ng c a enzyme c t 67 nh 69 K T LU N VÀ KI N NGH 71 TÀI LI U THAM KH O 73 PH L C 76 - 71 - T LU N VÀ KI N NGH 4.1 Tính ch t enzyme ch t mang ng tái c u trúc c a v t li u LDHs Mg/Al – CO3 2- B m t v t li u Có hi g gh , có d ng v i x p ch 2- n c a hydrotalcite Mg/Al CO3 t l c h t c a v t li u ch y u t n 60 µm Di n tích b m t riêng 21.7578 ± 0.0668 m²/g Phân t ng c a enzym kho 219.49 UI/mg protein, ho 4.2 Kh u ki n c n 6.5 Ho t tính riêng i 343 UI/g enzyme nh Porcine pancreas lipase lên ch t mang Mg/Al – CO3 2T l v t li u hydrotalcite Mg/Al – CO3 2- phù h p 2:1, cho hi u su t c cao nh t 79% protein; theo ho u ki n c nh nh cho hi u qu cao 300C , pH 7.5, th i gian 6h, t l enzyme/ch t mang 15 w/w, t c nh t t i nhi l c 300 v/p 4.3 Kh o sát ho t tính enzyme c enzyme c nh y u t nh Ho t tính riêng c a enzyme t ho t d u olive 332 UI/mg protein, i 361 UI/g enzyme T khu y t phân 300 v/p t thích h p 50 ml nh ph n ng pH t ình th y phân nh ng c a h enzyme c Sau 13 l n tái s d ng, ho s d ng ho t tính u tiên n ng th y u olive cho m i l n u olive 7.5 Nhi t i nh 300C i c a enzym l i 13% so v i l n - 72 - 4.4 Ki n ngh C nh Porcine pancreas lipase v t li u LDHs khác nhau, nh m tìm c v t li u c nh có hi u su t c nh ho t tính t t - 73 - TÀI LI U THAM KH O [1] Mendes, A A., P C Oliveira, et al., "Properties and biotechnological applications of porcine pancreatic lipase," Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, vol 78, no 0, pp 119-134, 2012 [2] Hanefelf, U., L Gardossi, et al., "Understanding enzyme immobilisation," Chemical Society Reviews, vol 38, no 2, pp 453-468, 2009 [3] Iso M., B Chen, et al., "Production of biodiesel fuel from triglycerides and alcohol using immobilized lipase," Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, vol 16, no 1, pp 53-58, 2001 [4] Yagiz, F., D Kazan, et al., "Biodiesel production from waste oils by using lipase immobilized on hydrotalcite and zeolites," Chemical Engineering Journal, vol 134, no 1-3, pp 262-267, 2007 [5] Lee, D.-G., K M Ponvel, et al., "Immobilization of lipase on hydrophobic nano-sized magnetite particles," Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, vol 57, no 1-4, pp 62-66, 2009 [6] Panwar, V., U K Shandilya, et al., "Immobilization of porcine pancreas lipase onto bristles of plastic brush: Kinetic properties," Journal of Chemical and Pharmaceutical Research, vol 4, no 1, pp 91-95, 2012 [7] Palomo, J M., C Ortiz, et al., "Lipase–lipase interactions as a new tool to immobilize and modulate the lipase properties," Enzyme and Microbial Technology, vol 4, no 447-454, p 36, 2005 [8] Tan, T., J Lu, et al., "Biodiesel production with immobilized lipase: A review," Biotechnology Advances, vol 28, no 5, pp 628-634, 2010 [9] Hartmann, M and D Jung, "Biocatalysis with enzymes immobilized on mesoporous hosts: the status quo and future trends," Journal of Materials Chemistry, vol 20, no 5, pp 844-857, 2010 [10] Zeng, H.-y., K.-b Liao, et al., "Characterization of the lipase immobilized on - 74 - Mg–Al hydrotalcite for biodiesel," Process Biochemistry, vol 44, no 8, pp 791-798, 2009 [11] Abdul Rahman, M B., U H Zaidan, et al., "Enzymatic synthesis of methyl adipate ester using lipase from Candida rugosa immobilised on Mg, Zn and Ni of layered double hydroxides (LDHs)," Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, vol 50, no 1, pp 33-39, 2008 [12] Xiao, M A N., S Mathew, et al., "Biodiesel fuel production via transesterification of oils using lipase biocatalyst," GCB Bioenergy, vol 1, no 2, pp 115-125, 2009 [13] Li, Y., G Zhou, et al., "Immobilization of Porcine pancreas lipase on fiber-like SBA-15 mesoporous material," Materials Science and Engineering: B, vol 162, no 2, pp 120-126, 2009 [14] A S., "Hydrolysis of Fish Oil by Olive Oil-Induced Vibrio sp Lipase," Memoirs of Faculty of Fisheries Kagoshima University, vol 40, pp 83-92, 1991 [15] Bagi, K., L M Simon, et al., "Immobilization and characterization of porcine pancreas lipase," Enzyme and Microbial Technology, vol 20, no 7, pp 531535, 1997 [16] Yang, B.-l., G.-s Zhao, et al., "Hydrolysis of Olive Oil with Immobilized Lipase in a Tapered Column Reactor," The Chinese Journal of Process Engineering, vol 3, no 3, pp 206-211, 2003 [17] Ren L., J He, et al., "Some factors affecting the immobilization of penicillin G acylase on calcined layered double hydroxides," Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, vol 16, pp 65-71, 2001 [18] N Bejoy, "Hydrotalcite," Resonance, vol 6, no 2, pp 57-61, 2001 [19] O’Neill, A., R Araújo, et al., "Effect of the agitation on the adsorption and hydrolytic efficiency of cutinases on polyethylene terephthalate fibres," Enzyme and Microbial Technology, vol 7, no 1801-1805, p 40, 2007 - 75 - [20] Rahman, M B A., M Basri, et al., "Immobilisation of lipase from Candida rugosa on layered double hydroxides of Mg/Al and its nanocomposite as biocatalyst for the synthesis of ester," Catalysis Today, Vols 93-95, no 0, pp 405-410, 2004 [21] al., " Kinetics of olive oil hydrolysis by Candida cylindracea lipase Progress in Biotechnology," Elsevier, vol 17, pp 209-104, 2000 [22] Voll, F., R L Krüger, et al., "Kinetic modeling of lipase-catalyzed glycerolysis of olive oil," Biochemical Engineering Journal, vol 56, no 3, pp 107-115, 2011 [23] Yang, J., Y Hu, et al., "Enhancing the catalytic properties of porcine pancreatic lipase by immobilization on SBA-15 modified by functionalized ionic liquid," Biochemical Engineering Journal, vol 70, no 0, pp 46-54, 2013 [24] H Zhao, "Methods for stabilizing and activating enzymes in ionic liquids—a review," Journal of Chemical Technology & Biotechnology, vol 85, no 7, pp 891-907, 2010 [25] Vilma, M., W Eleneora, et al., "Lipase immobilized by different techniques on various support materials applied in oil hydrolysis," Journal of the Serbian Chemical Society, vol 70, no 4, pp 609-624, 2005 [26] Scherer, R P., R L Dallago, et al., "Influence of process parameters on the immobilization of commercial porcine pancreatic lipase using three low-cost supports," Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, vol 1, no 4, pp 290294, 2012 [27] Goh, K.-H., T.-T Lim, et al., "Application of layered double hydroxides for removal of oxyanions: A review," Water Research, vol 42, no 6-7, pp 13431368, 2008 [28] Murty, V R., J Bhat, et al., "Hydrolysis of Oils by Using Immobilized Lipase Enzyme: A Review," Biotechnology and Bioprocess Engineering, vol 7, no 2, pp 57-66, 2002 - 76 - PH L C Ph l c 1: Công th c tính tốn Cơng th - nh hi u su t Hi u su t c nh theo kh ng protein = × 100% V i: ng o c gi l i ch t mang = ng protein dung d o = c c nh : × : n protein s d ng c nh, mg/ml th tích dung d ch enzyme s d o th c hi n c ng protein l i dung d ch sau c = nh, ml nh: × : n protein c a dung d ch l th tích dung d ch l - c sau c Hi u su t tính theo ho t tính = × 100 % c sau c nh, ml nh, mg/ml - 77 - : : Ho t tính enzyme l i d ch r a : Ho t tính Cơng th u nh ho t tính - Nguyên t c c D ng acid béo sinh theo th t tính c a enzym xúc tác - c th c hi n: T o nh u: Cân 10g gum arabic 10g d phosphate nh m c lên 200ml b m ng hóa vịng 20 phút Th c hi n ph n ng th y phân: Hút 50 ml nh enzyme xúc tác, sau m i kho ng th i gian nh c c th y tinh 250ml, thêm nh hút 5ml m ng acid béo sinh T i th m xá T0: M u tr e vào Ti : M u t i th m th i k t lúc b u cho enzyme vào xúc tác ph n ng Khu y liên t c su t trình di n ph n ng Chu v k t thúc ph n ng t i th m c n ki m tra, hút 5ml m u cho ã ch a 10 mL ethanol 99.5o, nh gi t thymolphtalein 0.1% làm ch t ch th màu r i chu b ng NaOH n dung d ch chuy n thành màu xanh nh t b n vòng giây d ng l i, ghi nh n k t qu ng acid béo Y sinh = ( ) × 0.05 × 1000 ,( é / ) - 78 - : V0 s ml NaOH chu Vi s ml NaOH chu m u tr ng m u t i th m th i nh giá tr ng bi u di theo th ng acid béo sinh ng th ng ,( = Ho t tính riêng c é / ú ) c tính theo cơng th c sau: ,( = / ) 50 + Ho t tính: × ( + 1000) ,( 0.1 + = Ho i c a enzym c = V ) nh so v i enzym t × 100%,( ) ng protein mg enzym (mg) ng nh b: t ng h n h p ch a a mg protein enzym cho vào ph n ng u (g) - 79 - Ph l c : Xây d ng chu n protein D Máy quang ph , 1ml (có th ình tia Hóa ch C n 900 Dung d ch protein chu n: cân 10mg albumin b ng cân phân tích, pha c c t, l 200C Khi dùng pha loãng 100 l n, u cho tan Gi c dung d ch có n 0.1 mg/ml Dung d ch thu c th Bradford: dung d ch thu c th có thành ph n Ch t màu Coomassie brilliant blue Gtuy i, l c hòa tan 50ml c n c dung d ng nh t Cho vào 100ml dung d ch nh m c 1l b c c t L u, gi nhi 40C Ti n hành: L p m t lo t ng theo s th t 0, 1, 2, 3, 4, v i n albumin chu n ng nghi m ch a m u c n phân tích X Th c hi n m u tr ng v c c t ng h b m giây, canh th i gian phút cho 5ml thu c th vào ng nghi m 0, l nghi m 1, l Tính th i gian yên th m phút cho 5ml thu c th vào ng yên c ti p t c ch c 20 phút, ti c sóng 595 nm Ta có giá tr OD0, c cách m n h t h p thu c a dung d ch th ng (OD1) t ng Ghi l i giá tr OD - 80 - Tính k t qu : V ng n tính gi a n D ình m im quang OD595 ng n tính gi a n quang OD595 i ng protein m u phân tích K t qu d D ng chu n ng chu n protein – d ng albumin huy t bò làm protein chu n, k t qu c th hi n th sau: OD 0.35 0.3 y = 0.0058x - 0.0013 R2 = 0.9995 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 10 20 30 40 50 60 -0.05 th ng chu n bi u th m ng protein dung d ch OD ình bi u di n có d ng = 0.0058 0.0013 v i h s = 0.9995 - 81 - Ph Nguyên t c àd hi ùm tia X m hi àn h ên t tinh th Chi ên m tâm nhi Các tia t ành trung tia ph ình thành lên vân sáng vân t ình Vulf – Bragg: = nb X, nm d kho ph góc gi àm ịn cho phép cịn cho phép xác h ình c Scherrer: = 0.9 - 82 - : góc gi àm Nguyên t c ên c àng hu theo yêu c ình d c ên c C t t ên m ên c vào m phát x ã ên m ên b ày qua m ph bi ành m hi màng hình thu, ph ên màng ình tr ùy thu àt iên c ùm tia m ên c ên c pzc c nh ngh trung hịa khơng mang Dung d có dung d giá tr pH c a dung d ch mà t nh i gian gi nh m t sau: i h t khí ngu i t t Cho dung d ch NaCl 0.1M vào c c - 83 - th y tinh 50 ml, dùng dung d ch HCl 0.05M dung d ch NaOH v giá tr t nh, cân m c c nói trên, l ch nh pH ng xác 0.1g m u cho vào i pH sau 24 gi ph giá tr i ho n c a ch t h p i so v i giá tr u c a dung d ch NaCl Khi giá tr pH th PZC b m t ch t h p ph mang tính acid (mang t h p ph có kh giá tr p ph c l i, PZC b m t ch t h p ph ph có kh th p p ph n di b nh kh ng phân t c a enzyme c dùng ng Nguyên t c c a m v t lý c hình d n tích, c u hình; u, ch m tc ng c/kh ng c n c tính c u trúc c ng, i phân t ng phân t s di chuy n v nh c c c a ADN mà s di chuy n nc nc c nh ch t nhu m (ethidium bromide, b ng nc phát hi n v trí phân t n di T c phân t c kh i ng phân t mong mu n Enzyme n c u t o t m t hay nhi th d i ta có u tài s d ng k thu t SDS-PAGE, t t c protein m u b bi n tính thành d ng th v hình d y, s khác n tích khơng cịn ph thu c nh c Nh v y m i có th d a thang chu n Vì v y, SDStrình tinh s ch V i nh ị s di chuy n n a mà ch nh kh ng phân t t qu c a u tiên, k t qu dãy g m r t nhi u protein - 84 - c tinh s ch, s m V ng protein s gi m s có m t v ch ngày ng v i protein m c tiêu Di t hi ên b r = × , : S : di /g) nm Am : di chi /phân t N :s M hút chân n áp su t 10-9 mmHg nh m lo i b khí có mao qu n c a m u Cho m u h p ph ch t b h p ph ( sau h p ph , t Ti l ng 77 ng h p ph , ta có m c ng h p ph n P/Po = ng ng h p ph , r i ti n hành nh h p ph , v i m i giá tr P/Po ta l i có m ch s ng nh h p ph ng thi t b SALD-2101 Nguyên lý ho ng c a tia laser v i v t ch ng d a c phân tán dung d ch - 85 - bình khu y s i tính ch t nhi u x c c c a v t li u c Ph l c 4: Chu n b dung d õi s thay h t m phosphate Dung d ch mononatri orthophosphate 0.2M (a): 27.8g NaH2PO4 hòa tan m nh n 1000ml Dung d ch dinatri hydrophosphate 02M (b): 53.05g Na2HPO4.7H2O ho c 71.7g Na2HPO4.12H2O hòa tan Dung d s ml dung d nh m n 1000ml m phosphate có pH khác ph thu c vào s ml dung d ch (a) nh m n 200ml ... aureus 22 6 Ca2+ ,Mg2 + Mn2+ Staphylococcus aureus Ca2+,Mn2+ Coban, K Serratia marcescens 345 Mg2 + Fe2+,Ni2+, Cu2+, Hg2+ , Zn2+ Bacillus sp FH5 Fe2+,Mn2+, Ca2+, Hg2+, Mg2 +, Ba2+ Cu2+, Co2+, Na+,Zn2+... Cu2+, Mo2+, Mg2 +, Zn2+ Ca2+ Acinetobacter baumannii BD5 Mn2+, Ca2+, Mg2 + Cu2+, Zn2+ Rhizopus oryzae - Fe2+, Cu2+, Hg2+, Aspergillus terreus Ca2+ ,Mg2 + Fe2+,Ni2+, Cu2+, Co2+ 1.1.4 ng d ng c a enzyme. .. 30 2. 1.1 Ch t mang Al /Mg CO 32- ã nung 4500C 30 2. 1 .2 Enzyme Porcine Pancreas lipase 31 2. 1.3 D u th c v t 31 2. 2 Thi t b hóa ch t 32 2.3 N i dung