Luận văn thạc sĩ Công nghệ thực phẩm: Nghiên cứu sản xuất Koji để ứng dụng trong sản xuất nước mắm từ thịt vụn cá ngừ

Từ cơ sở thực tiễn và khoa học trên, đề tài “Nghiên cứu sản xuất Koji để ứngdụng trong sản xuất nước mắm từ thịt vụn cá ngừ” được thực hiện nhằm mục đíchđánh giá khả năng sử dụng chế phẩ

ĐẠI HỌC QUOC GIA TP HCMTRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

HOÀNG THỊ HÀNG

NGHIÊN CỨU SAN XUẤT KOJI DE UNG DỤNG TRONG

SAN XUẤT NƯỚC MAM TU THỊT VỤN

CÁ NGUChuyên ngành: CÔNG NGHỆ THUC PHAMMã số: 60540101

LUẬN VÁN THẠC SĨ

TP HO CHI MINH, tháng 7 năm 2017

CONG TRINH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TAITRUONG DAI HOC BACH KHOA-DHQG-HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS Lại Quốc Đạt

Cán bộ chấm nhận xét 1: PGS.TS Phan Tại Huân

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyênngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nêu có).

CHỦ TỊCH HOI DONG TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CONG H A XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIEM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: HOANG THỊ HANG MSHV: 1570423Ngày, tháng, năm sinh: 29/9/1986 Nơi sinh: Hà NộiChuyên ngành: Công nghệ thực phẩm Mã số : 60540101I TÊN ĐÈ TÀI:

NGHIÊN CỨU SAN XUẤT KOJI DE UNG DỤNG TRONG SAN XUẤT NƯỚCMAM TỪ THỊT VỤN CÁ NGỮỪ

Il NHIEM VU VÀ NOI DUNG:- Khao sát ảnh hưởng của thành phan môi trường đến quá trình sinh tổng hopprotease trong quá trình tạo chế phẩm từ Koji

- Khảo sát các yếu tổ pH ban dau và độ âm canh trường đến quá trình sinh tổnghop protease trong quá trình tạo chế phẩm từ Koji

- Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ bỗ sung chế phẩm protease từ Koji đến quá trìnhthủy phân protein từ thịt vụn co sam cá ngừ

- Khảo sát ảnh hưởng của phương pháp bổ sung muối đến quá trình thủy phânprotein từ thịt vụn cơ sam cá ngừ

Ill NGÀY GIAO NHIỆM VU: 16/01/2017

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 18/6/2017V CAN BO HUONG DAN: TS Lại Quốc Đạt

Tp HCM, ngay 16 thang 01 nam 2017

CAN BO HUONG DAN CHU NHIEM BO MON DAO TAO

(Họ tên va chữ ky) (Họ tên và chữ ký)

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

(Họ tên và chữ ký)

LỜI CÁM ƠNĐầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn và bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhất đến TS.Lại Quốc Đạt Xin cảm ơn thay đã luôn tan tình chi day cho tôi những kiến thức vàhướng dẫn cho tôi những kỹ năng nghiên cứu quý báu nhất trong quá trình tôi thựchiện luận văn.

Tôi cũng xin cảm ơn Quý thầy cô trường Đại học Bách Khoa — Đại học Quốc GiaTP.HCM, Quý thầy cô bộ môn Công nghệ Thực phẩm đã truyền đạt những kiến thứcvà kinh nghiệm hữu ich cũng như tạo mọi điều kiện giúp tôi hoàn thành luận van.

Ngoài ra, tôi cũng xin cảm ơn tới những bạn học viên Cao học và những bạn sinhviên Đại học cùng làm việc tại phòng thí nghiệm vi sinh và phòng thí nghiệm hóa sinhtại trường Dai học Bách Khoa đã giúp đỡ và hỗ trợ tôi rất nhiệt tình trong quá trình tdithực hiện luận văn.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và lòng biết ơn sâu sắc nhất

Thành pho Hô Chi Minh, ngày 18 tháng 6 năm 2017

Học viên thực hiện

Hoàng Thị Hằng

TOM TAT LUAN VANHiện nay, trong quá trình sản xuất cá ngừ phi lê, một lượng lớn phế phẩm đượcthải ra, trong đó riêng phan cơ sam cá ngừ chiếm tỷ lệ khoảng 10% khối lượng nguyênliệu Đây là nguồn đạm rất đáng kế, nhưng dang duoc sử dung dé làm bột cá bố sungvào thức ăn gia súc và thủy sản như phế liệu của các loại thủy sản khác Do đó, nếunguồn phế liệu nay được khai thác dé sản xuất các sản phẩm có giá trị gia tăng cao, sẽgóp phần làm tăng hiệu quả kinh tế của ngành chế biến biến thủy sản

Trong những năm gân đây, nguồn nguyên liệu đạm phục vụ cho sản xuất nướcmam đang ngày càng thiếu hụt Trong khi đó, nhu cau sử dụng nước mắm của ngườitiêu dùng trong nước ngày càng tăng do số lượng người tiêu dùng ngày càng tăng Nếunguồn thịt vụn cá ngừ được sử dụng để sản xuất nước mam, với một phương pháp phùhợp, sẽ góp phần giải quyết được được thực trạng này

Tuy nhiên, trong thịt vụn cá ngừ không có nguồn protease sẵn có như trong nộitạng của cá Do đó, dé sản xuất nước mam, can thiết phải bd sung nguồn enzyme từbên ngoài vào Chế phẩm Koji, chế phẩm enzyme thô từ nam mốc Apergillus oryzae đãđược sử dụng như nguén protease trong sản xuất các sản phẩm như nước tương từ đậunành Do đó, đây có thể được xem là nguồn enzyme phù hợp trong sản xuất nước mămtừ thịt vụn cá new.

Từ cơ sở thực tiễn và khoa học trên, đề tài “Nghiên cứu sản xuất Koji để ứngdụng trong sản xuất nước mắm từ thịt vụn cá ngừ” được thực hiện nhằm mục đíchđánh giá khả năng sử dụng chế phẩm Koji để sản xuất nước mắm từ thịt vụn cá ngừ đểgóp phan đa dạng hóa nguồn nguyên liệu sản xuất nước mắm đáp ứng nhu cầu củangười tiêu dùng, tăng hiệu quả kinh tế của ngành chế biến thủy sản Theo mục đích đó,nội dung được thực hiện trong đề tài bao gom hai phan chinh sau:

Phan 1: Nghiên cứu các yếu tô ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hop protease từKoji trên môi trường đậu nành dé tạo chế phẩm Koji b6 sung vào quá trình thủy phân

thịt vụn cá Các nội dung khảo sát bao gồm: Ty lệ đậu nanh/trau, hàm lượng chất cảm

ứng casein, pH canh trường, độ âm canh trường.Phần 2: Khảo sát quá trình lên men nước mắm từ thịt vụn cá ngừ sử dụng enzymeprotease từ chế phẩm Koji đã nuôi cấy Các yếu tố khảo sát bao gdm: Hàm lượng chếphẩm enzyme (thông qua tỷ lệ bỗ sung chế phâm Koji) và phương pháp b6 sung muối

Kết quả nghiên cứu thu được như sau:

- Môi trường thích hợp cho quá trình nuôi cấy giống Koji để sinh tổng hợpprotease là: ty lệ đậu nanh/trau/casein là 70/25/5 theo khối lượng, pH ban đầu 7, độ âmban đầu 50 % w/w Ở điều kiện trên, với mật độ vi sinh vật là 10° cfu/mL, thời gian lênmen là 72 giờ, hoạt lực protease thu được là 1,228 U/g chế phẩm thô

- Kết quả khảo sát quá trình lên men nước mam băng chế phẩm Koji sinh tổnghợp được cho thấy, điều kiện thích hợp cho quá trình lên men nước mắm từ thịt vụn cángừ là nông độ enzyme bồ sung là 1,2 U/g protein cá, hàm lượng muối là 15%, đượcbố sung làm 4 lần Với điều kiện đó, sau 18 ngày lên men, sản phẩm nước mắm thuđược có nông độ Nitơ tổng là 22,69 g/100g, Nitơ acid amin là 19,05 g/100g và nitơNH; là 2,37 g/100g, tỉ lệ nito amin/nito tong là 83,96%

Kết quả nghiên cứu thu được cho thấy, việc sản xuất nước mắm từ co sam thịtvụn cá ngừ là khả thi về mặt kỹ thuật Tuy nhiên để có thể ứng dụng trong thực tiễn sảnxuất, cần phải thực hiện thêm các nghiên cứu khác như: Tối ưu hóa quá trình lên men,khảo sát chất lượng dinh dưỡng và chất lượng cảm quan của sản phẩm tạo thành, đánhgiá hiệu quả kinh té của quá trình sản xuât nước măm từ thịt vụn cơ sâm cá new.

ABSTRACTAt present, in the processing of tuna fillet, a large amount of by-product, in whichthe red tuna muscle accounts for about 10% of the volume of raw materials This is avery significant source of protein, but is being used to make fishmeal supplements incattle feeds and fisheries as waste of other fisheries Therefore, if the source of this by-product is exploited for the production of high value products, it will contribute to theeconomic efficiency of the maritime product processing industry.

In recent years, the source of raw materials for fish sauce production isincreasingly in short supply Meanwhile, the demand for fish sauce of domesticconsumers is increasing due to the increasing number of consumers If the source ofscrap tuna fish is used to produce fish sauce, with a suitable method, will contribute tosolve this situation.

However, in tuna scrap there is no available source of protease as in the viscera offish Therefore, to produce fish sauce, it is necessary to add enzyme source fromoutside Koji, the crude enzyme preparation from Apergillus oryzae, has been used as asource of protease in the manufacture of products such as soy sauce Therefore, this isconsidered to be a suitable source of enzymes in the production of fish sauce from tuna

scraps.

Base on following practical and scientific basic, the matter of “Research on theproduction of protease from Koji for use in fish sauce from red tuna muscle” wascarried out for the purpose of evaluating the potential use of Koji inoculants forproduction fish sauce from tuna scrap to help diversify the source material of fish sauceproduction to meet the demand of consumers, increase the economic efficiency ofmaritime product processing For that purpose, the content included in the topicconsists of the following two main section:

Section |: Research on factors influencing the biosynthesis of protease from Kojion soybean to produce Koji preparation supplemented with hydrolysis of tuna scrap.The contents of the survey included: soybean/paddy, casein inducible content, initialpH, culture moisture.

Section 2: Investigation of fermented fish sauce from tuna scrap using proteasefrom cultured koji The survey factors include: enzyme content (follow Kojisupplementation rate) and salt addition method.

Research results show that:

The suitable environment for Koji cultivation for biosynthesis of protease is: Theratio of soybean/paddy/casein is 70/25/5 by mass, pH: 7, humidity: 50% w/w With the

conditions, a microbial density of 10°cfu/mL, the fermentation time was 72 hours, the

enzyme activity was 1,228 U/g.

Results of fermented fish sauce fermentation with Koji biosynthesis of proteaseshowed that the suitable condition for fermented fish sauce from tuna scrap wasenzyme concentration: | ,2 U/g protein fish, salt content is 15%, added in 4 times Withthat condition, after 18 days of fermentation, the fish sauce obtained was the totalnitrogen concentration of 22,69 g/100g, nitrogen amine is 19,05 g/l00g and NH3nitrogen is 2,37 g/I, the ratio of nitrogen amine/nitrogen is 83 ,96%.

The results of the study showed that the production of fish sauce from red tunamuscle was technically feasible However, in order to be able to apply in productionpractice, other studies such as optimizing the fermentation process, nutritional qualitysurvey and sensory quality of the products must be carried out, the cost-effectivenessof the production of fish sauce from tuna fish scraps.

LỜI CAM ĐOANTôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của chính bản thân tôi Các nộidung nghiên cứu và các kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai côngbố trước đây, không sao chép từ bat cứ tài liệu hay bất cứ nguồn nào dưới mọi hìnhthức Việc tham khảo nguồn tài liệu (nếu có) đều được trích dẫn và ghi rõ nguồn tàiliệu tham khảo theo đúng quy định.

Tác gia luận văn

Hoàng Thi Hang

MUC LUC09099000) i

TOM TAT LUẬN VĂTN -° << SE 9 ưu 0 x0 x0 scxe ii

LOT CAM DOAN uvccsssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssnsssssssssssssssssssssssssessess vi

MUC LU Cu.in ccccctrcccscctecccsccccccsscccscsessccsesssssssessssscccesssscscssssccssssesscesssssssscssssssscssers ViiDANH MỤC BÁNG 5-09 0 99.090.299 0 1 1xx sesese xii

DANH MỤC HÌNHH - 2° %9 E9 959 g0 g0 9 0 955952 xiv

MỞ DAU unssssssssssssssssssssssscessscssscsssssssesssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssnssesseeseess 1

1 Đặt vẫn đề - c1 112g HT ng HH HT ng l

2 Mục tiêu của để tài - tk 1112191 3 51119191 1E 11129 01011111111 111g ng ng 2

3 Nội dung nghiÊn CỨU - << 1 10000 0.00 nọ 24.Ý nghĩa về khoa học và thực tiỄn + + xxx S111 2111 E51 11 5151 3 181 1E xe ree 3

CHƯƠNG 1: TONG QUANN < 5< 7.1 nrkenrerreosereorseoreiie 4

1.1 TỐng quan VỀ Cá 'IØừ - ¿6 SE 2E9E9EE 191212191111 21111111 2111211111111 11111 4

[.I.1 Giới thiệu Chung .- «c0 nọ re 41.1.2 Phân loại và phân bồ - ¿2E E2 SE EE E19 5E E21 15111 5111111111111 11 11x Te 4

1.1.2.1 Phân loại của cá ngừ tại Việt Nam - - - << G S0 HH ke 41.1.2.2 Sự phân bố của cá gr -¿-¿- - ¿5+ 2t+S* SE E9 12321911 211111 2111112111111 te 5

1.1.3 Thành phan hóa học của cá 'ng8Ừ ¿+ + S2 +E+E2EE2EEEEEEEEEEEEEEEEEkrrrrrrrrkee 6

1.1.4 Thực trạng về chế biến cá ngừ hiện nay ¿5-5252 222E£*cxvEcrerrrrererree 7

1.1.4.1 Thực trạng chung trên toàn thé giới +: + 2 2 2E+ES£+E+EEzEvxererrrrererree 7

1.1.4.2 Tinh hình chế biến cá ngừ tai Việt Nam w cccccccscsccsescscssesssssesessesssesessesssesees 9

(o1: 0/0707 77 :.‹-1 10

1.2.1 Lịch sử phát trién KOjï ¿5522522223323 2232121112121 11c 10

1.2.2 Ban chat ctha Kojiccecccccccccccscsssscsssscsesscsesesscsesscsssesscsssesscsesesscscsesesseseseesesesesseseeeeees 10

1.2.3 Các yếu tô anh hưởng đến sinh tong hợp protease trong mốc Koji Aspergillus27274277-EEPP77SSẺẺẺ ddẢẢẢẢ II

1.2.3.1 Thành phan môi trường - ¿2+ 256292 SE+E+EEEE£EEEEEEEEEEEEEEEEErrkrkrrrrrreee 11

1.2.3.2 Điều kiện nuôi cấy veececcececcccccscsssscscscscsescsescscsssscscscsvssssesesescsssssssscsestsssseeeseess 13

1.3 Nước mam và quá trình lên men nước mắm bố sung profease - 19

1.3.1 Thuc trang san xuất nước mắm tại Việt Nam hiện I0 19

1.3.2 Co sở khoa học của ứng dung protease trong sản xuất nước măm 20

1.3.2.1 Cơ chế phân giải của enzyme protease ¿5-5525 2xcEzzrerererree 20

1.3.2.2 Phương pháp sản xuất nước mắm truyền thống và phương pháp có bổ sungCNZYME 2 ( 21

1.3.3 Ứng dụng chế phẩm protease tir Koji trong sản xuất nước MAM 23

CHUONG 2: NGUYEN LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Nguyên liệu và hóa chất ¿- 55252 SE E93 1239112321911 2111 2111211111111 .cxye 25

2.I.1 Nguyên lIỆU - - - << c G00 nọ re 252.1.2 Ha 08 ‹‹‹+1DD 25

"61 J0 00 0 -:‹-11IA 26

2.3 Nội dung nghiÊn CỨU - - < << 11000000 27

2.3.1.3 Khảo sát ảnh hưởng của pH ban dau của môi trường nuôi cay đến hoạt tínhDU ằa - 29

2.3.1.4 Khảo sát ảnh hưởng của độ âm ban đầu của môi trường nuôi cây đên hoạt00189: d - 292.3.2 Khảo sát khả năng sử dụng chế phẩm Koji để thủy phân protein trên cơ chất thịtVUN CO SAM CA MU 01 an 302.3.2.1 Phan tich thanh phan hóa học của thịt vụn co sam cá nØỪ << 30

2.3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của phương pháp b6 sung muối một lần trong quá trìnhthủy phân protein từ thịt vụn co sam cá ngừ bằng chế phẩm Koiji - 31

2.3.2.3 Khảo sát anh hưởng của nồng độ protease va phương pháp bồ sung muốitrong quá trình thủy phân protein từ thịt vụn co sam cá ngừ băng chế phẩm Koji 32

2.4 Các phương pháp phân tÍch - + 1999910110111 090 0 332.4.1 Phương pháp định lượng bào tử (đếm trực tiếp) ¬ 33

2.4.2 Xác định hàm lượng AM - ¿2 5£ SE2ESEE E3 E3 CA E111 33

2.4.3 Xác định hoạt tính protease bằng phương pháp Anson cải tiến 33

2.4.4 Phương pháp xác định hàm lượng tro nung đến khối lượng không đổi 33

2.4.5 Phương pháp xác định hàm lượng chất béo - ¿5 +5 +2 ££+s+E+£zzzrszed 33

2.4.6 Xác định hàm lượng nito tong - ¿- 552222522 SE‡EEEEEEEEEEEEEEEEkrkrkrrrrrrree 33

2.4.7 Xác định hàm lượng nito acid amin bang phương pháp Ninhydrin 33

2.4.8 Xác định hàm lượng nitơ amoniac (Nxua) bằng phương pháp chưng cất 34

2.4.9 Xác định tỉ lệ mito amin/ nito tONg + ¿5 5+ 2xx 2EEeErkekrrkrkrrrrerree 34

2.4.10 Phương pháp xử lý $6 liệu - + - + 2 SE SE2E£ESEEEEEEEEESEEEEEEEEEEEErErrrrrred 34

CHƯƠNG 3: KET QUA VA BAN LUẬN - 2 <5 s° 5 sssssessssesessssese 35

3.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến quá trình sinh tổng hợpprotease trong quá trình nuôi cay mốc Aspergillus OrVZđ€ 5-5-5255 ccsccceccse 35

3.1.1 Ảnh hưởng của tỉ lệ đậu nanh/trau trong môi trường nuôi cay đến hoạt tínhDU 6G ( a3 353.1.2 Ảnh hưởng của hàm lượng casein đến hoạt tính protease - 37

3.1.3 Ảnh hưởng của pH ban đầu của môi trường nuôi cấy đến hoạt tinh protease 39

3.1.4 Ảnh hưởng của độ 4m ban đầu của môi trường đến hoạt tinh protease 41

3.2 Kết qua khảo sát kha năng sử dụng chế phẩm Koji dé thủy phân protein trên cochất thịt vụn cơ sam cá 10 — -12A 43

3.2.1 Thành phân hóa học của thịt vụn co sam cá HØỪ TQ re 43

3.2.2 Anh hưởng của việc bố sung muối một lần đến khả năng thủy phân protein từthịt vụn co sam cá ngừ băng chế phẩm Kojji - ¿25525252 2*+E+££Evxerezeerererree 45

3.2.3 Anh hưởng của việc bồ sung muối nhiều lần đến khả năng thủy phân protein từthịt vụn co sam cá ngừ băng chế phẩm Kojji - ¿25525252 2*+E+££Evxerezeerererree 50

CHUONG 4: KET LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ, 5 5° 5s s2 se ssssesssese 57

n<‹ 7 57

4.2 Kiến nghị -c- c3 1 12 1111111111511 11 110111111111 11010111 111101111111 01 70010111100 57

PHỤ LỤC

DANH MỤC BANGBảng 1 1 Thanh phan chiều dai một số loài cá ngừ [6] -¿-5-+5555c£s£s+szc+2 5

Bảng 1 2 Sự phân bố của 4 loại cá ngừ có sản lượng đánh bắt lớn nhất tại Việt Nam 6

Bảng 1 3 Thành phan dinh dưỡng trung bình trong 100g cá ngừ [8] - 7

Bảng 1 4 Thành phần dinh dưỡng (theo giá trị trung bình) trong 100g hạt đậu nành 15

Bảng 1.5 Thành phan acid amin của đậu nành . + +55 25s+s+s++s+x+ezscsee 16

Bảng 2 1 Tỉ lệ trâu/đậu nành trong môi trường khác nhau 27

Bang 2 2 Hàm lượng casein trong môi trường nuôi cấy khác nhau - 28

Bảng 2 3 Lượng muối cần bố sung và thời gian bồ sung vào canh trường 32

Bảng 3 1 Kết quả hoạt tính protease ở các thành phần môi trường nuôi cây khác nhau¬ 35Bảng 3 2 Ảnh hưởng của hàm lượng casein đến hoạt tinh protease - 37

Bang 3 3 Kết quả hoạt tính protease dưới anh hưởng của pH ban đầu môi trường 39

Bảng 3 4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của độ âm đến hoạt tính protease trong quátrình nuôi cấy: -.- ¿+ c2 t2 1219112121211 131111 211111111111 11 1111111111010 010111 111g 41

Bang 3 5 Thanh phan nguyên liệu thịt vụn cơ SAM cá ngừ -. - 55555: 43

Bảng 3 6 Thành phan amino acid trong thịt vụn cơ Sam cá ngừ - 44

Bang 3 7 Kết quả phân tích trong quá trình thủy phân protein b6 sung muối một lầntương ứng hoạt độ protease ban đầu 1,1 U/g protein cá - ¿5-55 + s+s+sscs¿ 46

Bang 3 8 Kết quả phân tích trong quá trình thủy phân với hàm lượng chế pham KojiJa 1,1 U/g protein 7 ốẻe 50

DANH MỤC HÌNHHình 2 Sơ đồ quy trình nghiên €ỨU -¿- ¿+2 SE +E+E2SE+E+EEE£ESEEEEEESEEcerkrkrrkrrrrees 26

Hình 3 1 Ảnh hưởng của tỉ lệ trấu/đậu/casein đến hoạt tinh protease trong quá trìnhnuôi cay chế phẩm Koji (®: MTI, m: MT2, A: MTT3), - 5-5-5252 S222 2E£E+EzEzrerercee 36

Hình 3 2 Ảnh hưởng của lượng casein bố sung trong môi trường nuôi cây đến hoạt

tính protease (®: 3%, m: 4%, Á: 52%, X: Ó0) QQQQQQQQHHH HH HH TH re 38

Hình 3 3 Ảnh hưởng của pH ban đầu của môi trường đến hoạt tinh protease (®: pH 5,m:pH 6, A: pH 7, x: PH §) . c1 1131011139101 1 9 0111 ng 39Hình 3 4 Ảnh hưởng của độ 4m đến hoạt tinh protease trong quá trình nuôi cấy 42

Hình 3 5 Sự biến đôi hàm lượng nitơ tong trong quá trình thủy phân protein từ thịtvụn cơ sam cá ngừ băng chê phầm Koji b6 sung muôi một lân - 46Hình 3 6 Sự biến đối hàm lượng nitơ acid amin trong quá trình thủy phân protein từthịt vụn co sam cá ngừ băng chế phẩm Koji bố sung muỗi một lần - 47

Hình 3 7 Sự biến đổi hàm lượng nitơ NH; trong quá trình thủy phân protein từ thịtvụn cơ sam cá ngừ băng chê phầm Koji b6 sung muôi một lân - 47Hình 3 8 Tỷ lệ nitơ acid amin/nitơ tổng trong quá trình thủy phân protein từ thịt vụncơ sam cá ngừ băng chê phâm Koji bô sung muôi một lân - -«««<- 46Hình 3 9 Hoạt lực protease trong quá trình thủy phân protein từ thịt vụn cơ sam cángừ bang chế phẩm Koji b6 sung muối một lần - - ¿22-5 2+2 2+s+£+£+zszsee: 46

Hình 3 10 Tỉ lệ nito tổng trong quá trình thủy phân protein từ thịt vụn co sam cá ngừbăng chế phẩm Koji bố sung muối nhiều lần ($: 1,1 U/g, m: 1,2 U/g, A: 1,3 U/g) 52

Hình 3 11 Sự biến đổi hàm lượng nito acid amin trong quá trình thủy phân protein từthịt vụn co sam cá ngừ bằng chế phẩm Koji bố sung muối nhiều lần ($: 1,1 U/g, m: 1,2U/g, Mt 1,3 20 ỐỐỔỐỔ.ằ - Ả 53

Hình 3 12 Sự biến đổi hàm lượng nito NH; trong quá trình thủy protein từ thịt vụn cosam cá ngừ băng chế phẩm Koji b6 sung muối nhiều lần (: 1,1 U/g, m: 1,2 U/g, A: 1.3

Hình 3 13 Tỉ lệ nitơ acid amin/nitơ tổng trong quá trình thủy phân protein từ thịt vụncơ sam cá ngừ băng chế phẩm Koji bố sung muối nhiêu lần (®: 1,1 U/g, m: 1,2 U/g, A:

MỞ ĐẦU1 Đặt van đề

Trong ngành chế biến nước mắm ở nước ta từ trước tới nay, nguyên liệu thườngdùng là cá cơm, cá thu, cá nục, cá phèn [rong đó, cá cơm được sử dụng nhiều nhất.Riêng đối với cá ngừ ở nước ta, sản lượng khai thác khá lớn, một số phụ phẩm như

dau, xương, nội tạng, mang, vay cá, bung, da, được nghiên cứu thu nhận các thành

phan có giá trị như lipid, protein, Nhung nguồn phụ phẩm này chủ yếu sử dụng trongtrong sản xuât bột cá, dâu cá, giá trị kinh tê không cao.

Riêng đối với thành phan co sam cá ngừ, đó là phan thịt den gần xương sống,nguyên liệu cá sau khi sản xuất ra các mặt hàng trên phan cơ thịt sam loại ra có thé lênđến 20% tổng trọng lượng của nguyên liệu [1] Thành phan dinh dưỡng khá cao, lượngthải ra tương đối lớn, có thé tận dụng để tăng giá tri sử dụng Tuy nhiên, hiện tại lượngthịt này được sử dụng làm thức ăn chăn nuôi hoặc bán ra các đầu mối bán lẻ tại các chợvới giá thành từ 4.000 — 5.000 đ/kg Các nhà máy chế biến cá ngừ vẫn chưa tìm đượcgiải pháp hiệu quả để tận dụng lượng thịt đỏ này sản xuất các sản phẩm có giá trị kinhtế, đảm bảo chất lượng về vệ sinh an toàn thực phẩm [2]

Theo AC Nielsen (2015), tổng thị phan nước mắm Việt Nam khoảng 230 triệulí/năm và doanh thu 554 triệu đô la Mỹ Nhu cau của thị trường hằng năm tăng khoảng5 + 7% Như vậy có thé thay răng thị trường nước mắm vẫn đang phát triển mạnh và cónhiều tiềm năng [3]

Việc tận dụng phan thịt giàu protein này vào quá trình chế biến nước mắm là rấtcần thiết và hợp lý, vừa tận dụng được lượng phế liệu có giá trị dinh dưỡng, vừa giúpgiải quyết cho van dé thiếu hụt nguồn nguyên liệu sản xuất nước mắm hiện nay, khi manguồn cá cơm đang ngày càng khan hiếm, tạo ra sản phẩm có giá tri gia tăng cao hơn.Tuy nhiên, do trong nguồn phụ phẩm này không có protease để có thể thủy phân

protein nên can phải bô sung protease vào nguyên liệu trong quá trình lên men nướcmam Nêu su dụng chê phâm enzyme protease thương mai dé thủy phân protein trongchê biên nước mam thì giá thành tương đôi cao, phụ thuộc vào nguôn cung cap trên thịtrường, dẫn đến hiệu quả kinh tế thấp.

Koji là chế phẩm giống nam mốc được sản xuất dau tiên ở Nhật Bản Khi muốntạo ra các loại enzyme mong muốn thì việc đầu tiên sẽ là cấy giống mốc thuan chủnglên cơ chất hạt gạo, malt hoặc đậu nành, sau đó sẽ được sây khô và đóng gói, nhằm tạora bào tử giống thuần khiết của Aspergillus oryzae hoặc Aspergillus sojae, lúc này cóthé sử dụng giống nay dem cấy truyền sang mẻ khác để tạo ra enzyme với số lượng lớntrên những cơ chất khác nhau [4] Koji đã được ứng dụng trong lên men nước tương từđậu nành, lên men rượu sake của Nhật Bản bằng quá trình đường hóa, hoặc ứng dụnglên men hôn hợp đậu nành và bột mì đê làm sản phâm miso, xì dâu

Trên cơ sở đó, dé tài: “Nghiên cứu san xuat koji đề ứng dụng trong sản xuâtnước mắm từ thịt vụn cá ngừ” được nghiên cứu đê góp phân khai thác hiệu quả

nguồn phụ phẩm cá ngừ, nâng cao hiệu quả kinh tế trong ngành chế biến thủy sản

2 Mục tiêu của đề tàiMục tiêu chung của đề tài là góp phần nâng cao hiệu quả của của ngành chế biếnthủy sản thông qua việc sử dụng hiệu quả nguồn phế liệu tao ra sản phẩm có giá trị gia

tăng cao.

Mục tiêu cụ thé của dé tài là nghiên cứu khảo sát quá trình sản xuất chế phẩmKoji từ mốc Aspergillus oryzae và đánh giá khả năng sử dụng trong quá trình lên mennước măm từ thịt vụn cơ sâm cá ngừ.

3 Nội dung nghiên cứuDé thực hiện mục tiêu nghiên cứu của đê tài, các nội dung nghiên cứu sau đượcthực hiện:

- Khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường đến quá trình sinh tổng hợpprotease trong quá trình tạo chế phẩm Koji.

- Khảo sát các yếu tố pH ban đầu và độ âm canh trường đến quá trình sinh tổnghop protease trong quá trình tạo chế phẩm Koji

- Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ bỗ sung chế phẩm Koji đến quá trình lên mennước mam từ thịt vụn cơ sam cá ngừ

- Khảo sát ảnh hưởng của phương pháp bồ sung muối đến quá trình lên men nướcmam từ thịt vụn cơ sam cá ngừ.

4 Y nghĩa về khoa học và thực tiễn4.1 Y nghĩa khoa học:

Ý nghĩa khoa học của đề tài là:

- Góp phần cung cấp dữ liệu khoa học về sự ảnh hưởng của một số yếu tố đến quátrình sinh tổng hop protease trong quá trình nuôi cay Koji từ nam mốc Aspergillus

CHUONG 1: TONG QUAN1.1 Tong quan vé ca ngir

1.1.1 Giới thiệu chungCá ngừ thuộc họ cá thu ngừ, tên gọi chung là cá ngu đại dương, là loại cá lớnthuộc họ cá bạc má (Scombridae), chủ yếu thuộc chi Thunnus, sinh sống ở vùng biếnâm, cách bờ độ 185 km trở ra [5]

Gioi: AnimaliaNgành: ChordataLớp: ActinopterygiBo: PerciformesHo: ScombridaeChi: ThunnusCá ngừ là loại cá có giá trị kinh tế quan trọng nhất ở biển Việt Nam Cá ngừ phânbố ở khắp các vùng biển Việt Nam, kích thước cá tương đối lớn (6 loài có kích thướctừ 20 + 70 cm, khối lượng từ 0,5 + 4 kg Riêng hai loài cá ngừ vây vàng và cá ngừ mắtto có kích thước lớn 70 + 200 cm, khối lượng 1,6 + 64 kg)

1.1.2 Phân loại và phân bố1.1.2.1 Phần loại của cá ngừ tại Việt Nam

Trong 14 loài cá ngừ thuộc 8 giỗng phân bố ở Biển Đông va lân cận, ở biển ViệtNam đã bat gặp 8 loài thuộc 5 giống, đó là:

- Cá ngừ chu: Auxis thazardCá ngừ ô: Auxis rocheiCá ngừ chấm: Euthynnus affinisCá ngừ bò: Longtail tunaCá ngừ sọc dua: Sarda orientalisNgoài 5 loại cá ngừ trên, còn có 2 loại cá ngừ di cư đại dương là: Cá ngừ văn

(Katsuwonus pelamis) và cá ngừ vây vàng (Thunnus albacares), là đôi tượng của nghêcâu vàng, mới vào Việt Nam trong thời gian gân đây [6].

Đặc điêm sinh học của một sô loài cá ngừ như sau:

Bang 1 1 Thanh phan chiều dai một số loài cá new |6]

Loài Chiêu dài đánh bat (em)

Auxis rochei 20 — 59A.thazard 24-29Euthynnus affinis 20 — 64Sarda orientalis 41-7]Thunnus tonggol 26 — 68Katsuwonus pelamis 41-65

Tất cả các loài cá ngừ kế trên chủ yếu ăn cá thuộc giống cá nuc (Decapterus):Mực ống (Loligo spp); cá trích (Sardinella.Spp) và cá com (Stolephorus spp) va cađộng vật phù du [6].

1.1.2.2 Sự phân bố của cá ngừCá ngừ phân bố rộng ở vùng nước ven bờ và ngoài khơi biển Việt Nam Theo kếtquả phân tích cá ngừ đánh bat bằng lưới rê, có thé cho rang cá ngừ từ ngoài khơi biểnĐông bat đầu di cư vào vùng biến miền Trung từ tháng | + 2 Chúng ở vùng biển miềnTrung một thời gian và sau đó thì một phân di cư lên phía Bắc vào Vịnh Bắc Bộ từtháng 3 + 4 và ở đó cho đến tháng 8 + 9, một phan di cư xuống phía Đông Nam Bộ vàVịnh Thái Lan, phần lớn cá vẫn ở lại vùng biên miền Trung [6T]

Sự phân bố của 4 loại cá ngừ có sản lượng đánh bắt cao nhất tại Việt Nam đượcthé hiện trong Bảng 1.2:

Bang 1 2 Sự phân bố của 4 loại cá ngừ có sản lượng danh bắt lớn nhất tại Việt Nam[6].

Loài Vùng biến

Vịnh Bắc BộNeu chù Miễn Trung

Vịnh Thái LanVịnh Bắc Bộ

Ngừ cham Vịnh Thái Lan

Ngừ bò Vịnh Thái Lan

Vịnh Bắc BộNgừ sọc dưa Miễn Trung

1.1.3 Thành phan hóa học của cá ngừMỗi loại cá ngừ có hàm lượng dinh dưỡng khác nhau, tính theo giá trị trung bìnhthì cá ngừ thuộc loại có hàm lượng dinh dưỡng tương đối cao, nhất là hàm lượngprotein trong cơ thịt cá ngừ Tinh theo hàm lượng trung bình bao gồm cả: vây, da, bụng được trình bày trong Bảng 1.3 Trong khi dùng trong chế biến thì cần phải loại bỏcác thành phần như mang, vây, da hàm lượng dinh dưỡng trong những thành phầnnày lại không nhiều

Có thé thay nếu chi tính hàm lượng protein trong cơ thịt cá ngừ thì cao hơn hancác loại cá khác, cụ thể là loài cá cơm, loại cá thường dùng để sản xuất nước mắm.Hàm lượng dinh dưỡng trong cá cơm bao gom nước là 78,3%, protein là 18,7%, lipid

1,7% [7].

Bang 1 3 Thanh phan dinh dưỡng trung bình trong 100g cá ngừ [8]

Thành phần Hàm lượngNước 77,5 98Protein 210gLipid 03g

Tro 12gCa 44 mg

P 206 mgFe 1,0 mgVitamin A 5 mcgVitamin BI 0,02 mgVitamin B2 0,08 mgVitamin PP 4.0 mg

1.1.4 Thực trạng về chế biến cá ngừ hiện nay1.1.4.1 Thực trạng chung trên toàn thé giới

Trong năm 2011, trong khi sản lượng khai thác cá ngừ toàn cầu đạt khoảng 4,76triệu tan, thì lượng sản phẩm cá ngừ đóng hộp chỉ có gần 2 triệu tan Các phụ phẩmđược thải ra từ sản xuất cá ngừ đóng hộp (bao gồm đầu, bộ xương, nội tạng, mang,phân thịt màu sam, vây bụng và da) có thé chiếm tỉ lệ rất lớn so với lượng nguyên liệuban đầu Các số liệu báo cáo trong ngành sản xuất thịt cá ngừ cho thấy các phế phẩm,phụ phẩm chiếm khoảng 50% tổng nguyên liệu ban đầu Khi philê cá, sản phẩm datđược thường chỉ chiếm khoảng 30-50% so với lượng nguyên liệu ban đầu [9]

Có thé thay, ngành chế biến cá ngừ đã và đang tao ra một lượng đáng kế các phếphẩm, phụ phẩm và thịt vụn từ các thành phần như dau, bộ xương, bụng, gan và trứng.Đây là những bộ phận chứa protein chất lượng cao, axit béo omega-3, vi chất dinh

dưỡng (như vitamin A, D, riboflavin, niacin) và khoáng chất (như sắt, kẽm, selen và ốt) [10].

i-Ngành cá ngừ cũng đã có những tiễn bộ đáng ké trong tận dụng các phụ phẩmcho người tiêu dùng Từ lượng phế phẩm, phụ phẩm của cá ngừ, một công ty ở TháiLan đã sản xuất khoảng 2.000 tan dầu cá ngừ hang năm Đây là một sản phẩm có giá trịcao dành cho con người Dau cá ngừ tinh chế có 25 + 30% là axit docosahexaenoic(DHA), và thậm chí là cả axit eicosapentanoic (EPA), chúng thường được bổ sungtrong các thực phẩm pho biến như bánh mì, sữa chua, sữa và sữa công thức cho trẻ sơsinh [10].

Sau Thái Lan, Philippines là nước lớn thứ 2 trong sản xuất cá ngừ đóng hộp ởchâu A Phan thịt mau sam (chiếm khoảng 10% trong cá ngừ) được đóng hộp và xuấtkhẩu sang các nước như Papua New Guinea Thịt màu sam của cá ngừ có chất lượngdinh dưỡng cao hon so với thịt bình thường bởi chúng có hàm lượng cao các axIt béoomega-3, các khoáng chất, và một số vitamin [9]

Đã có nhiều nghiên cứu khoa học nhằm tăng cường tận dung các phế phẩm, phụphẩm dé sử dung trong ngành thực phẩm chức năng và dược phẩm, nhưng van cònnhiều rào cản trong việc thương mại hóa các sản phẩm này Riêng đối với cá ngừ, trongthành phan cơ thịt đỏ có chứa hàm lượng acid amin histidin dễ biến đổi thành histaminkhi sử dụng dễ gây dị ứng Bên cạnh đó, màu sắc của cơ thịt đỏ cá ngừ được tạo ra chủyếu là myoglobin (Mb) và hemoglobin (Hb) Cơ thịt đỏ này dễ bị biến đổi thành màutối do sự oxi hóa nguyên tử sắt (Fe) trong nhóm hem của protein khi tiếp xúc với oxydé hình thành dạng metMb (Mb-Fe””) có màu nâu không mong muốn [11]

1.1.4.2 Tình hình chế biến cá ngừ tại Việt NamTại Việt Nam sản phẩm cá ngừ chủ yếu được sơ chế và xuất khẩu sang thị trường

nước ngoài, trong đó thị trường Mỹ, EU và Nhật Bản là thị trường trọng yếu Cá được

sơ chế bằng cách làm sạch, sau đó được thăn/philê và cắt khúc theo hình dạng mongmuốn của khách hang, đóng gói và bảo quản đông lạnh

Một sô sản pham cá ngu đóng hộp cũng được chê biên đê xuât khâu, còn lại sô it

cá ngừ được tiêu thụ trong những nhà hàng, quán ăn, siêu thi, cửa hàng thực phẩm

Theo thống kê của Hiệp hội Chế biến và xuất khẩu Thủy sản Việt Nam quý1/2017, xuất khẩu cá ngừ dạng thăn/philê đông lạnh là cao nhất, chiếm 47% tổng giá trịxuất khẩu cá ngừ, tiếp theo là cá ngừ chế biến đóng hộp 30,4% [11]

Cá được đánh bắt và đem về các công ty chế biến thủy sản, sau đó được mồ vàlàm sạch, philê những phan thịt trắng thành miếng, hoặc dạng lát, dạng viên rôi đem điđóng gói bảo quan dé xuất khẩu hoặc chế biến làm sản phẩm cá ngừ đóng hộp Trongcông đoạn làm sạch và philê chỉ lấy phần cơ thịt trắng, cắt bỏ mang, vây, ruột,

XƯƠNG

Do yêu câu nghiêm ngặt đối với các mặt hàng khi xuất khẩu, nhất là sản phẩmthực phẩm tươi sống, do đó những phan thịt không có giá trị cảm quan cũng như có batcứ một thành phan nào ảnh hưởng tới chất lượng sử dụng sẽ không được xuất khâusang các thị trường nước ngoài.

Trong những phan phế liệu không được xuất khẩu là mang, vây, ruột, phan da bịtrầy xước, xương, thịt cơ sằm Những phế liệu này sẽ được bán cho các công ty sảnxuất thức ăn gia súc với giá rất rẻ, gần đây có một số công ty của Thái Lan cũng sangthu mua phân ruột cá, nhiều nhất là gan để chế biến sản xuất dầu cá Đối với nhữngphân thịt gần xương sống của cá, chủ yếu là co sam, một lượng nhỏ có cả phan cơ thịttrăng không được lấy ra hết chiếm tỉ lệ tương đối cao, khoảng 10% tổng trọng lượng

nguyên liệu cá, phân thịt này có hàm lượng protein cao, nêu tận dụng nguôn nay dé sảnxuât ra sản phầm có giá tri là điêu cân thiệt hiện nay.

1.2 Tổng quan về Koji1.2.1 Lịch sử phát triển Koji

Người nghiên cứu thành công và phát hiện ra Koji đầu tiên đó là JokichiTakamine (1854 — 1922), ông là người nghiên cứu sớm nhất loại nam Aspergillusoryzae Vào thời đó dé đường hóa tinh bột lúa mì và ngô ở phương Tây người ta dùngmam đại mạch (malt) Trong khi đó ở Nhật người ta dùng loại nắm sợi mà ta gọi làmốc tương, cơm đã cho mọc loại mốc này ở Nhật gọi là Koji, hoạt tính enzyme trongkoji cao hơn nhiều so với trong mầm đại mạch Hiện nay, nam sợi Aspergillus oryzaeđã được chọn lọc để có các chủng có hoạt tính rất cao Koji được sản xuất ra dướidạng bánh thì gọi là mochi-kojr, còn dưới dang hạt thì gọi là bara—koji, quá trình sảnxuất ra koji gọi là sei-koji Nam này còn được dùng ở Nhật Ban dé sản xuất tươngNhật từ đậu tương, dạng đặc gọi là miso (soybean paste), dạng loãng gọi là shoyu (soysauce), còn trong sản xuất rượu sake thì quan trọng nhất là khâu sản xuất koji, thứ nhìlà chuẩn bị giống nắm men rượu (moto), thứ ba mới là lên men (tsukuri) Theophương pháp truyền thống thì mốc được sản xuất trên gạo hap chín theo tỉ lệ 96% gạovà 4% tro của một số lá cây như camellia, zalkova, nudi cay ở 34 — 36°C trong 7ngày, loại koji này được gọi là tane — koji [12].

1.2.2 Bản chất của KojiKoji là một trong những thành phan quan trọng nhất được coi là giống khởi độngđể sản xuất một số thực phẩm lên men truyền thống của Nhật Bản Koji có chứa mộthệ các enzyme thủy phân được tạo thành trong nam mốc sinh trưởng trên các cơ chấtchứa tinh bột Các enzyme thủy phân này bao gồm glucoamylase, amyloase,protease dé thủy phân tinh bột và protein thành các chất có trọng lượng phân tửthâp Tùy thuộc vào san phâm cuôi cùng can thu được là gì mà người ta sản xuât ra

1.2.3 Cac yếu tố ảnh hưởng đến sinh tong hop protease trong mốc KojiAspergillus oryzae

1.2.3.1 Thanh phan môi trườngNguồn carbon:

Trong môi trường nuôi cấy nam mốc để sản xuất protease, người ta thường dùngmột số co chat tự nhiên làm nguôồn cung cấp cacbon, nito và chất khoáng như bột mì,cám ngô, cám gạo, bột đậu tuong [14] Ramana Murthy-MV, và các cộng sự (1994)đã nuôi cấy chủng nắm mốc Aspergillus oryzae CFTRI 1480 trên môi trường cám mì[15] Lê Văn Việt Mẫn và Trần Thi Ánh Tuyết thu nhận protease từ canh trường nuôicây bề mặt với thành phan là cám gạo và bột đậu nành [16]

Đối với Aspergillus oryzae, các nguồn carbon có tác dụng tốt đến sinh tổng hợpprotease được sắp xếp theo thứ tự giảm dan như sau: fructose, saccharose, maltose,glucose, mannite, arabinose, galactose, lactose [17].

Nguồn nito:

Chất cảm ứng

Chất cảm ứng được xem như là một chất nền để sinh tổng hợp enzyme Trong sốcác enzyme do vi sinh vật tổng hợp, có những enzyme bình thường chỉ tổng hợp rất ítoi Tuy nhiên, khi thêm một số chất nhất định vào môi trường nuôi cay thì hàm lượngcủa chúng có thé tăng lên rất nhiều lần, chất gây nên hiệu quả này gọi là chất cảm ứng

Đặc biệt, để điều hòa và định hướng sinh tổng hợp enzyme của nắm mốc, người ta

thường dùng chat cảm ứng — là những chất kích thích quá trình sinh tổng hợp enzymemột cách đáng kể, vì chúng là những cơ chất đặc hiệu của enzyme [17] RamanaMurthy-MV, va các cộng sự (1994) đã nuôi cay chủng nam mốc Aspergillus oryzaeCF TRI 1480 trên môi trường cam mi, khi thêm 0,53% pepton thì hàm lượng proteasetrong môi trường tăng lên 7% so với mẫu đối chứng [15], Lê Nguyễn Doan Duy vàcộng sự (2014) khi nôi cây mốc Aspergillus oryzae trên môi trường cám và trau đã bổsung thêm gelatin làm chất cảm ứng [19]

Cơ chat cảm ứng được xem như là yếu tố quan trọng dùng dé điều khiến quá trìnhsinh tong hop enzyme từ vi sinh vật Khi cho cơ chất vào môi trường nuôi cấy với liềulượng tăng dan thi khả năng tong hop enzyme cảm ứng sẽ tăng dần đến một lúc nào đóquá trình này sẽ chựng lại và thậm chí sẽ giảm do hiện tượng tăng áp suất thâm thấubởi cơ chất gây nên [13]

Trong trường hợp nuôi cay vi sinh vật tổng hop protease, trong môi trường canphải có chất cảm ứng là các protein Nhiều loài nắm mốc khác nhau (Aspergillus

oryzae, Aspergillus awamori, Aspergillus niger, Aspergillus flavus) trên môi trường cócác ngu6n protein sinh tong hop protease có hoạt lực rất cao Nhiều nghiên cứu chothay quá trình sinh tong hop enzyme diễn ra mạnh mẽ trên môi trường chứa cám mì,bột đậu tương đã tách chất béo và một ít nguồn nito vô cơ [13]

Các chất dinh dưỡng khác:

Ngoài nito va carbon ra, lưu huỳnh, photpho, silic cũng có ảnh hưởng quantrọng đến quá trình sinh tổng hợp protease trong quá trình nuôi cấy, lưu huỳnh có théảnh hưởng khác nhau đến quá trình tổng hợp enzyme, bản thân lưu huỳnh là thànhphan của một số acid amin tham gia vào cau tao enzyme Ngoài các yếu tố kể trên, cácnguyên tố vi lượng, vitamin và một số yếu tố khác cũng có ảnh hưởng đến sự sinhtrưởng của vi sinh vat và hàm lượng protease trong môi trường nuôi [20].

1.2.3.2 Điều kiện nuôi cấyPhương pháp nuôi cay bề mặt

Trong lên men truyền thống, lên men cơ chất răn (SSF) là thích hợp cho nắm mốc

phát triển bởi độ âm thấp và cho phép các khuẩn ty của nắm xâm nhập vào cơ chất.[21].

Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy bê mặt: [4] [11]

- Nong độ enzyme tạo thành cao hon nhiều so với dịch nuôi cay chim sau khi datach té bao vi sinh vat

- Chế phẩm dễ dàng sấy khô mà không làm giảm đáng kể hoạt tinh enzyme, chếphẩm khô, dé bao quản, vận chuyên, nghiền nhỏ hoặc sử dụng trực tiếp nếu không cầnkhâu tách và làm sạch enzyme.

- Tốn ít năng lượng (điện, hơi, nước, công nhân), thiết bị, dụng cụ nuôi cây đơngiản, có thể thực hiện ở quy mô gia đình, trang trại cũng như ở quy mô lớn hơn

- Nuôi cây trong điêu kiện không cân vô trùng tuyệt đôi, và trong quá trình nuôicấy nếu có nhiễm trùng phần nào, khu vực nào thì chỉ cần loại bỏ canh trường phân đó

Nhược điểm của phương pháp nuôi cấy bê mặt: [4] [11]

- Phương pháp nuôi cay bề mặt có năng suất thấp, khó cơ khí hóa, tự động hóa

Trong môi trường nuôi cây nam moc dé sản xuât protease, người ta thường dùngmột sô cơ chat tự nhiên là nguôn cung cap cacbon, nitơ và chat khoáng như bột mì,cám mì, cám ngô, cám gạo, bột đậu, tương [ 4|.

Các loại nâm moc trong tự nhiên có kha năng sinh tông hợp nhiêu loại enzymengoại bào đê giúp chúng đông hóa các cơ chât phức tạp trong môi trường sông Tuynhiên moi loài có kha năng sinh tông hợp mạnh một loại enzyme nao đó so với các loạienzyme khác [IS].

Đã có nhiều nghiên cứu nuôi cay Aspergillus oryzae nham thu nhận protease bằngnhững thành phần môi trường khác nhau, điều kiện nuôi cây khác nhau như NguyễnThị Ngọc Giang và Nguyễn Minh Thủy (2016) đã nuôi cay Aspergillus oryzae trên koji

nắm bào ngư dé thu nhận amylase và protease [22]; Lê Nguyễn Doan Duy và cộng sựđã nuôi cay Aspergillus oryzae trên môi trường có thành phan cơ chất là cám, trau vàgelatin để thu nhận enzyme protease [23]

Riêng đối với đậu nành, có thé coi là thành phan thích hợp cho việc nuôi cay mốcđể thu nhận protease do hàm lượng protein trong đậu nành khá lớn từ 29,6 — 50,5%,trung bình là 36 — 40% Các nhóm protein đơn giản (% so với tổng số protein):albumin (6 — 8%), globulin (25 — 34%), glutelin (13 — 14%), prolamin chiếm mộtlượng nhỏ không đáng kề [23].Về giá tri protein, đậu nành đứng hàng đầu về đạmnguôn gốc thực vật, thành phan acid amin trong protein của đậu nành ngoài methioninevà trytophan còn có các acid amin khác với lượng khá cao tương đương acid amin cótrong thịt [23].

Bang 1 4 Thanh phan dinh dưỡng (theo giá trị trung bình) trong 100g hạt đậu nành

STT Thanh phan Giá trị

1 Năng lượng 446 Kcal

Bảng 1 5 Thành phân acid amin của đậu nànhStt Acid amin Hàm lượng

l Isoleucine 1,971 g

2 Leucine 3,309 g3 Lysine 2,/06 g

4 Methionine 0,547 g5 Cysteine 0,655 g6 Phenylalanine 2122 ¢

Threonine 1,766 gTrytophan 05919 Valine 2,209 g

10 Histidine 1,097

II Arginine 3,153 g

12 Aspartic acid 5,112 g13 Glutamic acid 7,874 g14 Proline 2,379 g

Nguôn: USDA Nutrient Database

Carbohydrate chiếm khoảng 30 + 34% hạt đậu nành Phan carbohydrate có théchia làm hai loại: loại tan và không tan trong nước Loại tan trong nước chỉ chiếmkhoảng 10% tổng lượng carbohydrate Thành phần khoáng chiếm khoảng 5% trọnglượng chất khô của hạt đậu nành, trong đó đáng chú ý nhất là Ca, P, Mn, Zn, và Fe[23].

Độ âm môi trường

Độ am môi trường có ảnh hưởng đáng kế đến sự sinh trưởng và sinh tổng hợpprotease khi nuôi cây nam mốc bằng phương pháp bề mặt Thông thường, độ âm banđầu của môi trường thích hợp cho đa số các loài nam mốc nuôi cấy bề mặt với khay hởlà 58 + 60% Nếu độ âm trên 60% thì dé bị tạp nhiễm, khó thông khí, còn nếu độ âmdưới 50% thì môi trường sẽ khô nhanh, nắm mốc sinh bào tử mạnh và làm giảm họattính protease tạo thành Trong thời gian nuôi cấy nên giữ môi trường có độ âm 50 +60%, muốn vậy can phải duy trì độ 4m không khí trong phòng nuôi cấy khoảng 95 +

100% [24].pH môi trườngpH môi trường có ảnh hưởng đến tỷ lệ giữa các protease được tổng hợp, do đónếu giữ cho pH luôn có một giá trị xác định trong suốt quá trình nuôi cấy, vi sinh vật sẽtạo thành mạnh mẽ một dang protease xác định, chiếm ưu thé trong môi trường [30].Khi dùng phương pháp nuôi cây bé mặt, pH môi trường hầu như không thay đối đángkế trong quá trình phát triển của vi sinh vật Còn khi dùng phương pháp nuôi cay chim,pH môi trường có ảnh hưởng rất lớn, nhiều khi có vai trò quyết định đối với sự tích lũyprotease trong môi trường [25].

Nhiệt độMỗi một loài vi sinh vật có một nhiệt độ tối thích cho quá trình sinh trưởng cũngnhư sinh tổng hợp enzyme Nhiệt độ môi trường nuôi cấy không chỉ ảnh hưởng đángkế đến sự phát triển, khả năng sinh tổng hợp protease mà còn ảnh hưởng đến tính chấtcủa protease nam moc [26].

Những kết qua nghiên cứu mới đây cho thay, da số các loài nam mốc phát triểnthích hợp ở khoảng nhiệt độ 25 + 35°C Nguyễn Thi Ngọc Giang và Nguyễn MinhThủy (2016) đã ủ mốc Koji ở 28 + 32°C [22] Nếu nhiệt độ cao hơn hoặc thấp honnhiệt độ tối thích thì sẽ kìm hãm sự phát triển và sinh tong hợp enzyme của chúng

Ở nhiệt độ cao các enzyme dễ bị biến tính, do enzyme có bản chất là protein,nhưng điều này còn tùy thuộc vào loại enzyme mà vi sinh vật đó tong hợp hợp Khanăng chịu nhiệt của protease kiềm kém hon protease acid [4]

Độ thoáng khí

Các loài nam mốc thường là những vi sinh vật hiếu khí, nên độ thoáng khí củamôi trường nuôi cây có ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh tổng hợp protease [20] Tuynhiên, trong một số trường hợp, việc cung cấp oxy không day đủ sẽ làm giảm nhẹ sựsinh trưởng của vi sinh vật nhưng làm tăng quá trình sinh tổng hợp protease [13].Thông thường để làm tăng độ thoáng khí trong môi trường người ta thôi không khí vôtrùng qua canh trường hoặc đảo trộn, tốc độ đảo trộn càng lớn thì môi trường càng bãohòa oxy nhiều hơn Độ thoáng khí có thé đánh giá dựa vào lượng oxy hòa tan trongmôi trường [20].

Thời gian nuôi cấy

Thông thường lượng enzyme được tổng hợp nhiều nhất trong môi trường khi nắmmốc chuẩn bị sinh bào tử [2] Quá trình phát triển của nắm mốc theo phương pháp bềmặt trai qua 3 giai đoạn sau [11] [17] [20]:

Giai đoạn 1: Kéo dài khoảng 10 + 14 giờ dau, bào tử bắt đầu nảy mam, với nhữngthay đối sau:

- Soi nắm bắt đầu hình thành và phát triển những sợi tơ trang hoặc màu sữa nhỏ

- Nhiệt độ bắt đầu tăng

Giai đoạn đầu chưa hình thành enzyme, nắm phát triển chưa mạnh nên chưa cầnphải thông khí nhiều, chỉ cần chuẩn bị môi trường nuôi cấy được thông thoáng ngay từđầu thì giai đoạn này chưa cần phải tiến hành đảo trộn để làm thông thoáng khí, nhiệt

độ nuôi bat dau dé 6 30°C vì giai đoạn này giỗng rat man cảm với nhiệt.

Giai đoạn 3: Giai đoạn này kéo dài khoảng 10 + 20 giờ Một số thay đổi diễn ranhư sau:

Quá trình trao đối chất giữa nắm mốc và môi trường giảm dan nên nhiệt độ giảmso với giai đoạn 2, tuy nhiên quá trình sinh tổng hợp enzyme vẫn tiếp tục, chất dinhdưỡng cũng sẽ giảm Nhiệt độ môi trường giảm do đó làm giảm lượng không khí môitrường xuống còn khoảng 20 + 25 thé tích không khi/thé tích phòng nuôi cấy/1 giờ Ởgiai đoạn này, cần phải xác định thời điểm để thu nhận enzyme [20]

Tuy thuộc vào điêu kiện nuôi cây và đặc tính sinh ly cua từng chung nâm moc décó thé xác định thời điểm kết thúc dé thu enzyme đạt gái trị tối đa

1.3 Nước mắm và quá trình lên men nước mắm bồ sung protease1.3.1 Thực trạng sản xuất nước mam tại Việt Nam hiện nay

Theo phương pháp sản xuất truyền thống của nước ta trước đây thì chỉ có cá vàmuối, thời gian ủ chượp từ | đến 2 năm mới được một mẻ, sau đó được cải tiễn băngcách bồ sung thêm dứa, du đủ để giảm bớt thời gian sản xuất Tuy nhiên, thời gian thủyphân vẫn còn rất dài Hoặc có cả phương pháp hóa học, dùng HCI để thủy phân proteincủa cá, tuy nhiên lại gây độc hại vào sản phẩm và ngay chính những công nhân sảnxuất [27] [28]

Đã có nhiều phương pháp pháp sản xuất ở những địa phương khác nhau, điều đólàm cho nước mắm ở mỗi vùng miền có những nét đặc trưng riêng Một số phươngpháp sản xuât nước mam truyén thông ở các địa phương như:

- Phương pháp sản xuất nước mắm của vùng Cát Hải — Hai Phòng: Đặc trưng củaphương pháp này là trong quá trình chế biến chượp được cho muối nhiều lần, b6 sungthêm nước, phơi năng và đánh đảo liên tục Phương pháp này tận dụng tối đa hoạt độngcủa hệ enzyme protease trong cá và vi sinh vật có ích trong quá trình chế biến chượp[27] [29] [30].

- Phương pháp sản xuất nước mắm của miền Trung: Phuong pháp sản xuất củamiền Trung gan giống với phương pháp sản xuất nước mắm ở Phú Quốc, mudi đượcbố sung một lần ngay từ đầu sau đó ướp vào thùng chuop và gai nén Hoạt động củaprotease trong cá sẽ thủy phân protein thành acid amin Tuy nhiên, nước mắm PhúQuốc còn cho thêm 2% thính trong quá trình chế biến nhằm tạo hương cho sản phẩm[27] [28].

1.3.2 Cơ sở khoa học của ứng dung protease trong sản xuất nước mắm1.3.2.1 Cơ chế phân giải của enzyme protease

Bản chất của quá trình sản xuất nước mắm [31]:

, ñ ,

Ca + muỗi > nước mamBan chat của quá trình này chính là quá trình thủy phân protein trong cá nhờ hệ:

Enzyme protease——> peptol ——> polypeptide ———>peptide ——> acid amin

Qua trinh thuy phan protein đến acid amin là một quá trình rất phức tạp Đặc hiệucủa enzyme là chỉ tac dụng lên một vài chat nào đó với vài kiêu liên kêt nhât định, nhưenzyme peptidase chỉ tác dụng lên mối liên kết peptide để thủy phân mỗi liên kết này:

—CO— NH —-——ờ —COOH + —NH;Sự tham gia của enzyme trong quá trình thủy phân theo cơ chế xúc tác theo sơ đồ

Sau:

E+S « ES <— E+PTrong quá trình chế biến nước mam thi S chủ yếu là protein, ES là phức hợp chattrung gian giữa enzyme và cơ chất, P là sản phẩm

Sự tạo thành và chuyên biến ES qua 3 bước [31]:

Bước 1: Enzyme kết hợp với protein tạo thành phức chat enzyme protein, bướcnày xảy ra khá nhanh, liên kết không bên

Bước 2: Xảy ra sự chuyển biến của các phân tử protein dẫn đến làm phá vỡ cácmôi liên kết đồng hóa trị tham gia vào phản ứng Khi đó trong phức chất ES đồng thờixảy ra hai quá trình là sự dịch chuyển thay đổi electron, dẫn đến sự cực hóa của mốiliên kết tham gia vào phản ứng và sự biến dạng hình học của mỗi liên kết đồng hóa trịtrong phân tử protein cũng như trong trung tâm hoạt động của enzyme, làm cho proteinhoạt động, quá trình thủy phân dễ dàng hơn

Bước 3: Giai đoạn tạo thành các acid amin và peptid cấp thấp, giải phóng enzyme.1.3.2.2 Phương pháp sản xuất nước mắm truyền thống và phương pháp có bố

sung enzyme

a) Phương pháp truyền thống:Sản xuất nước mắm theo phương pháp truyền thông tức là chỉ có cá và muối đượcủ trong chugp trong thùng hoặc lu, vai, chỉ sử dụng hệ enzyme protease có trong ruộtcá, trong quá trình ủ chượp có thé có thêm phương pháp đánh đảo hoặc phơi nang Dođó đòi hỏi thời gian ủ chượp kéo dài, hiệu suất thu hồi đạm chưa cao, người sản xuấtphải có kinh nghiệm trong chế biến Tuy nhiên, sản xuất nước mam theo phương pháp

truyền thông cho sản phầm có mùi hương rat đặc trưng và nhât là an toàn cho ngườitiêu dùng [27].

b) Phương pháp sản xuất nước mam có bố sung protease

Việc ứng dụng enzyme vào trong sản xuất nước mắm hiện nay là điều tất yếu, bởitính khả thi của nó Bồ sung enzyme vào quá trình thủy phân cá giúp cho việc rút ngănthời gian thủy phân một cách đáng kể, đồng thời nâng cao được hiệu suất thu hồi đạmtừ cá, cai thiện dinh dưỡng cho sản phầm nước mam.

Đã có nhiêu loại protease được sử dụng trong trong chê biên nước mam nhưpapain, bromelain, protease từ nam mốc [17]

Những loại enzyme thường được bô sung vào san xuat nước mam là nhữngenzyme thương mại, tức là những enzyme đã được tinh chê nhăm loại bỏ các tap chatvà các enzyme khác, tránh được sự biên đôi các thành phân trong nước măm.

Đã có nhiêu công trình nghiên cứu của các tác gia ứng dung protease trong sanxuat nước mam:

Nguyễn Bài, Nguyễn Ngọc Lân (1996) đã nghiên cứu san xuất nước mam nganngày bang enzyme protease giúp cho việc sản xuất nước mam được cải thiện về thờigian sản xuất [32] Nguyễn Lân Dũng và cộng sự (1967) đã ứng dung protease từ nammốc Aspergillus oryzae từ 1 + 3 ngày ở nhiệt độ 55°C, kết quả cho thay bã xương lắngxuống, nước cốt ở trên trong, tuy nhiên hương vị không bang nước mam truyền thống[11].

Năm 1961, Cục cung tiêu — chế biến, thuộc Tổng cục Thủy sản (nay là Bộ Thủysản) va nhà máy rượu Hà Nội, đã nghiên cứu tác động của nam mốc Aspergillus flavusva Aspergillus oryzae trong quá trình thủy phân thịt cá đã cho thay, Aspergillus oryzae