Nghiên cứu cố định urease và ứng dụng trong xét nghiệm phân tích urea máu

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA LÊ THỊ MỸ NGỌC NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH UREASE VÀ ỨNG DỤNG TRONG XÉT NGHIỆM PHÂN TÍCH UREA MÁU Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số: 60 42 80 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HỒ CHÍ MINH, THÁNG NĂM 2013 C ng tr nh ƣ c ho n th nh t i: Trƣờn Đ ọ B K o - ĐHQG-TP.HCM Cán hƣớng dẫn khoa học : (Ghi rõ họ, tên, học h m, học vị v chữ ký) Cán chấm nhận xét : (Ghi rõ họ, tên, học h m, học vị v chữ ký) Cán chấm nhận xét : (Ghi rõ họ, tên, học h m, học vị v chữ ký) Luận văn th c sĩ ƣ c b o vệ t i Trƣờng Đ i Học ách Khoa, ĐHQG Tp.HCM ng y 22 tháng năm 2013 Th nh ph n Hội ồng ánh giá Luận văn th c sĩ gồm: (ghi rõ họ, tên, học h m, học vị Hội ồng chấm b o vệ luận văn th c sĩ) Xác nhận Chủ tịch Hội ồng ánh giá LV v Trƣởng khoa qu n lý chuyên ng nh sau luận văn ã ƣ c sửa chữa (nếu c ) CHỦ TỊCH H I ĐỒNG TRƢỞNG KHOA 15 ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM C NG HÒA XÃ H I CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự - H nh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: LÊ THỊ MỸ NGỌC MSHV: 10310944 Ng y, tháng, năm sinh: 31.10.1982 Nơi sinh: Vĩnh Long Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số : 60 42 80 I TÊN ĐỀ TÀI: “NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH UREASE VÀ ỨNG DỤNG TRONG XÉT NGHIỆM PHÂN TÍCH UREA MÁU” NHIỆM VỤ VÀ N I DUNG: - Tách chiết enzyme urease từ ậu nành - Kh o sát iều kiện cố ịnh enzyme urease chất mang có nguồn gốc tự nhiên: alginate, chitosan, celite - Lựa chọn chất mang với iều kiện cố ịnh tối ƣu v kh tái sử dụng nhiều - Ứng dụng xét nghiệm xác ịnh nồng ộ urea huyết bệnh nhân II NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 06/02/2012 III NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 30/11/2012 IV CÁN B HƢỚNG DẪN: TS.HUỲNH NGỌC OANH Tp HCM, ngày tháng năm 20 CÁN B HƢỚNG DẪN CHỦ NHIỆM B (Họ tên chữ ký) MÔN ĐÀO TẠO (Họ tên chữ ký) TRƢỞNG KHOA (Họ tên chữ ký) HVTH: Lê Thị Mỹ Ngọc Luận văn thạc sĩ – 2013 LỜI CẢM ƠN Tơ x n tỏ lịn b ết ơn sâu sắ đến T ến sĩ Huỳn N ọ O n t ể quý T ầy Cô, b n bè làm v ệ ọ tập t Trƣờn Đ ọ B Bộ môn Côn n ọ tập t đìn ỗ trợ mặt t n t ần t trƣờn ệSn k o T àn p ố Hồ C í M n t o đ ều k ện oàn t àn luận văn Đồn t x n lờ ảm ơn quý đồn n ơn t ùn tồn ọ o tơ ệp nơ tơ n để tơ ó đ ều k ện ii TÓM TẮT Urease enzyme ứng dụng nhiều lĩnh vực, đặc biệt y học Enzyme urease dùng kit thử định lượng urea máu nước tiểu để chẩn đoán theo dõi chức thận Tuy nhiên enzyme thường nhập với giá thành cao Trong đó, Việt Nam đa số nghiên cứu chỉtập trung tách chiết enzyme urease từ đậu nành để tăng khả tái sử dụng sản phẩm cịn hạn chế Do chúng tơi tiến hành nghiên cứu điều kiện cố định enzyme urease số chất mang tự nhiên alginate, chitosan, celite Các khảo sát đạt kết tối ưu với tỉ lệ enzyme/chất mang alginate 3% 0,86 mg/ 5ml gel, chitosan 2,46 mg/1g hạt, celite 136,15 mg/1g hạt với tỉ lệ celite so với alginate 6% (w/v) Hoạt tính enzyme urease cố định celite bọc alginate so với dạng tự 79,97% cao nhất, cao chitosan (65%) alginate (55,23%) Tuy nhiên số lần tái sử dụng enzyme cố định hạt chitosan 14 lần với hoạt tính enzyme trì 50% so với ban đầu, cao alginate (9 lần) celite bọc alginate (5 lần) Nhiệt độ pH tối ưu enzyme urease dạng cố định hạt chitosan 700C 7,5, dạng tự 600C 7,0 Các thông số động học Vmax, Km enzyme cố định tự xác định, 0,663 (µmol/mg.phút), 225 mmol (enzyme cố định hạt chitosan) 1,202 (µmol/mg.phút), 92,5 mmol Sản phẩm enzyme urease cố định chitosan ứng dụng phân tích urea huyết bệnh nhân với kết tương đương với kết đo từ máy sinh hóa tự động HVTH: Lê Thị Mỹ Ngọc Luận văn thạc sĩ – 2013 iii ABSTRACT Urease is an enzyme which applied in lots of fields, especially in medicine Urease is used in many reagent kits to determine blood and urine urea concentration for diagnostic and monitoring kidneys function However, this enzyme is usually inported with high cost In Vietnam, most of researches only focus on extracting urease from soya bean, but researches to increase reusable capicity of this product still limited Consequently, we carried out a research about some immobilzing urease conditions onto some natural supports such as : alginate, chitosan, celite The investigations obtained optimum results with enzyme/support rate that were 0,86 mg / 5ml gel alginate 3%; 2,46 mg / 1g of activated-chitosan beads; 136,15 mg /1g of activated-celite beads; and rate of celite with alginate were 6% (w/v) The total activity of alginate coated celite-immobilized ureases comparing with solube ureases was the highest value (79,97%), higher than chitosan (65%) and alginate (55,2%) However, the chitosan-immobilized ureases could reuse for 14 times with their acivity maintained above 50%, higher than alginate (9 times), alginate coated-celite (5 lần) The optimum temperature and pH of chitosanimmobilized ureases were 700C and 7,5; solube ureases were 600C and 7,0 The kinetic parameters (Vmax , km ) of non immobilized and immobilized enzyme were determined, respectively, 0,663 (µmol/mg.min) and 225 mmol (chitosanimmobilized ureases); 1,202 (µmol/mg.min) and 92,5 mmol (solube ureases) Chitosan-immobilized ureases were applied to analyzeserum urea concentration of patients with the similar results measuring from the automaticaly biochemistry machine HVTH: Lê Thị Mỹ Ngọc Luận văn thạc sĩ – 2013 iv LỜI CAM ĐOAN Tô x n m đo n ơn trìn n ơn bố bất ứ nơ C n ệm đƣợ t ự số l ệu t í n ên ứu ủ r ên tơ , ƣ đƣợ ệm trun t ự mỗ t í ện n ất lần Tác gi luận văn Lê T ị Mỹ N ọ HVTH: Lê Thị Mỹ Ngọc Luận văn thạc sĩ – 2013 v DANH MỤC BẢNG Bản 3.1: Ảnh hƣởng thời gian tách béo ến hiệu suất thunhận enzyme 48 Bản 3.2: Kết qu kh o sát chế phẩm enzyme urease thu nhận từ ậu n nh tách béo 49 Bản 3.3: Ảnh hƣởng tỉ lệ enzyme/alginate ến hiệu suất cố ịnh protein 50 Bản 3.4: Ảnh hƣởng tỉ lệ enzyme/alginate ến hiệu suất cố ịnh enzyme 50 Bản 3.5: Ảnh hƣởng nồng ộ alginate ến hiệu suất cố ịnh enzyme 51 Bản 3.6: Ảnh hƣởng tỉ lệ enzyme/chitosan ến hiệu suất cố ịnh protein 52 Bản 3.7: Ảnh hƣởng tỉ lệ enzyme/chitosan ến hiệu suất cố ịnh enzyme 52 Bản 3.8: Ảnh hƣởng nồng ộ alginate ến ho t tính enzyme cố ịnh 54 Bản 3.9: Ảnh hƣởng tỉ lệ enzyme/celite ến hiệu suất cố ịnh protein 55 Bản 3.10: Ảnh hƣởng tỉ lệ enzyme/celite ến ho t tính enzyme cố ịnh 55 Bản 3.11: Ảnh hƣởng tỉ lệ celite ến kh cố ịnh enzyme 57 Bản 3.12: Ảnh hƣởng lo i chất mang ến hiệu suất cố ịnh enzyme 58 Bản 3.13: Ho t tính enzyme urease cố ịnh alginate l n sử dụng 59 Bản 3.14: Ho t tính enzyme urease cố ịnh chitosan l n sử dụng 61 Bản 3.15: Ho t tính enzyme urease cố ịnh celite bọc alginate l n sử dụng 62 Bản 3.16: Ảnh hƣởng nhiệt ộ ến ho t tính enzyme urease tự 65 Bản 3.17: Ảnh hƣởng nhiệt ộ ến ho t tính enzyme urease cố ịnh 65 Bản 3.18: Ảnh hƣởng pH ến ho t tính enzyme urease tự 66 Bản 3.19: Ảnh hƣởng pH ến ho t tính enzyme urease cố ịnh 67 Bản 3.20: Các th ng số ộng học enzyme tự v cố ịnh 70 Bản 3.21:Tƣơng quan giá trị ∆OD v nồng ộ urea chuẩn 71 Bản 3.22: So sánh kết qu urea máu dùng urease cố ịnh với kết qu từ máy sinhh a tự ộng Hitachi 917 73 HVTH: Lê Thị Mỹ Ngọc Luận văn thạc sĩ – 2013 vi DANH MỤC HÌNH H nh 1.1: Giáo sƣ James atcheller Sumner* Hình 1.2: Cấu trúc d ng tinh thể enzymeurease Hình 1.3:Cấu t o enzymeurease từ nguồn gốc khác Hình 1.4:Cấu t o trung tâm ho t ộng enzymeurease Hình 1.5: Cơ chế xúc tác enzyme urease H nh 1.6: Alginate v h nh nh t o gel CaCl2 18 Hình 1.7: Cấu t o d ng ồng trùng h p alginate 18 Hình 1.8: Cấu t o chitosan v chitin 19 Hình 2.1: Sơ nghiên cứu 37 Hình 2.2: Quy tr nh thu nhận enzyme urease từ h t ậu n nh 38 H nh 3.1: Đƣờng chuẩn Nessler 46 H nh 3.2: Đƣờng chuẩn Bradford .47 Hình 3.3: Ảnh hƣởng thời gian tách béo ến hiệu suất thu nhận enzyme 48 Hình 3.4:Ảnh hƣởng tỉ lệ enzyme/chitosan ến hiệu suất cố ịnh protein .53 Hình 3.5:Ảnh hƣởng tỉ lệ enzyme/chitosan ến hiệu suất cố ịnh enzyme 53 Hình 3.6: Ảnh hƣởng tỉ lệ enzyme-celite ến hiệu suất cố ịnh protein 56 Hình 3.7: Ảnh hƣởng tỉ lệ enzyme-celite ến hiệu suất cố ịnh enzyme 56 H nh 3.8: So sánh ho t tính enzyme cố ịnh chất mang khác .58 Hình 3.9: Kh tái sử dụng enzyme cố ịnh alginate 60 Hình 3.10: Kh tái sử dụng enzyme cố ịnh chitosan 62 Hình 3.11: Kh tái sử dụng enzyme cố ịnh celite bọc alginate 63 H nh 3.12: Kh tái sử dụng enzyme cố ịnh lo i chất mang .64 Hình 3.13: Ảnh hƣởng nhiệt ộ ến ho t tính enzyme tự cố ịnh 65 Hình 3.14: Ảnh hƣởng pH ến ho t tính enzyme tự v cố ịnh .68 Hình 3.15: iểu Lineweaver- urk biểu diễn mối quan hệ [1/V] v [1/S] enzyme tự v cố ịnh 69 Hình 3.16: Đƣờng chuẩn urea 72 HVTH: Lê Thị Mỹ Ngọc Luận văn thạc sĩ – 2013 vii DANH MỤC VIẾT TẮT - Ap : ho t tính riêng chế phẩm enzyme - P Đ, PCĐ : lƣ ng protein ban - Pcòn l i : lƣ ng protein kh ng ƣ c cố ịnh - cel-E : enzyme cố ịnh celite - cel-E-algi : enzyme cố ịnh celite bọc alginate - chi-E : enzyme cố ịnh chitosan - chi-E-algi : enzyme cố ịnh chitosan bọc alginate - cp : chế phẩm enzyme - cs : cộng - ECĐ : enzyme cố ịnh - H : hiệu suất so với giá trị cực - HCĐ : hiệu suất cố ịnh protein - He : hiệu suất cố ịnh enzyme - Km : số Michaelis Menten - mt : tổng khối lƣ ng - [S] : nồng ộ chất - TB : trung bình - TD : tự - TL : trích ly - V : tốc ộ ph n ứng - Vmax : tốc ộ ph n ứng cực - Vt, Vdd : tổng thể tích, thể tích dung dịch - ΣA : tổng ho t tính enzyme ban - ΣACĐ : tổng ho t tính enzyme cố ịnh - ΣATD : tổng ho t tính chế phẩm enzyme tự - ΣATL : tổng ho t tính dịch trích ly Đ HVTH: Lê Thị Mỹ Ngọc u, cố ịnh i i u trƣớc cố ịnh Luận văn thạc sĩ – 2013 88 Bản 6: Kết qu kh o sát h m lƣ ng protein chế phẩm urease từ ậu n nh tách béo 12h Kết Lần Lần Lần ∆OD 0,118 0,112 0,113 0,114 ± 0,0032* ∆ODTB H m mục tiêu y = 0,0011x + 0,0006 H m lƣ ng protein 206,18 (µg protein/mg cp) H m lƣ ng protein ≈ 0,206 (mg protein/mg cp) * : độ lệch chuẩn mẫu với lần thực H m lƣ ng protein chế phẩm = 0,114  0,0006 1 y b x = x 0,5 0,5 0,0011 a = 206,18 (µg protein/mg chế phẩm) Ho t tín r ên ế p ẩm enzyme ure se t ết từ đậu nàn AP = ACP / h m lƣ ng protein chế phẩm = 1,36 0,206 ≈ 6,6 (U/mg protein) Khảo sát đ ều kiện cố định enzyme urease alginate Bảng 7: Ho t tính v h m lƣ ng protein dung dịch chế phẩm enzyme mg/ml Kết Dung dịch chế phẩm enzyme Ho t tính A (U/ml cp) 4,09 H m lƣ ng protein (mg/ml cp) 0,62 Ho t tính chế phẩm enzyme urease có nồn độ mg/ml ∆ODTB = 0,103 Phƣơng tr nh ƣờng chuẩn NH3 : y = 0,0116x – 0,0046 A (U/ml cp) = HVTH: Lê Thị Mỹ Ngọc 1,5 y b x x x 0,1 0, a 17 x10 Luận văn thạc sĩ – 2013 89 = 0,103  0,0046 1,5 x x x 0,1 0,0116 0, 17 x10 = 4,09 U/ml cp Hàm lƣợn prote n ∆ODTB = 0,114 Phƣơng tr nh ƣờng chuẩn protein : y = 0,0011x + 0,0006 Lƣ ng protein c mg chế phẩm : y b x 0,5 a = 0,114  0,0006 x 0,5 0,0011 Lƣ ng protein tổng c 3mg chế phẩm = 206,18 (µg protein/mg cp) = 618,54 µg protein ≈ 0,62 mg protein Vậy 1ml chế phẩm enzyme c nồng ộ 3mg/ml c chứa 0,62 mg protein 3a Kết khảo sát tỉ lệ enzyme/alginate Bản 8: Kết qu nh hƣởng tỉ lệ enzyme/alginate ến hiệu suất cố ịnh protein Tỉ lệ dd Enzyme / dd Al n te 3% Kết 1:1 1:2 2:1 1/2 1/3 2/3 0,029 0,018 0,068 0,035 0,026 0,057 0,030 0,024 0,060 ∆ODTB 0,031 0,023 0,062 Σ Pcòn l i (mg) 0,69 0,51 1,40 Σ PCĐ (mg) 0,86 0,52 0,67 HCĐ (%) 55,48 50,49 32,37 Tỉ lệ pha lỗng ∆OD(protein thất thốt) Tính tốn lƣợn prote n ủ dun dị b n đầu ố địn  Protein tổng ban đầu trước cố định: Σ lƣ ng protein tự ban 1) Σ P Đ = HVTH: Lê Thị Mỹ Ngọc u (trƣớc c ) (mg) tƣơng ứng với trƣờng h p : 0,62 x x 1/2 = 1,55 mg Luận văn thạc sĩ – 2013 90 2) Σ P Đ = 0,62 x x 1/3 = 1,03 mg 3) Σ P Đ = 0,62 x x 2/3 = 2,07 mg  Protein tổng thất thoát: Σ lƣ ng protein thất thoát (mg) tƣơng ứng với trƣờng h p : 1) ΣPcòn l i = 0,031  0,0006 y b xV= x 25 = 690,90 µg ≈ 0,69 mg 0,0011 a 2) ΣPcòn l i = 0,023  0,0006 y b xV= x 25 = 509,09 µg ≈ 0,51 mg 0,0011 a 3) ΣPcòn l i = 0,062  0,0006 y b xV= x 25 = 1395,45 µg ≈ 1,40 mg 0,0011 a  Protein tổng cố định: 1) ΣPCĐ = 1,55 – 0,69 = 0,86 mg 2) ΣPCĐ = 1,03 – 0,51 = 0,52 mg 3) ΣPCĐ = 2,07 – 1,40 = 0,67 mg  Hiệu suất cố định: 1) HCĐ = 0,86 x 100 = 55,48% 1,55 2) HCĐ = 0,52 x 100 = 50,49% 1,03 3) HCĐ = 0,67 x 100 = 32,37% 2,07 Bản 9: Kết qu nh hƣởng tỉ lệ enzyme/alginate ến ho t tính enzyme cố ịnh Kết Tỉ lệ pha lỗng ∆OD HVTH: Lê Thị Mỹ Ngọc Tỉ lệ dd Enzyme / dd Al n te 3% 1:1 1:2 2:1 1/2 1/3 2/3 0,546 0,324 0,391 0,561 0,301 0,405 Luận văn thạc sĩ – 2013 91 ∆ODTB 0,550 0,319 0,416 0,552 0,315 0,404 Hệ số pha loãng : n = 20 Σ ACĐ (U) 5,65 3,24 4,14 He (%) 55,23 47,51 30,37 Tín to n tổn o t tín ủ dun dị b n đầu ố địn  Tổng hoạt tính dd enzyme tự ban đầu trước cđ (U) tương ứng với trường hợp 1) Σ A Đ = 4,09 x x 1/2 = 10,23 U 2) Σ A Đ = 4,09 x x 1/3 = 6,82 U 3) Σ A Đ = 4,09 x x 2/3 = 13,63 U  Tổng hoạt tính enzyme cố định tương ứng với trường hợp Hỗn h p gồm ml dung dịch urea v ml nƣớc cất ƣ c ủ với 1g h t enzyme cố ịnh Rút 0,2 ml ể xác ịnh ho t tính Hệ số pha lỗng l 4/0,2 = 20 l n 1) ΣACĐ = 0,552  0,0046 x 0,0116 17 x10 2) ΣACĐ = 0,315  0,0046 0,0116 x 3) ΣACĐ = 0,404  0,0046 0,0116 x x 20 = 5,65 U 17 x10 x 20 = 3,24 U 17 x10 x 20 = 4,14 U  Tổng hoạt tính enzyme cố định so với enzyme tự 1) He = 3,24 x 100 6,82 = 55,23% 2) He = 5,65 x 100 10 ,23 = 47,51% 3) He = 4,14 x 100 13,63 = 30,37% 3b Kết khảo sát nồn độ alginate Tính tốn tƣơng tự nhƣ mục 3.1 chúng t i thu ƣ c kết qu b ng 10 HVTH: Lê Thị Mỹ Ngọc Luận văn thạc sĩ – 2013 92 Bản 10: Ảnh hƣởng nồng ộ alginate ến tổng ho t tính enzyme cố ịnh Nồn độ dun dị Kết ΣA Đ (U) ∆OD ∆ODTB l n te (%) 10,23 10,23 10,23 10,23 0,419 0,479 0,522 0,530 0,401 0,490 0,530 0,505 0,425 0,487 0,543 0,551 0,415 0,485 0,532 0,529 Hệ số pha loãng : n = 20 l n Σ ACĐ (U) 4,26 4,97 5,44 5,41 He (%) 41,60 48,54 53,19 52,90 Khảo sát đ ều kiện cố định enzyme urease h t chitosan 4a Kết khảo sát ản ƣởng tỉ lệ enzyme /chitosan Tín to n lƣợn prote n ủ dun dị b n đầu ố địn  Lượng protein tổng tự ban đầu (trước cố định) (mg) : 1) Σ PBĐ = 0,62 x 2,5 = 1,55 mg 2) Σ PBĐ = 0,62 x 3,0 = 1,86 mg 3) Σ PBĐ = 0,62 x 3,5 = 2,17 mg 4) Σ PBĐ = 0,62 x 4,0 = 2,48 mg 5) Σ PBĐ = 0,62 x 4,5 = 2,79 mg 6) Σ PBĐ = 0,62 x 5,0 = 3,10 mg  Lượng protein tổng thất thoát cố định 1g hạt Dịch rửa ƣ c ịnh mứcvề 25 ml Dựa vào cơng thức (10), (11), (12) chúng tơi tính ƣ c lƣ ng proteincố ịnh, hiệu suất cố ịnh tƣơng ứng với mẫu nhƣ sau HVTH: Lê Thị Mỹ Ngọc Luận văn thạc sĩ – 2013 93 Bản 11: Kết qu protein cố ịnh 1g h t chitosan Kết Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 0,009 0,011 0,012 0,019 0,017 0,019 0,013 0,009 0,018 0,011 0,018 0,018 0,012 0,015 0,010 0,013 0,010 0,024 ∆ODTB (Vdd rửa = 25ml) 0,011 0,012 0,013 0,014 0,015 0,02 Σ Pcòn l i (mg) 0,24 0,26 0,28 0,30 0,33 0,44 Σ PCĐ (mg) 1,31 1,60 1,89 2,18 2,46 2,43 HCĐ (%) 84,52 86,02 87,10 87,9 88,17 85,81 Vdd enzyme (ml) ∆OD Tín to n o t tín ủ enzymeb n đầu ố địn  Tổng hoạt tính tự ban đầu (trước cố định) (U) Mẫu : ΣA Đ = 4,09 x 2,5 = 10,23 U Mẫu : ΣA Đ = 4,09 x 3,0 = 12,27 U Mẫu : ΣA Đ = 4,09 x 3,5 = 14,32 U Mẫu : ΣA Đ = 4,09 x 4,0 = 16,36 U Mẫu : ΣA Đ = 4,09 x 4,5 = 18,41 U Mẫu : ΣA Đ = 4,09x 5,0 = 20,45 U  Hoạt tính enzyme cố định (U) Ủ 1g h t chitosan với hỗn h p gồm ml dung dịch urea 2% v ml nƣớc cất Rút 0,2 ml dung dịch sau ph n ứng em xác ịnh ho t tính Hệ số pha loãng l 4/0,2 = 20 Dựa v o c ng thức (8), (13) chúng t i xác ịnh ƣ c ho t tính enzyme cố ịnh Bảng 12: Kết qu ho t tính enzyme cố ịnh 1g h t chitosan Kết Vdd enzyme (ml) ∆OD HVTH: Lê Thị Mỹ Ngọc Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 0,522 0,689 0,866 1,029 1,187 1,179 0,541 0,713 0,852 1,018 1,165 1,174 0,539 0,702 0,869 1,020 1,173 1,189 Luận văn thạc sĩ – 2013 Mẫu 94 ∆ODTB 0,534 0,701 0,862 1,022 1,175 1,181 Σ ACĐ (U) 5,46 7,16 8,79 10,41 11,96 12,02 He (%) 53,42 58,32 61,4 63,64 65,0 58,8 4b Khảo sát cố định chitosan kết hợp alginate Bản 13: Ho t tính enzyme cố ịnh chitosan bọc alginate Kết ∆OD ∆ODTB Nồn độ l n te 1% 2% 3% 1,024 0,888 0,721 1,040 0,901 0,741 1,030 0,917 0,732 1,031 0,902 0,731 Hệ số pha loãng : n = 20 Σ chi-E-algi (U) 10,50 9,19 7,46 Ho t tính enzyme cố ịnh chitosan kết h p với alginate so với chitosan tƣơng ứng với nồng ộ alginate 1, 2, 3% nhƣ sau : 1% : Σ chi-E-algi / Σ chi-E = 10 ,5 x 100 = 87,79 % 11,96 2% : Σ chi-E-algi / Σ chi-E = 9,19 x 100 = 76,84 % 11,96 3% : Σ chi-E-algi / Σ chi-E = 7,46 x 100 = 62,37 % 11,96 Khảo sát đ ều kiện cố định enzyme urease celite Tính tốn ho t tính v h m lƣ ng protein dung dịch enzyme c nồng ộ 30 mg/ml (pha ệm tris 0,2M pH 7,0, EDTA-Na21mM) nhƣ sau :  Ho t tính chế phẩm ∆ODTB = 1,556 Phƣơng tr nh ƣờng chuẩn NH3 : y = 0,0116x – 0,0046 HVTH: Lê Thị Mỹ Ngọc Luận văn thạc sĩ – 2013 95 A (U/ml cp) = y b 1,5 x x x 0,1 0, a 17 x10 = 1,556  0,0046 x 0,0116 = 59,35 U/ml cp 1,5 x x 0,1 0, 17 x10  Hàm lƣợng protein ∆ODTB = 0,110; hệ số pha loãng n= 10 Phƣơng tr nh ƣờng chuẩn protein : y = 0,0011x + 0,0006 Lƣ ng protein c mg chế phẩm : 0,110  0,0006 1 y b x x 10 = x x 10 0,5 0,5 0,0011 a Lƣ ng protein tổng c 30 mg chế phẩm = 1989,1 (µg protein/mg cp) = 59,67 (mg protein) H m lƣ ng protein dung dịch enzyme c nồng ộ 30 mg/ml = 59,67 mg protein/ml cp  Lƣợng protein tổng ho t tính dung dịch enzyme b n đầu (trƣớc cố định) Bản 14: Lƣ ng protein tổng v tổng ho t tính enzyme ban Kết u Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Vdd enzyme (ml) 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 Vdd tris pH 7,0 (ml) 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 ΣP Đ (mg) 59,67 89,51 119,35 149,18 179,02 ΣA Đ (U) 59,35 89,03 118,70 148,38 178,05 Lượng protein tổng tự ban đầu (mg) Mẫu : ΣP Đ = 59,67 mg Mẫu : ΣP Đ = 59,67 x 1,5 = 89,51 mg Mẫu : ΣP Đ = 59,67 x = 119,34 mg Mẫu : ΣP Đ = 59,67 x 2,5 = 149,18 mg HVTH: Lê Thị Mỹ Ngọc Luận văn thạc sĩ – 2013 96 Mẫu : ΣP Đ = 59,67 x = 179,01 mg Tổng hoạt tính enzyme ban đầu 5a Ản Mẫu : ΣA Đ = 59,35 U Mẫu : ΣA Đ = 59,35 x 1,5 = 89,03 U Mẫu : ΣA Đ = 59,35 x = 118,7 U Mẫu : ΣA Đ = 59,35 x 2,5 = 148,38 U Mẫu : ΣA Đ = 59,35 x = 178,05 U ƣởng tỉ lệ enzyme/ el te đến hiệu suất cố định Enzyme cố ịnh celite sau ủ qua êm 40C ƣ c rửa tris 0,2M pH 7,0, EDTA-Na21mM v ịnh mức nƣớc rửa 100 ml Bản 15: Lƣ ng protein cố ịnh 1g celite Kết Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu 0,030 0,079 0,120 0,147 0,489 0,034 0,085 0.125 0,143 0,477 0,041 0,08 0,131 0,142 0,482 ∆ODTB (Vdd rửa 100ml) 0,035 0,081 0,125 0,144 0,483 Σ Pcòn l i (mg) 3,13 7,31 11,31 13,04 43,85 Σ PCĐ (mg) 56,55 82,20 108,04 136,15 135,16 HCĐ (%) 94,77 91,83 90,52 91,27 75,50 ∆OD Dựa v o c ng thức (11), (12) tính ƣ c lƣ ng enzyme cố ịnh v hiệu suất tr nh cố ịnh celite 5b Ản ƣởng tỉ lệ enzyme/ el te đến tổng ho t tínhenzyme cố định Xác ịnh ho t tính enzyme urease cố ịnh lên celite cách ủ với hỗn h p 10 ml dung dịch urea 2% v 10 ml nƣớc cất Rút 0,2 ml dung dịch sau ph n ứng em xác ịnh ho t tính Hệ số pha lỗng l 20/0,2 = 100 Dựa v o c ng thức (8), (15) chúng t i xác ịnh ƣ c ho t tính enzyme cố ịnh Bản 16: Ho t tính enzyme cố ịnh 1g celite HVTH: Lê Thị Mỹ Ngọc Luận văn thạc sĩ – 2013 97 Kết ∆OD ∆ODTB Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu 0,655 0,642 0,989 1,001 1,398 1,382 1,902 1,911 1,899 1,874 0,641 0,982 1,403 1,881 1,896 0,646 0,991 1,394 1,898 1,890 96,48 65,02 96,08 53,96 Hệ số pha loãng : n = 100 l n Σ ACĐ (U) He (%) 32,99 55,59 50,49 56,71 70,92 59,75 5c Khảo sát cố định enzyme celite kết hợp alginate Bản 17: Ho t tính enzyme cố ịnh celite trƣớc bọc alginate Kết Khối lƣ ng celite-E (mg) ΣA celite-E (U) Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu 0,1 9,65 0,2 19,3 0,3 28,94 0,4 38,59 0,5 48,24 Bản 18: Ho t tính enzyme cố ịnh celite sau bọc alginate Kết ∆OD ∆ODTB Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu 0,472 0,481 0,490 0,946 0,955 0,957 1,402 1,395 1,399 1,414 1,398 1,401 1,421 1,409 1,416 0,481 0,953 1,399 1,404 1,415 Hệ số pha loãng : n = 50 l n ΣA celite-E-alginate (U) 12,31 24.28 35.59 35.72 35.99 Từ kết qu chúng t i c : - Ho t tính enzyme cố ịnh celite so với d ng tự l : ΣA celite-E / ΣATD = 65,02% (b ng 16) - Ho t tính enzyme cố ịnh celite so với d ng celite bọc alginate l : ΣA celite-E / ΣA celite-E-algi HVTH: Lê Thị Mỹ Ngọc = 28,94 x 100 = 81,31 % (b ng17, 18) 35,59 Luận văn thạc sĩ – 2013 98 Vậy ho t tính enzyme cố ịnh celite bọc alginate so với d ng tự l : ΣA celite-E-alginate / ΣATD Kết khảo sát yếu tố ản 65,02 x100 = 79,97 % 81,31 = ƣởn đến ho t tính enzyme cố định h t chitosan 6a Ản ƣởng nhiệt độ đến ho t tính enzyme urease Bản 19: Kết qu OD ho t tính enzyme tự tƣơng ứng với nhiệt ộ Kết ∆OD ∆ODTB N ệt độ 600C 650C 300C 400C 500C 700C 800C 0,151 0,212 0,342 0,644 0,518 0,498 0,220 0,149 0,201 0,331 0,637 0,531 0,479 0,233 0,160 0,193 0,327 0,646 0,522 0,489 0,228 0,153 0,202 0,333 0,642 0,524 0,489 0,227 Bản 20: Kết qu OD ho t tính enzyme cố ịnh tƣơng ứng với nhiệt ộ Kết ∆OD ∆ODTB 6b Ản 40 C 0,212 N ệt độ 50 C 600C 650C 0,349 0,435 0,518 700C 0,608 800C 0,469 0,125 0,224 0,363 0,457 0,533 0,586 0,478 0,121 0,213 0,358 0,445 0,529 0,609 0,498 0,153 0,202 0,333 0,642 0,524 0,489 0,227 30 C 0,131 0 ƣởng củ pH đến ho t tính enzyme urease Bản 21: Kết qu OD ho t tính enzyme tự tƣơng ứng với giá trị pH Kết ∆OD pH 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 0,071 0,101 0,117 0,324 0,289 0,193 0,083 0,094 0,102 0,307 0,313 0,174 0,097 0,097 0,098 0,312 0,300 0,189 ∆ODTB 0,084 0,097 0,106 0,314 0,301 0,185 Bản 22: Kết qu OD ho t tính enzyme cố ịnh chitosan tƣơng ứng với giá trị pH HVTH: Lê Thị Mỹ Ngọc Luận văn thạc sĩ – 2013 99 Kết pH 5,5 0,081 6,0 0,151 6,5 0,246 7,0 0,325 7,5 0,388 8,0 0,356 ∆OD 0,080 0,149 0,265 0,328 0,419 0,355 ∆ODTB 0,091 0,084 0,152 0,151 0,259 0,257 0,324 0,326 0,440 0,416 0,331 0,347 Khảo sát tính chất động học enzyme urease tự cố định Bản 23: Kết qu xác ịnh vận tốc thủy phân enzyme tự v cố ịnh Nồng Tự ộ [S] 1/[S] mmol (mmol)-1 0,5 83,33 1,0 urea [V] Cố ịnh 1/[V] -1 [V] 1/[V] (µmol/mg.phút) (µmol/mg.phút)-1 (µmol/mg.phút) (µmol/mg.phút) 0,012 0,536 1,867 0,185 5,411 166,67 0,006 0,788 1,269 0,251 3,988 1,5 250,00 0,004 0,911 1,098 0,366 2,731 2,0 333,33 0,003 1,020 0,981 0,403 2,479 2,5 416,67 0,002 1,006 0,994 0,436 2,292 3,0 500,00 0,002 0,999 1,001 0,404 2,473 3,5 583,33 0,002 1,006 0,994 0,401 2,492 4,0 666,67 0,002 0,972 1,029 0,403 2,479 (%) Từ b ng 23 chúng t i xây dựng ƣ c thị Lineweaver- urk v th ng số ộng học enzyme tự v cố ịnh:  Tự : y = 76,998x + 0,832 (R2 = 0,986) Vmax = 1/0,832 = 1,202 (µmol/mg.phút) Km = 1,202 x 76,998 = 92,5 (mmol)  Cố ịnh : y = 339,62x + 1,5093 (R2 = 0,9848) Vmax = 1/1,5093 = 0,663 (µmol/mg.phút) Km = 1,202 x 339,62 = 225 (mmol) Ƣớc tính chi phí cho xét nghiệm urea máu dùng enzyme urease cố định HVTH: Lê Thị Mỹ Ngọc Luận văn thạc sĩ – 2013 100 8a Chi phí cho trình tách béo thu nhận enzyme Bản 24: Chi phí cho q trình tách béo STT Ngun liệu - H a chất Số lƣ ng Đơn vị tính Th nh tiền Đậu n nh 30 g 1.380 Diethyl ether 200 ml 32.000 Amonium sulfate 500 g 36.000 Đệm phosphate 0.2M 700 ml 1.500 Giấy lọc miếng 1.000 TỔNG C NG 71.880 Do hiệu suất thu nhận enzyme urease tách béo 12h: H = 26,09% nên khối lƣ ng enzyme urease th thu ƣ c từ 30g bột ậu nành là: = 7,83g tƣơng ứng với 71.880 ồng m Vậy muốn thu enzyme t ô tốn 71.880/7,83 = 9.180 đồn 8b Chi phí cho q trình cố định hạt chitosan Bản 25: Chi phí cho tr nh t o h t chitosan STT Nguyên liệu - H a chất Số lƣ ng Đơn vị tính Th nh tiền 0,1 g 140 Chitosan Acid acetic ml 50 NaOH 1M 0,02 g 50 Gluraraldehyde ml 1.000 Đệm tris aminomethane0.2M 50 ml 200 EDTA-Na2 0,1 g 50 TỔNG C NG 1.490 Với h a chất nhƣ chúng t i thu ƣ c 3,75g h t chitosan ho t h a Vậy muốn thu HVTH: Lê Thị Mỹ Ngọc t tos n o t ó tốn 1.490/3,75 = 397 đồn Luận văn thạc sĩ – 2013 101 8c Chi phí cho q trình cố định enzyme hạt chitosan Lƣ ng enzyme ban u dùng cố ịnh 1g h t chitosan iều kiện tối ƣu (HCĐ = 65%, mECĐ = 2,46 mg) là: mE Đ = = 3,78 mg với số tiền tƣơng ứng l 3,78 x 9.180 = 35 ồng Vậy muốn thu t enzyme ố địn tos n tốn 397 + 35 = 432 đồn Tuy nhiên h t enzyme cố ịnh gi m >70% so với ban u sử dụng 12 l n phí cho l n sử dụng enzyme cố ịnh l : 432/12 = 36 ồng 8d So sánh chi phí cho xét nghiệm urea máu sử dụng enzyme cố định chitosan sử dụng kit Human Bản 26:So sánh chi phí test xét nghiệm urea máu phƣơng pháp Sử dụng urease cố ịnh STT Nguyên liệu - H a chất Số Đơn vị lƣ ng tính Th nh tiền Trichloracetic acid 0.5 ml 50 HCl 0,1N 0.5 ml 20 Thuốc thử Nessler Đệm tris aminomethane 0.2M H a chất d ng kit 0.5 ml 700 0.8 ml 10 TỔNG C NG (đồn ) HVTH: Lê Thị Mỹ Ngọc Sử dụng kit thƣơng m i Số Đơn vị lƣ ng tính 0.5 ml 880 Luận văn thạc sĩ – 2013 Th nh tiền 3.230 3.230 102 PHẦN LÝ LỊCH TRÍCH NGANG Họ v tên : Lê Thị Mỹ Ngọc Ng y, tháng, năm sinh : 31.10.1982 Địa liên l c : Nơi sinh: Vĩnh Long 507 Chung cƣ Phú Th nh, 53 Nguyễn Sơn, P.Phú Th nh, Q.Tân Phú, Tp.HCM QUÁ TRÌNH ĐÀO TẠO 2000 – 2004: sinh viên Đ i học Y Dƣ c Tp.HCM, chun ngành Xét nghiệm Q TRÌNH CƠNG TÁC 2004 ến nay: gi ng viên Bộ môn Xét nghiệm – Khoa Điều dƣỡng-Kỹ thuật Y học, Đ i học Y Dƣ c Tp.HCM HVTH: Lê Thị Mỹ Ngọc Luận văn thạc sĩ – 2013 ... TÊN ĐỀ TÀI: “NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH UREASE VÀ ỨNG DỤNG TRONG XÉT NGHIỆM PHÂN TÍCH UREA MÁU” NHIỆM VỤ VÀ N I DUNG: - Tách chiết enzyme urease từ ậu nành - Kh o sát iều kiện cố ịnh enzyme urease chất... ƣ c nghiên cứu nhiều nhằm ứng dụng nhiều lĩnh vực Trong y học, enzyme urease ã ƣ c số tác gi nghiên cứu cố ịnh v ứng dụng xét nghiệm phân tích urea máu Các kết qu ã cho thấy sử dụng enzyme urease. .. gian cố ịnh xác ịnh ƣ c nồng ộ mẫu thử 1.4.4 Ứng dụng enzyme urease cố định xét nghiệm urea máu Việc cố ịnh enzyme urease mang l i nhiều l i ích kể Với kh tái sử dụng nhiều l n, enzyme urease cố