+ Tối ưu hóa điều kiện trích ly polyphenol.- Khảo sát ảnh hưởng của quá trình thủy phân protein bởi protease đến hiệu suất thu nhận polyphenol với hỗn hợp đã thủy phân băng cellulase và
TONG QUAN 1.1 Tổng quan về trà xanh
LI Phan loại khoa hoc {1|
Trà có tên khoa hoc là Camellia sinensis, phan loại khoa hoc của trà xanh như sau:
Giới: Plantae Bộ: Ericales Họ: Theaceae Chi: Camellia Loai: Camellia sinensis Ngoài tên khoa học, trà xanh còn có nhiêu tên gọi khác nhau ở các nước khác
Tiếng Anh: Tea Plant Tiếng Mỹ: Tea
Tiếng Ấn Độ: Chha Tiếng Nga: Chai Tiếng Y: Te Tiếng Trung Quốc: Cha
Hình 1.1 Đặc điểm cây trà xanh
1.1.2 Phân bố và đặc điểm
Trà xanh có nguồn gốc từ Trung Quốc đại lục, Nam và Đông Nam A Trà xanh là cây thân bụi, rễ chính, hoa có mau vàng — trăng, đường kính hoa 2 — 4em, một hoa có 7 — 8 cánh Hạt trà xanh được ép dé sản xuất dầu trà dùng trong dược phẩm và mỹ phẩm Lá trà xanh dài 4-— 15cm, chiều ngang 2 — 5em Là trà non mảu xanh nhạt, có lông tơ trắng dưới bề mặt lá, lá giả có màu xanh đậm hơn, và tùy vào độ tuổi của lá trà mà cho ra các sản phẩm trà có chất lượng khác nhau Thông thường búp tôm 2 — 3 lá được sử dụng để sản xuất các loại trà lá khô [1]
Ngày nay, ở hau hết các tinh của nước ta đều có đều kiện thuận lợi đều trồng trà, song ba vùng trồng trà lớn nhất.
- Vung chè thượng du (Hà Giang, Tuyên Quang, Lai Châu, Yên Bái) chiếm khoảng 25% sản lượng chè miền Bắc.
- Vung chè trung du (Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Bac Can, Thái Nguyên) Đây là vùng chè chủ yếu chiếm đến 75% sản lượng chè miền Bắc với nhiều nhà máy sản xuất lớn.
- Vùng chè Tây Nguyên (Gia Lai, Kon Tum, Lâm Đồng, Đắc Lắc) chủ yếu trồng giống chè An Độ và chè shan, chè O Long.
1.1.3 Thành phân của lá trà
Bang 1.1 Thành phan hóa học của lá trà khô [2]
Hợp chat phenolic 0,3S6 liéu tinh trén ham luong chát khô
Thanh phần hóa học của lá trà: Protein (chiếm 15 — 20% chất khô), acid amin (1 — 4% chất khô) như Theanine, 5-N-ethylglutamine, acid glutamic, tryptophan, glycine, serine, acid aspartic, tyrosine, valine, leucine, , Khoang chiém 5% chat khô: canxi, magie, chrom, mangan, sat, đồng, kẽm, molybden, selen, , một lượng nhỏ chất béo, sac tố (chlorophyll, carotenoids) [3]
Bảng 1.2 Thành phân acid amin trong lá trà [4]
Aspartic acid 560 + 21,4 Glutamic acid 619 + 27,4 ASN 206 + 9,73 Serine 126 + 36,2 Histidine 693 + 79,8 Arginine 414+ 40,4 Glycine 30,7 + 5,43 Threonine 65,9 + 8,32
Alanine ND Theanine 4025 + 59,1 Tyrosine 63,5 + 36,7 Methionine 25,5 + 1,78 Tryptophan 61,9 + 3,33 Phenylalanine 30,5 + 24,0 Isoleucine 35,8 + 23,0 Leucine 27,5 + 9,70
Các hợp chất polyphenol trong trà bao gồm các hợp chất flavanols, flavandiols, flavonoids va phenolic acid Trong đó, flavanols chiếm ty lệ cao nhất, với đại diện là catechin [Š] Có 4 dạng catechin chính trong lá trà:
(—)-epigallocatechin gallate (EGCG), (—)-epigallocatechin (EGC), (—)-epicatechin gallate (ECG) và (—)-epicatechin (EC) [6] Catechin không mau, tan trong nước, là hop chat tao nén vi dang va chat cho tra xanh.
OH OH ad OH O OH O OH
(-)-Epicatechin-3-gallate (ECG) (-)-Epigallocatechin-3-gallate (EGCG)
Hình 1.2 Công thức cau tạo của catechin
Catechin được đặc trưng bởi các nhóm hydroxyl khác nhau trên vòng A va vòng B Epicatechin (EC) có một nhóm ortho-dihydroxyl trên vòng B, ở vị trí carbon 3’ và 4’, và một nhóm hydroxy] trên vòng C, tại vi tri carbon 3 [7]
Epigallocatechin (EGC) khác với epicatechin ở vi tri các nhóm hydroxyl, epigallocatechin có 3 nhóm hydroxyl trên vòng B tại các vi tri carbon 3’, 4’, 5’.[7]
Epicatechin gallate (ECG) khác epicatechin la nhóm gallate trong phan tử liên kết với carbon 3 ở vòng C.[8]
Epigallocatechin gallate (EGCG) có 3 nhóm hydroxyl ở vi trí carbon 3’, 4’,
5’ của vòng B và nhóm gallate trên carbon 3 của vòng C[8] EGCG là catechin được tìm thấy nhiều nhất trong lá trà xanh, trà Oolong và trà đen [2] Hàm lượng
EGCG có trong trà xanh vào khoảng 127 — 550 mg/L [9].
Bang 1.3 Thành phan của catechin và các flavonols trong dung dịch trà xanh* [6]
` Dịch chiết Dịch chiết Dịch chiết Tong cộng
1 (mg/l) 2 (mg/l) 3 (mg/l) (mg/l) Catechin
(a) Chuan bị dung dịch thi nghiệm: 1g lá trà khô được ngâm trong 100ml nước cất đun sôi trong 5 phút, thu 70ml dịch chiết và làm nguội đến nhiệt độ phòng dưới vòi nước chảy Tiếp tục cho thêm 70ml nước cất đun sôi vào bã trà, trích ly trong 5 phút, thu 70ml dịch chiết thứ 2, làm nguội dưới vòi nước chảy Dịch chiết thứ 3 thực hiện tương tự dịch thứ 2.
(b) ND: không phát hiện thấy
Khả năng chống oxy hóa của các nhóm catechin trong trà xanh là sự kết hợp của nhóm hydroxyl và vòng nhân thơm trong cau trúc phân tử, từ đó, liên kết va trung hòa các gốc lipid tự do của nhóm hydroxyl Các ion kim loại chuyển tiếp thường có khả năng bắt đầu các chuỗi oxy hóa bang cách phá vỡ liên kết O-O của các lipid hyperoxyde (LOOH), tạo ra các gốc tự do alkoxyl lipid, nhờ tính tạo phức với kim loại của catechin trà xanh góp phan nâng cao hoạt tính chống oxy hóa của chúng [32][33][34] Các phân tử catechin ức chế quá trình peroxy hóa chất béo bang cách liên kết với các gốc alkoxyl lipid tự do Khả năng chống oxy hóa của catechin phụ thuộc vào cầu trúc phân tử, số lượng và vi tri các gốc hydroxyl trong phân tử [10] Các phân tử catechins có o-dihydroxyl hoặc trihydroxyl ở vòng B sẽ có khả năng chống oxy hóa cao Các catechin có liên kết ester gallate ở vị trí carbon 3 (ECG, EGCG) có hoạt tính chống oxy hóa cao nhat[11] Sự có mặt của 3,4,5 — trihydroxyl ở vòng B đã đươc chứng minh là quan trọng trong tác dụng chống oxy hóa và các gốc tự do [30] Catechin trà xanh có hoạt tính chống oxy hóa mạnh hơn vitamin C và E [31], và thứ tự hiệu quả chống oxy hóa ECG > EGCG > EGC > EC
Ngoài tac dụng chống oxy hóa, catechin trong trà xanh còn tác động đến các tế bảo và phân tử trong tín hiệu dẫn truyền [14] Đặc tính ngăn ngừa ung thư của catechin trà xanh là do khả năng ức chế sự tăng sinh của tế bao khối u, sự hình thành mach, và sự gia tăng các yếu tố tăng trưởng [35][36] Điều tri bang EGCG giúp ức chế pha tăng trưởng G1, kìm hãm kinase phụ thuộc vào cylin (CDKs) và cảm ứng chất ức chế CDK p21 va p27 trong tế bao ung thư vú và tuyến tiền liệt [37] EGCG cũn ức chế cỏc nhõn tố trong quỏ trỡnh sao mó như NF - ôB va AP — 1 [38] Sự ức chế NF — kB va AP — 1 là hiện tượng chính giải thích hiệu quả hoạt tính chống oxy của catechin trà xanh va tác động của chúng lên từng phân tử cụ thé.
1.1.4 Một số nghiên cứu về trà xanh
Một số nghiên cứu trên động vật cho thấy catechins trong trà xanh giúp chống lại các căn bệnh liên quan đến lão hóa [12] Việc sử dụng trà xanh có tác dụng tốt đối với việc phòng chống nhiều loại ung thư, bao gồm ung thư phối, đại tràng, thực quản, miệng, dạ dày, ruột non, thận, tuyến tụy và tuyến vú [13] Các nghiên cứu dịch tễ học và thử nghiệm lâm sàng cho thấy trà xanh có thể giảm nguy cơ của nhiều bệnh mãn tính [14] do chính hàm lượng cao polyphenol có trong trà xanh có hoạt tinh chồng oxy hóa mạnh mang lại Bên cạnh đó, trà xanh còn có khả năng làm giảm huyết áp, do đó giảm nguy cơ đột quy và các bệnh liên quan đến tim mạch Các nghiên cứu trên động vat cho thay trà xanh giúp chống lại tiến triển của các bệnh lý về tim mạch nhờ làm giảm lượng đường trong máu va giảm trọng lượng cơ thể [15] Trong số các bệnh lý liên quan đến tuổi tác và thoái hóa thần kinh, trà xanh đã được chứng minh có kha năng chống lại diễn biến của các bệnh Parkinson, Alzheimer và các tốn thương do thiếu máu cục bộ[28] Trà xanh cũng cho tác dụng tốt đối với bệnh đái tháo đường thử nghiệm trên mô hình insullin ở động vật[29].
Sano và cộng sự (1995) đã báo cáo tác dụng ức chế của lá trà xanh chống lại sự peroxid hóa chất béo gây ra bởi tert-butyl hydroperoxide, và cơ chế chống oxy hóa tương tự đã được quan sát thấy trên thận khi uống EGCG [16] EGCG có tác dụng ức chế sự phát triển của các tế bảo hình sao ở gan, có tác dụng làm giảm tiến triển của bệnh xơ gan[24].
Hiệu quả của trà xanh trong điều trị bệnh tiêu chảy, thương hàn đã được người Châu Á biết đến từ rất lâu đời [17] Catechins trong trả xanh có tác dụng ức chế vi khuẩn Helicobacter Pylori [18], chống lại virus cúm trong giai đoạn sớm [19], chống lại các virus Herpes đơn [20][21] Năm 2003, Weber và cộng sự thấy rằng virus adeno gây bệnh bị ức chế bởi catechins trong trà xanh[22] Vào năm 2004 Masatomo Hirasawa báo cáo hoạt tính chống nam của trà xanh, chồng lại nam Candida albicans và khi kết hợp điều trị với liều thấp antimycotics, catechins trong trà xanh giúp làm giảm các tac dụng phụ của antimycofics[23 |.
Trong công nghệ thực phẩm, từ nhiều năm trở lại đây, người tiêu dùng ngày càng quan tâm đến các sản phẩm có bồ sung chiết xuất trà xanh Trà xanh thường được bố sung vào nhiều loại thực phẩm khác nhau: bánh mì, bánh quy, táo say, cac san pham từ thit, [7] Trong một số thử nghiệm nhỏ cho thay chiết xuất trà xanh có khả năng chống oxy hóa gần như tương đương với tert — butylhydroquinone (TBHQ) và có hiệu quả hơn rất nhiều các chất chống oxy hóa có nguồn gốc tự nhiên khác Trong thử nghiệm này, các mẫu sử dụng có hàm lượng béo khoảng 40% và được trộn cùng chiết xuất trà xanh có chứa 60ppm catechins, hoặc 100ppm TBHQ, được bảo quản ở điều kiện 50°C trong 13 tuần Sau đó mẫu được đem đi kiểm tra thời hạn sử dụng, và cho thấy tác dụng của trà xanh và TBHQ là như nhau[7].
Có rất nhiều nghiên cứu khác nhau về hoạt tính chống oxy hóa của trà xanh trong dầu thực vật và mỡ động vật Khi catechins trà xanh được thêm vào mì sợi va các loại dầu (dầu đậu nành, dầu cá và dầu động vat), chúng giúp ôn định hoạt tinh chống oxy hóa của sản phẩm chiên và dâu chiên [25] Trong các nghiên cứu về nguôn lipid có nguồn gốc từ đại dương như dầu chiết xuất từ mỡ hải câu, cá moi dau cho thấy chiết xuất trà xanh có tác dụng chống oxy hóa trong các sản phẩm nay.
Hoạt tính chống oxy hóa của chiết xuất trà xanh được so sánh với hoạt tính của butylated hydroxyanisole (BHA), butylated hydroxytoluen (BHT), TBHQ va a — tocopherol Ở những nông độ > 200ppm, chiết xuất trà xanh đã loại bỏ chlorophyll cho thấy hoạt tính chống oxy hóa cao vượt trội hơn BHA (200ppm), BHT (200ppm) va a — tocopherol (500ppm), nhưng kém hơn so với TBHQ [27].
Cellulose có cau tạo rất da dạng va là nguồn polymer tái sử dung được trên thế giới Cellulose là thành phan chủ yếu của thành tế bào thực vật Nguồn cellulose chủ yếu là cây thân gỗ, phụ phẩm nông nghiệp, thực vật thủy sinh, cỏ và các loại thực vật khác.
Bảng 1.4 Thanh phan hóa học của các nguồn điển hình chứa cellulose Nguồn Cellulose Hemicellulose Lignin Thanh phan
Ba mia 40 30 20 10 Xo dừa 32-43 10 — 20 43 — 49 4 LõI ngô 45 35 15 5 Thân cây ngô 35 25 35 5 Bông 95 2 | 0.4
Cây gai 76 17 i 6 Cây xi-dan B 14 i 2 Cây lục lạc 80 10 6 3 Rom 30 50 15 5
Cellulose là chuỗi polysaccharide mạch thang có câu tạo từ vai trăm dén hon 10 nghìn phân tử D — glucose liên kết với nhau băng liên kết B(1,4)-glycoside.
HOW, mo ằ Lo OH ơ _ 2 HON, ~ 0 `“ 4 “ WHO 2
COOR OH COOR
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Trà xanh được cung cấp bới công ty Đức Nguyên sản xuất và đóng gói quy cách gói 200g Trà xanh sẽ được rửa sạch, bỏ cuồng, chọn những lá tươi, không hư hỏng để thực hiện thí nghiệm.
Enzyme pectinase va cellulase được cung cấp bới công ty BrennTag Việt Nam, TPHCM Pectinase được sản xuất từ nắm mốc Aspergillus aculeatus, xuất xứ từ hãng Novozymes, Đan Mạch Nhóm enzyme là Polygalacturonase (PG) với hoạt tính công bố là 4751 U/ml, pH hoạt động từ 3,0 — 5,0; nhiệt độ khoảng 40 — 55°C.
Enzyme ở dạng lỏng, màu nâu, bao quản trong tủ mát từ 0 - 10°C trước và sau khi sử dụng Cellulase được sản xuất từ nam mốc Trichoderma reesei, xuất xứ từ hãng
Novozymes, Đan Mạch Nhóm enzyme là Endoglucanse (EG) với hoạt tính là 5021U/mL pH hoạt động từ 3,0 — 7,0, nhiệt độ khoảng 40 — 55°C Enzyme ở dạng lỏng, mau nau, bảo quan trong tu mát từ 0 - 10°C trước và sau khi sử dụng.
Enzyme protease được cung cấp bới công ty BrennTag Việt Nam, TPHCM, tên thương mại là Flavourzyme 500MG Thành phần gồm endoprotease và exopeptidase, với số đơn vị hoạt lực 0,5U/ ul Khoảng nhiệt độ tối ưu 35 — 55°C, pH
Maltodextrin sử dụng sản phẩm Glueidex 12D, xuất xứ Pháp, độ âm nguyên liệu 3,3%.
Methanol (Merk, Đức) Acid gallic (Merk, Đức) NazCOs3 (Merk, Đức) K2Cr2O7 (Merk, Đức) Folin-ciocalteu (Merk, Duc)
DPPH (Sigma-Aldrich, My) Trolox (Sigma-Aldrich, Mỹ)
2.2 Dụng cu va thiết bi
Lon sat tay Cuvet Thau nhựa Ong nghiém Binh định mức 50ml, 100ml Gia đỡ ống nghiệm
Bình tam giác 100ml Dia thủy tinh
Binh thủy tinh tối mau Ông nhỏ giọt Pipet Iml, 5ml, 10ml Chén say 2.2.2 Thiét bi
Cân 2 chữ số, 4 chữ số Máy quang phố UV-VIS pH kế Máy cô quay chân không Bề điều nhiệt May say phun (SD-06AG spray dryer, Anh) May say âm hồng ngoại Tủ lạnh
May hút chan không Bếp hồng ngoạiTủ sấy Máy xay sinh tổMáy lắc
2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu thành phần lá trà xanh
Khao sat thoi gian chan
Vv Khao sat quá trình thủy phân với cellulase và pectinase
Ne Đường tong, đường khử
Anh hưởng của nhiệt độ va thời gian chan Hàm mục tiêu
Tỷ lệ pectinase/ cellulase pH
Khao sat quá trình thủy phân với enzyme protease
Hàm lượng enzyme Thời gian thủy phân
Ni ưu hóa 4 yếu tố quy trình khảo sát chlorophyll
Ham luong polyphenol trong dich trich ly
Hàm lượng enzyme Thời gian thủy phân Tôi ưu hóa 2 yêu tô
Hàm lượng polyphenol trong địch trích ly yy, ` y,
Hoạt tớnh chống oxy húa (DPPH) ằ
Kiém tra các chỉ tiêu vi sinh Đường tong, đường khửPolyphenol tong
2.3.2 Quy trình trích ly dịch trà xanh bang enzyme
So ché Nước, cuống, lá hỏng, tạp chất,
Thủy phâ cellulase và uy phan pectinase y
“+ Sơ chế Muc đích: Loại bỏ bớt các tạp chat, vi sinh vật, thuốc bảo vệ thực vat, dé đảm bảo tính đồng nhất và chính xác cho nghiên cứu.
Phương pháp thực hiện: Rua dưới vòi nước chảy, chỉ loại bỏ các lá hư hong, thdi, va giữ lại luôn cả nhánh liền với lá. s* Chan Muc đích: Đình chỉ hoạt động các enzyme oxy hóa, ngăn ngừa tra xanh bị biến đổi mau, đồng thời cũng tiêu diệt một số vi sinh vật bám trên bề mặt nguyên liệu Quá trình làm tăng độ thâm thấu của nguyên sinh chất, làm cho dich bào thoát ra dé dang khi tiễn hành nghiên xay nguyên liệu Trong giai đoạn này, một số vitamin có thé bị phân hủy do nhiệt.
Phương pháp thực hiện: Chần nhanh trà trong nước sôi 10 giây, sau đó làm lạnh nhanh. s* Nghiền Muc đích: Phá vỡ cau trúc nguyên liệu tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình xử lý enzyme về sau.
Phương pháp thực hiện: Nghiền bằng cách xay băng máy xay đạt kích thước
Muc dich: Phân cắt chuỗi cellulose, pectin và protein thành những đơn vị ngắn hon nham làm tăng hiệu suất thu hồi chất khô hòa tan trong quá trình lọc.
Phương pháp thực hiện: Quá trình thủy phân được thực hiện trong bể điều nhiệt có lac đảo 120 vòng/ phút nham tăng kha năng tương tác giữa enzyme và cơ chất giúp cho quá trình thủy phân hiệu quả hon[55]. s* V6 hoạt enzyme
Muc đích: Đình chỉ hoạt động của enzyme b6 sung trong quá trình thủy phân, nham tránh các biến đối diễn ra sau thủy phân do enzyme b6 sung [40].
Phương pháp thực hiện: Cho các mẫu thủy phân vào nước nóng 85°C trong 3 phút[56] s* Lọc
Muc đích: Lọc qua ray có kích thước 16 0.5mm để tạo sự đồng nhất tương đối trong hỗn hợp huyền phù, đồng thời tránh ảnh hưởng xấu đến quá trình say phun.
Phương pháp thực hiện: Loc chan không qua vai lọc s* Cô đặc
Mục đích: Tách bớt một phan nước ra khỏi dịch lọc, tang ham lượng chất khô có trong dịch Thực hiện ở nhiệt độ 50°C, đến khi hàm lượng chất khô đạt 8.5%.
Phương pháp thực hiện: Dùng thiết bị cô quay chân không của phòng thí nghiệm.
* Phối trộn Muc đích: Tron thêm chất mang vào dich trà xanh làm tăng hàm lượng chất khô, tạo cầu trúc bột min cho sản phẩm, tăng hiệu suất thu hồi cho quá trình sấy phun.
Phương pháp thực hiện: Tính toán hàm lượng và bồ sung maltodextrin vào dịch tra xanh dé đạt nồng độ chất khô từ 15 — 30% (w/w) Khuay tan hoàn toàn trước khi đem đi sấy. s* Say phun Muc đích: Làm bỗc hơi nhanh lượng nước trong dung dich sau phối trộn băng nhiệt độ cao tạo ra sản phẩm dang bột min với độ hút âm thấp và bảo quản được lâu.
KET QUÁ VA BAN LUẬN 3.1 Kết quả xác định một số thành phan trong nguyên liệu
Bang 3.1 Một số thành phan trong nguyên liệu trà xanh
Thành phần Đơn vị Kết quả Độ âm % 69.82 Carbohydrat % khôi lượng chất khô 23,54 Đường tông % khôi lượng chất khô 6,81 Đường khử % khôi lượng chất khô 3,08 Protein % khôi lượng chất khô 15,57 Cellulose % khôi lượng chất khô 5,66
Pectin % khôi lượng chất khô 5,72 Tro % khôi lượng chất khô 4,5
Polyphenol tong mgGAE/g chat khô 53,38
Từ kết quả bảng 3.1 cho thấy, nguyên liệu dùng cho nghiên cứu có hàm lượng các chất như sau: nước chiễm 69,82%, carbohydrate chiém 23,54%, protein chiếm 15,57%, tro 4,5% khối lượng chất khô Protein, cellulose, pectinase chiém 5,66; 5,72 và 15,57% khối lượng chat khô, từ đó cho thay việc thủy phân bang enzyme dé giải phóng chất khô là hoàn toàn phù hợp.
Bên cạnh các thành phan trên, lá trà còn có ham lượng các hợp chat có hoạt tính sinh học cao, có lợi cho sức khỏe như: hàm lượng polyphenol 53,38 mgGAE/g chất khô, hoạt tính chống oxy hóa theo DPPH là 409,8 mgTEAC/100g.
3.2 kết quả xác định nhiệt độ và thời gian chan
Quá trình gia nhiệt sẽ làm biến màu hỗn hợp trà xay, cụ thể ở đây là màu xanh của lá trà — chủ yếu do chlorophyll tạo nên Do đó dé dam bao lá trà đạt được màu tôi ưu nhât sau quá trình chân, chúng tôi khảo sát chê độ chân với các chê độ nhiệt độ và thời gian khác nhau như đã trình bày ở bảng trên Kết quả thu được như đỗ thị dưới đây:
Hình 3.1: Anh hưởng của chế độ chan đến hàm lượng chlorophyll trong lá tra Ghi chú: Giá trị biéu diễn là trung bình ba lần lặp lại + độ lệch chuẩn Trong cùng một hàng, những giá tri nghiệm thức có cùng ký tự thì không có sự khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê với mức ý nghĩa a