Luận văn thạc sĩ Công nghệ thực phẩm: Khảo sát quá trình thủy phân dầu dừa bằng Enzyme Lipase từ tuyến tụy lợn và Lipase từ Candida Rugosa

LỜI MỞ ĐẦU Ngày nay, việc sử dụng những chế phẩm enzyme thương mại để thực hiện các phản ứng thủy phân, thay thế cho các loại xúc tác hóa học đang trở nên phổ biến bởi vì điều kiện phản

TỔNG QUAN

Dầu dừa

Dầu dừa chứa các loại acid béo có độ dài mạch trung bình (từ C8 đến C18), acid béo no chiếm tỷ lệ cao (khoảng 90%) Acid lauric chiếm tỷ lệ cao nhất (khoảng 48%), đứng thứ hai là acid myristic (khoảng 16%) Ở Việt Nam, dầu dừa thường được thu nhận từ cơm dừa của giống dừa Bến Tre.

1.1.1 Giới thiệu chung về dầu dừa

Dầu dừa là loại dầu ăn được (edible oil) được chiết xuất từ cơm dừa của trái dừa trưởng thành Dầu dừa có nhiều ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như chế biến thực phẩm, sản xuất dược phẩm Do có hàm lượng acid béo no cao nên dầu dừa có thời gian bảo quản khá dài (khoảng 6 tháng ở 24 o C) [3] Tuy nhiên tỷ lệ acid béo no cao lại sẽ ảnh hưởng đến giá trị dinh dưỡng của dầu dừa vì thiếu những acid béo không no thiết yếu

Có thể phân dầu dừa thành 2 nhóm: dầu dừa thô và dầu dừa tinh luyện

Dầu dừa thô hay dầu dừa nguyên chất là loại dầu ít trải qua quá trình xử lí nhất

Do vậy, dầu dừa thô chứa khá nhiều tạp chất bên cạnh thành phần triglyceride như

13 monoglyceride, digglyceride, các chất màu, chất thơm,…Chỉ số acid của dầu thô nằm trong khoảng 6 – 10 [1]

Phương pháp khô: Cùi dừa khô được tách khỏi vỏ bằng nhiệt độ cao của lò lửa, lò nung [4] Những miếng dừa khô sau đó được ép hay được trích ly bằng dung môi

Sản phẩm thu được là dầu dừa và phần bã giàu protein và chất xơ Tỷ lệ thu hồi dầu khi sử dụng phương pháp này khá cao (khoảng 90%), chất lượng dầu khá ổn định, tuy nhiên màu dầu vàng sậm

Phương pháp ướt: Sử dụng cơm dừa nạo tươi thay cho dừa sấy khô Người ta sử dụng protein trong dừa để tạo ra một hệ nhũ tương dầu và nước [5] sau đó là phá vỡ hệ nhũ để thu hồi dầu Trước đây, phương pháp phổ biến là đun hệ nhũ trong thời gian dài, điều này làm cho dầu bị đổi màu và không có hiệu quả kinh tế cao Ngày nay, người ta thường sử dụng phương pháp ly tâm kết hợp một số phương pháp tiền xử lý như xử lý lạnh, gia nhiệt, xử lý acid,… Phương pháp ướt cho hiệu quả kém hơn so với phương pháp khô do năng suất thấp hơn 10 – 15%, tỷ lệ hư hỏng cao hơn

Phương pháp ướt cũng đòi hỏi chi phí về trang thiết bị, năng lượng và chi phí vận hành cao [6]

Dầu dừa nguyên chất là loại dầu dừa thô được sản xuất bằng phương pháp khô và qua quá trình khử màu, mùi, nên sản phẩm có màu sáng và trong suốt

Dầu dừa tinh luyện hay còn gọi là dầu dừa RBD (Refined, Bleached, Deodorized) là loại dầu thu được từ quá trình tinh luyện dầu thô Quy trình tinh luyện dầu bao gồm: thủy giải để trung hòa acid béo tự do, gia nhiệt để vô hoạt enzyme và sấy khô dầu, khử mùi bằng hơi quá nhiệt, khử màu bằng than hoạt tính Dầu tinh luyện gần như không chứa tạp chất gì khác ngoài triglyceride Chỉ số AV của dầu tinh luyện phải dưới 0,3 [1]

Ngoài hai loại dầu dừa đã trình bày trên, dầu dừa còn có thể qua quá trình hydro hóa hoặc tách phân đoạn

Dầu dừa hydro hoá: Trong quá trình hydro hóa, các acid béo không no sẽ được cộng hợp với hydro, giảm hoàn toàn hay một phần số nối đôi có sẵn, dẫn đến làm tăng nhiệt độ nóng chảy Nguyên liệu của quá trình hydro hóa dầu thường là dầu tinh luyện có nhiệt độ nóng chảy 24 o C Dầu dừa hydro hóa có nhiệt độ nóng chảy 36 – 40 o C Nhược điểm của loại dầu này là chứa một lượng acid béo dạng trans không có lợi cho sức khỏe

Dầu dừa tách phân đoạn: Quá trình tách phân đoạn dựa vào nhiệt độ nóng chảy sẽ tạo ra nhiều phân đoạn dầu dừa giàu các loại acid béo khác nhau và sẽ được sử dụng cho những mục đích khác nhau

1.1.2 Thành phần của dầu dừa và so sánh với các loại dầu thực vật khác

Thành phần acid béo của dầu dừa theo TCVN 7597:2013 được trình bày trong bảng 1.1

Bảng 1.1: Thành phần acid béo có trong dầu dừa

Tên Chiều dài mạch carbon Hàm lượng

Dầu dừa chứa trên 91% acid béo no Hầu hết các acid này có mạch C ngắn và trung bình từ C8 đến C18, đặc biệt là acid lauric C12 chiếm 51% tổng lượng chất béo

Acid oleic là acid béo không no có tỷ lệ khá cao trong thành phần của dầu dừa (5%) Acid này tạo cho dầu dừa mùi thơm đặc trưng của bơ Tỷ lệ acid béo no cao (91%) sẽ có lợi cho chế biến vì chậm bị oxy hóa, tuy nhiên các acid béo mạch ngắn sẽ tạo nên một mùi ôi khó chịu khi dầu dừa bị thủy phân khi bảo quản hoặc chế biến

Bảng 1.2 So sánh thành phần của dầu dừa với các loại dầu thực vật khác

Hàm lượng acid béo no, % tổng chất béo

Hàm lượng acid béo không no một nối đôi, % tổng chất béo

Hàm lượng acid béo không no nhiều nối đôi, % tổng chất béo

Bảng 1.2 so sánh thành phần acid béo của dầu dừa với các loại dầu khác Theo bảng này, dầu dừa có tỷ lệ acid béo no cao nhất, sau đó là dầu cọ và dầu hạt bông

Các loại dầu thường dùng để chế biến thực phẩm như dầu đậu phộng, dầu đậu nành, cọ, bắp đều có tỷ lệ acid béo no trong khoảng 10 – 20% [1]

1.1.2.1 Tính chất vật lý của dầu dừa

Theo TCVN 7597:2013 về dầu thực vật thì dầu dừa dùng làm thực phẩm cần có những tính chất vật lý và chỉ số chất lượng như trong bảng 1.3

Bảng 1.3: Đặc tính lý và hóa của dầu dừa thô [7] Đặc tính Đơn vị Giá trị

Tỉ trọng tương đối (40 o C/nước ở 20 o C) 0,908 – 0,921

Trị số xà phòng hóa (mg KOH/g dầu) 248 – 265

Các chất không xà phòng hóa (g/kg) < 15

Tỉ lệ đồng vị carbon ổn định -3,71 – -6,36

1.1.3 Ứng dụng của dầu dừa trong công nghệ thực phẩm

Do hương vị thơm ngọt đặc trưng, dầu dừa thường được đưa vào một số sản phẩm đặc biệt như càri vùng Nam Á, bánh nướng, bánh ngọt, sauce trái cây [8], tạo mùi thơm cho bắp rang [9]

Một số ứng dụng khác của dầu dừa có thể kể đến là việc thay thế dầu đã được hydro hóa để sản xuất bánh nướng và bánh kẹo [10] Dầu dừa được hydro hóa được sử dụng trong bột kem tách béo hay các sản phẩm thức ăn nhẹ như bắp rang Dầu dừa đã hydro hóa được bán tại Đức bởi công ty Copha Tại Úc, dầu dừa còn là thành phần chính trong các món ăn nhẹ

Năng lượng cung cấp bởi 100g dầu dừa là 862kcal, ngoài ra còn có vitamin E 0,09mg, vitamin C 0,05mg và sắt 0,04mg [1].

Enzyme lipase

Enzyme lipase (triacylglycerol acylhydrolase, EC 3.1.1.3) là một enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân chất béo [11] Lipase là một loại enzyme esterase

Lipase đảm nhận vai trò thiết yếu trong quá trình tiêu hóa, vận chuyển và xử lý chất béo có trong chế độ ăn hằng ngày (triglyceride, chất béo, dầu) trong hầu hết các sinh vật sống Một số loại virus cũng có khả năng tổng hợp lipase [12], [13]

Hầu hết lipase chỉ xúc tác thủy phân tại một số vị trí nhất định trên mạch glycerol của lipid (A1, A2 hay A3), điển hình là lipase trong tụy tạng của người là loại enzyme giúp phân cắt chất béo trong chế độ ăn uống, chuyển đổi các triglyceride thành monoglyceride và 2 acid béo [14]

Trong môi trường tự nhiên cũng tồn tại một số loại lipase như phospholipase [15] haysphingomyelinases [16] Một số lipase được tiết ra bởi các vi sinh vật gây nhiễm trùng Đặc biệt, Candida albicans có một lượng lớn các loại lipase khác nhau giúp duy trì độc lực của C.albicans trong mô của con người [17]

Lipase từ thực vật: Ở thực vật, lipase được tìm thấy ở mô dự trữ hạt dầu, hạt ngũ cốc trong quá trình nảy mầm của hạt Hầu hết các lipase không hoạt động trong thời kỳ ngủ đông, ngoại trừ lipase được tìm thấy ở hạt đậu caston [18] Lipase thực vật ít được tách chiết dạng thương phẩm vì hoạt độ yếu và không ổn định

Lipase từ động vật: Động vật là một nguồn phong phú của enzyme lipase Nguồn lipase động vật quan trọng nhất là từ tụy tạng của bò, cừu và lợn Lipase từ tụy tạng lợn là một trong những lipase được biết đến sớm nhất và khá thông dụng Lipase tụy lợn ưu tiên xúc tác thủy phân liên kết ester của các acid béo với hơn 12 nguyên tử carbon và chủ yếu tác động vào vị trí C-1 của glycerol Lipase từ tụy lợn bao gồm một chuỗi duy nhất 450 acid amin và trọng lượng phân tử của protein là vào khoảng 50.084Da [18], [19]

Lipase chiết từ dạ dày cừu cũng là một loại lipase động vật phổ biến Loại lipase này ưu tiên xúc tác thủy phân acid béo chuỗi ngắn trong chất béo từ sữa và đặc biệt được sử dụng trong việc tạo thành hương thơm của phomat [18]

Lipase từ vi sinh vật:

Vi khuẩn: Lipase ngoại bào của Streptomyces rimous R6554 W được tách từ dịch lọc canh trường bằng sắc ký cột Streptomyces là vi khuẩn đất Gram (+) thể hiện khả năng đặc biệt đối với sự tổng hợp các chất trao đổi thứ cấp và sử dụng lipase thuỷ phân ngoại bào để phá huỷ nguyên liệu hữu cơ trong môi trường sống tự nhiên Tuy nhiên cho đến nay, chỉ có một vài lipase Streptomyces đă được xác định hoạt độ

Ngoài ra, người ta cũng đã tìm thấy lipase có trong một số loài vi khuẩn khác như

Pseudomonas cepacia có hoạt độ ngay ở nhiệt độ cao, trong môi trường kiềm và kỵ nước [18]

Nấm mốc: Lipase được tìm thấy ở một số loài như Aspergillus, Rhizopus (tách từ quả dừa), Rhizopus oryzae (phân lập từ dầu dừa), Pythiumnltimum (trong dung dịch hữu cơ, không có nhũ tương) và Mucor sp humicola lamuginosa [18]

Nấm men: Candida rugosa là một nguồn sản xuất lipase quan trọng Các đặc tính xúc tác cấu trúc hoá sinh của lipase trong loài nấm men Candida rugosa đă được công bố trên nhiều tài liệu Có ít nhất 7 loài Candida rugosa có khả năng sản xuất lipase trong

17 đó có 4 loài đă được xác định đặc tính và 3 loài đă được dùng để sản xuất enzyme thương phẩm [18]

Cũng như các loại enzyme khác, lipase có thể thu được từ mô và các cơ quan của động vật hay vi sinh vật Các loại enzyme lipase đều có những tính chất chung, song chúng cũng khác nhau về một số tính chất như tính đặc hiệu cơ chất hay mức độ phân giải cơ chất, khối lượng phân tử, thành phần acid amin và điều kiện hoạt động Sự khác nhau này xuất hiện không chỉ ở các loại khác nhau mà còn giữa những chủng trong cùng một loài

Khối lượng phân tử của lipase dao động khá nhiều giữa các chủng vi sinh vật:

Candida rugosa có hai đồng phân là LipA (58kDa) và LipB (62kDa); Geotrichum candidum khoảng 60.000 Da; Aspergillus niger là 97.000 Da; Penicillium crustosum là 29.300 Da; C Paralipolytica là 55.900 Da Lipase được sản xuất từ P camemberti là một glucose-protein có khối lượng phân tử 38 kDa [18]

1.2.2.2 Trình tự acid amin và cấu trúc không gian

Thành phần acid amin của lipase từ các nguồn khác nhau cũng khác nhau, nhưng nhiều trình tự acid amin được suy ra từ trình tự của lipase tách dòng, từ đó cho thấy có sự tương đồng giữa những cấu trúc không gian của lipase Chẳng hạn như trình tự 20 acid amin đầu tiên của lipase từ động vật có vú giống với vùng N- của lipase từ P camemberti giống một phần với lipase từ Humicola lanuginosa và Aspergillus niger nhưng lại khác so với lipase 1 từ P.cyclopum So sánh tiếp đầu N của lipase 1 của P expansium và P solium thì ta thấy ngoài 20 acid amin đầu khác nhau ra thì còn lại là giống nhau Đối với lipase từ Candida rugosa thì sự sắp xếp trình tự N của những protein thể hiện sự tương đồng giữa lipase 2 và lipase 3 nhưng không tương đồng với lipase 1 Sự quyết định trình tự N- trên 19 acid amin chỉ là sự tương đồng cao với những lipase tương tự

Nói chung là có rất ít những lipase có trình tự giống nhau hoàn toàn, ngoại trừ khu vực xung quanh tâm hoạt động Khi ta so sánh trình tự acid amin xung quanh tâm hoạt động của ba nhóm enzyme là protease, lipase, cutinase với enzyme esterase, người ta thấy sự tồn tại của trình tự GxGxG ở vị trí serin Ngoại lệ duy nhất được tìm thấy là sự thay thế alanin cho glycin thứ hai trong subtilisin Không một trình tự nào

18 được tìm thấy quanh vùng gốc histidin hoặc aspartic (glutamic) của trung tâm hoạt động trừ trường hợp của các enzyme tương đồng từ các loài họ hàng rất gần [18]

 Cấu trúc không gian Đã có rất nhiều thí nghiệm được thực hiện nhằm tìm hiểu cấu trúc không gian của lipase Trong đó thì cấu trúc ba chiều của lipase được coi là cơ sở để hiểu được phản ứng động học, đặc hiệu cơ chất và tiên đoán được những đặc điểm sinh hóa và hoạt động của lipase tại bề mặt pha dầu nước Lipase từ Rhizomun miehei là enzyme thủy phân đầu tiên có cấu trúc bậc 3 được xác định bởi tinh thể học tia X

Ứng dụng của enzyme lipase và các công trình nghiên cứu

1.3.1.1 Trong công nghiệp thực phẩm

Trong công nghiệp thực phẩm người ta sử dụng lipase để cải biến các triacyglycerol, nâng cao chất lượng các loại dầu thực vật rẻ tiền, chất lượng thấp bằng cách thay thế các acid béo no bởi các acid béo không no, trong dung môi hiếm nước [18] Đối với thực phẩm được chế biến từ sữa, lipase được sử dụng rộng rãi để làm tăng mùi vị, làm tăng độ chín của phomat, hoặc chế biến những sản phẩm như phomat và phân giải lipid Những acid béo tự do mạch ngắn (chủ yếu là C4, C6) được thuỷ phân ra do tăng lipase vào sữa béo dẫn đến sự tăng hương vị đặc trưng cho sữa Trong khi đó nếu các acid béo mạch trung bình (C12, C14) được tạo ra sẽ có xu hướng tạo ra mùi vị tựa như xà phòng cho sản phẩm Thêm vào đó những acid béo tự do này có thể tham gia vào các phản ứng hoá học đơn giản với vi sinh vật dẫn đến việc tổng hợp những gia vị có mùi thơm khác nhau Những nguồn lipase dùng cho việc tăng hương vị ở phomat trên mô của những loài động vật nhai lại (dê non, cừu, bê) Một số chế phẩm lipase được sử dụng làm tăng mùi vị và làm chín phomat được thu từ một số chủng như M.miehei, A.niger hay A oryzae [18]

Một nghiên cứu của Yuji Shimada và cộng sự (1998) về sản xuất γ -linolenic acid (GLA) bằng cách thủy phân dầu cây lưu ly bởi enzyme lipase từ candida rugosa

Mức độ thủy phân là cao nhất với 80% với thời gian là 15h [30]

Lipase được sử dụng để làm tăng những chất béo nhờ việc chuyển ester hoá tới một triglyceride có giá trị cao, bơ cocoa, có một hỗn hợp 1,3-2-oleoyl-glycerol chưa no (palmitic, streraic và oleic) có thể được chế xuất từ loại dầu rẻ tiền chiết xuất ở tổng hợp thân cây cọ (1,3-dipalmitoy 1-2-oleoyl-glycerol) với tritearrin hay stearic lần lượt là 1, 3 số lipase đặc trưng [Mastuao và cộng sự, 1981], trong khi phương pháp chuyển đổi ester hoá hoá học dưới những điều kiện kiềm có thể dẫn đến sự tạo thành sản phẩm mang tính ngẫu nhiên và tạo thành sản phẩm phụ không mong muốn Bằng việc sử dụng phương pháp chuẩn bị giống khác nhau (acid palmitic hầu như không có trong hai vị trí với 1, 3- dioleoyl- 2palmitoyl-glycerol) có thể được thay thế bằng

28 những chất thay thế sữa béo được chiết xuất phần nhiều từ cây cọ, dầu palmitoyl glycerides với những acid béo không no Triglycerides cùng với acid octanoic và acid decanoic ở vị trí 1,3- và một acid béo cần thiết ở vị trí 2- có thể được sản xuất theo cách này dành cho những bệnh nhân không đủ dịch tuỵ hoặc kém hấp thụ [18]

Tomoko Okada và cộng sự (2007) đã nghiên cứu sử dụng lipase xúc tác thủy phân dầu chiết xuất từ cá mòi Thái Bình Dương để sản xuất acid béo - 3 Lipase vi sinh vật thương mại có sẵn là Candida rugosa, Candida cylindracea, Mucor javanicus, và

Aspergillus niger đã được sử dụng cho thủy phân dầu cá mòi ở 37°C [31]

1.3.1.2 Trong công nghiệp dược và hóa chất

Trong những năm gần đây enzyme ngày càng được sử dụng nhiều và rộng rãi trong y học, để sản xuất một số thuốc và dùng trực tiếp để chữa bệnh Ở nhiều nước trên thế giới, đặc biệt ở Nhật Bản hàng năm người ta đã sản xuất một lượng lớn chế phẩm enzyme vi sinh vật có độ tinh khiết cao trong đó có mặt của lipase [18]

Trong dược phẩm lipase được ứng dụng rộng rãi trong quá trình sản xuất thuốc chữa bệnh cho người và các loại hoá chất bảo vệ thực vật (thuốc trừ sâu, trừ cỏ) Gần đây hơn, trong lĩnh vực hoá học tinh khiết, người ta đã dùng lipase để tạo các chất trung gian tổng hợp qua quá trình thuỷ phân lập thể chọn lọc, ứng dụng trong sản xuất thuốc trừ sâu Pyretinoidic [18]

Ngoài ra trong phòng thí nghiệm các lipase cũng được nhà hoá học hữu cơ dùng làm công cụ tổng hợp một số chất khác như phân giải Racemic epoxiester nhờ lipase của

Rhizopus arhisus Với mong muốn có thể sản xuất một loại thuốc làm giãn động mạch vành, người ta dựa vào tính chất chọn lọc thuỷ phân của lipase trong môi trường dung môi hữu cơ [18]

Các lipase có thể xúc tác ester hoá, chuyển đổi ester hoá và ester hoá tương tác trong các dung môi hữu cơ với lượng nước thấp, ứng dụng chính của các lipase trong hoá hữu cơ là sự phân giải các hỗn hợp enantiomeric Có một vài nhóm phân tử liên quan đến sự truyền tính trạng dấu hiệu làm gia tăng những căn bệnh dị ứng, viêm là những lipid hay lipid analogues Sự truyền tín hiệu ở giữa và trong nội bào ở sinh vật liên quan gần gũi với những loại lipid đơn lẻ như phosphatidylinositol, lipase cũng như photpholipase đều có thể được sử dụng để tổng hợp trên phạm vi lớn [18]

1.3.1.3 Trong công nghiệp thuộc da

Quá trình thuộc da yêu cầu phải bỏ lớp chất béo dưới da Sử dụng phối hợp lipase với các enzyme thuỷ phân khác như protease đã mở ra con đường mới cho công nghiệp thuộc da Một quá trình enzyme mới cho sản xuất từ da sống đến thuộc da bao gồm việc giặt, rũ lông và rửa sạch trong bể nước có pH khoảng 8-13 chứa một enzyme ưa

29 kiềm Rõ ràng cần sử dụng phối hợp lipase với các protease kiềm hay trung tính và một chất hoạt động bề mặt khác Tại Nga, đã có bằng sáng chế sử dụng chế phẩm enzyme để thuộc da cừu với các đặc tính ưu việt hơn như độ bền, độ co giãn tăng và giảm cứng [18]

1.3.1.4 Trong công nghiệp mỹ phẩm

Lipase được ứng dụng nhiều trong công nghiệp mỹ phẩm để sản xuất các chất hoạt động bề mặt và các hợp chất thơm Những thành phần chủ yếu trong mỹ phẩm và nước hoa được điều chế bằng phản ứng ester hoá glycerol được xúc tác bởi lipase

Việc chuyển ester hoá của 3,7- dimethyl 4,7- octadien- 1- ol bởi lipase từ nhiều nguồn vi sinh vật khác nhau để điều chế oxide hoa hồng là một hương liệu quan trọng trong sản xuất nước hoa [18]

1.3.1.5 Trong công nghiệp sản xuất các chất tẩy rửa

Hiện nay thị trường lớn nhất cho các loại lipase là việc sử dụng nó như những chất cấu thành trong các loại bột giặt ở công nghệ giặt khô Ngày nay lipase được dùng trong bột giặt để thuỷ phân các vết dầu mỡ mà con người tiết ra quần áo, chăn đệm trong điều kiện nhiệt độ thấp và pH cao với những chất hoá học có hoạt độ bề mặt

Một số lipase ở dạng thương phẩm đã được sử dụng trong ngành thuốc tẩy là Lipase humicola của Novo Nordisk, lipolase hoặc lipase P.glumace của Unilever được sử dụng trong ngành công nghiệp tẩy rửa Những lipase dùng làm bột giặt cho những hộ gia đình giữ ổn định với các protease và hoạt động có hiệu quả trong điều kiện kiềm [18]

1.3.2 Các công trình nghiên cứu sử dụng enzyme lipase để thủy phân dầu béo

Mục đích nghiên cứu

- Khảo sát quá trình thủy phân sử dụng hai loại enzyme lipase là lipase porcine pancreas (PPL) có nguồn gốc từ động vật và lipase từ Candida rugosa (LCR) có nguồn gốc từ vi sinh vật nhằm tìm ra thông số thích hợp cho quá trình thủy phân dầu dừa với hàm mục tiêu là hoạt độ riêng của enzyme

- Khảo sát các thông số động học của enzyme để giải thích sự khác nhau về hoạt độ riêng

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên liệu, hóa chất, dụng cụ và thiết bị

Dầu dừa nguyên chất được sử dụng trong đề tài này được cung cấp bởi công ty trách nhiệm hữu hạn chế biến dừa Lương Quới

Hình 2.1 Sản phẩm dầu dừa của công ty Lương Quới Đặc điểm cảm quan và vật lý

- Trạng thái: trong suốt, không tạp chất

- Màu sắc: màu trong suốt

- Mùi vị: mùi dừa nhẹ

- Hạn sử dụng: 24 tháng kể từ ngày sản xuất

Enzym lipase porcine pancreas, Type II, ký hiệu L3126, sản xuất bởi công ty Sigma Aldrich (Mỹ), nhập khẩu và phân phối bởi công ty trách nhiệm hữu hạn Khoa Học Hợp Nhất

Theo thụng tin từ nhà cung cṍp, 1 đơn vị hoạt độ (UI) sẽ thủy phõn ra 1 àmol acid béo trong 1 giờ tại pH 7,7; nhiệt độ 37 o C Nếu sử du ̣ng cơ chất là dầu olive, hoạt độ riêng của enzyme PPL nằm trong khoảng 100 – 400 UI/mg protein Nếu sử dụng cơ chất là triacetin tại pH 7,4, nhiệt độ 37 o C, hoạt độ riêng của enzyme PPL nằm trong khoảng 30 – 90 UI/mg protein

Enzyme PPL được bảo quản trong phòng thí nghiệm ở nhiệt độ 2 – 8 o C và được kiểm tra hoạt độ định kỳ mỗi tháng để kiểm tra sự thay đổi hoạt độ của chế phẩm enzyme theo thời gian

 Enzyme lipase từ Candida Rugosa

Enzyme lipase từ Candida rugosa là chế phẩm dạng bột thu từ loài nấm men cùng tên do hãng Sigma (Mỹ) cung cấp

Chế phẩm có hoạt độ riêng là 1135 U/mg protein (sử dụng trên cơ chất là dầu ô liu) ở pH 7.2, nhiệt độ 37°C

Enzyme LCR được bảo quản trong phòng thí nghiệm ở nhiệt độ 2 – 8 o C và được kiểm tra hoạt độ định kỳ mỗi tháng để kiểm tra sự thay đổi hoạt độ của chế phẩm enzyme theo thời gian

Hóa chất được sử dụng trong nguyên cứu được dùng để kiểm tra nguyên liệu, pha đệm và chuẩn độ Phần lớn hóa chất có xuất xứ từ Trung Quốc, Việt Nam (Bảng 2.1) Bảng 2.1 Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

STT Tên hóa chất Nơi sản xuất Mục đích sử dụng

1 Na2HPO4 Trung Quốc Pha đệm

2 NaH2PO4 Trung Quốc Pha đệm

Phosphate 1N 3 Phenoltalein 1% Trung Quốc Chất chỉ thị màu

4 NaOH 0.1N Trung Quốc Chuẩn độ, kiểm tra chỉ số AV

5 Ethanol 96 o Việt Nam Bất hoạt enzyme

6 Coomassie brilliant blue G-250 Hàn Quốc

Kiểm tra hàm lượng protein của enzyme

7 Protein chuẩn Bovine serum albumin Merck

Kiểm tra hàm lượng protein của enzyme

8 Acid acetic Trung Quốc Kiểm tra PoV

9 Cloroform Trung Quốc Kiểm tra PoV

11 Na2S2O3 0,01N Trung Quốc Kiểm tra PoV

2.1.3 Dụng cụ và thiết bị

Bên cạnh những dụng cụ thí nghiệm thông thường có xuất xứ từ Trung Quốc như erlen, becher, cốc đong, ống đong, bình định mức, burette, pipette, bảng 2.2 trình bày một số thiết bị và dụng cụ được sử dụng trong nghiên cứu

Bảng 2.2 Dụng cụ và thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

STT Tên dụng cụ, thiết bị Nơi sản xuất

1 Máy đồng hóa cơ Đức

2 Máy đồng hóa áp lực cao Đan Mạch

2.1.3.1 Thiết bị đồng hóa cơ và đồng hóa áp lực cao

Hình 2.2 Thiết bị đồng hóa cơ và đồng hóa áp lực cao

 Thiết bị đồng hóa cơ

Thiết bị đồng hóa cơ sử dụng trong nghiên cứu là thiết bị Heidolph Diax 900 được sản xuất bởi hãng Labexchange (Đức) Thông số kỹ thuật của thiết bị đồng hóa cơ được trình bày ở bảng 2.3

Bảng 2.3: Thông số kỹ thuật của thiết bị đồng hóa cơ dùng trong nghiên cứu

Thông số kỹ thuật Giá trị

Tốc độ quay của trục khuấy 8000 – 26000 vòng/phút Thể tích dịch đồng hóa 0.6 – 7 500 mL

Phạm vi độ nhớt 1 – 5 000 mPa s

 Thiết bị đồng hóa áp lực cao

Thiết bị đồng hóa áp lực cao sử dụng trong nghiên cứu được sản xuất bởi hãng APV – SPX (Đan Mạch) Thông số kỹ thuật của thiết bị đồng hóa áp lực cao được trình bày ở bảng 2.4

Bảng 2.4: Thông số kỹ thuật của thiết bị đồng hóa áp lực cao dùng trong nghiên cứu

Thông số kỹ thuật Giá trị

Công suất làm việc 11 lít/h

Lượng mẫu nhỏ nhất để kiểm tra 100 mL Áp suất làm việc tối đa 2000 bar Đường kính của pittong 10 mm

Vật liệu bao quanh pittong PVDF/EPDM Động cơ TEFC, 3kW, 3 pha/50Hz/380V

Mặt ngoài của máy Làm bằng thép không rỉ

Sơ đồ nghiên cứu

Khảo sát sơ bộ các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ riêng của enzyme lipase

Quy hoạch thực nghiệm quá trình thủy phân dầu dừa bằng enzyme lipase

Nồng độ enzyme Nhiệt độ pH

Khảo sát các thông số động học của enzyme và quá trình thủy phân dầu dừa sử dụng enzyme lipase Khảo sát nguyên liệu

- Chỉ số acid - Chỉ số peroxide - Hàm lượng chất khô

- Hàm lượng protein - Hoạt độ, hoạt độ riêng - Nghiên cứu 2 loại enzyme:

Porcine Panrea Lipase (LPP) và Candida Rugosa Lipase (LCR)

Hình 2.3: Sơ đồ nghiên cứu

Các quá trình dùng trong nghiên cứu

Dầu dừa Đệm phosphate Đồng hóa cơ Đồng hóa áp lực cao

Hình 2.4 Quy trình tạo nhũ dầu trong nước

Mục đích của quá trình này là đồng hóa sơ bộ hệ nhũ trước khi đưa vào máy đồng hóa áp lực cao

Tiến hảnh: Trộn 10mL dầu và 30mL đệm Phosphate 1N có pH được pha theo từng thí nghiệm vào erlen Để hỗn hợp vào máy đồng hóa cơ và đồng hóa ở chế độ 24000 vòng/phút

 Đồng hóa áp lực cao

Mục đích của quá trình này là xé nhỏ hạt cầu béo và làm cho hệ nhũ trở nên đồng nhất với nhau và hạn chế tách lớp trở lại

Tiến hành: Hỗn hợp nhũ dầu sau khi được đồng hóa sơ bộ thì sẽ được cho vào phễu tiếp liệu của máy đồng hóa áp lực Hỗn hợp được cho hoàn lưu liên tục trong 6 phút ở điều kiện 200bar

Hình 2.5 Quá trình thủy phân nhũ dầu dừa

Mục đích của quá trình này là đưa nhiệt độ của hệ nhũ lên nhiệt độ tối ưu cho enzyme hoạt động

Tiến hành: Cho erlen đựng hỗn hợp nhũ dầu vừa được đồng hóa xong vào bể điều nhiệt và tiến hành gia nhiệt lên 40 o C

Mục đích của quá trình này là cho enzyme vào hệ nhũ để enzyme xúc tác quá trình thủy phân nhũ dầu

Tiến hành: Enzyme lipase được hòa tan với đệm Phosphate 1N bằng máy lắc vortex

Dung dịch enzyme sau đó được cho vào erlen chứa nhũ dầu rồi lắc đều

Bố trí thí nghiệm

2.4.1.1 Dầu dừa nguyên chất Mục đích: Đánh giá nguyên liệu dầu dừa nguyên chất

Tiến hành: Nguyên liệu dầu dừa được bảo quản lạnh đông ở -18 o C, được rã đông tự nhiên và xác định các chỉ số acid (AV) theo AOAC 969.17, peroxide (PoV) theo AOAC 965.33 và hàm lượng chất khô

2.4.1.2 Enzyme Lipase Mục đích: Xác định hoạt độ và hoạt độ riêng của các loại enzyme khảo sát

Tiến hành: Xác định hàm lượng protein trongg enzyme bằng phương pháp Bradford

[38] và xác định hoạt độ, hoạt độ riêng của enzyme Hoạt độ và hoạt độ riêng của enzyme được kiểm tra định kỳ mỗi tháng một lần

2.4.2 Khảo sát sơ bộ các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ riêng của enzyme lipase

2.4.2.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của tỷ lệ dầu đệm đến hoạt độ riêng của enzyme lipase Mục đích: Xác định lượng đệm thích hợp để thủy phân nhũ tương dầu trong nước

Tiến hành: Dầu dừa được nhũ hóa theo quy trình 2.4.1 Enzyme được hòa tan với đệm và cho thủy phân với nhũ dầu theo quy trình 2.4.2 Mỗi nghiệm thức lặp lại 2 lần Thời gian lấy mẫu là 5 phút/lần Mẫu được bất hoạt enzyme bằng 10mL cồn 96 o Xác định hoạt độ riêng bằng phương pháp chuẩn độ Thông số cố định và biến đổi thực hiện trong thí nghiệm được trình bày ở bảng 2.5

Hàm mục tiêu: Hoạt độ riêng của enzyme và ta chọn hoạt độ riêng cao nhất

Bảng 2.5: Thông số cố định và biến đổi của thí nghiệm 1

2.4.2.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến hoạt độ riêng của enzyme lipase Mục đích: Xác định lượng enzyme thích hợp để thủy phân nhũ tương dầu trong nước

Cách tiến hành và hàm mục tiêu tương tự như thí nghiệm 1 Bảng 2.6: Thông số cố định và biến đổi của thí nghiệm 2

Thông số cố định Đệm Phosphate 1N Phosphate 1N

Nồng độ cơ chất (g/ml) 0,23 0,23

2.4.2.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ riêng của enzyme lipase Mục đích: Xác định nhiệt độ thích hợp để thủy phân nhũ tương dầu trong nước

Cách tiến hành và hàm mục tiêu tương tự như thí nghiệm 2 Bảng 2.7: Yếu tố cố định và biến đổi của thí nghiệm 3

Thông số cố định Đệm Phosphate 1N Phosphate 1N

Nồng độ cơ chất (g/ml) 0,23 0,23

Nồng độ enzyme (% w/w) Kết quả của TN 1 Kết quả của TN 1 pH 8 7

2.4.2.4 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ riêng của enzyme lipase Mục đích: Xác định pH thích hợp để thủy phân nhũ tương dầu trong nước

Cách tiến hành và hàm mục tiêu tương tự như thí nghiệm 3 Bảng 2.8: Yếu tố cố định và biến đổi của thí nghiệm 4

Thông số cố định Đệm Phosphate 1N Phosphate 1N

Nồng độ cơ chất (g/ml) 0,23 0,23

Nồng độ enzyme (% w/w) Kết quả của TN 1 Kết quả của TN 1 Nhiệt độ ( o C) Kết quả của TN 2 Kết quả của TN 2

Thông số thay đổi pH 7 - 7,5 – 8 - 8,5 - 9 6 - 6,5 – 7 - 7,5 - 8

Mục đích: Viết phương trình hồi quy và tìm điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân để hàm mục tiêu đạt giá trị cực đại

Phương pháp quay bậc hai của Box – Hunter, cấu trúc có tâm với hàm mục tiêu là hoạt độ riêng của enzyme lipase, Y1 (U/mg protein) Ba yếu tố khảo sát gồm: Nồng độ enzyme, nhiệt độ thủy phân, pH thủy phân

Tiến hành: Đồng hóa 40mL nhũ gồm 10mL dầu và 30mL đệm (theo quy trình 2.4.1)

Tiền hành thủy phân nhũ dầu dừa (theo quy trình 2.4.2) với các điều kiện được bố trí dựa theo ma trận thực nghiệm Xác định hoạt độ riêng tại từng điều kiện thí nghiệm và tìm hệ số cho phương trình hồi quy

Thực hiện thí nghiệm minh chứng bằng điều kiện mới thu được sau khi giải phương trình hồi quy để kiểm tra kết quả của quy hoạch thực nghiệm

Xử lý kết quả quy hoạch thực nghiệm bằng phần mềm Modde 5.0

2.4.4 Khảo sát các thông số động học của enzyme lipase

2.4.4.1 Xác định động học của phản ứng thủy phân [18]

Mục đích: Viết phương trình động học của phản ứng thủy phân nhũ dầu dừa bằng enzyme lipase

Tiến hành: Đồng hóa 200mL nhũ gồm 50mL dầu và 150mL đệm (theo quy trình

2.4.1) Tiền hành thủy phân nhũ dầu dừa (theo quy trình 2.4.2) sử dụng các điều kiện vừa tìm được trong phần quy hoạch thực nghiệm Thời gian thủy phân là 1 giờ và lấy mẫu 5 phút/lần Vẽ đường cong biểu diễn sử thay đổi của hàm lượng acid béo theo thời gian Xử lý số liệu bằng phần mềm R để xác định được hằng số của phương trình động học có dạng: 𝑃 𝑠𝑝 = 𝑃 𝑚𝑎𝑥 × (1 − 𝑒 −𝑘𝑡 )

2.4.4.2 Xác định các thông số động học của enzyme lipase [18]

Mục đích: Tìm các giá trị hằng số động học phản ứng mà từ đó ta so sánh được khả năng xúc tác của 2 loại enzyme

Tiến hành: Đồng hóa nhũ với các nồng độ cơ chất khác nhau (theo quy trình 2.4.1)

Tiền hành thủy phân nhũ dầu dừa (theo quy trình 2.4.2) với điều kiện mà ta vừa tìm

43 được ở phần quy hoạch thực nghiệm Thời gian lấy mấu là 1 phút/lần Vẽ đồ thị biểu diễn lượng acid béo sinh ra theo thời gian ứng với từng nồng độ cơ chất khác nhau

Kết quả được dùng để tính các hằng số động học của enzyme lipase

Xác định các thông số động học trong phương trình Michealis – Menten (km và vmax) theo phương pháp do Lineweaver Burk đề xuất Từ các kết quả thực nghiệm thu được, ta vẽ đường thẳng tuyến tính giữa nghịch đảo nồng độ cơ chất ban đầu 1

[𝑆] và nghịch đảo vận tốc phản ứng 1

𝑣 Phương trình đường thẳng cắt trục tung 1

𝑘 𝑚 , từ đó ta suy ra km và vmax (Hình 1.3) Hằng số tốc độ phản ứng (kcat) hay còn gọi là số vòng quay được xác định theo phương trình

[𝐸 0 ] (2.2) Với vmax là vận tốc phản ứng ban đầu cực đại (àmol/mL.phỳt)

[E0] là nồng độ ban đầu của enzyme (àmol/mL) Kcat là hằng số tốc độ phản ứng hay còn gọi là số vòng quay (mL/phút)

Hình 2.6 Phương trình Lineweaver – Burk

Phương pháp xử lý số liệu

Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành lập lại ba lần đối với mỗi thí nghiệm Kết quả được trình bày ở dạng giá trị trung bình ± sai số % Đánh giá sự khác biệt có ý nghĩa giữa các mẫu thí nghiệm được thực hiện bằng phương pháp thống kê ANOVA (α = 5%), sử dụng phần mềm Statgraphic Centurion XV

Các phương pháp phân tích

Nguyên tắc: Dùng dung dịch NaOH 0.1N để trung hòa hết acid béo tự do có trong mẫu thử được hòa tan trong dung môi ethanol trung tính với chỉ thị màu phenolphatalein

Cách tiến hành được trình bày trong phần phụ lục 3

2.6.2 Xác định chỉ số peroxide [39]

Nguyên tắc: Xử lí phần mẫu thử trong môi trường acid acetic và chloroform bằng dung dịch kali iodide Các peroxide tạo thành trong quá trình ôi hóa chất béo sẽ phản ứng với dung dịch KI tạo ra I2 tự do trong môi trường acid theo phản ứng:

Cách tiến hành được trình bày trong phần phụ lục 4

2.6.3 Xác định hàm lượng chất khô [39]

Hàm lượng chất khô của dầu dừa nguyên liệu được xác định bằng cân sấy ẩm

2.6.4 Xác định hàm lượng protein trong enzyme [39]

Nguyện tắc: Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức hợp với protein Trong dung dịch mang tính acid, khi chưa kết nối với protein thì thuốc nhuộm có bước sóng hấp thu cực đại 465 nm; khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp thu cực đại ở bước sóng 595 nm Độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm có liên hệ một cách trực tiếp tới nồng độ protein

Protein chuẩn được sử dụng trong nghiên cứu là albumin huyết thanh bò (Bovine serum albumin hay BSA)

Cách tiến hành được trình bày trong phần phụ lục 1

2.6.5 Xác định hoạt độ và hoạt độ riêng của enzyme [18]

Phương pháp xác định hoạt độ và hoạt độ riêng của enzyme được trình bày trong phần phụ lục 2

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Khảo sát nguyên liệu

Các thông số chất lượng của dầu dừa nguyên liệu được trình bày trong bảng 3.1 Ta có thể thấy rằng trong nguyên liệu dầu dừa có độ ẩm thấp, chỉ số acid và peroxide nằm trong giới hạn của dầu dừa nguyên chất theo TCVN 7597:2013

Bảng 3.1: Tính chất của dầu dừa nguyên liệu

Thông số Chỉ số acid

3.1.2.1 Hàm lượng protein trong enzyme

Mục đích: Xác định hàm lượng protein có trong enzyme để tính toán hoạt độ riêng của enzyme

Hình 3.1 thể hiện đường chuẩn protein xây dựng với chất chuẩn là Bovine Serum Albumin (BSA) Phương trình đường chuẩn có R 2 = 0,9954

Từ đường chuẩn, dùng phương pháp nội suy từ phương trình đường chuẩn, kết quả hàm lượng protein trong enzyme PPL là 44,25% w/w

Hình 3.2 thể hiện đường chuẩn protein xây dựng với chất chuẩn là Bovine Serum Albumin (BSA) Phương trình đường chuẩn có R 2 = 0,9954

Từ đường chuẩn, dùng phương pháp nội suy từ phương trình đường chuẩn, kết quả hàm lượng protein trong enzyme LCR là 4,26% w/w

3.1.2.2 Hoạt độ và hoạt độ riêng ban đầu

Mục đích: Xác định hoạt độ và hoạt độ riêng của enzyme PPL đối với cơ chất dầu dừa

Tiến hành: Kiểm chứng hoạt độ riêng của enzyme PPL tại các điều kiện thủy phân được xác định bởi các nhà nghiên cứu trước (pH 7.4, 37 o C, cơ chất dầu dừa) [40]

Thí nghiệm xác định hoạt độ và hoạt độ riêng của enzyme PPL được lặp lại 3 lần Kết quả hoạt độ thu được là 110,9 ± 0, U/mg enzyme, hoạt độ riêng của enzyme là 249,5 ± 2,2 U/mg protein

Mục đích: Xác định hoạt độ và hoạt độ riêng của enzyme LCR đối với cơ chất dầu dừa

Tiến hành: Kiểm chứng hoạt độ riêng của enzyme LCR tại các điều kiện thủy phân được xác định bởi các nhà nghiên cứu trước (pH 7, 37 o C, cơ chất dầu dừa) [40]

Thí nghiệm xác định hoạt độ và hoạt độ riêng của enzyme LCR được lặp lại 3 lần

Kết quả hoạt độ thu được là 181,6 ± 0,7 U/mg enzyme, hoạt độ riêng của enzyme là 4276 ± 24,6 U/mg protein

Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện thủy phân đến hoạt độ riêng của enzyme

3.2.1.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ dầu đệm đến hoạt độ riêng

Trong thí nghiệm này, em thay tỉ lệ dầu đệm từ 1:1 đến 1:5 theo mục 2.4.2.1 Kết quả thí nghiệm được trình bày trên hình 3.1

Hình 3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ dầu đệm đến hoạt độ riêng của enzyme PPL

Tỉ lệ dầu đệm thích hợp tạo điều kiện cho enzyme tiếp xúc với cơ chất dễ dàng

Enzyme PPL chỉ thủy phân chất béo hiệu quả tại bề mặt liên pha giữa hai pha dầu nước Mặc khác với mỗi loại cơ chất khác nhau thì tỉ lệ dầu : đệm phù hợp là khác nhau Nguyên nhân có thể do sự khác biệt trong thành phần hóa học và tính chất của mỗi loại dầu Vì vậy việc xác định tỉ lệ dầu : đệm là yếu tố quan trọng trong việc khảo sát quá trình thủy phân bằng enzyme PPL trên từng loại cơ chất

Theo hình 3.1, khi tỉ lệ dầu đệm thay đổi từ 1:1 đến 1:3 thì hoạt độ riêng của enzyme cũng tăng dần từ 385,7 ± 77.1 U/mg protein đến 2005,8 ± 154,3 U/mg protein Hoạt độ riêng enzyme đạt cao nhất khi tỉ lệ dầu đệm là 1:3

Mỗi enzyme và mỗi loại cơ chất đều có một tỉ lệ dầu đệm tối ưu nhất cho enzyme hoạt động Có thể lý giải rằng, ở một tỉ lệ dầu đệm thích hợp thì hệ nhũ tương bền vững, diện tích bề mặt liên pha lớn, giúp cho phản ứng thủy phân xảy ra dễ dàng hơn

Khi thay đổi tỉ lệ dầu : đệm từ 1:1 đến 1:5 thì lượng đệm ngày càng tăng làm cho độ nhớt của nhũ giảm xuống, với tỉ lệ dầu đệm là 1:3 thì độ nhớt của nhũ là phù hợp để enzyme có thể dễ dàng phân tán trên bề mặt liên qua dầu đệm, từ đó khiến hoạt độ thủy phân tăng lên Một nghiên cứu của Larissa và cộng sự (2007) tiến hành thủy phân dầu đậu nành bằng enzyme PPL, nhận thấy tỉ lệ dầu đệm tối ưu là 1:4 [41]

H oạt độ ri êng của enz ym e PPL (U /m g prot ei n)

3.2.1.2 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme PPL đến hoạt độ riêng của PPL

Mục đích và phương pháp đã được trình bày ở mục 2.4.2.2 Kết quả thí nghiệm đươc trình bày trên hình 3.2

Hình 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến hoạt độ riêng của enzyme PPL

Tỉ lệ enzyme/cơ chất là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt độ riêng của enzyme Nếu lượng enzyme quá thấp thì khả năng tiếp xúc của enzyme và cơ chất bị hạn chế, dẫn đến quá trình thuỷ phân kém hiệu quả, mang lại hiệu suất thấp và đôi khi thu được sản phẩm không mong muốn Nếu lượng enzyme quá cao, khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất lớn, thúc đẩy phản ứng thuỷ phân xảy ra nhanh, sinh ra nhiều acid béo ở giai đoạn đầu làm giảm pH môi trường gây ức chế hoạt động của enzyme dẫn đến giảm hoạt độ enzyme

Theo hình 3.2, nhận thấy khi tăng nồng độ enzyme PPL từ 0.01% w/w dầu đến 0,05% w/w thì hoạt độ riêng của enzyme PPL giảm dần Hoạt độ riêng cao nhất được ghi nhận tại nồng độ 0,01% là 2022,4 ± 119 U/mg protein và thấp nhất tại nồng độ 0,05% là 678,1 ± 11,9 U/mg protein Do khi lượng enzyme PPL tăng từ 0.01% lên 0,05% thì khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất cũng tăng lên quá cao khiến lượng acid sinh ra quá nhiều sẽ kéo pH môi trường ra khỏi khoảng hoạt động tối ưu của enzyme PPL, khiến enzyme bị bất hoạt và hoạt độ riêng giảm đi rõ ràng

3.2.1.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến hoạt độ riêng của PPL

Mục đích và phương pháp tiến hành được thực hiện theo mục 2.4.2.3 Kết quả thu đươc trình bày trên hình 3.3

H oạ t độ riêng của enzy m e PPL (U/m g pro tein)

Hình 3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ riêng của enzyme PPL

Mỗi enzyme hoạt động trong một khoảng nhiệt độ khác nhau Nhiệt độ tác động mạnh mẽ đến tới độ thủy phân cũng như hoạt động của enzyme Mỗi enzyme sẽ hoạt động tốt nhất tại khoảng nhiệt độ tối ưu của chúng Để đạt hoạt độ riêng cao thì việc xác định nhiệt độ tối ưu cho enzyme là rất cần thiết Enzyme PPL hoạt động tốt trong khoảng nhiệt độ từ 30 – 45 o C

Từ hình 3.3, ta nhận thấy hoạt độ của enzyme PPL đạt cực đại tại nhiệt độ 40 o C là 2070,1 ± 59,1 U/mg protein Khi tiếp tục tăng nhiệt độ lên 42 o C thì hoạt độ của enzyme bắt đầu giảm chỉ còn 1537,8 ± 118,3 U/mg protein Điều này cho thấy hoạt độ của enzyme PPL trên cơ chất dầu dừa thể hiện tốt nhất trong khoảng nhiệt độ 40 o C

Kết quả này tương đồng với nghiên cứu của Trần Thị Bé Lan và cộng sự (2012) khi nghiên cứu so sánh những điều kiện thủy phân dầu dừa của hai loại enzyme là PPL và LCR, nhiệt độ tối ưu của cả hai loại enzyme này là 40 o C [40]

3.2.1.4 Ảnh hưởng của pH thủy phân đến hoạt độ riêng

Mục đích và phương pháp tiến hành đã được trình bày trong phần 2.4.2.4 Kết quả thu đươc biểu diễn trên hình 3.4

H oạ t độ riêng của enzy m e P P L ( U/g pro tein)

Hình 3.4 Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ riêng của enzyme PPL pH của môi trường ảnh hưởng rất lớn đến khả năng xúc tác của enzyme, vì nó ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, enzyme và tác động đến độ bền protein của enzyme Enzyme từ các nguồn khác nhau có pH hoạt động tối ưu khác nhau trên từng loại cơ chất khác nhau Enzyme PPL hoạt động tốt nhất ở môi trường kiềm, trong khoảng giới hạn 7,3 – 9,0

Theo hình 3.4, ta nhận thấy tại pH 8,0 thì hoạt độ riêng của enzyme đạt cao nhất là 2272,3 ± 133,7 U/mg protein, pH này vẫn nằm trong khoảng pH tối ưu của enzyme

Lei và cộng sự (2009), hoạt độ xúc tác của PPL đạt cao nhất khi thủy phân nhũ tương dầu olive ở pH 6,9 [42] Enzyme PPL có khoảng pH hoạt động tương đối rộng, và với mỗi loại cơ chất khác nhau, enzyme sẽ hoạt động tốt ở một pH khác nhau

3.2.2.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ dầu đệm đến hoạt độ riêng của LCR

Mục đích và phương pháp tiến hành đã được trình bày trong phần 2.4.2.1 Kết quả thu đươc trình bày trên hình 3.5

H oạt độ ri êng của enz ym e PPL (U /m g prot ei n) pH

Hình 3.5 Ảnh hưởng của tỷ lệ dầu đệm đến hoạt độ riêng của enzyme LCR

Theo hình 3.5, khi tỉ lệ dầu đệm thay đổi từ 1:1 đến 1:3 thì hoạt độ riêng của enzyme LCR cũng tăng dần từ 4025,2 ± 211,9 U/mg protein đến 20126 ± 1059,3 U/mg protein Hoạt độ riêng enzyme LCR đạt cao nhất khi tỉ lệ dầu đệm là 1:3

Mỗi enzyme và mỗi loại cơ chất đều có một tỉ lệ dầu đệm tối ưu nhất cho enzyme hoạt động Có thể lý giải rằng, ở một tỉ lệ dầu:đệm thích hợp thì hệ nhũ tương bền vững, diện tích bề mặt liên pha lớn, giúp cho phản ứng thủy phân xảy ra dễ dàng hơn

Khi thay đổi tỉ lệ dầu : đệm từ 1:1 đến 1:5 thì lượng đệm ngày càng tăng làm cho độ nhớt của nhũ giảm xuống, với tỉ lệ dầu đệm là 1:3 thì độ nhớt của nhũ là phù hợp để enzyme có thể dễ dàng phân tán trên bề mặt liên qua dầu đệm, từ đó khiến hoạt độ thủy phân tăng lên Một nghiên cứu của Kamol và cộng sự (2008) về khả năng xúc tác của enzyme lipase từ Candida rugosa lipase trên cơ chất dầu dừa tinh khiết, tỉ lệ dầu : đệm tối ưu là 1:1 [34]

3.2.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến hoạt độ riêng của LCR

Khi thay đổi mật độ enzyme LCR từ 0,05% đến 1,5% và thực hiện thí nghiệm theo hoạch định 2.4.2.2 thì kết quả được trình bày ở hình 3.6

H oạt độ ri êng của enz ym e L C R ( U /m g prot ei n)

Hình 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến hoạt độ riêng của enzyme LCR

Quy hoạch thực nghiệm

Để có thể xác định ảnh hưởng đồng thời của nồng độ enzyme, nhiệt độ và pH đến hoạt độ riêng của enzyme PPL, chúng tôi tiến hành quy hoạch thực nghiệm Bảng 3.2 mô tả biến đổi của giá trị nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH (biến tự nhiên và mã hóa) theo ma trận quy hoạch thực nghiệm và kết quả thí nghiệm

Phương pháp quay bậc 2 của Box – Hunter, cấu trúc có tâm với hàm mục tiêu là hoạt độ riêng của enzyme lipase, Y1 (U/mg protein) Ba biến số khảo sát bao gồm hàm lượng enzyme, nhiệt độ thủy phân và pH thủy phân

Bảng 3.2 Các biến số trong ma trận quy hoạch thực nghiệm đối với enzyme PLL

Enzyme PPL được tiến hành cho thủy phân ở những điều kiện khác nhau trong 20 thí nghiệm được bố trí theo ma trận quy hoạch thực nghiệm (Bảng 3.3)

Bảng 3.3: Ma trận quy hoạch thực nghiệm đối với enzyme PPL

Biến mã hóa Biến tự nhiên

Enzyme Nhiệt độ pH Enzyme quả

Giải bài toán quy hoạch thực nghiệm cho hàm mục tiêu là hoạt độ riêng, kết quả được trình bày trong bảng 3.4

Bảng 3.4 Kết quả giải bài toán quy hoạch thực nghiệm đối với enzyme PPL

Hệ số Giá trị b ij t Ghi chú b0 2435,49 30,57 Nhận b1 -130,26 1,63 Loại b2 -39,28 0,49 Loại b3 -130,00 1,63 Loại b11 -718,23 9,01 Nhận b22 -606,68 7,61 Nhận b33 -501,24 6,29 Nhận b12 -29,76 0,37 Loại b13 236,39 2,97 Nhận b23 -0,61 0,01 Loại

Giá trị t được nhận khi t > t p (n 0 -1)= 2,571

Phương trình 3.1 và 3.2 mô tả ảnh hưởng của nồng độ enzyme, nhiệt độ và pH đến hoạt độ riêng của enzyme theo biến mã hóa và biến tự nhiên:

Vì Ftính = 0,88 < 𝐹 1−𝑝(𝑓 1 ,𝑓 2 ) = 4,71 nên phương trình hồi quy tương thích với thực nghiệm theo tiêu chuẩn Fisher

Phương trình hồi quy theo biến mã hóa (3.1) cho thấy các yếu tố ảnh hưởng có ý nghĩa thống kê đến hoạt độ riêng bao gồm bậc 2 của nồng độ enzyme, nhiệt độ và pH và cặp ảnh hưởng tương hỗ nồng độ enzyme - pH Các tác động bậc 1 của nồng độ

57 enzyme, nhiệt độ, pH và ảnh hưởng tương hỗ của các cặp nồng độ enzyme – nhiệt độ, nhiệt độ - pH không ảnh hưởng đáng kể đến hoạt độ riêng của enzyme trong thời gian khảo sát Các yếu tố bậc 2 của nồng độ enzyme, nhiệt độ và pH thì có tác động âm đến hoạt độ riêng của enzyme (Hình 3.9) Điều đó có nghĩa là khi tăng nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH so với điểm tâm của nó (40 o C, 0.01%, 8) thì hoạt độ riêng sẽ giảm xuống

Hình 3.9: Mức độ ảnh hưởng của nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH và tương tác giữa chúng đến hoạt độ riêng của enzyme PPL Bề mặt đáp ứng của hoạt độ riêng khi thay đổi nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH được biểu diễn trên hệ trục ba tọa độ trong hình 3.10

Hình 3.10 Bề mặt đáp ứng của hoạt độ riêng khi thay đổi đồng thời nồng độ enzyme, nhiệt độ và pH đối với enzyme PPL

Giải phương trình hồi quy theo biến tự nhiên (3.2) bằng công cụ Optimizer trong chương trình Modde 5 cho giá trị cực đại là 2456,24 U/mg protein khi nồng độ enzyme, nhiệt độ, lần lượt là 0,0094% w/w, 39,6 o C và pH là 7,8

Kết quả cho thấy điểm cho giá trị hoạt độ riêng cực đại của phương trình (3.2) rất gần các giá trị tâm trong bảng 3.2 Khi so sánh kết quả tính toán từ phương trình hồi quy thu được với kết quả thí nghiệm ở tâm, sự khác biệt là không có ý nghĩa thống kê (p

> 0,05) Như vậy, điều kiện nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH để hoạt độ riêng đạt giá trị cao nhất lần lượt là 0,0094% w/w, 39,6 o C và 7,8 Khi đó hoạt độ riêng là 2425,2 ± 59,1 U/mg protein

Như vậy có thể rút ra quy luật: Các thông số nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH ảnh hưởng đến hoạt độ riêng của enzyme PPL theo dạng hàm bậc 2 của nồng độ enzyme, nhiệt độ và pH và cặp ảnh hưởng tương hỗ nồng độ enzyme - pH

3.3.2 Lipase từ C andida Rugosa Để có thể xác định ảnh hưởng đồng thời của nồng độ enzyme, nhiệt độ và pH đến hoạt độ riêng của enzyme LCR, chúng tôi tiến hành quy hoạch thực nghiệm Bảng 3.5 mô tả biến đổi của giá trị nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH (biến tự nhiên và mã hóa) theo ma trận quy hoạch thực nghiệm và kết quả thí nghiệm

Phương pháp quay bậc 2 của Box – Hunter, cấu trúc có tâm với hàm mục tiêu là hoạt độ riêng của enzyme lipase, Y1 (U/mg protein) Ba yếu tố khảo sát bao gồm hàm lượng enzyme, nhiệt độ thủy phân và pH thủy phân

Bảng 3.5: Các biến số trong ma trận quy hoạch thực nghiệm đối với enzyme LCR

Enzyme LCR được tiến hành cho thủy phân ở những điều kiện khác nhau trong 20 thí nghiệm được bố trí theo ma trận quy hoạch thực nghiệm (Bảng 3.6):

Bảng 3.6: Ma trận quy hoạch thực nghiệm đối với enzyme LCR

Biến mã hóa Biến tự nhiên

Enzym e Nhiệt độ pH Enzyme

Giải bài toán quy hoạch thực nghiệm cho hàm mục tiêu là hoạt độ riêng, kết quả được trình bày trong bảng 3.7

Bảng 3.7 Kết quả giải bài toán quy hoạch thực nghiệm đối với enzyme LCR

Hệ số Giá trị b ij t Ghi chú b0 25553,72 97,37 Nhận b1 2556,27 9,74 Nhận b2 -837,62 3,19 Nhận b3 2968,95 11,31 Nhận b11 -5811,51 22,14 Nhận b22 -7089,04 27,01 Nhận b33 -7035,05 26,81 Nhận b12 -350,51 1,34 Loại b13 1830,51 6,97 Nhận b23 -36,23 0,14 Loại

Giá trị t được nhận khi t > t p (n 0 -1)= 2,571

Phương trình 3.3 và 3.4 mô tả ảnh hưởng của nồng độ enzyme, nhiệt độ và pH đến hoạt độ riêng của enzyme theo biến mã hóa và biến tự nhiên:

Vì Ftính = 3,739 < 𝐹 1−𝑝(𝑓 1 ,𝑓 2 ) = 4,82 nên phương trình hồi quy tương thích với thực nghiệm theo tiêu chuẩn Fisher

Phương trình hồi quy theo biến mã hóa (3.3) cho thấy các yếu tố ảnh hưởng có ý nghĩa thống kê đến hoạt độ riêng bao gồm bậc 1 và bậc 2 của nồng độ enzyme, nhiệt độ và pH và ảnh hưởng tương hỗ giữa nồng độ enzyme - pH Các cặp ảnh hưởng tương hỗ của các cặp nồng độ enzyme – nhiệt độ, nhiệt độ - pH không ảnh hưởng đáng kể đến hoạt độ riêng của enzyme trong thời gian khảo sát Các yếu tố bậc 1 và 2 của nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH, cặp ảnh hưởng tương hỗ nồng độ enzyme – pH chủ yếu có tác động âm đến giá trị hoạt độ riêng (Hình 3.11) Điều đó có nghĩa là khi tăng nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH so với điểm tâm của nó (40 o C; 011%; 7,5) thì hoạt độ riêng sẽ giảm xuống

Hình 3.11: Mức độ ảnh hưởng của nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH và tương tác giữa chúng đến hoạt độ riêng của enzyme LCR Bề mặt đáp ứng của hoạt độ riêng khi thay đổi nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH được biểu diễn trên hệ trục ba tọa độ trong hình 3.12

Hình 3.12 Bề mặt đáp ứng của hoạt độ riêng khi thay đổi đồng thời nồng độ enzyme, nhiệt độ và pH

Giải phương trình hồi quy theo biến tự nhiên (3.4) bằng công cụ Optimizer trong chương trình Modde 5 cho giá trị cực đại là 26128,9 U/mg protein khi nồng độ enzyme, nhiệt độ, lần lượt là 0,11% w/w, 39 o C và pH là 7,7

Kết quả cho thấy điểm cho giá trị hoạt độ riêng cực đại của phương trình (3.4) rất gần các giá trị tâm trong bảng 3.2 Khi so sánh kết quả tính toán từ phương trình hồi quy thu được với kết quả thí nghiệm ở tâm, sự khác biệt là không có ý nghĩa thống kê (p

Khảo sát động học

3.4.1 Xác định phương trình động học của quá trình thủy phân nhũ dầu của enzyme lipase

Phương trình động học phản ứng giúp chúng ta biết được khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất trong quá trình thủy phân theo thời gian

Nhũ dầu dừa được thủy phân trong vòng 1 giờ và lấy mẫu mỗi 5 phút để kiểm tra hàm lượng acid béo sinh ra theo thời gian Kết quả được trình bày trong bảng 3.9 và hình 3.13

Bảng 3.9 Lượng acid béo sinh ra theo thời gian khi thủy phân dầu dừa bằng PPL (àmol acid bộo/mL mẫu)

Thời gian Lần 1 Lần 2 Lần 3

Hình 3.13 Lượng acid béo sinh ra theo thời gian khi thủy phân dầu dừa bằng PPL

L ượn g aci d bộo si nh ra (àm ol /m l)

Xử lý kết quả bằng phần mềm R cho ta được kết quả lượng acid béo tối đa (Pmax) cùng vận tốc ban đầu (k) (Bảng 3.9) Ta có được phương trình động học:

Phương trình 3.5 biểu diễn động học của quá trình phản ứng thủy phân nhũ dầu của enzyme PPL, qua đó ta thấy được rằng lượng acid béo tối đa có thể sinh ra là 12,6 àmol/ml mẫu

Nhũ dầu dừa được thủy phân trong vòng 1 giờ và lấy mẫu mỗi 5 phút để kiểm tra hàm lượng acid béo sinh ra theo thời gian Kết quả được trình bày trong bảng 3.10 và hình 3.14

Bảng 3.10 Lượng acid béo sinh ra theo thời gian khi thủy phân dầu dừa bằng enzyme LCR (àmol/mL mẫu)

Thời gian Lần 1 Lần 2 Lần 3

Hình 3.14 Lượng acid béo sinh ra theo thời gian khi thủy phân dầu dừa bằng LCR

Xử lý kết quả bằng phần mềm R cho ta được kết quả lượng acid béo tối đa (Pmax) cùng vận tốc ban đầu (k) (Bảng 3.10) Ta có được phương trình động học:

Phương trình 3.6 biểu diễn động học của quá trình phản ứng thủy phân nhũ dầu của enzyme LCR, qua đó ta thấy được rằng lượng acid béo tối đa có thể sinh ra là 112,4 àmol/ml mẫu, hệ số gúc là 0.04

Từ hai phương trình 3.5 và 3.6 ta có thể kết luận sự biến thiên của hàm lượng acid béo sinh ra theo thời gian của cả hai loại enzyme là như nhau, bằng chứng là hệ số góc của cả hai đường cong xấp xỉ nhau Tuy nhiên, LCR có khả năng xúc tác thủy phân mạnh hơn do đó lượng acid béo sinh ra nhiều hơn so với PPL Nguyên nhân là do sự khác nhau về cấu trúc và tính đặc hiệu của hai loại enzyme

3.4.2 Xác định các thông số động học của enzyme lipase

Kết quả thực nghiệm cho thấy ở cùng điều kiện tối ưu của quá trình thủy phân thì hoạt độ riêng của LCR luôn cao hơn so với PPL Các loại enzyme khác nhau thì có các thông số động học khác nhau, các giá trị thông số động học của 2 loại enzyme được trình bày trong bảng 3.11

L ượn g aci d bộo si nh ra (àm ol /m l)

Bảng 3.11 Các thông số động học ứng với hai loại enzyme PPL và LCR

Porcine Pancreas Lipase Lipase từ Candida Rugosa v max k m k cat v max k m k cat

Hằng số Michelis Menten km đặc trưng cho ái lực của enzyme với cơ chất, bảng 3.11 cho ta thấy hằng số km của PPL là cao hơn so với LCR có nghĩa là ái lực giữa enzyme với cơ chất của PPL nhỏ hơn nhiều so với LCR, điều này thể hiện qua hằng số tốc độ phản ứng ban đầu của enzyme – cơ chất (vmax) Hằng số km của PPL lớn hơn so với LCR dẫn đến việc vận tốc phản ứng cực đại vmax của PPL nhỏ hơn so với LCR Bảng 3.11 cũng cho thấy hằng số kcat của LCR lại cao hơn so với PPL, điều này có nghĩa là trong một thời gian nhất định thì LCR chuyển hóa nhiều sản phẩm hơn so với PPL, điều này cũng dẫn đến vận tốc cực đại của LCR cao hơn so với PPL

So sánh các thông số động học đã giải thích cho việc hoạt độ riêng của enzyme LCR cao hơn so với PPL Nguyên nhân dẫn đến sự khác nhau của các thông số động học này có thể là do nguồn gốc thu nhận khác nhau của hai loại enzyme Nguốn gốc khác nhau dẫn đến sự khác nhau về cấu trúc của tâm hoạt động từ đó làm cho các thông số động học khác nhau