Luận văn thạc sĩ Công nghệ thực phẩm: Nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp Gamma Aminobutyric AICD (GABA) từ môi trường cám gạo sử dụng chủng LACTOBACILLUS BREVIS

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOANGUYEN THỊ XUAN NU’ NGHIÊN CỨU QUA TRÌNH SINH TONG HỢP GAMMAAMINOBUTYRIC ACID GABA TỪ MOI TRƯỜNG CÁM GẠO SỬ DỤNG CHỦNG LACTOBACILLUS BREVIS Chuyên ngành : Công ng

MO DAU 1.1 Ly do hinh thanh dé tai

Gamma Aminobutyric Acid (GABA) là một axit amin, chat dan truyén có chức năng quan trọng trong hệ thống thần kinh GABA như là thuốc an thần tự nhiên của cơ thé Thông thường, não bộ sẽ tiết ra lượng GABA chúng ta cần.

Nhưng đối với chế độ ăn uống kém, tiếp xúc với các chất độc môi trường, nồng độ GABA có thé trở nên cạn kiện Quá ít hợp chất quan trọng này trong cơ thể có thể dẫn đến sự lo lang, khó chịu, mất ngủ, Wi vậy, GABA được xem như là thành phan quan trọng cần bố sung cho cơ thé Đây chính là ly do nhiều hướng tập trung nghiên cứu dé tìm ra được giải pháp, các nguồn nguyên liệu khác nhau có thé tong hợp GABA đạt hiệu quả cao.

Gạo là nguồn lượng thực quan trọng, chiếm số lượng lớn ở nước ta Trong đó, lúa sau quá trình xay xát cho ra cám gạo là nguồn phụ phẩm chiếm 10% tổng khối lượng lúa Cám gạo tại Việt Nam hiện nay là nguồn nguyên liệu rat doi dào, giá thành rẻ nhưng gan như chi sử dụng dé làm thức ăn gia súc Việc ứng dụng cám gạo làm nguyên liệu trong quá trình sinh tổng hợp GABA sẽ làm gia tăng giá trị của cám.

Một số nghiên cứu về sinh tong hop GABA từ cám lúa mạch và cám lúa mì qua quá trình ủ cho năng suất chuyển đổi từ glutamate sang GABA khá cao tương ứng 92%, 60% tỷ lệ chuyên đổi [1] Từ đây cho thay, cám gạo với thành phần hoá học tương tự cũng có thể thực hiện quá trình sinh tong hop tao GABA.

Mặt khác, nguyên liệu cám gạo sử dung enzyme Alcalase, Flavourzyme đạt hiệu quả thủy phân protein, đồng thời tăng hàm lượng axit glutamic đã được nghiên cứu bởi Hamada (2000)[2] Villanueva và cộng sự (1999) cũng chứng minh hàm lượng axit glutamic tăng lên khi thủy phân hạt dướng dương băng Alcalase, Flavourzyme, kết hợp 2 protease tương ứng là: 21 4, I3,3, 21,8 (g/100g protein) [3].

Kết qua cũng được báo cáo bởi Ckova và cộng sự (2002) [4] Điều này cho thay việc ứng dụng enzyme để thủy phân protein để làm tăng hàm lượng axit glutamic cho quá trình sinh tổng hop GABA là khả thi.

HVTH: Nguyễn Thị Xuân Nữ

Bên cạnh đó, các nghiên cứu về sinh tổng hợp GABA hiện nay chủ yếu sử dụng vi khuẩn LAB, đặc biệt là Lb brevis do khả năng san sinh enzyme GAD cao hơn so với các phương pháp ủ, nay mam LD brevis đã được ứng dụng dé sinh tong hợp GABA từ nguyên liệu nước ép quả mâm xôi đen, bã rượu shochu, môi trường

MRS [5] Việc ứng dụng vi khuẩn này trong sinh tong hop GABA từ cám gạo chưa được nghiên cứu nhiều.

Xuất phát từ thực tế đó, nghiên cứu được triển khai thực hiện đề tài “Nghiên cứu quá trình sinh tổng hop Gamma Aminobutyric Acid (GABA) từ môi trường cám gạo sử dụng chung Lactobacillus brevis”.

1.2 Mục tiêu đề tài 1.2.1 Mục tiêu tổng quát

Tận dụng nguồn phụ phẩm cám gạo từ quá trình sản xuất công nghiệp dé làm môi trường sản xuất sản phẩm GABA có giá trị gia tăng cao.

1.2.2 Mục tiêu cu thể Lên men sản xuất GABA đạt hiệu suất cao từ nguyên liệu cám gạo sử dụng các vi sinh vật có lợi (Lactobacillus brevis) với sự hỗ trợ của enzyme.

- Xác định thành phần cơ bản của cám gạo ở 2 giai đoạn chính trong quy trình sản xuất gạo (giai đoạn xát và giai đoạn đánh bóng) Tu đó, chọn được nguyên liệu phù hợp cho quá trình sinh tổng hợp GABA.

- Khảo sát ảnh hưởng quá trình tiền xử lý nguyên liệu cám gạo đến khả năng lên men sinh tổng hợp GABA

- Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nito (peptone) bố sung đến kha năng lên men sinh tổng hợp GABA.

TONG QUAN 2.1 Tong quan về GABA

Gamma Aminobutyric Acid (GABA) là một axit amin phi protein có 4 carbon

(hình 2.1), một thành phân quan trọng trong nhóm các axit amin tự do.

A NAL ° OH

NGUYEN LIEU VA PHUONG PHAP NGHIEN CUU

Mục tiêu tong quát của dé tài là tận dụng nguồn phụ phẩm cám gạo từ quá trình sản xuất công nghiệp để làm môi trường sinh tổng hợp sản phẩm GABA có giá trị gia tăng cao, đáp ứng như cau tiêu thụ của thị trường.

Mục tiêu cụ thé của dé tài là nghiên cứu quá trình lên men sinh tổng hợp GABA đạt hiệu suất cao từ nguyên liệu cám gạo sử dụng các vi sinh vật có lợi (LB. brevis) dưới sự hỗ trợ của enzyme.

Thông tin về nguyên liệu cám gạo: ¢ Nguồn gốc: Nhà máy xay xát lúa gạo TU RO ¢ Địa chỉ: 126/1a đường Phan Van Hon, ấp 1, xã Xuân Thới Thượng, huyện

Hóc Môn, TP.HCM. ¢ Sản lượng: 30 tan/ngay ¢ Thong số kĩ thuật của nguyên liệu cám thé hiện qua bảng 3.1

Bảng 3.1 Thông số của cám nguyên liệu trong nghiên cứu Thông số Cám xát Cám xoa (cám lau) Mức độ nghiền (% khối lượng) 6-7 3

Ty lệ thu hồi (% khối lượng) 6+0,5 3+ 0,5

Cám gạo ngay sau khi lay trực tiếp từ nhà máy sẽ được đưa vào quy trình xử lý cám, phục vụ cho nghiên cứu Cám gạo được xử lý theo quy trình trong hình 3.2.[43]

Hình 3.2 Quy trình xử lý cám gạo e Hấp Cám gạo sau khi thu nhận từ các nhà máy xay xát sẽ được hấp ở nhiệt độ 95°C +5°C, thời gian 10 phút để vô hoạt các enzyme gây hư hỏng dầu như lipase, lipoxygenase va peroxidase có trong cám, ngăn cản sự oxy hóa va làm ổn định nguyên liệu cám sau này. e SaySau khi hap vô hoạt enzyme, cám chuyén qua sấy ở nhiệt độ là 60°C đến khi độ am đạt 5 — 6%, thời gian say 30 phút/mẻ/500g, nhằm thuận lợi cho quá trình tách béo tiếp theo. e Tach béo

Tiến hành tách béo bang phương pháp trích ly trong dung môi hexane, trong thiết bị trích ly có vỏ áo điều nhiệt Tỉ lệ dung moi : cám là 3:1 (w/w), trích ly ở nhiệt độ thường, thời gian trích ly là 48 giờ.

Sau quá trình trích ly, pha ran được tách riêng Pha lỏng được đưa qua thiết bị chưng cất để tách dung môi và thu hồi béo của cám gạo. e Say Sau khi trích ly, cám được đem say khô dé bay hết dung môi Cám tách béo được đựng trong bao nhựa (polypropylene), hàn ghép mí và bảo quản lạnh ở nhiệt độ 4°C để chuẩn bị cho quá trình nghiên cứu.

3.2.2 Vi khuẩn Lb brevis Thí nghiệm này sử dụng vi khuẩn Lactobacillus brevis VTCC — B — 397 được phân lập từ cải chua của Bảo tàng giống chuẩn Vi sinh vật (VTCC), Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội Giống được giữ trong môi trường thạch nghiêng MRS bảo quản ở 4 — 10°C Mỗi tháng tiến hành cấy chuyền định kỳ để giữ giống.

Enzyme được bảo quản trong tủ lạnh nhiệt độ 5-10°C.

Thông tin về enzyme được trình bay tại bang 3.2

Bảng 3.2 Thông tin về enzyme sử dụng trong nghiên cứu

Alcalase® 2.4 | Endopeptidase Dan Mach Bacillus 24 AU-A/g | 55- 70°C 65-85

Flavourzyme® Hỗn hợp của Aspergillus Dang ran, 500 LAPU/g, 50-55°C 5,0-7,0.

500 MG endoproteases oryzae mau nâu va exopeptidases

3.3.1 Sơ đồ nghiên cứu — quy trình thí nghiệm

Quy trình nghiên cứu khả năng lên men sinh tổng hợp GABA từ nguyên liệu cám gạo tách béo sử dụng chủng Lb brevis được thể hiện qua hình 3.3.

CK Enayme (néu “ Xử lý nguyên liệu ¥

Lọc LE Ba loc ¥ Điều chỉnh dịch men | Ỷ

Hình 3.3 Quy trình nghiên cứu khả năng lên men sinh tổng hợp GABA từ nguyên liệu cám gạo tách béo su dụng chung LD brevis.

Tiến hành khảo sát quá trình xử lý các nguyên liệu ở các điều kiện khác nhau dé đánh giá hiệu quả sinh tong hợp GABA.

Các mẫu thí nghiệm sau khi được xử lý sẽ được lọc qua vải lọc bang may loc chan khong để loại bỏ bã tạo thuận lợi cho quá trình lên men sinh tong hop GABA.

> Diéu chinh dich men Các mẫu thí nghiệm được điều chỉnh pH = 5,0 trước khi lên men.

Các mau thí nghiệm được đem thanh trùng ở nhiệt độ 80°C, thời gian 30 phút để tiêu diệt vi sinh vật, ngăn ngừa tạp nhiễm, ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp GABA của vi khuẩn Lb brevis.

Các mẫu sau thanh trùng được làm nguội về nhiệt độ 30-32”C trước khi lên men.

Mẫu được tiến hành lên men với thông số quá trình: e Lượng giống giống cấy: 10% v/v với mật độ tế bảo trong ống giống 10°cfu/ml. e T°C: 30°C e Thời gian lên men: 48 giờ

> Nuôi cấy Môi trường MRS lỏng được chuẩn bị theo tỷ lệ 55,15g MRS hòa tan với 1000ml nước cất Sau đó, môi trường MRS được hấp tiệt trùng ở 121°C, trong 20 phút.

Lb brevis trước khi sử dụng được dem đi nhân giống- Giống trước khi lên men được tiễn hành hoạt hoá dé đảm bảo sự 6n định.

- Nhân giống: Dùng que cay tròn lấy phần khuẩn lac vi khuẩn trong ống men giống gốc, cây vào ống nghiệm có chứa sẵn 10ml môi trường MRS lỏng đã tiệt trùng Nuôi cay trong tủ âm ở nhiệt độ 34°C trong 24h.

Sau đó, giỗng được đem đi lên men.

3.3.1.2 So đô nghiên cứu Nội dung của các thí nghiệm trong nghiên cứu nay được trình bày tóm tat trong sơ đồ biéu diễn ở hình 3.4.

| 1 Khao sát nguyên liệu a tiên xử lý nguyên liệu cam gạo đền Khảo sát ảnh hưởng quá trìn khả năng lên men sinh tổng hop h \

“ a ằị Anh hưởng nụng độ œ-amylase đờn qua trỡnh tiờn xử lý nguyờn liệu

(, ` „ „ ơ ằ| Anh hưởng quỏ trỡnh xử lý băng a-amylase đờn kha năng sinh tụng hợp

Anh hưởng ty lệ Alcalase : Flavourzyme đến quá trình tiền xử lý nguyên liệu sản xuất GABA.

3 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nito bô sung đên khả năng lên men r

2 x L4 Ầ ) Anh hưởng nông độ enzyme protease đên quá trình tiên xử lý nguyên liệu Ảnh hưởng của quá trình tiền xử lý nguyên liệu đến khả năng sinh tổng hợp

Anh hưởng của nồng độ peptone bổ sung đến khả năng lên men sinh

Hình 3.4 Sơ đồ nội dung nghiên cứu

3.3.2 Nội dung 1: Xác định thành phân hóa học của nguyên liệu s* Mục dich

Xác định thành phần cơ bản của nguyên liệu của cám gạo, mà ở đây là cám xát và cám xoa Từ đó, năm được thông tin cơ bản của đối tượng, làm cơ sở để chọn ra loại nguyên liệu phù hợp cho nghiên cứu, dé ra các giải pháp thích hợp dé hỗ trợ cho quá trình sinh tổng hop GABA đạt hiệu quả hơn.

“+ Thông số đánh giá - Độ ẩm — phụ lục 1.2 - Hàm lượng protein tong — phụ lục 1.1 - Hàm lượng lipit tổng — phụ lục 1.7

- Ham lượng tinh bột — phụ lục 1.4

- Hàm lượng đường tổng — phụ lục 1.5.3

- Hàm lượng đường khử - phụ lục 1.5.4

- Hàm lượng tro tong — phụ lục 1.3 3.3.3 Nội dung 2: Khảo sát ảnh hướng quá trình tiền xử lý nguyên liệu cám gạo đến khả năng lên men sản xuất GABA 3.3.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng nông độ enzyme a-amylase đến quá trình tiễn xử lý nguyên liệu cảm gạo tách béo. s* Mục dich

KET LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ 5.1 Kết luận

Kết quả thu được trong quá trình nghiên cứu rút ra một số kết luận:

- Cám xát là nguyên liệu được lựa chọn phù hợp về mặt kĩ thuật và kinh tế cho quá trình lên men sinh tổng hợp GABA.

- Cám gạo tách béo thủy phân băng a — amylase với nồng độ enzyme 0,15%

(v/w) thì hàm lượng đường khử, hàm lượng chất khô hòa tan thu được tương ứng là 16,30mg/ml, 4,57°Brix.

- Hàm lượng GABA trong môi trường dich cám gạo tách béo thủy phân bang ơ-amylase đạt 6,41mg/ml, cao gần gấp 2,38 lần so với mẫu cám tách béo đối chứng (2,69mg/ml) Quá trình thủy phân ơ-amylase có thé đạt hiệu quả trong việc phá vỡ liên kết a -1,4 Glucoside của tinh bột với các protein, lượng axit amin cũng được giải phóng một phan nhỏ dé thực hiện chuyển hóa thành GABA.

- Mức độ thủy phân axit amin khi kết hợp 2 enzyme protease cao hơn so với việc chỉ sử dụng một trong hai enzyme Alcalase và Flavourzyme Tỷ lệ enzyme

Alcalase : Flavourzyme là 3:7 đạt hiệu quả, phù hợp cho mục đích lên men sinh tong hop GABA với hàm lượng đường khử 20,96 mg/ml, hàm lượng chất khô 5,23°Brix, mức độ thủy phân axit amin là 20,97%.

- Nông độ enzyme protease bổ sung 2% (w/w) đạt hiệu quả, tương ứng dich cám gạo tách béo thu được hàm lượng đường khử, hàm lượng chất khô, mức độ thủy phan axit amin tương ứng: 21,18 mg/ml, 5 53°Brix, 23 418%.

- Quá trình tiền xử lý nguyên liệu cám gạo tách béo sử dụng kết hợp ba enzyme a-amylase và Alcalase:Flavourzyme tỷ lệ 3:7 cho hiệu quả sinh tong hợp GABA cao nhất đạt 8,43 mg/ml sau 48 giờ lên men.

- Việc bố sung peptone vào dịch thủy phân cám gạo tách béo ảnh hưởng tới quá trình sinh tổng hợp GABA Nông độ peptone b6 sung 1,5% (w/v), với 40 giờ lên men, hàm lượng GABA đạt cao nhất 12,15mg/ml.

Như vậy việc sử dung Lb brevis để lên men sinh tong GABA từ dich cám gạo sử dụng enzyme để thủy phân có ý nghĩa cao về mặt khoa học — công nghệ cũng như kinh tế - xã hội.

5.2 Kiến nghị Dựa trên kết quả thu được, một số nội dung nghiên cứu tiếp theo cần thực hiện như sau:

- Hoàn thiện quá trình lên men sản xuất GABA từ cám gạo.

- _ Nghiên cứu ảnh hưởng của enzyme GAD đối với quá trình tong hợp GABA bởi Lb brevis - Nghiên cứu phương pháp cho quá trình trích ly, tinh sạch GABA có hiệu quả.

- Nghiên cứu điêu kiện sản xuât cụ thê ở quy mô pilot