Luận văn thạc sĩ Công nghệ thực phẩm: Nghiên cứu sản xuất chất chiết nấm men giàu 5''-Guanosine Monophosphate từ bã nấm men bia

Tiến hành sản xuất thử sản phẩm chất chiết nấm men bằng phương pháp thủy phân bởi enzyme với các điều kiện thích hợp thu được từ các nghiên cứu trên và xác... Chất chiết nấm men được ứng

TỔNG QUAN

Tổng quan về chất chiết nấm men

Theo Food Chemical Codex, "yeast extract" là sản phẩm chứa các thành phần hòa tan của nấm men Thành phần này chủ yếu gồm axit amin, đoạn peptide, carbohydrate và muối Quá trình thủy phân các chuỗi peptide diễn ra nhờ các enzyme của chính tế bào nấm men hoặc các enzyme thực phẩm bổ sung.

Hình 1.1: Chất chiết nấm men dạng bột (Yeast extract)

Chiết xuất nấm men là sản phẩm thu được sau khi phá vỡ tế bào nấm men, phổ biến trong công nghệ thực phẩm với vai trò là phụ gia thực phẩm hoặc gia vị Nó xuất hiện đa dạng trong súp, nước chấm, đồ ăn nhẹ và thực phẩm đóng hộp Trong lĩnh vực vi sinh, chiết xuất nấm men được dùng làm thành phần dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật.

Youk và Ingram (1996), một số thành phần vitamin có trong chất chiết nấm men sẽ có tác dụng tốt cho sức khỏe của con người và là một thành phần có trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật [11] Đã có nhiều nghiên cứu về quá trình sản xuất chất chiết nấm men (Breddam và Beenfeld, 1991; Roman và cộng sự, 1991; Choi và Chung, 1998) [11] Hiện tại, có khá nhiều phương pháp sản xuất chất chiết từ tế bào nấm men, tuy nhiên, xét về bản chất thì đó là sự ứng dụng hai quá trình chính: tự phân (autolysis) và thủy phân (hydrolysis)

Chất chiết nấm men đã được sản xuất đại trà và được thương mại hóa với ba dạng sản phẩm: dạng lỏng, dạng paste và dạng bột (Nagodavwithana, 1992;

Sommer, 1998; Joseph, 1999) [35] Vì có nhiều ưu điểm hơn trong việc vận chuyển và bảo quản, sản phẩm chất chiết nấm men dạng bột vẫn được sử dụng phổ biến hơn

Chất chiết nấm men được xem như là một thành phần tự nhiên có khả năng tạo vị Theo quy định của luật thực phẩm châu Âu (European Food Law), chất chiết nấm men sẽ phải được ghi nhãn là “yeast extract” hoặc “natural flavour” mà không phải kèm theo danh sách thành phần các chất có trong sản phẩm

Chất chiết nấm men có hai hướng ứng dụng chính:

Trong sản xuất thực phẩm

Trong công nghệ thực phẩm, chất chiết nấm men được sử dụng rộng rãi với hai mục đích chính: tăng cảm giác mùi vị cho sản phẩm và góp phần nâng cao giá trị dinh dưỡng của sản phẩm thực phẩm (Moresi và cộng sự, 1995) [10]

Chất chiết nấm men được sử dụng với mục đích chính là tạo ra hương vị thơm ngon và cho cảm nhận vị umami Umami – thường được gọi là vị ngọt thịt – là một trong 5 vị cơ bản cùng với vị ngọt, chua, đắng và mặn (thuật ngữ “umami” chính thức được công nhận tại hội thảo khoa học quốc tế về vị umami, 1985)

Umami là vị của acid amin L-glutamate và 5’- ribonucleotide như guanosine monophosphate (GMP) và inosine monophosphate (IMP) Tác dụng cơ bản của umami là khả năng tạo vị hài hòa cũng như làm “tròn vị” cho món ăn Thông thường, người ta thường sử dụng monosodium glutamate (MSG) để tạo vị umami

Trong chất chiết nấm men, thành phần acid glutamic tự do rất nhiều và hiện nay, nó được xem như là một thành phần thay thế cho bột ngọt (với thành phần chính là monosodium glutamate) trong sản xuất thực phẩm

Nghiên cứu của Kunikawa (1960) đã chứng minh 5’-GMP có khả năng kích thích vị giác Do nấm men có chứa rất nhiều RNA, mà bản thân RNA lại rất giàu 5’- GMP nên đây chính là điều kiện thuận lợi để nghiên cứu sản xuất chất chiết nấm men giàu 5’- GMP ứng dụng trong công nghệ thực phẩm

Chất chiết nấm men được ứng dụng ngày càng nhiều trong công nghiệp thực phẩm:

Trong sản xuất thực phẩm chay, chất chiết xuất từ nấm men đóng vai trò là thành phần tự nhiên mang vị ngọt đặc trưng "umami", ứng dụng trong công nghệ sản xuất thực phẩm chay Thêm vào đó, hàm lượng lớn các acid amin, peptide và protein trong chất này cung cấp nguồn dinh dưỡng cần thiết cho người sử dụng thực phẩm chay.

- Trong sản xuất các loại thực phẩm như súp (soup), các loại nước chấm (sauces), các món ăn từ thịt, các dạng snack và những thức ăn được chế biến sẵn (Berry, 1982; Peppler, 1982; Erten và Tanguler, 2006) [37] [41]

Trong kỹ thuật nuôi cấy vi sinh vật

Nguồn dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật Trong đó, nguồn cacbon đảm bảo sự tổng hợp một số các hợp chất hữu cơ và nguồn nitơ chịu trách nhiệm chính cho việc tổng hợp các acid nucleic là hai thành phần được xem là quan trọng nhất Bên cạnh đó, một số các thành phần khác như phospho, sulfur và các hợp chất vi lượng như khoáng và vitamin có liên quan đến những cofactor quan trọng để thực hiện những phản ứng chuyển hóa sinh học

Chất chiết nấm men được xem như là một tác nhân tích cực cho sự phát triển và sinh trưởng của nấm men trong suốt quá trình lên men, kích thích tốc độ lên men và sự sinh tổng hợp các sản phẩm của quá trình lên men (Thomas và Ingledew, 1990; Jones và cộng sự, 1994; Bafrncova và cộng sự, 1999) [35] [44]

Thành phần của chất chiết nấm men chứa hàm lượng protein, acid amin, lipid, vitamin và khoáng chất thiết yếu cho sự phát triển của nấm men, tạo nên các hợp chất quan trọng hỗ trợ quá trình sinh trưởng và phát triển toàn diện.

Tổng quan về nấm men

1.2.1 Cấu trúc tế bào nấm men

Nấm men Saccharomyces cerevisiae có cơ thể đơn bào Chúng phân bố rộng rãi khắp nơi Đặc biệt thấy chúng có mặt nhiều ở đất trồng nho và các nơi trồng hoa quả Ngoài ra thấy chúng có mặt trên trái cây chín, trong không khí, trong nhụy hoa và cả nơi sản xuất rượu vang [2] [5]

Hình 1.2: Tế bào nấm men S cerevisiae trong giai đoạn sinh sản bằng phương pháp tạo chồi

Saccaromyces có khoảng 40 loài (Van Der Walt, 1970) Trong đó,

Saccharomyces cerevisiae là loài được sử dụng phổ biến trong thực phẩm, đặc biệt là trong công nghệ lên men Saccharomyces cerevisiae có hình elip, kích thước đường kớnh tế bào lớn khoảng 5 – 10àm, nhỏ khoảng từ 1 – 7àm Tế bào nấm men thường có kích thước lớn gấp 5 – 10 lần tế bào vi khuẩn Kích thước của tế bào nấm men thay đổi theo điều kiện nuụi cấy, theo tuổi sinh lý Thể tớch của tế bào là 29àm 3 cho một tế bào đơn bội, và 55àm 3 cho một tế bào lưỡng bội Nấm men thể hiện hầu hết các cấu trúc và chức năng của tế bào nhân chuẩn, và được sử dụng như là một mô hình chung cho các tế bào nhân chuẩn sinh học Trong thành phần của nấm men, nhóm cao phân tử gồm protein, glucoprotein, polysaccharide, polyphosphate, lipid, nucleic acid [24]

Bảng 1.1: Bảng phân loại các thành phần trong nấm men [25]

Nhóm cao phân tử Loại Thành phần chính

Protein Cấu trúc actin, tubulin (bộ khung tế bào) histones (H2A,

Glycoprotein Thành tế bào mannoprotein

Enzyme Enzyme chức năng (Invertase)

Polysaccharide Thành tế bào glucan, mannan, chitin

Polyphosphate Dự trữ Polyphosphate trong không bào

Nấm men là sinh vật đơn bào hiển vi, tế bào cơ bản giống như động vật, thực vật So sánh cấu tạo tế bào nấm men với vi khuẩn ta thấy có sự tiến hóa nhảy vọt từ nhân sơ đến nhân chuẩn Cùng với sự tiến hóa về nhân và cơ chế phân chia nhân (nhân có màng, có các thể nhiễm sắc, …), ở tế bào nhân chuẩn xuất hiện nhiều thể không thấy ở nhân sơ, như ti thể, lục lạp, …

Tế bào nấm men cũng như nhiều loại tế bào khác, được cấu tạo chủ yếu từ các thành phần cơ bản như sau: thành tế bào, màng nguyên sinh chất, nhân, các cơ quan con khác

Hình 1.3: Sơ đồ của tế bào và các cơ quan của nấm men

Lipid Cấu trúc Sterol tự do trong màng tế bào

Dự trữ Hạt lipid (sterol ester và triglyceride) Chức năng Dẫn xuất phosphoglyceride, acid béo tự do Nucleic acid DNA Hệ gen học DNA (80%); ty thể (10-20%)

RNA rRNA (80%); mRNA (5% cytosol, ER, mitochondria), tRNAs, snRNAs

Thành tế bào nấm men có độ dày 100 – 200nm, chiếm khoảng 15 – 25% khối lượng tế bào Thành phần chính của thành tế bào nấm men là chitin, glucan và mannan Chức năng chính của thành tế bào nấm men là bảo vệ tế bào khỏi các tác nhân bên ngoài, duy trì hình dạng tế bào, hỗ trợ thẩm thấu chất dinh dưỡng và thải chất thải.

Thành tế bào nấm men được cấu tạo từ nhiều thành phần khác nhau Trong đó, đáng kể nhất là: glucan, manan, protein, lipid và một số thành phần nhỏ khác như kitin Thành phần chính là polysaccharide (80 – 90%) chủ yếu là glucan và mannan, còn lại là protein, lipid và glucosemin Trên có nhiều lỗ để hấp thu các chất dinh dưỡng và các sản phẩm trao đổi chất thải ra [2] [22]

Manan : là hợp chất cao phân tử của D-manose, mỗi phân tử manan thường chứa từ 200÷400 thành phần manose Thường manan liên kết với protein theo tỷ lệ 2:1 Manan thường có mối liên kết α-1,6 ; α-1,2 ; β-1,3, phân tử lượng của chúng khoảng 5.10 4 KDa

Glucan: là hợp chất cao phân tử của D-glucose Đó là một polysaccharide phân nhánh có liên kết β-1,6 và β-1,3 Cả hai thành phần này phân bố đều trên thành tế bào

Protein: thường được liên kết với các thành phần khác, ví dụ như manan

Trong thành phần của chúng chứa nhiều acid amine khác nhau, như glycine, alanine, tyrosine, leucine, isoleucine, asparagine, glutamine, phenylalanine, và một lượng nhỏ serine, histidine, tryptophan Phức hợp protein-manan rất bền vững do đó tế bào nấm men rất khó bị phá vỡ Thường thì các polysaccharide nằm phía ngoài và protein nằm phía trong gần bào tương

Kitin: thường nằm ở phần nảy chồi Chúng chiếm một số lượng rất nhỏ, khoảng 3% Đây là chất rất bền vững, không bị enzyme phân hủy, vì vậy chúng có tác dụng bảo vệ chồi trong khi chồi còn non Khi tế bào con phát triển, tách khỏi tế bào mẹ, nơi tạo ra tế bào con này sẽ tạo ra vết sẹo và không bao giờ ở vị trí này tạo ra một chồi mới

Thực ra, thành tế bào gồm 3 lớp: lớp ngoài là màng nhẵn dày 10 đến 30nm gồm chủ yếu là lypoprotein, lớp tiếp theo chứa phức hợp mannan protein dày 100nm, lớp trong cùng có thể là chất keo hoặc sợi li ti dày từ 10 đến 250nm, cấu tạo từ những gốc glucan gồm 94% glucose và khoảng 6% hexoamin

Ngoài ra, còn thấy trong thành tế bào nấm men có lipid ở dạng phospholipid, chúng chiếm khoảng 1÷10% Ở thành tế bào, người ta phát hiện có hai vùng có tính thẩm thấu có chọn lọc đối với các chất khác nhau Vỏ này chứa các lỗ có đường kính đến 3,6nm, qua đó nước và các chất dinh dưỡng cần thiết cho tế bào được đi vào bên trong

Các enzyme được tách ra từ tế bào tập trung ở các lớp này, chúng thủy phân các đường có phân tử lớn như maltose, saccarose…không có khả năng thẩm thấu vào bên trong tế bào Nhờ đó, các đường maltose, saccarose…được đồng hóa ở bên trong tế bào

Màng tế bào chất, với độ dày chỉ 0,1 nm, bao bọc tế bào chất và có cấu tạo phức tạp từ protein, phospholipid và enzyme permease Khi tế bào còn non, màng tế bào chất bám sát thành tế bào, giúp nấm men trao đổi chất mạnh mẽ Tuy nhiên, khi tế bào già đi, màng tế bào chất co lại, tạo khoảng trống giữa thành tế bào và chất nguyên sinh, cản trở quá trình trao đổi chất của nấm men.

Màng nguyên sinh chất có 4 chức năng cơ bản: tác dụng như rào chắn thẩm thấu, điều chỉnh chất dinh dưỡng từ môi trường vào trong tế bào và ngược lại cho các sản phẩm trao đổi chất ra ngoài tế bào, thực hiện sinh tổng hợp một số hợp phần của tế bào (các cấu tử của vỏ tế bào), nơi khu trú một số enzyme và cơ quan của tế bào (như ribosome) Vận chuyển chất qua màng liên quan đến tính thẩm thấu của màng Đặc tính này trước hết phụ thuộc vào các enzyme phospholipase và lipase

Phương pháp phá vỡ tế bào

Trong công nghệ sản xuất chất chiết nấm men, quá trình phá vỡ tế bào được xem như là một trong những quá trình quan trọng nhất và ảnh hưởng khá lớn đến hiệu suất của cả quá trình Chất chiết nấm men có thể được sản xuất bằng phương pháp tự phân (autolysis), bằng kỹ thuật co nguyên sinh chất (plasmolysis) và kỹ thuật xử lý enzyme (enzymatic hydrolysis), trong đó, kỹ thuật tự phân vẫn được sử dụng rộng rãi nhất (Chae và cộng sự, 2000; Taguler và Erten, 2008) [11] [37] Bên cạnh đó, còn có nhiều phương pháp phá vỡ tế bào như phương pháp cơ lý, phương pháp nhiệt hay phương pháp sử dụng sóng siêu âm,…

Thông thường, trong công nghệ sản xuất chất chiết nấm men, người ta thường ứng dụng quá trình tự phân và quá trình xử lý enzyme để thực hiện việc phá vỡ thành tế bào và thu nhận hầu hết đầy đủ các chất chiết bên trong

1.3.1 Phá vỡ tế bào nấm men bằng phương pháp tự phân [39]

Tự phân là một phương pháp thích hợp trong việc thu nhận các thành phần của tế bào nấm men để sản xuất chất chiết nấm men ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm (Reed và Nagodawithana, 1991) [35] [41]

1.3.1.1 Đặc điểm của quá trình tự phân

Tự phân là quá trình thủy phân các polymer sinh học (biopolymers) có bên trong tế bào dưới tác dụng của các enzyme thủy phân khi tế bào đã chết, sản phẩm tạo thành là các phân tử có khối lượng thấp (Babayan and Bezrukov, 1985) [11]

Khi tế bào nấm men đã chết, thành tế bào không còn khả năng tự bảo vệ và sẽ bị phá hủy bởi chính các enzyme ở trong tế bào Lúc này, các chất ở trong tế bào chất như protein, nucleotide, carbohydrate…cũng sẽ bị chính hệ enzyme này tấn công và phân hủy (Taguler và Erten, 2008) [37]

Trong phương pháp tự phân, các enzyme thủy phân (hydrolytic enzymes) – thường là protease và nuclease – có trong tế bào sẽ xúc tác cho việc thủy phân protein và các acid nucleic [6] Các protease sẽ tiến hành quá trình thủy phân các protein của nấm men thành các peptide và các amino acid

Chất chiết nấm men thông thường được sản xuất từ Saccaromyces cerevisiae

(nấm men bánh mì hay bã nấm men bia) Với bã nấm men bia, phải tiến hành xử lý trước khi sử dụng để loại bỏ hết các hợp chất có trong hoa hublon và các chất rắn trong quá trình lên men bia (Walker, 1999) nhằm làm giảm vị đắng của sản phẩm sau này Tuy nhiên, nếu sử dụng nấm men bánh mì thì không cần thiết tiến hành quá trình xử lý này (Bridson and Brecker, 1970) [37] [41]

Theo nghiên cứu của A.J Martınez-Rodrıguez và cộng sự (2001), cấu trúc của tế bào nấm men có nhiều sự thay đổi khi tiến hành quá trình tự phân; đặc biệt trên những cấu trúc cơ bản của tế bào và ở những vi cấu trúc (ultrastructure) bên trong tế bào Nghiên cứu của nhóm tác giả thực hiện trên chủng nấm men

Saccharomyces cerevisiae EC1118 Có sự khác nhau khá rõ rệt về hình thái cấu trúc của nấm men trong 2 điều kiện thí nghiệm khác nhau Sau 24h trong môi trường nuôi cấy tổng hợp (5% glucose và 1% chất chiết nấm men), nấm men như được kéo dài ra, có hình trứng và trong khoảng thời gian này bên trong tế bào chất có một không bào hình cầu khá lớn chứa các cấu tử hình cầu, có vị trí chính là ở rìa của không bào Thí nghiệm tự phân của nấm men được tiến hành quá trình tự phân trong môi trường rượu vang (wine medium – Feuillat, 1987) với thành phần gồm ethanol 10% (v/v), acid tartaric 4g/l, acid malic 3g/l, acid acetic 0,1g/l, potassium sulfate 0,1g/l và magienium sulfate 0,025g/l Sau 24h tiến hành quá trình tự phân, thể tích của nấm men nhỏ hơn rất nhiều vì có sự hòa tan của lượng tế bào chất ra môi trường bên ngoài trong suốt quá trình tiến hành tự phân (autolysis) (Pueyo et al., 2000; Martınez-Rodrıguez và Polo, 2000) Quan sát kỹ trên kính hiển vi quang học Nomarsky (Nomarsky Light Microscopy), với một số lượng lớn các tế bào nấm men có sự tăng thể tích của không bào, trên thực tế là hầu như chiếm gần hết thể tích của tế bào chất [27]

Hình 1.4: Hình thái cấu trúc của tế bào nấm men quan sát dưới kính hiển vi quang học Normasky (Normasky Light Microscopy) khi được nuôi cấy trong môi trường tổng hợp sau 24h (a) và sau 24h khi tiến hành quá trình tự phân trong môi trường rượu vang (wine medium) (b) [27]

Với sự hỗ trợ của thiết bị LTSEM (Low Temperature Scanning Electron

Microscopy) – kính hiển vi điện tử quét nhiệt độ thấp, việc quan sát hình thái cấu trúc của tế bào sẽ rõ ràng hơn Sau 24h tiến hành quá trình tự phân, tế bào nấm men không chỉ sinh ra khá nhiều “vết sẹo” (bud scars) mà còn có một lượng lớn các nếp nhăn (wrinkles) và các nếp gấp (folders) có trên thành tế bào Tất cả chúng hầu hết đều theo chiều dọc (longitudinal) và có kết quả tương tự như nghiên cứu của Avakiantz (1982), Charpentier và cộng sự (1986), Kollar và cộng sự (1993) khi sử dụng kỹ thuật kính hiển vi điện tử quét Nguyên nhân chính là do tế bào nấm men bị mất đi hầu hết tế bào chất Lý luận này hoàn toàn hợp lý và được chứng minh khi quan sát trên tế bào bình thường được nuôi cấy trong môi trường tổng hợp thì không có xuất hiện những vết nhăn hay nếp gấp Song song đó, việc quan sát hình thái của tế bào nấm men còn cho thấy có rất nhiều các vết nứt gãy ở rất nhiều tế bào Việc quan sát hình ảnh không gian ba chiều của các tế bào cho thấy chúng đều trống rỗng và chúng đã mất hết các tế bào chất ở bên trong Từ đó, có thể kết luận rằng, sau

24h khi tiến hành tự phân trong môi trường rượu vang (wine medium), quá trình tự phân đã kết thúc Kết quả này cũng tương thích với kết quả nghiên cứu của Maritenez Rodriguez và Polo (2000) [27]

Hình 1.5: Tế bào nấm men sau 24h tiến hành quá trình tự phân trong môi trường rượu vang (wine medium) được quan sát bằng kỹ thuật LTSEM [27]

(a) Vi cấu trúc của tế bào nấm men

(b) (c) quan sát vết đứt gãy của các tế bào trống rỗng, hầu như bị mất hết lượng tế bào chất trong suốt quá trình thủy phân

1.3.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tự phân

Nhiệt độ, độ pH và thời gian là những yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến quá trình tự phân, bên cạnh nồng độ nấm men, ethyl acetate và chitosan Những yếu tố này quyết định chất lượng của sản phẩm chiết xuất nấm men cuối cùng.

(Peppler, 1982) [37] Đối với từng loại nấm men khác nhau thì yếu tố ảnh hưởng cũng khác nhau (Satake Kenji, 2002)

 Ảnh hưởng của nồng độ nấm men trong dung dịch:

- Nồng độ nấm men trong dung dịch có ảnh hưởng lớn đến hiệu quả tự phân

Nồng độ nấm men quyết định hiệu quả tự phân Nồng độ nấm men càng thấp, hiệu quả tự phân càng cao Tuy nhiên, nồng độ nấm men quá thấp sẽ làm dung dịch tự phân quá loãng, giảm tính kinh tế Do đó, việc lựa chọn nồng độ nấm men phù hợp là rất quan trọng.

- Theo nghiên cứu của Champagne và cộng sự (2003) dung dịch tự phân thường được pha loãng ở nồng độ 10 – 15% [36] [20] [38]

- Yếu tố nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình tự phân, đặc biệt là tổng hàm lượng chất chiết thu được, hàm lượng amino acid và đặc tính cảm quan của sản phẩm Theo Taguler và Erten (2008), sự khác nhau về hàm lượng protein trong dịch thu được sau khi tiến hành quá trình tự phân có liên quan đến mức độ hoạt động (active) và không hoạt động (inactive) của enzyme ở các nhiệt độ khác nhau trong suốt quá trình tự phân [37]

Quá trình thủy phân RNA thu nhận 5’-GMP bằng enzyme 5’-phosphodiesterase

Trong nghiên cứu này, chất chiết nấm men được sản xuất bằng cách phá vỡ thành tế bào sử dụng kết hợp giữa endo- và exo- enzyme Đã có khá nhiều nghiên cứu về việc sử dụng kết hợp giữa 2 loại enzyme này trong quy trình sản xuất chất chiết nấm men (Breddam and Beenfeld, 1991; Roman và cộng sự, 1991; Choi and Chung, 1998) Theo nghiên cứu của H.J Chae và cộng sự (2000), trong quá trình thủy phân protein của nấm men, hàm lượng của exoprotease có ảnh hưởng rất mạnh đến hiệu suất thủy phân và đặc tính cảm quan của sản phẩm chất chiết nấm men sau này [11]

1.4 QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN RNA ĐỂ THU NHẬN 5’-GMP BẰNG ENZYME 5’ - PHOSPHOESTERASE

1.4.1 Cấu tạo RNA 1.4.1.1 Cấu tạo hóa học và đặc điểm chung của RNA

Axit ribonucleic (RNA) là một loại axit nucleic Hai đặc điểm cơ bản về cấu tạo, phân biệt giữa axit ribonucleic và axit deoxyribonucleic là cấu tử đường và bazơ nitơ Trong phân tử tRNA có chứa đường ribose, còn trong DNA có chứa đường deoxyribose Thành phần các bazơ pyrimidine trong RNA và DNA cũng khác nhau DNA chứa cytosine và thymine, không có uracil, ngược lại, RNA chứa cytosine và uracil, và không có thymine Ngoài ra, trong RNA có nhiều bazơ thứ yếu (các bazo nitơ ít gặp) hơn trong DNA Đơn vị cơ bản xây dựng nên RNA cũng là các nucleotide Chúng liên kết với nhau cũng bằng liên kết 3'-5'-phosphodiester để tạo thành phân tử polynucleotide như DNA Về cấu trúc phân tử, RNA có cấu trúc mạch đơn chứ không phải là mạch kép như DNA Cấu trúc bậc I của RNA xác định trật tự sắp xếp các gốc nucleotide trong chuỗi polynucleotide

Hình 1.7: Mô hình biểu diễn khả năng tạo thành cấu trúc xoắn đôi ở những đoạn RNA có các trình tự bazo bổ sung

Cấu trúc bậc II của RNA cũng là xoắn nhưng khác với DNA, phân tử RNA là một chuỗi polynucleotide liên tục nên cấu tạo xoắn chỉ thực hiện trong phạm vi một phân tử Khi đó, chuỗi polynucleotide tạo cấu trúc xoắn bằng cách tạo nên các liên kết hydro giữa adenine và uracil (A− U) và giữa guanine và cytosine (G − C)

RNA nằm trong nguyên sinh chất, trong ribosome và cả trong nhân tế bào, nhưng tập trung chủ yếu trong nguyên sinh chất

RNA thông tin (mRNA): được tổng hợp trong nhân tế bào trên khuôn của DNA nên chúng chứa một lượng lớn thông tin cần thiết cho sự tổng hợp các protein đặc hiệu khác nhau Độ lớn của mRNA phụ thuộc vào độ lớn của protein cần tổng hợp, như vậy, các phân tử mRNA của một tế bào có kích thước rất khác nhau và trình tự nucleotide của các RNA thông tin cũng rất khác nhau Sau khi được tổng hợp ở nhân tế bào, mRNA sẽ chuyển từ nhân đến ribosome, mang những thông tin cần thiết cho quá trình tổng hợp protein

Hình 1.8 : Cấu tạo của mRNA

tRNA (axit ribônuclêic vận chuyển) có chức năng vận chuyển các axit amin đến ribosome để tổng hợp nên phân tử protein Nó chiếm từ 10% đến 20% tổng RNA của tế bào và có trọng lượng phân tử tương đối nhỏ, chỉ từ 75 đến 90 nucleotide Đến nay, người ta đã xác định được thành phần và trật tự sắp xếp của hơn 100 loại tRNA khác nhau.

Hình 1.9 : Cấu tạo của tRNA

RNA ribosome (rRNA): ribosome được cấu tạo từ hai tiểu đơn vị, gồm một tiểu đơn vị lớn và một tiểu đơn vị nhỏ Mỗi tiểu đơn vị được xây dựng từ ba thành phần chính là protein, lipid và rRNA

1.4.1.2 Đặc điểm RNA trong nấm men

RNA là một trong những thành phần của nấm men Trong đó, 3 loại đóng vai trò quan trọng trong việc tổng hợp protein cho tế bào là mRNA, tRNA và rRNA

Hàm lượng RNA trong tế bào nấm men dao động trong khoảng từ 6-12%

(w/w), phụ thuộc vào đặc tính sinh trưởng của nấm men và đã được chứng minh trên nấm men Saccharomyces cerevisiae (Furukara và cộng sự 1983; Parada và

Acevedo, 1983) [35] [18] Chính điều này cho thấy có sự thuận lợi cho việc sản xuất chất chiết nấm men giàu 5’-GMP

1.4.2 Đặc điểm của guanosine 5 monophosphate (5’-GMP)

Guanosine 5 monophosphate có tên gọi khác là 5-guanidylic acid hay guanylic acid và thường được viết tắt là 5’-GMP Nó chính là một trong số các nucleotide cấu tạo nên RNA 5’-GMP chính là ester của acid phosphoric và nucleoside guanosine Thành phần cấu tạo của 5’-GMP gồm có nhóm phosphate, phân tử đường ribose và nucleobase guanine

Hình 1.10 : Cấu tạo của 5’-GMP

GMP được sử dụng trong công nghệ thực phẩm như là một phụ gia thực phẩm (food additives) ở dạng muối như: disodium guanylate (E627), dipotassium guanylate (E628) và calcium guanylate (E629)

Ngoài ra, nhóm 5’ - nucleotide được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực dược, có thể dùng để tổng hợp kháng sinh và thuốc chống ung thư Bên cạnh đó, nucleotide đóng vai trò quan trọng trong điều trị các bệnh về thần kinh và tuần hoàn máu (Lu-E-Shi và cộng sự, 2006) [34] [29].

GMP có thể được thu nhận từ quá trình lên men của vi sinh vật hoặc sử dụng phương pháp enzyme (Laufer và Gutcho, 1968) Theo Shi và cộng sự (2006), GMP được thu nhận một cách trực tiếp từ quá trình lên men sử dụng vi sinh vật, bằng phương pháp hóa học hoặc bằng phương pháp enzyme Quá trình thu nhận GMP từ enzyme không quá phức tạp, hiệu suất thu hồi sản phẩm khá cao

1.4.3 Quá trình thủy phân RNA để thu nhận 5’-GMP bằng enzyme 5’ – phosphoesterase

1.4.3.1 Đặc điểm của enzyme 5’ - phosphodiesterase

Chất lượng của chất chiết nấm men, đặc biệt là về các đặc tính cảm quan, chịu tác động rất lớn bởi hàm lượng của 5’-GMP và 5’-IMP Phương pháp thu nhận các nucleotide từ RNA của nấm men, enzyme 5’-phosphodiesterase được đề nghị bởi Kuninaka và cộng sự (1961) [11]

5′-phosphodiesterase (EC 3.1.4.1), cũng được gọi là phosphodiesterase I, là một enzym ngoại bào, thuộc nhóm exonuclease, cắt liên kết phosphodiester giữa nhóm hydroxit và phosphate của axit nucleotide Nó thực hiện quá trình cắt các phân tử axit nucleic thành các nucleotide riêng biệt (5′-AMP, 5′-GMP, 5′-CMP và 5′-UMP), đặc biệt là đối với các phân tử RNA.

Hình 1.11 : Cơ chế tác dụng của enzyme 5’-phosphodiesterase

Hoạt tính của enzyme được xác định theo phương pháp của Fujishima và cộng sự (1972) Sau này, phương pháp này cũng được phát biểu bởi Fujimoto và cộng sự (1974) Nó được xác định bằng lượng acid nucleotide hòa tan (acid solube nucleotides) thu được khi tiến hành quá trình thủy phân RNA bằng chính enzyme này 0,1ml enzyme dạng lỏng sẽ được ủ với 1,9ml dịch cơ chất (1%RNA, 0,125M đệm acetate, pH=5,4 và 3mM Zn 2+ ) ở 69 0 C trong 15 phút Quá trình phản ứng sẽ được ngừng lại khi thêm vào 2ml chất làm kết tủa acid nucleic (0,25 % ammonium molybdate hoàn tan trong 2,5 % perchloric acid) Hỗn hợp sau đó sẽ được giữ lạnh trong khoảng thời gian là 10 phút Các RNA bị kết tủa sẽ được loại bỏ bằng phương pháp ly tâm 4000rmp ở 4 0 C trong thời gian là 10 phút Phần dịch lỏng còn lại sau khi ly tâm sẽ được pha loãng với nước cất Sau đó, dịch lỏng này sẽ được tiến hành đo độ hấp thụ ở 260nm Hoạt độ enzyme được tính theo công thức sau:

Enzyme activity/(U/mL) = A 260 × 4,0 × 50/0,1 × 15 = A 260 × a × 133,3 với a là hệ số pha loãng

Như vậy, một đơn vị hoạt độ enzyme được xác định là lượng 5’nucleotide gây nên sự tăng 1,0 độ hấp thụ trong 1 phút ở 260nm [34]

Theo Tyas Utamin và cộng sự (2011), hoạt độ của enzyme 5’ phosphodiesterase được xác định bằng hiệu suất thủy phân của bis-p-nitrophenyl phosphate (NPP) Quá trình được tiến hành bằng việc cho 0,1ml enzyme dạng lỏng vào 0,8ml đệm acetate 50mM và dung dịch sẽ được ủ ở 60 0 C trong khoảng thời gian là 1 phút Sau đó, 0,1ml dung dịch cơ chất NPP 10mM được thêm vào Quá trình phản ứng được ngừng lại sau 10 phút khi thêm vào 0,3 ml dung dịch sodium carbonate 5% Sau đó, dung dịch sẽ được thêm vào 1,7ml aquadest Màu vàng của p-nitrophenol sẽ được đo độ hấp thụ ở bước sóng 400nm sử dụng máy quang phổ

Một đơn vị hoạt độ enzyme được xác định chính là lượng enzyme cần thiết cho quá trỡnh để giải phúng được 1àmol p-nitrophenol trong mỗi phỳt ở 60 0 C và pH=5,0 (Dhule và cộng sự, 2006) [41][34]

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên liệu

2.1.1 Bã thải nấm men bia

Nghiên cứu sử dụng bã thải nấm men bia Saccharomyces cerevisiae từ nhà máy bia Sapporo - công ty TNHH Sapporo Việt Nam Nhà máy này đặt tại Khu công nghiệp Việt Hóa - Đức Hòa 3, huyện Đức Hòa, tỉnh Long An.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng ba loại enzyme: enzyme Protamex và enzyme Flavourzyme 500L của hãng Novozyme (Đan Mạch), Phosphodiesterase I của hãng Sigma Aldrich (Mỹ)

Enzyme Protamex ® (E.C 3.4.21.62) là dòng sản phẩm protease từ vi khuẩn

Bacillus licheniformis và Bacillus amyloliquefaciens của hãng Novozyme A/S

 Hoạt độ: 398,7mAU/g (1AU = 550UI)

 Sản phẩm có màu nâu Cường độ màu thì không phải là một chỉ tiêu để đánh giá độ hoạt động của enzyme

 Dạng vật lý: thể lỏng

 Chất ổn định: sodium chloride

 Yêu cầu kỹ thuật của enzyme thể hiện trong bảng 2.1

Bảng 2.1: Bảng yêu cầu kỹ thuật của sản phẩm Protamex ®

Chỉ tiêu Giới hạn dưới Giới hạn trên Đơn vị

Tổng tế bào vi sinh vật hiếu khí - 50000 /g

 Điều kiện bảo quản: bao gói bảo quản trong điều kiện khô ráo và tránh ánh sáng mặt trời Sử dụng sản phẩm trong vòng 6 tháng sau khi mở bao bì

 Enzyme này bất hoạt khi xử lý nhiệt ở 85 0 C trong 10 phút Đây là sản phẩm enzyme được FAO/WHO, JECFA và FCC công bố đạt tiêu chuẩn dùng cho thực phẩm

Enzyme Flavourzyme ® là dòng sản phẩm protease từ nấm mốc Aspergillus oryzae và của hãng Novozyme A/S (Bagsvaerd, Denmark)

 Sản phẩm có màu nâu Màu của sản phẩm tùy vào từng lô hàng Cường độ màu thì không phải là một chỉ tiêu để đánh giá độ hoạt động của enzyme

 Dạng vật lý: thể rắn

 Chất ổn định: potassium chloride, sucrose

 Yêu cầu kỹ thuật của enzyme thể hiện trong bảng 2.2

Bảng 2.2: Bảng yêu cầu kỹ thuật của sản phẩm Flavourzyme ®

Chỉ tiêu Giới hạn dưới Giới hạn trên Đơn vị

Tổng tế bào vi sinh vật hiếu khí - 10000 /g

 Điều kiện bảo quản: bao gói bảo quản trong điều kiện khô ráo và tránh ánh sáng mặt trời Sử dụng sản phẩm trong vòng 6 tháng sau khi mở bao bì Đây là sản phẩm enzyme được FAO/WHO, JECFA và FCC công bố đạt tiêu chuẩn dùng cho thực phẩm

Enzyme phosphodiesterase I là sản phẩm thương mại của Sigma Aldrich Co., Ltd – Mỹ

 Hoạt độ: ≥ 0,01 UI/mg chất rắn Một đơn vị hoạt độ (UI) sẽ thủy phân được 1àmol cơ chất bis p nitrophenyl phosphate trong mỗi phỳt ở pH 8,8 và 37 0 C

 Dạng vật lý: thể rắn

 Nguồn thu nhận: từ nọc rắn (crude dried venom)

 Điều kiện bảo quản: bao gói bảo quản trong điều kiện khô ráo và tránh ánh sáng mặt trời Sử dụng sản phẩm trong vòng 6 tháng sau khi mở bao bì

2.1.3 Hệ đệm phosphate – citrate pH môi trường làm thay đổi cấu trúc không gian protein vì một số amino acid có mạch nhánh phân ly COO– và NH 4 tạo liên kết ion Do đó, pH cũng là một yếu tố ảnh hưởng lớn đến hoạt tính của các enzyme tự phân, do đó ảnh hưởng đến mức độ phá vỡ màng tế bào nấm men và khả năng giải phóng các thành phần từ lớp không gian chu chất ra bên ngoài tế bào

Dung dịch đệm là dung dịch có pH không thay đổi nhiều khi một lượng nhỏ acid (H + ) hoặc base (OH – ) được thêm vào Như vậy, dung dịch đệm bao gồm một cặp acid base liên hợp (acid yếu và muối của acid yếu này hoặc base yếu và muối của base này) và tỉ lệ của chúng sẽ quyết định pH của dung dịch

Việc pha dung dịch đệm tuân theo nguyên tắc chọn cặp acid – base có hằng số phân ly pK A/B gần với pH đệm cần pha và phối trộn chúng với nhau

Hệ đệm được chọn ở đây là hệ đệm phosphate – citrate Trong hệ đệm có hai thông số quyết định tới tính chất hệ đệm là nồng độ của hệ đệm, pH của hệ đệm

Hầu hết các hệ đệm được sử dụng ở nồng độ từ 0,1M và 10M hoặc có thể pha loãng khi cần thiết pH được điều chỉnh trong vòng một đơn vị pH từ pKa của acid– base/liên hợp pH = pKa + log ([Base]/[Acid]) với tỉ lệ của [Base]/[Acid] = 1,096 Hệ đệm phosphate - citrate gồm acid citric 0,1M và Na 2 HPO 4 0,2M có pH 2,2 – 8,0

Bảng 2.3: Hệ đệm phosphate – citrate

Na 2 HPO 4 0,2M (mL) Acid citric 0,1M (mL) pH

Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Quy trình thu nhận chất chiết nấm men giàu 5’-GMP

Tự phân Xử lý E Protamex

Ly tâm Thu nhận chất chiết

Ly tâm Thu nhận chất chiết

Xử lý E phosphodiesterase Xử lý E phosphodiesterase

Xử lý nhiệt Xử lý nhiệt

Sản phẩm chất chiết nấm men giàu 5’-GMP

Xử lý E Flavourzyme Xử lý nhiệt Nấm men

Xử lý Nước vô khuẩn

- Rửa với nước vô khuẩn tỷ lệ nấm men : nước vô khuẩn là 1:3 (w/w) Để lắng 1h, gạn nước

- Rửa với nước muối vô khuẩn 0,9% theo tỷ lệ 1:3 (w/w) Để lắng 1h, gạn nước

- Ly tâm 3000 vòng/phút trong 15 phút để thu sinh khối nấm men ướt

- Rửa với nước nóng pH = 7,0 theo tỉ lệ 1:3 (w/w), ở 60 – 65 0 C trong vòng 0,5h

- Nấm men ướt sẽ được bảo quản ở lạnh 4 0 C trong vòng 2 – 3 ngày

 Phá vỡ thành tế bào

Phá vỡ thành tế bào bằng phương pháp tự phân

- Huyền phù nấm men được điều chỉnh về 15% (w/w)

- Tiến hành tự phân nấm men trong dung dịch đệm phosphate – citrate Tiến hành khảo sát các giá trị pH ban đầu, thời gian tự phân

Phá vỡ tế bào bằng phương pháp sử dụng enzyme

- Huyền phù nấm men được điều chỉnh về 15% (w/w) bằng dung dịch đệm phosphate-citrate

Để thủy phân protein trong điều kiện tối ưu, hỗn hợp được xử lý với enzyme Protamex ở nhiệt độ 50°C, pH 7,0 trong điều kiện khuấy (200 rpm) trong 5 giờ Enzyme được bất hoạt ở 95°C trong 10 phút, sau đó hỗn hợp được làm lạnh đến 50°C và thêm enzyme Flavourzyme Quá trình thủy phân tiếp tục diễn ra ở 50°C, pH 7,0 với điều kiện khuấy (200 rpm) trong 5 giờ.

- Vô hoạt enzyme ở 95 0 C trong 10 phút

- Ly tâm 10.000 x g, ở nhiệt độ 4 0 C trong khoảng 10 phút để thu dịch nấm men

 Xử lý enzyme phosphodiesterase I (5’ – phosphodiesterase)

- Điều chỉnh pH của dịch sau khi thủy phân bởi các enzyme protease về pH tối ưu của Phosphodiesterase I với pH = 8,8

- Nhiệt độ tiến hành thủy phân là 37 0 C

- Sau khi thủy phân xong, hỗn hợp sẽ được gia nhiệt ở 95 0 C trong vòng 5 phút để vô hoạt enzyme

- Hỗn hợp thu được sẽ được ly tâm với chế độ 10,000 x g, ở nhiệt độ là 4 0 C trong khoảng 10 phút

Khảo sát quá trình phá vỡ tế bào nấm men để thu nhận chất chiết

Khảo sát quá trình phá vỡ tế bào nấm men bằng phương pháp tự phân

Khảo sát quá trình phá vỡ tế bào nấm men bằng phương pháp thủy phân kết hợp bởi E Protamex (xử lý trước) và

Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố pH trong quá trình tự phân

Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố thời gian trong quá trình tự phân

Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ giữa 2 loại enzyme trong hỗn hợp enzyme xử lý

Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ hỗn hợp enzyme xử lý so với cơ chất

Tối ưu hóa các điều kiện phá vỡ tế bào bằng phương pháp tự phân

Tối ưu hóa các điều kiện phá vỡ tế bào bằng phương pháp thủy phân bởi sự kết hợp của E Protamex và E

Khảo sát hàm lượng enzyme phosphodiesterase thực hiện quá trình thủy phân RNA để thu nhận 5’-

GMP So sánh hiệu suất trích ly protein

Sản xuất thử chất chiết nấm men giàu 5’-GMP Xác định hiệu suất trích ly protein và hàm lượng 5’-GMP trong sản phẩm thu được

2.2.2.1 Nghiên cứu quá trình phá vỡ tế bào bằng phương pháp tự phân

Tự phân nấm men trong dung dịch đệm phosphate – citrate, nồng độ huyền phù là 15% (w/w) Ảnh hưởng của pH đến quá trình tự phân

- Thông số thay đổi: pH 4,0 – 4,5 – 5,0 – 5,5 – 6,0 – 6,5

 Thời gian tiến hành tự phân: 30h

 Nồng độ huyền phù nấm men: 15% (w/w)

- Hàm mục tiêu: hiệu suất quá trình thủy phân, hàm lượng chất chiết thu được Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình tự phân

- Thông số thay đổi: thời gian tự phân 15h – 20h – 25h – 30h – 35h – 40h - Thông số cố định

 Nồng độ huyền phù nấm men: 15%

 pH: chọn pH tối ưu của thí nghiệm trên

- Hàm mục tiêu: hiệu suất quá trình thủy phân, lượng chất chiết thu được

Lưu ý: mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần để kiểm tra ý nghĩa của sự khác biệt của kết quả theo phương pháp ANOVA

Chọn điều kiện tối ưu của quá trình phá vỡ tế bào nấm men bằng tự phân

Tối ưu hóa quá trình bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm

Phương pháp quy hoạch thực nghiệm: phương pháp ma trận trực giao cấp 2 có tâm là 2 yếu tố ảnh hưởng là pH và thời gian tự phân, hàm mục tiêu là hiệu suất trích ly protein

Tiến hành 11 thí nghiệm, gồm 3 thí nghiệm ở tâm và 8 thí nghiệm ở các giá trị biên

2.2.2.2 Nghiên cứu quá trình phá vỡ tế bào nấm men bằng phương pháp thủy phân bởi enzyme

Enzyme được sử dụng trong nghiên cứu này là hai hoại enzyme Protamex ® và Flavourzyme ® của hãng Novozyme (Đan Mạch) Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme sử dụng

- Thí nghiệm được thực hiện với việc sử dụng hai loại enzyme Protamex ® và enzyme Flavourzyme ® với tỷ lệ thích hợp

- Thông số thay đổi: tỷ lệ % enzyme Protamex ® trong hỗn hợp enzyme Giá trị thay đổi: 0% - 20% - 40% - 60% - 80% - 100%

 Nồng độ huyền phù nấm men: 15% (w/w)

 Thời gian xử lý enzyme: 10h

 Hàm lượng hỗn hợp enzyme sử dụng: 3% (so với huyền phù nấm men)

- Hàm mục tiêu: hiệu suất trích ly protein Ảnh hưởng của hàm lượng enzyme sử dụng

- Thông số thay đổi: hàm lượng của hỗn hợp enzyme sử dụng (% - so với huyền phù nấm men) Giá trị thay đổi: 1% - 2% - 3% - 4% - 5%

 Nồng độ huyền phù nấm men: 15% (w/w)

 Thời gian xử lý enzyme: 10h

 Tỷ lệ enzyme Protamex ® trong hỗn hợp enzyme: tối ưu từ thí nghiệm trên

- Hàm mục tiêu: hiệu suất trích ly protein

Chọn điều kiện tối ưu của quá trình phá vỡ tế bào bằng phương pháp enzyme

Tối ưu hóa quá trình bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm

Phương pháp quy hoạch thực nghiệm: phương pháp ma trận trực giao cấp 2 có tâm là 2 yếu tố ảnh hưởng là tỷ lệ và hàm lượng enzyme sử dụng, hàm mục tiêu là hiệu suất trích ly protein

Tiến hành 11 thí nghiệm, gồm 3 thí nghiệm ở tâm và 8 thí nghiệm ở các giá trị biên

2.2.2.3 Khảo sát hàm lượng enzyme phosphodiesterase thực hiện quá trình thủy phân RNA để thu nhận 5’-GMP

- Chúng tôi tiến hành quá trình thủy phân RNA trong chất chiết nấm men để thu nhận 5’-GMP bởi enzyme Phosphodiesterase I của Sigma Aldrich Co., Ltd

- Thông số thay đổi: hàm lượng enzyme phosphodiesterase thực hiện quá trình thủy phân RNA để thu nhận 5’-GMP Các giá trị thay đổi là: 0,1%; 0,2%; 0,3% và 0,4%

 Điều chỉnh pH = 8,8 bằng đệm phosphate – citrate

 Tiến hành thủy phân ở nhiệt độ 37 0 C trong thời gian 15 phút

 Sau thủy phân, tiến hành quá trình vô hoạt enzyme bằng cách đun nóng dịch thủy phân ở nhiệt độ 95 0 C trong thời gian 5 phút

 Tiến hành định lượng 5 – GMP trong dung dịch thu được bằng phương pháp HPLC

- Hàm mục tiêu: hàm lượng 5’-GMP trong sản phẩm thu được

2.2.2.4 Quá trình sản xuất thử chất chiết nấm men giàu 5’-GMP bằng phương pháp thủy phân RNA bởi enzyme 5’ – phosphodiesterase

Tiến hành quá trình sản xuất chất chiết nấm men theo hai phương pháp tự phân và thủy phân bởi enzyme với các điều kiện tối ưu thu nhận được trong nghiên cứu trên

Tiến hành xác định các chỉ tiêu để đánh giá chất lượng sản phẩm và khả năng ứng dụng của từng quy trình:

 Hàm lượng chất rắn hòa tan

 Hiệu suất trích ly protein

Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp đo hàm ẩm

Trong nghiên cứu này, việc xác định độ ẩm của nguyên liệu được thực hiện trên máy đo độ ẩm tự động Scaltec

Nguyên lý hoạt động của máy đo độ ẩm dựa trên ba bộ phận chính: nguồn nhiệt để sấy và tách ẩm, cân phân tích để xác định khối lượng hiện thời, và bộ phận xử lý số liệu và điều khiển Quá trình sấy sẽ tiếp tục cho đến khi sự thay đổi về khối lượng của mẫu thử là không đáng kể.

2.3.2 Phương pháp xác định hiệu suất trích ly protein

Nguyên tắc: hiệu suất trích ly được xác định bằng tỷ lệ của hàm lượng protein hòa tan trong dịch chiết và tổng hàm lượng protein thu được (theo Basappa và cộng sự, 1986)

Hỗn hợp sau khi được thực hiện quá trình phá vỡ tế bào sẽ được tiến hành ly tâm ở 10000 x g ở 4 0 C trong vòng 10 phút Tiến hành xác định hàm lượng protein hòa tan trong dung dịch thu được sau khi ly tâm, từ đó xác định được hiệu suất trích ly của quá trình

2.3.3 Xác định hàm lượng protein hòa tan bằng phương pháp Lowry

Nguyên tắc: hầu hết protein đều chứa tyrosin và tryptophan Tỷ lệ những acid amin này trong phân tử tùy thuộc vào loại protein, vì vậy những protein cùng một loại với nhau thì tỷ lệ các acid amin này trong phân tử của chúng khác nhau

Khi cho protein tác dụng với thuốc thử Folin sẽ tạo thành một phức chất có màu Cường độ màu sắc của mẫu thí nghiệm tỷ lệ với hàm lượng tyrosin và tryptophan (cũng như hàm lượng protein có trong mẫu) Trên nguyên tắc này, ta có thể dùng phương pháp so màu để xác định hàm lượng protein tan

2.3.4 Xác định hàm lượng protein tổng số bằng phương pháp Kjeldahl

Nguyên tắc: vô cơ hóa mẫu thử bằng H 2 SO 4 đậm đặc và có chất xúc tác K 2 SO 4 và CuSO 4 ở nhiệt độ cao Các hợp chất có chứa nito thì chuyển thành NH 3 và tiếp tục kết hợp với H 2 SO 4 tạo thành muối (NH 4 ) 2 SO 4 dùng kiềm mạnh đẩy NH 3 từ muối (NH 4 ) 2 SO 4 hình thành ra thể tự do Định lượng NH 3 bằng acid

2.3.5 Xác định hàm lượng của 5’-GMP [19][23]

Xác định 5’-GMP bằng phương pháp sử dụng HPLC với cột Enconosphere C18 Column sử dụng đầu dò UV với bước sóng là 254 nm

Pha động được sử dụng trong phương pháp HPLC này là đệm kali dihydrophosphate pH = 5,6 Tốc độ dòng là 0,6 ml/phút và thể tích mẫu tiêm vào là 5àl Trong quỏ trỡnh chuẩn bị, mẫu sẽ được siờu õm trong 10 phỳt và sau đú được lọc qua màng lọc 0,45àm.

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Khảo sát quá trình phá vỡ tế bào nấm men bằng phương pháp tự phân

3.1.1 Ảnh hưởng của pH đến hiệu suất trích ly protein

Hình 3.1 : Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của pH đến hiệu suất trích ly protein của quá trình tự phân

Ghi chú: “ a, b, c, d, e….”: ký tự giống nhau thì các giá trị khác biệt không có ý nghĩa, ký tự khác nhau thì các giá trị khác biệt có ý nghĩa với p