NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Điều kiện tạo sinh khối tế bào Lactobacillus acidophilus giàu β-galactosidase Xác định vị trí enzyme β-galactosidase trong tế bào Xác định tính chất chế phẩ
TỔNG QUAN
Khái quát về L acidophilus
Theo khóa phân loại của Bergey thì L acidophilus thuộc:
L acidophilus là vi khuẩn Gram dương, có dạng hình que, có chiều dài 1.5 đến
6.0 àm, chiều rộng 0.6 đến 0.9 àm Cỏc tế bào vi khuẩn này thường xếp theo dạng cặp hoặc tạo thành chuỗi ngắn Khuẩn lạc trong môi trường thạch có kích thước 2 đến 5 mm, lồi, đục, mịn, bóng và không có sắc tố (Gopal, 2011)
2.1.3 Cấu tạo vách và màng tế bào
Vách tế bào L acidophilus gồm: peptidoglycan, acid teichoic, S-layer và polysaccharide (hình 2.1)
Hình 2.1: Mô hình cấu tạo vách tế bào như L acidophilus
Lớp peptidoglycan là thành phần chính tạo nên cấu trúc bền vững cho vách tế bào Peptidoglycan chiếm 50 đến 80% khối lƣợng vách tế bào, gồm những polysaccharide xếp song song chứa các monomer gồm acid N-acetyl-muramic (M) và N-acetyl-D-glucosamine (G) nối bằng liên kết β-1,4-glycoside Giữa các lớp polysaccharide này đƣợc nối với nhau nhờ các peptide gắn ở acid N-acetyl-muramic (hình 2.2) (Harrison và cộng sự, 2011)
Hình 2.2: Thành phần của peptidoglycan ở vi khuẩn lactic
Thành phần acid teichoic thay đổi tùy theo chủng, giai đoạn sinh trưởng, pH môi trường và nguồn carbon Nó giữ nhiều chức năng đối với vách tế bào, bao gồm: acid teichoic và acid teichuronic tạo liên kết cộng hóa trị với peptidoglycan, acid lipoteichoic và lipoglycan gắn với màng tế bào chất nhƣng một vài phân đoạn của nó được tìm thấy nằm tự do trong vách tế bào hay giải phóng trong môi trường (Jafarei và cộng sự, 2011)
S-layer của L acidophilus M92 có kích thước 45 kDa (Frece và cộng sự,
2005) S-layer có vai trò quan trọng trong việc duy trì các chức năng của tế bào vi khuẩn, quyết định và duy trì hình dạng tế bào Nó có thể chịu đƣợc các điều kiện khắc nghiệp về pH, nhiệt độ, phóng xạ, một số tác nhân phân giải protein, áp suất cao S-layer hoạt động nhƣ một tấm chắn bảo vệ những receptor nhận diện bởi vỏ phage ở dưới vách tế bào Ngoài ra, nó còn có khả năng tương tác và điều khiển những tế bào miễn dịch thông qua cảm ứng sự hoạt động của cytokine (Jafarei và cộng sự, 2011)
Exopolysaccharide (EPS) giúp tế bào vi sinh chống lại điều kiện khô, thực bào, phage, độc tố, protozoa và áp suất thẩm thấu EPS ở vi khuẩn lactic đƣợc chia thành hai nhóm: homopolysaccharide và heteropolysaccharide Đối với L acidophilus
EPS là heteropolysaccharide có vai trò quan trọng trong việc tạo cấu trúc cho các sản phẩm sữa lên men (Vuyst và cộng sự, 1999; Marshall và cộng sự, 2001)
Màng tế bào gồm lớp đôi phospholipid dày 4 nm và một số protein, duy trì môi trường nội bào, gradient nồng độ, hệ thống vận chuyển Nó sẽ dễ dàng bị phá vỡ bởi áp suất thẩm thấu ở những vị trí vách có lỗ hổng (Harrison, 2011)
L acidophilus là loài không di động, không tạo bào tử và vi hiếu khí hoặc kỵ khí Nguồn carbohydrate, nitrogen, vitamin và các yếu tố vi lƣợng nhƣ acid oleic, manganese, và các ester đặc biệt là tween 80 thuận lợi cho sự phát triển L acidophilus lên men đường lactose nhưng chậm, có khả năng lên men các loại đường glucose, sucrose, maltose, mannose, esculin, salicin, không lên men arabinose, xylose, rhammose, ribose, sorbitol Vi khuẩn này phát triển chậm trong sữa vì hàm lƣợng peptide và acid amino thấp
Ngoài ra, L acidophilus còn có khả năng tạo ra các bacteriocin Bacteriocin là những hợp chất có bản chất protein, do vi khuẩn tạo ra và có khả năng ức chế sự phát triển của các vi khuẩn khác thuộc loài gần với giống sản xuất L acidophilus có thể sinh tổng hợp ra các loại bacteriocin nhƣ lactocin B, lactacin F, acidocin A và acidocin B (Jafarei và cộng sự, 2011)
L acidophilus là loài vi khuẩn kỵ khí tùy nghi, chúng phát triển mạnh trong môi trường lỏng và agar ở điều kiện kỵ khí chuẩn (5% CO2, 10% H 2 và 85% N 2 ) Nhiệt độ tối ưu cho L acidophilus phát triển thường từ 35 đến 40 o C, có một vài loài phát triển ở 45 o C, pH tối ƣu từ 5.5 đến 6.0
Thành phần môi trường lên men L acidophilus yêu cầu dinh dưỡng rất cao
Môi trường nuôi cấy chuẩn thường phải rất giàu các vitamin, nucleotide và acid amin như pepton, trypton, cao nấm men, cao bò Ngoài ra, thành phần môi trường còn có sorbitol, tween 80, sodium acetat Tween 80 giúp đồng nhất thành phần môi trường, tăng khả năng hấp thu và thay đổi thành phần màng tế bào làm tăng tính thấm Môi trường nuôi cấy thường được sử dụng là MRS (De Man, Rogosa, Sharpe) lỏng hay agar (Sriphannam và cộng sự, 2012)
2.1.6 Vai trò của L acidophilus trong các sản phẩm sữa lên men
L acidophilus được dùng trong các sản phẩm sữa lên men như yogurt, nước uống yogurt, kefir và koumiss Nhiệt độ và pH của sản phẩm sau lên men ảnh hưởng đến sự tồn tại và ổn định của L acidophilus Vi khuẩn này tồn tại lâu hơn khi bảo quản ở nhiệt độ từ 5 đến 9 o C Trong quá trình lên men yogurt, điều quan trọng là phải chọn chủng L acidophilus có thể kết hợp với S thermophilus Tốc độ tăng trưởng của S thermophilus cao hơn nhiều so với L acidophilus, sự phát triển của L acidophilus trong sữa sẽ giúp chuyển hóa một số sản phẩm của S thermophilus nhƣ acid formic, pyruvate và CO 2 (Jafarei và cộng sự, 2011).
Enzyme β-galactosidase (EC 3.2.1.23/108)
2.2.1 Sơ lƣợc về enzyme β-galactosidase
Enzyme β-galactosidase (β-D-galactoside-galactohydrolase), là enzyme xúc tác thủy phân cắt β-galactoside thành monosaccharide, hoạt động trên các cơ chất nhƣ lactose, ganglioside GM1, lactosylceramide, glycoprotein Enzyme lactase (EC 3.2.1.108) chỉ thủy phân lactose là trường hợp riêng của β-galactosidase (Dhaked, 2010; Highi, 2011)
Dựa vào cấu trúc phân tử β-galactosidase thuộc 4 họ Glycoside hydrolase (GH) gồm GH1, GH2, GH35 và GH42 Trong đó, lactase chủ yếu ở GH1 và GH2 Nhiều β-galactosidase ở thực vật và động vật thủy phân polysaccharide, galactolipid và glycoprotein nhƣng không thủy phân lactose (Panesar và cộng sự, 2010)
Enzyme β-galactosidase từ L acidophilus R22 thuộc GH2 là heterodimer
(M r ≈105kDa) bao gồm hai tiểu phần, tiểu phần lớn có phân tử lƣợng 72 kDa và tiểu phần nhỏ có phân tử lượng 35 kDa được xác định bằng phương pháp native PAGE và SDS-PAGE (Nguyen và cộng sự, 2007)
Enzyme β-galactosidase đƣợc tìm thấy ở nhiều nguồn nhƣ vi sinh vật, thực vật và động vật Tùy theo nguồn gốc β-galactosidase sẽ có những đặc tính riêng β- galactosidase có nguồn gốc từ vi sinh được quan tâm và đã thương mại hóa nhiều hơn là từ thực vật và động vật Thu nhận β-galactosidase từ vi sinh đơn giản hơn, tốc độ sinh trưởng nhanh và hiệu suất sản xuất cao hơn (Panesar và cộng sự, 2010)
2.2.2.1 Nguồn β-galactosidase từ động thực vật
Enzyme β-galactosidase đƣợc tìm thấy trong nhiều mô thực vật, có vai trò nhất định liên quan đến quá trình sinh học như tăng trưởng của cây, chín trái và thủy phân lactose Những nghiên cứu sinh học phân tử đã làm sáng tỏ vai trò của β- galactosidase đối với sự sinh trưởng của cây và chín trái β-galactosidase có vai trò quan trọng đối với quá trình chín của trái hồng vì làm giảm đáng kể nồng độ galactosyl trong vách tế bào và thủy phân liên kết với pectin Enzyme β- galactosidase từ đu đủ, giúp thủy phân vách tế bào và làm mềm trái trong suốt quá trình chín (Lazan và cộng sự, 2004) Hầu nhƣ pH tối ƣu cho enzyme β-galactosidase từ thực vật nằm ở khoảng pH acid Enzyme β-galactosidase tách từ quả hạnh (Amygdalus communis) có pH tối ƣu 5.5, nhiệt độ tối ƣu 50 o C, duy trì đƣợc 89% hoạt tính sau 2 tháng lưu giữ ở 4 o C Ở động vật hữu nhũ, enzyme β-galactosidase nằm trong đường tiêu hóa, đặc biệt nhiều ở những động vật mới sinh ra (Husain, 2010)
2.2.2.2 Nguồn β-galactosidase từ vi sinh vật
Từ nhiều loài vi sinh vật, enzyme β-galactosidase đã được thu nhận và thương mại (bảng 2.1)
Bảng 2.1: Nguồn β-galactosidase từ vi sinh vật (Panesar và cộng sự, 2010)
Nguồn gốc Vi sinh vật
Vi khuẩn Alicyclobacillus acidocaldarius subsp rittmannii
Bacillus acidocaldarius, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus subtilis, Bacillus megaterum, Bacillus stearothermophilus
Bacteriodes polypragmatus Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis Clostridium acetobutylicum,
Clostridium thermosulfurogens Corynebacterium murisepticum Enterobacter agglomerans, E cloaceae Escherichia coli
L acidophilus, L.bulgaricus, L helviticus, L kefiranofaciens, L lactis, L sporogenes, L themophilus, L delbrueckii
Leuconostoc citrovorum Pediococcus acidilacti, Pediococcus pento Propioionibacterium shermanii
Pseudomonas fluorescens Pseudoalteromonas haloplanktis Streptococcus cremoris, Streptococcus lactis, Streptococcus thermophius
Thermus rubus, Thermus aquaticus Trichoderma reesei
Nấm mốc Alternaria alternate, Alternaria palmi
Aspergillus foelidis, Aspergillus fonsecaeus, Aspergillus fonsecaeus, Aspergillus carbonarius, Aspergillus oryzae Auerobasidium pullulans
Curvularia inaequalis Fusarium monilliforme, Fusarium oxysporum Mucor meihei, Muco pusillus
Neurospora crassa Penicillum canescens, Penicillum chrysogenum, Penicillumexpansum
Candida pseudotropicalis Saccharomyces anamensis, Saccharomyces lactis, Saccharomyces fragilis
Kluyveromyces bulgaricus, K fragilis, K lactis, K marxianus
Nguồn β-galactosidase từ nấm mốc
Enzyme β-galactosidase từ nấm mốc có pH tối ƣu nằm trong khoảng acid từ 2.5 đến 5.4, do đó có hiệu quả nhất khi thủy phân lactose trong các sản phẩm có tính acid như whey Enzyme β-galactosidase từ nguồn này thường là enzyme chịu nhiệt Tuy nhiên, enzyme này dễ bị ức chế ngƣợc do sản phẩm mà chủ yếu là galactose Nấm mốc thường sử dụng lactose với tỷ lệ rất thấp, với hai cơ chế chuyển hóa lactose:
Thủy phân ngoại bào và hấp thu các monomer
Enzyme β-galactosidase từ Aspergillus oryzae đƣợc tinh sạch bằng dung môi
2-propanol trên DEAE-Sephadex A-50 và Sephadex G-200, có pH tối ƣu với Ortho- nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG) là 4.5 còn lactose là 4.8 Khoảng pH hoạt động từ 4.0 đến 9.0, nhiệt độ tối ƣu 46 o C Hằng số Michaelis với ONPG là 7.2 x 10 -4 M và 1.8 × 10 -2 M với lactose Hg 2+ , Cu 2+ , sodium lauryl sulfate và N-bromo- succinimide là những thành phần kìm hãm hoạt tính β-galactosidase (Husain, 2010)
Nguồn β-galactosidase từ nấm men
Enzyme β-galactosidase của nấm men có hoạt tính cao trong đệm ở khoảng pH 6.0 đến 7.0 (Genari và cộng sự, 2003)
Nấm men K lactis là nguồn quan trọng để sản xuất β-galactosidase thương mại Enzyme β-galactosidase từ nguồn này đƣợc ứng dụng rộng rãi để thủy phân lactose trong sữa, tạo ra nhiều sản phẩm từ sữa mà người không dung nạp lactose có thể sử dụng được Nguồn β-galactosidase từ K lactis đã được thương mại hóa dưới các tên Maxilact (DSM Food Specialties, Delft, The Netherlands) và Lactase (SNAM Progetti, Italy), còn Lactozym (Novo, NordiskA/S, Bagsvaerd, Denmark) là sản phẩm thương mại từ K fragilis (Panesar, 2010)
Nguồn β-galactosidase từ vi khuẩn
Enzyme β-galactosidase từ vi khuẩn đƣợc ứng dụng rộng rãi trong thủy phân lactose vì dễ lên men, hoạt tính enzyme cao và ổn định Vi khuẩn lactic gồm các nhóm lactococci, streptococci và lactobacillus nhận đƣợc nhiều sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học bởi 3 lý do sau:
Khi sử dụng enzyme này thủy phân lactose trong các sản phẩm lên men thì không hoặc ít gây phản ứng phụ
Vi khuẩn lactic thường được coi là an toàn vì vậy nguồn enzyme từ chúng có thể đƣợc sử dụng trực tiếp mà không cần phải tinh sạch
Nhiều chủng thuộc nhóm vi khuẩn lactic có hoạt tính probiotic cải thiện chức năng đường tiêu hóa
Lactobacillus sp đƣợc phân lập từ dạ dày động vật đƣợc sử dụng trong lên men các sản phẩm sữa Khi vào cơ thể người vi khuẩn này sẽ thủy phân lactose ở đại tràng, lƣợng Lactobacillus sp trong đại tràng giúp đánh giá khả năng thủy phân lactose trong đường tiêu hóa (Husain, 2010)
Tuy nhiên, khả năng sinh tổng hợp enzyme β-galactosidase từ nguồn vi khuẩn thấp hơn 10 lần so với nấm men Điều này có thể cải thiện thông qua quá trình tối ưu thành phần môi trường và điều kiện lên men hay sử dụng kỹ thuật tái tổ hợp DNA (ĩstok, 2007)
2.2.3 Cấu trúc của enzyme β-galactosidase
Enzyme β-galactosidase từ E coli bao gồm bốn chuỗi polypeptide, mỗi chuỗi
1023 amino acid, monomer A-D Mỗi monomer gồm 5 vùng đƣợc thể hiện qua 5 màu: xanh dương, xanh lá cây, vàng, lục lam và đỏ (hình 2.4) Vùng 1 là nơi gắn
Mg 2+ Vùng 2 là nơi gắn Na + Hai ion này cần cho sự hoạt động mạnh của enzyme β-galactosidase Vùng 3 có cấu trúc ống đan (barrel) α/β hoặc gấp khúc “TIM” gắn với vị trí hoạt động ở C cuối của ống đan (Matthews, 2005)
Hình 2.4: Cấu trúc của enzyme β-galactosidase từ E coli
Bốn monomer này nằm trên bốn gốc vuông Ba giao diện riêng biệt đƣợc hình thành giữa những cặp monomer khác nhau Thứ nhất là giao diện “long” giữa các monomer đối xứng qua trục hoành nhƣ A và B, C và D với khoảng cách 4000 A o2 Thứ hai là giao diện “activating” giữa các monomer đối xứng qua trục tung nhƣ A và D, B và C với khoảng cách 4600 A o2 Thứ ba là giao diện nhỏ hơn giữa A và C,
B và D với khoảng cách 230 A o2 (Matthews, 2005)
2.2.4 Cơ chế hoạt động của enzyme β-galactosidase (EC 3.2.1.23)
Enzyme β-galactosidase xúc tác thủy phân tại vị trí galactosyl của β-D- galactopyranosides liên kết với các aglycone Điều này cho phép xác định hoạt tính bằng phương pháp so màu với các cơ chất như X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β- D-galactopyranoside) và ONPG, dưới tác dụng của β-galactosidase tạo ra aglycon có màu (Matthews, 2005) Đầu tiên, cơ chất hình thành liên kết cộng hóa trị α-D-galactosyl với nucleophile Glu537 của enzyme với sự hỗ trợ của acid, Glu461 hay Mg 2+ , đồng thời cắt liên kết glycoside Sau đó một liên kết đƣợc hình thành giữa galactosyl và enzyme, chuyển galactosyl đến một chất nhận có khả năng cho electron (hình 2.5) Kết quả phản ứng tùy thuộc vào chất nhận galactosyl Nếu chất nhận galactosyl là nước (R 2 = H) thì sản phẩm sẽ là galactose Nếu chất nhận galactosyl là saccharide (R 2 = glucose, galactose, lactose) thì xảy ra sự chuyển vị galactosyl và tổng hợp GOS (Gosling và cộng sự, 2010)
Hình 2.5 :Cơ chế hoạt động của β-galactosidase trên galactoside
Sự hình thành GOS tăng khi nồng độ lactose cao hay giảm hoạt độ nước Sản xuất GOS đạt hiệu suất từ 2% đến 32% khi nồng độ lactose ban đầu từ 14% đến 40% (w/v) Do đó, khi sử dụng β-galactosidase thủy phân lactose trong những sản phẩm có nồng độ lactose ban đầu thấp nhƣ sữa và whey thì β-galactosidase không thể hiện hoạt tính galactosyl-transferase (Valero, 2009).
Phương pháp thủy phân lactose
Có 2 phương pháp thủy phân lactose bao gồm thủy phân bằng acid và thủy phân bằng enzyme β-galactosidase (Valero, 2009)
2.3.1 Thủy phân lactose bằng acid
Phương pháp cổ điển để thủy phân lactose là phương pháp dùng acid Lactose có thể đƣợc hòa trong dung dịch acid hay với nhựa trao đổi ion Lactose đƣợc thủy phân bằng acid dưới những điều kiện rất khắc nghiệt Lactose được thủy phân 80% trong vòng 3 phút ở pH 1.2 và nhiệt độ 150 o C Mặc dù phương pháp thủy phân lactose bằng acid đƣợc tiến hành rất đơn giản nhƣng có nhiều bất lợi Một điều quan trọng nhất là protein đã bị biến tính và mất chức năng ở pH thấp và nhiệt độ cao Hơn nữa, khi dùng phương pháp này cần phải khử khoáng do sự có mặt của khoáng trong whey làm giảm hiệu quả hoạt động của acid Ngoài ra, khi thủy phân lactose trong các sản phẩm thực phẩm bằng acid còn làm mất mùi và màu Chính vì thế, phương pháp này không được chấp nhận trong các sản phẩm thực phẩm mà phải dùng phương pháp thủy phân lactose bằng enzyme β-galactosidase
2.3.2 Thủy phân lactose bằng enzyme β-galactosidase β-galactosidase đƣợc ứng dụng thủy phân lactose trong sữa, whey và tổng hợp GOS Việc lựa chọn cách thức sử dụng enzyme phụ thuộc vào bản chất của cơ chất, đặc tính của enzyme cũng nhƣ lợi ích kinh tế của từng sản phẩm Đặc tính của enzyme cần quan tâm nhất là vùng pH và nhiệt độ hoạt động tối ƣu mà điều này lại tùy thuộc vào nguồn gốc enzyme β-galactosidase Enzyme β-galactosidase từ nấm mốc có pH hoạt động acid nên thích hợp cho thủy phân lactose trong whey acid Trong khi, enzyme β-galactosidase từ nấm men và vi khuẩn có pH hoạt động ở vùng trung tính thích hợp cho việc thủy phân lactose trong sữa và whey ngọt Nhiệt độ tối ƣu cho hoạt động của β-galactosidase ở vùng chịu nhiệt hoặc chịu lạnh, để tránh nhiễm vi sinh trong quá trình thủy phân trong các sản phẩm thực phẩm mà chủ yếu là sữa Nguồn β-galactosidase chịu nhiệt từ vi sinh vật chịu nhiệt nhƣ L bulgaricus subsp bulgaricus và Thermus thermophillus còn β-galactosidase chịu lạnh đƣợc phân lập từ psychrophiles (vi khuẩn ƣa lạnh) (Simpson, 2012)
2.3.2.1 Thủy phân lactose trong sữa
Sử dụng β-galactosidase để thủy phân lactose là một ứng dụng quan trọng trong công nghệ thực phẩm nhằm góp phần hỗ trợ, thích hợp cho các đối tƣợng không dung nạp lactose β-galactosidase đã đƣợc ứng dụng từ lâu vào công nghiệp chế biến sữa gián tiếp qua các vi khuẩn lactic trong các sản phẩm yaourt và phô mai Do lactose có độ hòa tan, độ ngọt thấp hơn so với hai đường đơn glucose và galactose nên sau khi thủy phân lactose còn giúp cải thiện một số tính chất cảm quan cho sản phẩm nhƣ tăng độ ngọt, tránh đƣợc hiện tƣợng kết tinh trong sữa cô đặc, kem (Panesar và cộng sự, 2006)
2.3.2.2 Thủy phân lactose trong whey
Không chỉ trong sữa, lactose còn hiện diện trong whey Whey là một phụ phẩm trong công nghiệp sản xuất phô mai Ƣớc tính cứ 1 kg phô mai thành phẩm đƣợc sản xuất thì sẽ có 9 lít whey đƣợc thải ra và trung bình có hơn 160 triệu tấn whey trên thế giới đƣợc thảy ra mỗi năm Tuy nhiên do sự hiện diện của lactose, whey có nhu cầu oxy để xử lý sinh học ở mức cao (BOD = 30 đến 50g/lít) nên đây là nguồn gây ô nhiễm môi trường đáng quan tâm Thủy phân lactose trong whey bằng β-galactosidase vừa giải quyết vấn đề môi trường vừa giúp tăng khả năng ứng dụng của whey vào công nghiệp chế biến thực phẩm Whey sau khi đƣợc thủy phân lactose có thể dùng làm chất tạo ngọt dùng trong công nghệ sản xuất kẹo, bánh và nước uống (Panesar và cộng sự, 2010; Oliveira, 2011)
Ngoài ứng dụng thủy phân lactose, β-galactosidase còn đƣợc ứng dụng để tổng hợp GOS nhờ hoạt tính galactosyl-transferase GOS đƣợc xem là prebiotic giúp kích thích sự phát triển của các vi khuẩn đường ruột có lợi như Bifidobacteria sp hay Lactobacillus sp Ngoài ra, GOS còn có nhiều chức năng khác nhƣ tăng khả năng hấp thu khoáng ở ruột non, giảm nồng độ cholesterol trong huyết thanh, giảm áp lực máu và nhiều chức năng khác (Panesar, 2006).
Kỹ thuật tạo thấm
Tạo thấm (permeabilization) là kỹ thuật làm tăng tính thấm của màng hay vách tế bào, cho phép một số chất di chuyển tự do qua màng hay vách tế bào (hình 2.6) Bằng nhiều phương pháp khác nhau những tế bào này có thể tăng tính thấm mà không làm giảm hay phá hủy cơ quan bên trong Dựa vào nhiều yếu tố nhƣ loại tế bào, bản chất của enzyme, hiệu quả chuyển hóa sinh học, quá trình tạo thấm có thể xảy ra toàn bộ hay một phần Việc lựa chọn một phương pháp tạo thấm tùy thuộc vào thành phần vách hay màng tế bào và bản chất của phản ứng biến đổi sinh học Tính năng tạo thấm còn tùy thuộc vào nồng độ và thời gian xử lý giữa tế bào và tác nhân tăng tính thấm Khi màng tế bào đã tạo thấm nhiều lần có thể gây thất thoát protein từ tế bào Về sau, có những phương pháp tạo thấm cho phép tạo những lỗ hổng vừa đủ cho cơ chất đi vào, sản phẩm đi ra mà không cho phép enzyme và những phân tử sinh học cần thiết thoát khỏi tế bào (Sridhar, 2009)
Hình 2.6: Tế bào trước và sau khi tạo thấm (Sridhar, 2009)
Phơi khô tế bào trên giấy lọc ở nhiệt độ phòng hoặc cộng thêm muối
Sốc nhiệt làm ly giải thành phần màng tế bào nhƣ protein và phospholipid
Sử dụng dòng điện đƣợc ứng dụng rộng rãi hơn
Dùng một dung môi hay phối hợp hai dung môi ở những nồng độ khác nhau Jackson và Demoss (1965) đã tạo thấm tế bào E coli đang sinh trưởng với toluene đã giải phóng 85% RNA và 25% protein Ngoài ra, một số dung môi nhƣ ether, dimethyl sulfoxide và acetone làm tăng hoạt tính enzyme nội bào ở nhiều sinh vật khác nhau Ethanol đƣợc dùng để tạo thấm tế bào Kluyveromyces sp có nhiều thuận lợi cho việc ứng dụng trong công nghệ thực phẩm (Flores và cộng sự, 1994) Những tế bào tái tổ hợp Pichia pastoris biểu hiện một số enzyme chọn lọc đƣợc tạo thấm bởi isopropanol
Chất tẩy có thể phục hồi hoặc không hiện tƣợng tạo thấm của tế bào Lysolecithin phục hồi đƣợc tính thấm của những tế bào động vật Các chất tẩy nhƣ Triton X-100, sodium dodecyl sulphate, sodium deoxycholate, Oxgall, Brij-85 và chất hoạt động bề mặt Pluronic F-68 có hiệu quả trong việc tăng tính thấm Cetyltrimethylam-monium bromide đƣợc ứng dụng rộng rãi để tăng tính thấm của
E.coli, K fragilis, Saccharomyces cerevisiae và Zymononas mobilis có enzyme nội bào Digitonin cũng đƣợc dùng để tăng tính thấm ở nấm men Nhiều yếu tố nhƣ nhiệt độ và thời gian xử lý ảnh hưởng đến tính thấm tế bào nấm men Ngoài ra, tính thấm qua màng tế bào còn phụ thuộc vào nồng độ chất tẩy cũng nhƣ tỉ lệ giữa chất tẩy và tế bào Vì vậy, tạo tính thấm tối ƣu qua màng tế bào để thu đƣợc hoạt tính enzyme cao nhất tùy thuộc vào loại tế bào và phản ứng chuyển hóa sinh học dưới điều kiện khảo sát
Trong nhiều dung môi đƣợc thử nghiệm để tăng tính thấm qua màng tế bào ở nấm men thì chloroform, ethanol, hỗn hợp chloroform và ethanol hoặc hỗn hợp ethanol và toluene có hiệu quả cao hơn Gần đây, kỹ thuật này đƣợc ứng dụng ở K lactis đƣợc dùng để tổng hợp lactulose từ lactose và fructose (Lee và cộng sự,
2004) Khi sử dụng ethanol nồng độ 30-55% ở S thermophilus và L delbrueckii subsp.bulgaricus làm cho 100% tế bào không còn sống và tăng hoạt tính β-D- galactosidase lên 15 lần so với mẫu đối chứng Có nhiều tác nhân đã đƣợc sử dụng để tăng tính thấm ở Kluyveromyces sp và Lactobacillus sp (bảng 2.2)
Bảng 2.2: Các tác nhân tăng tạo thấm ở Kluyveromyces sp và Lactobacillus sp
Vi sinh vật Tác nhân tạo thấm Nguồn tham khảo
K bulgaricus Propanol, isopropanol, n- butanol, tert-butanol,ethanol, acetone, dimethylsulfoxide
Joshi MS và cộng sự, 1987
K fragilis Digitonin Gowda LR và cộng sự, 1988
K lactis Chloroform/ethanol Champluvier B và cộng sự,
K fragilis Digitonin Joshi MS và cộng sự, 1989
K fragilis Freeze–thawing, solvent, protease treatment, salting out, isoamyl alcohol
K.lactis Digitonin, isopropanol, ethanol, tert-butanol, ethanol:toluene, chloroform
Siso MIG và cộng sự, 1992
K fragilis Ethanol Gonzalez-Siso MI và Suarez-
S thermophilus Ethanol Somkuti GA và cộng sự, 1998
L delbrueckii Ethanol Somkuti GA và cộng sự, 1998
K lactis Ethanol Becerra M và cộng sự, 2001
K marxianus Ethanol, propanol, isopropanol, n-butanol, dimethylsulfoxide, toluene, acetone, chloroform, CTAB, digitonin
L acidophilus là nguồn quan trọng sinh tổng hợp β-galactosidase để sản xuất sữa nghèo lactose Tuy nhiên, enzyme β-galactosidase từ nguồn này là enzyme nội bào gây khó khăn trong quá trình ứng dụng, việc trích ly khó khăn và tốn kém Chính vì lẽ đó kỹ thuật tạo thấm không những giải quyết những vấn đề trên mà còn duy trì môi trường nội bào ổn định cho sự hoạt động của enzyme β-galactosidase Kumari và cộng sự (2011), đã nghiên cứu tạo thấm cho tế bào nấm men K marxianus NCIM 3465 với các dung môi n-butanol, n-propanol, iso-propanol, toluene, aceton và ethanol với nồng độ từ 10 đến 70% (v/v) Trong các loại dung môi này, hoạt tính β-galactosidase cao nhất khi tạo thấm bằng ethanol với nồng độ 50% Khi phối hợp toluene 25% (v/v) với ethanol 50% (v/v) với tỷ lệ 1:1 hoạt tính β-galactosidase tăng 9% so với chỉ dùng ethanol 50% Tuy nhiên, toluene là một dung môi độc, không đƣợc dùng trong thực phẩm Khi sử dụng ethanol để tạo thấm cho tế bào L acidophilus vừa hiệu quả, dễ bay hơi, không độc hại, chi phí thấp mà còn là thành phần trong một số thức uống lên men (Panesar và cộng sự, 2007; Kumari và cộng sự, 2011)
Nhận biết hiện tượng tạo thấm
Khi tăng tính thấm qua màng tế bào sẽ làm giải phóng những thành phần có phân tử lƣợng nhỏ chủ yếu là những nucleotide hoặc các yếu tố đƣợc đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ, những chất này vào tế bào qua bơm Na + -K + Sự giải phóng những enzyme ở dịch bào nhƣ lactate dehydrogenase là một dấu hiệu dễ nhận biết có hiện tƣợng tăng tính thấm qua màng tế bào Cho ethidium bromide đi vào tế bào sẽ kết hợp với DNA tạo phức hợp phát huỳnh quang Hiện tƣợng tăng tính thấm qua màng đƣợc xác định qua hoạt tính của một số enzyme nội bào nhƣ β-galactosidase, alcohol dehydrogenase, phenylalanine ammonia lyase và catalase (Sridhar, 2009).
Kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật
Cố định tế bào có nghĩa là các tế bào về mặt vật lý đƣợc giữ lại hay định vị lại trong một không gian nhất định sao cho các tế bào đó giữ đƣợc các tính chất xúc tác sinh học của chúng, hoặc nếu có thể, thậm chí là bắt buộc giữ đƣợc khả năng sống của chúng và các tế bào đó có thể đƣợc sử dụng lại, liên tục Nhƣ vậy, việc cố định tế bào vi sinh vật có thể là cố định tế bào đã chết hay còn sống (Yang, 2007)
2.5.2 Các phương pháp cố định tế bào vi sinh vật
Các phương pháp cố định tế bào có thể được chia thành bốn nhóm:
Cố định tế bào trên bề mặt chất mang rắn
Nhốt tế bào trong khung mạng xốp
Nhốt tế bào bằng phương pháp cơ học bên trong một màng chắn
Hình 2.7: Các kỹ thuật cơ bản cố định tế bào (Kourkoutas và cộng sự, 2004)
Hình 2.8: Các dạng xử lý và cố định tế bào (Tampion, 1987)
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Vật liệu và hóa chất
L acidophilus được cung cấp từ bộ sưu tập giống của Bộ môn công nghệ Sinh học, Trường Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh, L acidophilus được giữ trong môi trường MRS agar, bảo quản ở 4 o C
Môi trường MRS dịch thể (MT1)
Cho 20ml MT1 vào chai thủy tinh để hoạt hóa giống
Lấy 100ml MT1 vào erlen 250ml để nhân giống
Hấp tiệt trùng ở 121 o C trong 15 phút
Môi trường MRS agar (MT 2)
Là môi trường MRS dịch thể có bổ sung thêm agar 20 (g/l) để giữ giống
Môi trường lên men cảm ứng β-galactosidase (MT3)
Cho 100ml MT3 vào erlen 250ml
Hấp tiệt trùng ở 121 o C trong 15 phút
Sodium alginate: Chế phẩm dạng bột rắn do công ty Kanto (Nhật Bản) sản xuất, dung dịch alginate 1% ở 20 o C có độ nhớt 350cP
ONPG: dạng bột rắn, màu trắng, do công ty Merck (Đức) sản xuất
Ortho-nitrophenyl (ONP): dạng bột rắn màu vàng, do công ty Merck (Đức) sản xuất
Lysozyme: Chế phẩm dạng bột rắn màu trắng, do công ty Sigma sản xuất, có hoạt tính riêng lớn hơn 40000 U/mg protein, pH hoạt động từ 6.0 đến 9.2, pH tối ƣu 6.2
Methylamine-HCl: dạng bột rắn màu trắng, do công ty Merck (Đức) sản xuất
Lactose: Chế phẩm dạng bột rắn màu trắng, do công ty Merck (Đức) sản xuất, khả năng hòa tan trong nước ở 20 o C là 161 g/l
Sữa bò tươi mua ở trại sữa 44/5 Phạm Văn Chiêu, Phường 9, Quận Gò Vấp Sữa có hàm lƣợng lactose 4.2%(w/v) đƣợc hấp tiệt trùng ở 121 o C trong 15 phút, bảo quản mẫu sữa ở 4 o C
3.1.5 Thiết bị và dụng cụ
Kính hiển vi Olympus CX41
Máy đo quang phổ hấp thu UV – Vis Thermo Spectronic
Tủ cấy, tủ ấm, tủ sấy
Erlen, becher, đĩa petri, ống nghiệm, bình định mức, pipetman, pipette, buồng đếm hồng cầu.
Sơ đồ nghiên cứu
Hình 3.1: Sơ đồ nội dung nghiên cứu
Nồng độ ethanol Nhiệt độ
Khảo sát nồng độ alginate Thời gian
Khảo sát tỷ lệ hàm lƣợng tế bào khô /alginate
Lƣợng chế phẩm/thể tích sữa Thời gian thủy phân pH Nguồn nitrogen Nguồn khoáng Thời gian lên men
1 Lên men thu nhận tế bào
2 Xác định vị trí β-galactosidase
3 Khảo sát tính năng tạo thấm cho tế bào L acidophilus
4 Cố định L acidophilus chứa β-galactosidase trong alginate
6 Ứng dụng thủy phân lactose trong sữa
Khả năng tái sử dụng
Bố trí thí nghiệm
3.3.1 Lên men thu nhận tế bào L acidophilus giàu β-galactosidase
Dùng que cấy lấy một ít sinh khối từ ống thạch nghiêng vào chai thủy tinh chứa 20ml MT1, lắc 100 vòng/phút trong 20 giờ ở nhiệt độ phòng để hoạt hóa giống Dùng pipetman chuyển 1ml giống đã đƣợc hoạt hóa vào erlen chứa 100ml MT1 lắc 100 vòng/phút ở nhiệt độ phòng để nhân giống Sau 18 giờ nhân giống tế bào L acidophilus nằm cuối pha log, chuyển 1% (v/v) giống sang MT3, lắc 100 vòng/phút trong 35 giờ để lên men sinh tổng hợp β-galactosidase
3.3.1.1 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitrogen
Bổ sung hàm lƣợng cao thịt từ 0.5 đến 2.0% (w/v) vào MT3 Nhƣ vậy, nguồn nitrogen trong môi trường lên men gồm cao nấm men và cao thịt với tỷ lệ phần trăm là 6:0.5, 6:1.0, 6:1.5 và 6:2.0 và đối chứng không bổ sung cao thịt
Sau 35 giờ lên men thu canh trường (CT), xác định mật độ tế bào và hoạt tính enzyme β-galactosidase có trong tế bào
Chọn tỷ lệ phần trăm cao nấm men và cao thịt bổ sung vào MT3 thu sinh khối có hoạt tính β-galactosidase cao nhất
3.3.1.2 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của khoáng chất
Bổ sung vào môi trường MT3 nồng độ khoáng NaCl và MgSO 4 7H 2 O từ 0 đến 10mM
Sau 35 giờ lên men thu CT, xác định mật độ tế bào và thu nhận tế bào xác định hoạt tính β-galactosidase
Chọn hàm lƣợng khoáng bổ sung vào MT3 thu sinh khối có hoạt tính β- galactosidase cao nhất
3.3.1.3 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men
Khảo sát thời gian lên men đến 60 giờ, sau 10 giờ lấy CT đo mật độ tế bào và hoạt tính β-galactosidase có trong tế bào
Chọn thời gian lên men thu tế bào có hoạt tính β-galactosidase cao nhất
3.3.2 Khảo sát tính năng tạo thấm cho tế bào L acidophilus
3.3.2.1 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ ethanol
Sinh khối tế bào đƣợc trộn đều với các nồng độ ethanol 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60% và đệm sodium phosphate pH 6.8 (mẫu đối chứng) giữ ở 30 o C trong 20 phút Chọn nồng độ ethanol tạo thấm cho tế bào tốt nhất, thể hiện qua hoạt tính β- galactosidase cao nhất
3.3.2.2 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý ethanol
Sinh khối tế bào đƣợc trộn đều với ethanol có nồng độ đã tối ƣu, giữ ở nhiệt độ
30 o C, 35 o C, 40 o C, 45 o C, 50 o C, 55 o C và 60 o C trong thời gian 20 phút
Chọn nhiệt độ cho tế bào có hoạt tính β-galactosidase cao nhất
3.3.2.3 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian xử lý ethanol
Sau khi có nồng độ ethanol và nhiệt độ phù hợp khảo sát thời gian xử lý trong các khoảng thời gian 5, 10, 15, 20 và 25 phút
3.3.3 Cố định tế bào L acidophilus đã tạo thấm trong gel alginate
Alginate được hòa tan trong nước muối NaCl 0.85%
Cho tế bào L acidophilus đã đƣợc tạo thấm
Khuấy trộn hỗn hợp trong 1giờ bằng máy khuấy từ để hỗn hợp đạt đƣợc độ đồng nhất
Hút hỗn hợp bằng pipet 10ml và nhỏ từng giọt vào dung dịch CaCl 2 0.075M, khoảng cách từ đầu ống thoát pipet đến bề mặt dung dịch CaCl 2 là 10cm
Để yên 30 phút cho hạt gel cứng hoàn toàn Tách và rửa hạt gel bằng dung dịch NaCl 0.85%
Xác định hoạt tính β-galactosidase của tế bào đã cố định trong gel alginate
3.3.3.1 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ gel alginate
Lấy 3ml CT ly tâm thu đƣợc 4.53 mg tế bào khô đƣợc hòa thành 10ml alginate với các nồng độ lần lƣợt thay đổi là 1.5, 2.0, 2.5 và 3% (w/v)
3.3.3.2 Thí nghiệm khảo sát tỷ lệ lượng tế bào khô/gel alginate
Sau khi có nồng độ gel alginate phù hợp, khảo sát hàm lƣợng tế bào khô thay đổi 4.53, 9.06, 13.59 và 18.12mg (tương đương với 3, 6, 9 và 12ml CT ) hòa thành 10ml gel alginate
3.3.4.1 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ
Hoạt tính β-galactosidase trong chế phẩm đƣợc đo ở các nhiệt độ 35, 40, 45,
50, 55 và 60 o C Xác định nhiệt độ phù hợp
3.3.4.2 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của pH
Hoạt tính β-galactosidase trong chế phẩm đƣợc đo ở nhiệt độ tối ƣu với các pH thay đổi 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5 và 7.0 để chọn pH thích hợp
3.3.5 Ứng dụng thủy phân lactose trong sữa tươi
3.3.5.1 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ chế phẩm
Một lƣợng chế phẩm có hoạt tính β-galactosidase từ 0.054 đến 0.27g (khối lƣợng khô) đƣợc dùng để thủy phân lactose trong 10ml sữa trong thời gian 2 giờ ở nhiệt độ tối ƣu của chế phẩm
Chọn tỷ lệ chế phẩm có hiệu suất thủy phân lactose trong sữa cao nhất
3.3.5.2 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian thủy phân
Với tỷ lệ chế phẩm đã chọn, tiếp tục khảo sát thời gian thủy phân từ 1 đến 4 giờ để xác định thời gian thủy phân phù hợp
3.3.5.3 Khả năng tái sử dụng chế phẩm
Sau mỗi lần sử dụng chế phẩm để thủy phân lactose trong sữa, tách ra và rửa sạch bằng dung dịch NaCl 0.85% và tái sử dụng cho lần thủy phân tiếp theo.
KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
Lên men thu nhận tế bào giàu β-galactosidase
Trong một số nghiên cứu trước, từ các giống Lactobacillus sp được lấy từ bộ sưu tập giống thuộc Bộ môn công nghệ Sinh học Trường Đại Học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh đã chọn đƣợc L acidophilus có hoạt tính β-galactosidase cao nhất Sau 20 giờ hoạt hóa giống từ môi trường thạch nghiêng vào 20ml MT1, dựng đường cong tăng trưởng trong MT1 Sau 18 giờ lên men, tế bào phát triển ở cuối pha log Thu nhận tế bào ở giai đoạn này và chuyển 1% giống (v/v) sang MT3 để lên men thu nhận tế bào giàu hoạt tính β-galactosidase
Khi khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon như glucose, galactose, lactose và maltose bổ sung vào môi trường lên men L acidophilus thì galactose và lactose có ảnh hưởng nhiều đến khả năng sinh tổng hợp enzyme β-galactosidase Tuy nhiên, lactose tăng hiệu quả sinh tổng hợp enzyme β-galactosidase cao hơn 77% so với galactose Chính vì thế, lactose đƣợc chọn làm nguồn cacbon bổ sung vào môi trường lên men thu nhận tế bào giàu hoạt tính β-galactosidase
Trong các nguồn nitrogen bổ sung vào môi trường lên men L acidophilus, theo thứ tự khả năng sinh tổng hợp enzyme β-galactosidase khi nguồn các nitrogen nhƣ sau: cao nấm men > cao thịt > pepton > ammonium sulphate Tuy nhiên, cao nấm men chỉ tăng khả năng sinh tổng hợp enzyme β-galactosidase 16% so với cao thịt Do đó, để tăng sinh tổng hợp enzyme β-galactosidase trong tế bào, chúng tôi tiến hành phối hợp hai nguồn nitrogen là cao nấm men và cao thịt
Trong những nguồn khoáng bổ sung vào môi trường lên men L acidophilus, các Na + , Mn 2+ , Mg 2+ tác động tích cực đến khả năng sinh tổng hợp enzyme β- galactosidase, ngƣợc lại Fe 2+ kìm hãm Khi tăng nồng độ của khoáng Mn 2+ lớn hơn 1mM sẽ khó hòa tan hoàn toàn khoáng này trong môi trường lên men (Ibrahim và cộng sự, 2010) Cho nên, trong các ion kim loại tác động tích cực chúng tôi chỉ khảo sát tiếp ảnh hưởng của nồng độ Na + và Mg 2+ Đối với từng loài vi sinh vật cụ thể và tỷ lệ giống nhất định, thời gian lên men phụ thuộc vào thành phần môi trường lên men Vì vậy, khi thay đổi thành phần môi trường lên men cần khảo sát thời gian lên men
Tóm lại, nhằm gia tăng khả năng sinh tổng hợp enzyme β-galactosidase của L acidophilus và ổn định môi trường lên men, chúng tôi sẽ khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ phần trăm cao nấm men và cao thịt, nồng độ khoáng Na + và Mg 2+ và thời gian lên men
4.1.1 Ảnh hưởng của nguồn nitrogen đến quá trình lên men thu tế bào giàu β- galactosidase
Kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ phần trăm cao nấm men và cao thịt trong môi trường lên men thể hiện qua hình 4.1 và phụ lục 3.1
Hình 4.1: Ảnh hưởng của tỷ lệ phần trăm cao nấm men:cao thịt trong môi trường lên men đến mật độ tế bào và hoạt tính β-galactosidase
Khi trong môi trường lên men, nguồn nitrogen được phối hợp theo tỷ lệ phần trăm cao nấm men và cao thịt là 6:0.5 và 6:1.0, có sự gia tăng mật độ tế bào và hoạt tính β-galactosidase Tuy nhiên, khi tiếp tục thay đổi tỷ lệ phần trăm cao nấm men và cao thịt là 6:1.5 và 6:2.0 thì mật độ tế bào và hoạt tính β-galactosidase không thay đổi đáng kể Như vậy, khi bổ sung vào môi trường lên men với một tỷ lệ cao nấm men và cao thịt nhất định sẽ có tác động gia tăng sự sinh trưởng tế bào và sinh tổng hợp β-galactosidase Mật độ tế bào và hoạt tính β-galactosidase đạt cực đại với
OD Hoạt tính β-galactosidase (U/ml.CT)
OD Hoạt tính β-galactosidase (I/ml.CT)
Cao nấm men:Caothịt (%) tỷ lệ phần trăm cao nấm men và cao thịt là 6:1.0 (OD=2.325 và 0.602U/ml.CT), hoạt tính β-galactosidase tăng 36% so với mẫu đối chứng Đối với hầu hết các vi sinh vật, nguồn nitrogen đƣợc hấp thu và chuyển hóa để tạo thành acid amino, acid nucleic, protein và thành phần trong vách tế bào Ngoài ra, nguồn nitrogen còn có vai trò quan trọng cho quá trình sinh tổng hợp β- galactosidase (Kader và cộng sự, 2012) Trong số các nguồn nitrogen, cao nấm men thường giúp cho quá trình sinh trưởng của vi khuẩn cũng như sinh tổng hợp β- galactosidase có hoạt tính cao hơn các nguồn nitrogen khác (Jokar và cộng sự, 2009; Alazzeh và cộng sự, 2009) Cao nấm men là nguồn cung cấp các peptide, acid amino, khoáng và vitamin nhóm B (Kavanagh, 2011) Khi lên men Bacillus subtilis trong môi trường có nguồn nitrogen là cao nấm men cho hoạt tính β-galactosidase (0.25 U/ml.CT) cao hơn các nguồn nitrogen khác (Natarajan và cộng sự, 2012) Theo Chakraborti và cộng sự (2003) trong các nguồn nitrogen bổ sung vào môi trường lên men thì cao thịt cho hoạt tính β-galactosidase cao nhất Do đó, nguồn nitrogen từ cao nấm men và cao thịt có vai trò quan trọng đối với sự sinh trưởng và sinh tổng hợp β-galactosidase ở L acidophilus
Nhƣ vậy, việc phối hợp các nguồn nitrogen phù hợp có tác dụng gia tăng sinh tổng hợp β-galactosidase Kết luận này tương tự kết quả nghiên cứu của Pavani và cộng sự (2011) khi khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitrogen đến khả năng sinh tổng hợp β-galactosidase từ Aspergillus flavus, nhận thấy nguồn nitrogen từ soya peptone cho hoạt tính cao nhất tiếp đó là cao nấm men Khi tác giả này kết hợp hai nguồn nitrogen soya peptone và cao nấm men thì hoạt tính cao hơn từng nguồn nitrogen riêng lẻ
4.1.2 Ảnh hưởng của thành phần chất khoáng đến quá trình lên men thu tế bào giàu β-galactosidase
Kết quả ảnh hưởng của nồng độ MgSO 4 7H 2 O và NaCl từ 2 đến 10mM bổ sung vào môi trường lên men đến mật độ tế và hoạt tính β-galactosidase thể hiện ở bảng 4.1
Bảng 4.1: Ảnh hưởng của khoáng trong môi trường lên men đến mật độ tế bào và hoạt tính β-galactosidase
Hoạt tính β-galactosidase (U/ml.CT)
Hoạt tính β-galactosidase (U/ml.CT)
Các giá trị trong bảng biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn của 3 mẫu độc lập Các giá trị trong cùng một cột kí hiệu khác nhau biểu thị sự khác nhau có nghĩa (P