NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:> Xác định thành phan hóa học co bản của hạt bụp giấm Khảo sát ảnh hưởng của quá trình xử lí nguyên liệu đến sự tổng hợp GABA.Khảo sát các điều kiện lên men phù hợp
TÔNG QUAN 2.1 Tổng quan về GABA
2.1.1 Giới thiệu về GABA GABA là một amino acid phi protein có 4 carbon, nó được tìm thấy trong tế bào vi sinh vật (VSV), thực vật và động vật GABA được phát hiện lầu dau tiên trong mô củ khoai tây vào năm 1949 [2| Chức năng của GABA ở các loài sinh vật vẫn chưa được hiểu biết day đủ Ở thực vat, GABA có vai trò trong việc chồng lại các stress sinh học từ môi trường như nông độ muối cao, côn trùng, điều kiện ánh sáng thấp, sự xâm nhập của vi khuẩn, virus GABA còn đóng vai trò trao đối chất trong chu trình Krebs và sự phát triển, sinh sản ở thực vật [3] Ở động vật, GABA được tìm thay Vol nong do cao trong não, ngoài có vai trò trao đổi chat trong chu trình Krebs còn đóng một vai trò chính trong sự dẫn truyền thần kinh ức chế của hệ thần kinh trung ương và các mô ngoại vi Nó ngăn chặn các tín hiệu thần kinh kích thích giúp giảm căng thăng, lo âu, mat ngủ và hỗ trợ điều trị nhiều bệnh than kinh ở người [4] Ở vi sinh vật, vai trò chủ yếu của GABA là giúp vi sinh vật chống lại điều kiện pH thấp [2] Ngoài ra, GABA còn liên quan đến sự nảy mam bào tử của một số vi khuẩn [2]; tham gia vào chu trình Krebs va chồng lại điều kiện thiếu oxi ở một số vi khuẩn hiếu khí, chồng lại muối mật, áp suất thâm thấu cao [5].
Hình 2.1 Công thức cau tạo của GABA [6]
GABA chủ yếu được hình thành bằng phan ứng ơ-decarboxyl không nghịch đảo của acid L-glutamic hoặc muối của nó, được xúc tác bởi enzyme glutamic acid decarboxylase (GAD) Enzyme nay được tìm thấy ở vi sinh vật như: Lactobacillus,
Escherichia, Streptococcus, Aspergillus và Neurospora; ở thực vật như: trà, cà chua, đậu nành, khoai tây, gạo lứt nay mam; và trong não của động vật có vu [4] Ngoài ra,
HVTT: Nguyễn Thị Bích Liên
GABA còn được tìm thay ở côn trùng như: gián, châu chau, sâu bướm va ong mat [4].
Tuy nhiên hiện nay người ta chủ yếu tập trung vào việc nghiên cứu san xuất GABA hơn là việc chiết tách GABA Vi khuẩn Lactobacillus va nam men là hai loài quan trọng nhất dé sản xuất GABA vì chúng thường được sử dụng phổ biến trong sản xuất thực phẩm lên men [4].
2.1.2 Cơ chế tổng hợp GABA ở người
Trong cơ thể người, GABA được phát hiện trong hệ thống thần kinh trung ương vào khoảng năm 1950 bởi Eugene Roberts nhưng đến năm 1960, GABA mới được đề xuất là chất dẫn truyền thần kinh ức chế trong cơ thể Ngoải não, GABA cũng có mặt trong tế bào lympo B tuyến tụy, buông trứng, tinh hoàn, ống tiêu hóa GABA có chức năng quan trọng trong hệ thống thần kinh [7].
Quá trình tong hop va chuyén hóa GABA ở người cũng tương tự như ở thực vat, động vật, được thực hiện theo chu trình “GABA shunt” (hình 2.2) bởi 3 enzyme chính: enzyme glutamic acid decarboxylase (GAD), GABA d-oxoglutarafte transaminase (GABA-—T) va enzyme succinic semialdehyde dehydrogenase (SSADH) [8].
“GABA shunt” là một chu trình khép kin với mục đích là để sản xuất và đảm bảo sự cung cấp GABA GABA có ở nông độ cao (mM) trong nhiều vùng não Nong độ này cao gấp 1.000 lần so với nông độ các chất dẫn truyền thần kinh monoamine thông thường trong cùng một vùng Diéu này phù hợp với tác động mạnh mẽ và chuyên biệt của các noron thần kinh GABAergic ở các vùng nay Glucose là tiền thân chính cho sản xuất GABA trong cơ thé người, mặc dù pyruvate và các acid amin khác cũng có thé đóng vai trò tiền thân Bước dau tiên trong “GABA shunt” là sự chuyển hóa ơ-ketoglutarate (được hình thành từ chuyển hóa glucose trong chu trình Krebs) bởi
GABA a-oxoglutarate transaminase (GABA-T) tạo thành axit L-glutamic Sau đó enzyme glutamic acid decarboxylase (GAD) xúc tác cho việc khử nhóm cacboxyl cua acid glutamic (hoặc glutamate) dé tao thanh GABA GAD dường như chi được biểu hiện trong các tế bào sử dụng GABA như một chất dẫn truyền thần kinh Khi lượng GABA sinh ra vượt quá ngưỡng thì một tín hiệu thần kinh sẽ kích hoạt quá trình chuyển hóa GABA bởi GABA-T để hình thành succinic semialdehyde Dé bảo tồn nguồn cung GABA, sự chuyển đổi này thường xảy ra khi có sẵn một phân tử a- ketoglutarate để nhận nhóm amin được loại bỏ khỏi GABA, dé tao thành glutamic acid.
Do đó, một phân tử GABA chỉ có thé được chuyển hóa nếu một phân tử glutamic được hình thành Succinic semialdehyde có thể bị oxy hóa bởi enzyme SSADH tạo thành succinic acid và sau đó có thé quay lại chu ky Krebs, hoàn thành vòng lặp [8].
Mặc dù, GABA-T có thể tham gia tong hop GABA từ succinic semialdehyde nhưng vai trò cơ bản của enzyme này là chuyển hóa GABA tạo thành succinic semialdehyde Ngoài ra, những chất ức chế hoạt động của GABA-T cũng làm sinh ra một lượng lớn GABA ở trong não [9] Hơn nữa, quá trình tạo GABA của GAD cần có sự tham gia của vitamin B6 hay còn được gọi là pyridoxal-5’-phophate (PLP) được xem như một coenzyme [2].
O NH, ° 90 ° HO-C-CHCH,CH,C-OH HO-C-CCH,CH,C-OH
SSADH agape ĐC y-Aminobutyric acid 0 ° (GABA) HO-CCH,CH,C-OH ~ _ Succinic acid
Hình 2.2 Chu trình chuyển hóa GABA 6 não người (GABA shunt)[8]
HVTT: Nguyén Thi Bich Lién
2.1.3 Chức năng sinh lý của GABA đối với cơ thể người 2.1.3.1 Hoạt động của GABA trong hệ thần kinh người
GABA được tổng hợp trong não, hoạt động bằng cách ngăn chặn tín hiệu não (các dẫn truyền thần kinh kích thích) thông qua các thụ thể GABA GABA được tạo ra bởi các tế bào than kinh GABAergic, sau đó được phóng thích ra ngoài khe Synap, khuếch tán trong khe Synap và gắn vào các thụ thể GABA Các thụ thể GABA, nhận biết và gắn kết GABA, nam tại các màng sau khe Synap Có 3 nhóm thụ thé GABA là
GABA-A và GABA-C là thụ thé ức chế nhanh, có vai trò ngăn chặn các truyền dẫn co giật, lo lang, hoảng loạn và căng thăng Thụ thể GABA-A liên kết với một kênh ion Khi GABA kết hop với thụ thể nó làm mở kênh ion cho phép ion Cl’ xuyên qua mang và đi vào trong tế bào than kinh, làm tăng tinh phân cực của màng tế bào than kinh, do đó các truyền dẫn thần kinh kích thích bị ngăn chặn [4].
Các thụ thể GABA-B làm trung gian cho sự ức chế chậm các truyền dẫn thần kinh, là loại thụ thể chuyển hóa chất, có vai trò quan trọng trong trí nhớ, tâm trạng, phan ứng đau Khi GABA kết hợp với thụ thể GABA-B, sẽ tạo ra sự chuyển hóa của một chất trung gian là G-protein, làm mở kênh ion K* gan đó, cho phép ion K” đi ra ngoài tế bào thần kinh, làm tăng tính phân cực của màng tế bào thần kinh, do đó các truyền dẫn thần kinh kích thích bị ngăn chặn [4].
Sau khi làm xong nhiệm vụ, GABA được tái hấp thụ ở các tế bào thần kinh trướcSynap (nơi tạo ra GABA) và các tế bào thần kinh đệm xung quanh bởi các protein vận chuyển GABA (GAT) Các protein này hoạt động phụ thuộc nhiệt độ hoặc gradient nông độ, chênh lệch nồng độ GABA bên trong và bên ngoài khoảng 200 lần GABA được đưa trở lại các tế bào thần kinh GABAergic dé tái sử dụng, nhưng GABA được hap thu vào các tế bào than kinh đệm sẽ được chuyền hóa thành succinic semialdehyde bởi enzyme GABA-T và không thể tái tổng hợp trong các tế bào này vì thiếu enzyme
GAD Cuối cùng, GABA có thé được phục hôi từ nguồn này băng đường vòng qua chu trình Krebs [8].
Hình 2.3 Hoạt động cia GABA ở hệ than kinh người [8]
2.1.3.2 Các chức năng sinh lý của GABA đối với cơ thể người
Ngày nay, GABA được các nhà khoa học chứng minh là chất có hoạt tính sinh học mạnh, có nhiều chức năng sinh lý quan trọng và tác động tích cực cho sức khỏe của con người Các chức năng sinh lý của GABA thử nghiệm trên động vật và người được tổng hợp ở bảng 2.1.
HVTT: Nguyễn Thị Bích Liên
Bang 2.1 Các chức năng sinh lý cua GABA [4]
Chức năng sinh lý Chức năng cụ thể Dẫn truyền thân kinh Uc chê dẫn truyền thân kinh Điêu chỉnh huyết áp Giảm huyết áp
Bệnh não Làm giảm các rôi loạn thần kinh
Bệnh liên quan hệ thần kinh
Làm giảm các rối loạn tâm trạng
Làm giảm triệu chứng mat ngủ Giảm phiền muộn
Phòng ngừa và điêu trị các chứng nghiện rượu
Các cơ quan quan trọng
Bảo vệ và chong lại bệnh thận man tinh
Kích hoạt chức năng gan
Cải thiện chức năng thị giác
Tăng tốc độ tổng hợp protein trong não Hệ thông miễn dịch Tăng khả năng miễn dịch
Bảo vệ và phòng chồng ung thư
Làm chậm và ức chế tế bao ung thư tăng sinh Kích thích các tế bào ung thư tự hủy diệt Uc chê các khôi u Điều chỉnh tê bào
Chống viêm và tăng sinh tế bào nguyên bào sợi Tổng hợp acid hyaluronic
Nâng cao hiệu suât của các nguyên bào sợi da
Làm suy giảm các phan ứng trao doi chat làm thiêu máu cục bộ
Hệ hô hấp Kiêm soát bệnh suyên
Kiểm soát đường hô hấp Điêu chỉnh nội tiết to Tăng hormone tăng trưởng
Kiêm soát bài tiét hormone Kiêm soát progesterone Kiêm soát hormone tuyên giáp Ngăn ngửa béo phì
2.1.4 Cơ chế sinh tong hợp GABA bởi vi sinh vật 2.1.4.1 Cơ chế tổng hợp Ở vi sinh vật, vai trò chủ yếu của việc sản xuất GABA là giúp vi sinh vật chống lại điều kiện pH thấp như ở: E.coli, Lactococcus lactis, Lactobacillus plantarum,
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Hạt bup giấm sử dụng trong quá trình nghiên cứu được thu mua tại huyện Tuy Phong, tỉnh Binh Thuận Bụp giấm được bảo quản nguyên hat trong điều kiện lạnh đông (-18°C) nhằm hạn chế sự nảy mam của hat gây ảnh hưởng đến các thành phan hóa học trong hạt, đồng thời hạn chế sự hư hong do vi sinh vật, môi trường.
Hình 3.1 Hạt bup giam trước và sau khi xay
Sử dụng giống vi khuẩn Lactobacillus plantarum VTCC B-890 được mua từ Bảo tàng giống Vi sinh vật, thuộc Viện Vi Sinh Vật và Công Nghệ Sinh Học, Đại học Quốc gia Hà Nội Lactobacillus plantarum VTCC B-890 là chủng vi khuẩn được phân lập từ dưa cải muối chua Giống vi sinh vật được bảo quản lạnh ở nhiệt độ 0 - 4°C dé sử dụng làm giống cấy trong quá trình nghiên cứu.
Su dung enzyme proteinase Flavourzyme 500 MG cua hang Novozymes, Dan
Mach, được cung cấp bởi công ty Brenntag Vietnam Co., Ltd Enzyme Flavouzyme được bao quan ở nhiệt độ 0 - 4°C trong quá trình nghiên cứu Flavourzyme 500 MG có hoạt độ được cụng bồ là 500 LAPU/ ứ (1 đơn vị LAPU là lượng enzyme cần dựng để thủy phân 1 mol L-Leucine-p-nitroanilide trong | phút).
Flavourzyme là một protease có nguồn gốc từ nam mốc Aspergillus oryzae, là một loại aminopeptidase bao gồm cả endo-peptidase và exo-peptidase, có khả năng thủy phân hơn 70 % các liên kết peptide của chuỗi protein tạo thành sản phẩm là các amino acid và một số chuỗi peptide ngắn Điều kiện hoạt động tối ưu của enzyme là 50 - 55°C, pH = 6-7 Enzyme được bat hoạt khi xử lí nhiệt ở 85°C trong 10 phut [42].
3.1.4 Các vật liệu và hóa chất khác
Bang 3.1 Các vật liệu, hóa chất sử dụng
Tên Hóa chât / vật liệu Hãng sản xuât Xuât xứ Ban nhôm TLC silicagel 60 F254 Merch Đức
„ Himedia An Độ Glutamic chuân
Filter 0,45um Sigma-Aldrich My Pyridoxal 5-phosphate
Diethyl ether Sucrose Phenylisothiocyanate HPLC TCI Anh
, Interchim Phap Triethylamine chuan HPLC
HVTT: Nguyén Thi Bich Lién
3.1.5 Máy móc, thiết bị sử dụng
Thiết bi HPLC Agilent 1260 Thiét bi Soxhlet
Thiết bị say thăng hoa Bề điều nhiệt
May đo quang phố UV — vis CT-2300 Tủ 4m
Tủ cay Máy đếm khuẩn lạc Nồi hấp tiệt trùng Bếp điện từ
3.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Nội dung nghiên cứu
Nội dung nghiên cứu được trình bày tóm tắt ở bảng 3.2
Bảng 3.2 Nội dung nghiên cứu
STT | Nội dung nghiên cứu Yếu tô khảo sát Hàm mục tiêu
` - Hàm lượng protein Xác định thành phân hóa l - Hàm lượng lipid học của nguyền liệu
- Hàm lượng đường khử và đường tổng
- Ảnh hưởng của chât béo
Khảo sát quá trình xử lý |- Ảnh hưởng của bã nguyên
- Ty lệ nguyên liệu và nước
Hàm lượng GABA - Nhiệt độ (mele bup giấm) ) m up giam
Khao sát điêu kiện lên - Ty lệ giông cây oe eee ,
3 , | (Xác định băng sac men GABA - Hàm lượng saccharose b6 ký bản mong) [50], sung
Khảo sát ảnh hưởng của ` 4 -Nông độ enzyme proteinase enzyme proteinase
Khao sat anh hưởng của , 5 -Ham lượng PLP bô sung coenzyme PLP
Hàm lượng GABA Xác định hàm lượng „
6 GABA tại các điều kiện | -Ham lượng GABA `
(Xác định băng tôi ưu
HVTT: Nguyén Thi Bich Lién
3.2.2.1 Quy trình lên men sinh tổng hợp GABA và phân tích mẫu
V V ` Á Đo pH Lọc Đếm số tế bào
Hinh 3.2 Quy trinh lén men GABA
Hạt bup giam được xay khô bang máy xay gia dung, sau đó được sàng qua ray có đường kính 16 250 um để đảm bảo độ mịn của bột và độ đồng nhất của mẫu sử dụng trong quá trình thí nghiệm.
Bột bụp giam được mang đi tách béo bang phương pháp Soxhlet (phụ lục A4).
HVTT: Nguyễn Thị Bích Liên
Mục đích của quá trình ngâm là hòa tan protein và một số chất dinh dưỡng từ bột bụp giấm vào nước dé chuẩn bị dịch bup giam cho quá trình lên men GABA.
Quá trình ngâm gồm 2 giai đoạn Giai đoạn dau, bột bụp giấm được ngâm trong nước cất, ở nhiệt độ phòng, có sử dụng máy lắc ở tốc độ 100 vòng / phút, với tỷ lệ bột : nước cất = 1 : 10 (w/v) (hoặc phù hợp với thí nghiệm tỷ lệ nguyên liệu : nước), trong thời gian 1 gid, sau đó thêm NaCl với hàm lượng 4 % (w/v) và tiếp tục lắc trong 1 giờ.
Hai giai đoạn này được thực hiện với mục đích chủ yếu là hòa tan hai thành phan protein chính trong hat bụp giấm là albumin (34 %) va globulin (47,12 %) [20] Như vay ham lượng protein tối da có thé được hòa tan vào dich bụp giảm là 81,12 %.
Dung dịch sau khi ngâm được đem đi nau sôi trong 10 phút, nhăm mục đích phá hủy các thành phân độc tố (HCN, saponin), chất kháng enzyme trypsin, chất liên kết với kim loại (phytate) và liên kết với protein (tannin) [20], [26] có thể gây ảnh hưởng xau đến quá trình sinh tong hop GABA của vi khuẩn Lb plantarum.
Chỉ thực hiện đối với các thí nghiệm có xử lý enzyme Dịch bụp giấm sau khi nau được làm nguội về 50 °C và cho enzyme Flavourzyme vào, xử lý trong 2 giờ trong bể điều nhiệt ở nhiệt độ 50 °C, pH = 6.4 (pH tự nhiên của dịch bụp giám), tốc độ lắc 60 vòng / phút Sau khi xử lý, enzyme được bất hoạt ở nhiệt độ 85°C trong 10 phút [42].
Dich bụp giam sẽ được tách bã bang ray có đường kính lỗ 74 um (200 mesh).
Tỷ lệ bã thu nhận được là 25 % (khối lượng bã khô so với tổng khối lượng bột khô).
Dịch bụp giảm được bổ sung nước để đảm bảo ty lệ bột bụp giảm : dịch bụp giảm = |: 10 (w/v) (hoặc phù hợp với thí nghiệm tỷ lệ nguyên liệu : nước) Sau đó dịch bụp giảm sẽ được đem đi chỉnh pH băng hệ đệm phosphate — citrate [43] Chỉ thực hiện công đoạn này ở các thí nghiệm can chỉnh pH.
Dịch bụp giấm được đem đi tiệt trùng bằng nỗi hấp tiệt trùng ở 121°C trong 15 phút, để tiêu diệt các vi sinh vật tạp nhiễm, tạo điều kiện cho quá trình lên men GABA bởi vi khuẩn Lb.plantarum Sau khi tiệt trùng, dịch bup giấm được làm nguội về nhiệt độ 35°C (hoặc phù hợp với điều kiện thí nghiệm nhiệt độ lên men).
Cay giống lactobacillus plantarum vào dịch bụp giẫm, lên men ở nhiệt độ 35°C trong tủ âm (hoặc phù hợp với điều kiện thí nghiệm nhiệt độ lên men), thời gian lên men theo điều kiện cụ thê của các thí nghiệm.
Sau khi lên men, dịch bụp giam được dem di do pH, cây đĩa đếm số lượng VSV và loc bang giấy lọc có đường kính lỗ 25 um dé đem đi phân tích hàm lượng GABA. s* Chuan bị giông cay:
Lactobacillus plantarum được bảo quản ở dạng thạch nghiêng, do đó, cần phải hoạt hóa dé đưa về giai đoạn sinh trưởng 6n định của giống Quá trình hoạt hóa giống được tiễn hành như sau: dùng que cấy lay một vòng sinh khối Lactobacillus plantarum từ ống thạch nghiêng cho vào 10 ml môi trường MRS đã tiệt tring, sau đó lac đều môi trường lỏng và cho vào tủ ấm, ủ ở nhiệt độ 35 °C trong 24 giờ Sau đó, lẫy 1 ml canh trường giống thu được cho vào 9 ml môi trường MRS đã tiệt trùng, tiếp tục ủ ở nhiệtHVTT: Nguyễn Thị Bích Liên độ 35 °C trong 24 giờ Lap lại nhiều lần liên tục cho đến khi môi trường hoạt hóa có giá tri OD ồn định, đồng thời số tế bào vi sinh vật cũng đạt giá tri ôn định.
KÉT QUÁ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Thành phan hóa học của hạt bụp giấm
Kết quả khảo sát thành phan hóa học của hạt bụp giam được thể hiện ở bảng 4.1.
Bang 4.1 Thành phan hóa học của hạt bụp giấm
Thành phân Hàm lượng (%) Độ âm 6,79 + 0,050
Qua kết quả ở bang 4.1, cho thay hàm lượng protein của hat bụp giấm được sử dụng trong nghiên cứu này là 22,02 %, thấp hơn so với hàm lượng protein của hạt bụp giấm tại Ai Cập (31,02 %) và tương đương với hạt bụp giẫm tại An Độ (18 — 22 %) [18] Như vậy, hàm lượng protein của hạt bụp gidm sử dụng trong nghiên cứu là khá cao (22,02 %), với thành phan acid glutamic trong protein chiếm tỷ lệ đến 21/78 % [17], chứng tỏ hạt bup giam là một nguồn cung cấp acid glutamic déi dào cho việc lên men tao GABA (chiếm 4,79 % khối lượng hạt bụp giảm) Ngoài ra, theo Sanoussi Atta và cộng sự (2013), hạt bụp giảm giàu các khoáng chất, đặc biệt là mangan, magie [23 | là hai thành phan cần thiết trong môi trường dinh dưỡng của Lb plantarum [33].
Tuy nhiên kết quả khảo sát cũng cho thấy, với hàm lượng đường tổng là 5,8 %, trong đó đường khử là 1,1 %, bột hạt bụp giảm khi chuẩn bị dịch lên men GABA sẽ được pha loãng với nước tạo thành dịch lên men theo tỷ lệ bột bụp giảm : dịch lên men
HVTT: Nguyễn Thị Bích Liên
= 1: 10, khi đó hàm lượng đường tổng và đường khử của dịch lên men sẽ lần lượt là 0,58 % và 0,11 % Hàm lượng đường này là khá thấp so với nhu câu nguồn carbon của vi khuẩn Lactobacillus plantarum đã được nghiên cứu trên môi trường chuân MRS là 2 % [33] Do đó, việc b6 sung nguồn dinh dưỡng carbon cần được khảo sát dé tìm ra hàm lượng đường tối ưu cho sự phát triển và sinh tổng hợp GABA của vi khuẩn
4.2 Kết qua khảo sát quá trình xử lý nguyên liệu 4.2.1 Ánh hưởng của chất béo trong nguyên liệu
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của chất béo trong hat bụp giấm (hình 4.1) cho thay hạt bụp giảm được tách béo sau khi lên men sẽ cho hàm lượng GABA cao hơn hạt bụp giam không tách béo, với hàm lượng lần lượt là 0,907 (mg/g bụp giấm) và 0,84 (mg/g bụp giảm) Sự khác biệt này là rất có ý nghĩa về mặt thông kê (xem phụ lục B4), chứng tỏ chất béo trong nguyên liệu có ảnh hưởng đến quá trình lên men sinh tong hợp GABA của vi khuẩn Lb plantarum Do đó, bột bup giam tách béo được lựa chon dé tiền hành các thí nghiệm tiếp theo.
Tach béo Khong tach béo
Hình 4.1 Hàm lượng GABA cia các mẫu sau lên men
Nguyên nhân có thé do hạt bụp giam có hàm lượng béo cao 21,82 % (bảng 4.1), nên hạt bụp giấm tách béo sẽ có hàm lượng các chất khô khác (carbohydrate, protein ) cao hơn hạt bụp giam chưa tách béo ở cùng khối lượng mẫu Trong đó hàm lượng protein trên bột tách béo so với bột không tách béo sẽ tăng từ 22 % lên 26,79 %.
Hàm lượng protein tăng lên sẽ được proteinase của vi khuẩn Lb.plantarum phân giải [31], làm cho hàm lượng acid glutamic cũng tăng lên Vi acid glutamic là co chất cho quá trình sinh tổng hợp GABA bởi enzyme GAD [5] nên khi hàm lượng glutamic tăng, sẽ làm tăng hàm lượng GABA.
Tách béo Không tách béo
Hình 4.2 Tong so VSV của các mau sau lên men
Ngoài ra, kết quả kiểm tra tong số VSV sau lên men (hình 4.2), cho thay mẫu tách béo có số lượng VSV là 10,47 (log CFU/ml) cao hơn mẫu không tách béo có số lượng VSV là 10.3 (log CFU/ml) Tuy nhiên, sự khác biệt số lượng VSV giữa hai mẫu không lớn (0,17 log CFU/ml), do đó có thé thay chất béo trong hạt bụp giảm không có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của vi khuẩn Lb plantarum Mặc dù, nhiều nghiên cứu cho thay dau hat bụp giấm có chứa các thành phan sterol có khả năng ức chế một số vi khuẩn gây bệnh như: A fumigatus, T mentagrophytes, S.aureus [20] [22] nhưng chưa có nghiên cứu nào cho thay sự ức chê đôi với vi khuân Lb plantarum.
HVTT: Nguyễn Thị Bích Liên
4.2.2 Ánh hưởng của bã nguyên liệu
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của bã nguyên liệu được thé hiện ở hình 4.3 và hình 4.4 Hàm lượng GABA của mẫu bột bụp giảm tách bã cao hơn nhiều so với mẫu bột bup giam không tách bã, sau 24 giờ lên men Cụ thé hàm lượng GABA ở mẫu không tách bã là 0,913 (mg/g), trong khi hàm lượng GABA của mẫu tách bã là 1,417 (mg/g).
Như vậy hàm lượng GABA tăng lên khoảng 1,55 lần Sự khác biệt giữa hai mẫu tách bã và không tách bã là rất có ý nghĩa về mặt phân tích thống kê (xem phụ lục B5).
Tách bã Không tách bã
Hình 4.3 Hàm lượng GABA cia các mẫu sau lên men
10 + - g | ——7,36_ 7,36 = Tổng số VSV ban đầu
Tach ba Khong tach ba
Hình 4.4 Tong so VSV của các mau trước và sau lên men
Ngoài ra, qua kết quả kiểm tra tổng số VSV hình 4.4 cho thấy, mẫu không tách bã có số lượng VSV thấp hon 4,13 (log CFU/ml) so với mẫu tách bã Hơn nữa so với số lượng VSV ban dau thì mẫu tách bã tăng thêm 3,24 (log CFU/ml), còn mẫu không tách bã lại giảm đi 0,89 (log CFU/ml) Điều này cho thay đối với mẫu không tách bã, VSV bị ức chế và không phát triển được Nguyên nhân của sự ức chế này có thể do, hàm lượng chất khô trong mẫu không tách bã cao hơn mẫu tách bã (khối lượng bã chiếm 25 % khối lượng bột bup giam, tính theo khối lượng khô) đã gây cản trở cho sự phát triển của vi khuẩn Lb.plantarum, vì giỗng như hau hết vi khuẩn lactic, chúng cần hoạt độ nước trên 0,9 để phát triển tốt [54] Như vậy, có thể nói nguyên nhân hàm lượng GABA mẫu không tách bã thấp hơn mẫu tách bã là do VSV bị ức chế, không phát triển được trong mẫu không tách bã.
Qua kết quả khảo sát, dịch lên men tách bã được lựa chọn để tiễn hành các thi nghiệm tiếp theo.
4.2.3 Ánh hưởng tý lệ nguyên liệu và nước của dịch lên men
Kết quả khảo sát tỷ lệ nguyên liệu : nước của dịch lên men trong quá trình ngâm và lên men được thể hiện ở hình 4.5 và hình 4.6 Hàm lượng GABA tăng lên khi tỷ lệ nguyên liệu : nước tang từ 1: 5 đến 1 : 20 (w/v) và đạt ham lượng cao nhất là 4,04 (mg/g) ở ty lệ nguyên liệu : nước = 1: 20 và 1 : 25 Hàm lượng GABA của mau | : 20 cao gấp 3,06 lần so với mẫu | : 5 (mẫu có hàm lượng GABA thấp nhất) Sự khác biệt về hàm lượng GABA giữa các mẫu là rất có ý nghĩa về mặt thống kê (xem phụ lục B6).
Do đó, tỷ lệ nguyên liệu : nước = 1 : 20 được chọn cho các thí nghiệm tiếp theo.
Ngoài ra, kết quả kiểm tra số lượng VSV của các mẫu ở hình 4.6 cho thấy có sự khác biệt rất nhỏ về tổng số VSV của các mẫu sau lên men (0,1 log CFU/ml giữa mẫu cao nhất và thấp nhất) Điều này cho thấy tỷ lệ nguyên liệu : nước trong quá trình chuẩn bị dịch lên men có ảnh hưởng không đáng kế đến sự phát triển của vi khuẩn
HVTT: Nguyén Thi Bich Lién
1:05 1:10 1:15 1:20 1:25 Ty lệ nguyên liệu : nước % (w/v)
Hình 4.5 Hàm lượng GABA cia các mẫu sau lên men
— Tông so VSV ban dau 8 (log CFU/ml)
7 4 = Tổng số VSV sau lên men
Ty lệ nguyên liệu : nước % (w/v)
Hình 4.6 Tông so VSV cua các mẫu trước và sau lên men
Sự khác biệt về hàm lượng GABA của các mẫu, có thể do tỷ lệ nguyên liệu :nước khác nhau trong quá trình ngâm bột bụp giam, làm cho hàm lượng protein được ly trích vào trong dịch bụp giấm có sự khác nhau Do đó ảnh hưởng đến lượng co chất glutamic của quá trình tổng hợp GABA và ảnh hưởng đến hàm lượng GABA sau lên men Theo báo cáo cua Saif Eldein (1998), với phương pháp trích ly protein từ bột hat bụp giấm tách béo ở nhiệt độ 30°C, khi tăng tỷ lệ nguyên liệu : nước từ 1: 10 lên I : 15 và | : 20 thì hàm lượng protein trích ly được tăng tương ứng từ 62,14 % lên 66 % và
70,5 % [20] Điều này hoàn toàn phù hợp với kết quả trong nghiên cứu nay Sự khác biệt về khả năng ly trích protein ở các tỷ lệ nguyên liệu : nước khác nhau có thể do nguyên lý sự khuếch tán của nước và các chất hòa tan theo chiều gradient nồng độ Ở tỷ lệ nước : nguyên liệu thấp, khi protein và các chất hòa tan được ly trích từ bột bụp giảm ra bên ngoài sẽ nhanh chóng làm tăng nồng độ các chất này trong dung dịch bên ngoài và đạt đến giới hạn về cân băng nồng độ giữa bên trong bột bụp giẫm và dung dịch bên ngoài Do đó, với tỷ lệ nước : nguyên liệu thấp hơn thì hàm lượng protein và các chất hòa tan sẽ ly trích ra được ít hơn Tuy nhiên hàm lượng GABA là như nhau ở tỷ lệ nguyên liệu : nước = 1 : 20 và 1 : 25 có thé do hàm lượng protein tăng lên không đáng kế va sự tong hop GABA vi khuẩn Lb plantarum bị hạn ché do các điều kiện khác của quá trình lên men chưa đạt được điều kiện tối ưu cho quá trình tổng hợp
GABA. s* Tóm lại các khảo sát phan xử lý nguyên liệu:
Kết quả rút ra từ các khảo sát ban đầu cho thấy, nghiên cứu sẽ tiễn hành quá trình lên men tao GABA của vi khuẩn Lb plantarum trong môi trường dịch bụp giam từ bột hạt bụp giảm tách béo và loại bỏ bã khỏi dịch lên men sau 2h ngâm khuấy Ty lệ tốt nhất về nguyên liệu : nước của dịch bụp giấm trong quá trình ngâm bột bụp giam và lên men là 1: 20 (w/v) Hàm lượng GABA thu nhận là 4,04 (mg/g bụp giấm).
HVTT: Nguyễn Thị Bích Liên
4.3 Kết quả khảo sát điều kiện lên men GABA 4.3.1 Ánh hưởng của pH dịch lên men
KÉT LUẬN VÀ ĐÈ NGHỊ 5.1 Kết luận
Đề tài “nghiên cứu quá trình lên men sinh tong hop Gamma Aminobutyric acid (GABA) từ môi trường hạt bụp giảm sử dụng chung Lactobacillus plantarum” đã hoàn thành với các kết quả chính như sau:
> Quá trình xử lý nguyên liệu: bột hạt bụp giảm tách béo, tách bã, chuẩn bị dịch lên men với tỷ lệ nguyên liệu: nước = 1 : 20 là điều kiện xử lý tối ưu cho quá trình lên men GABA.
> Các thông số tối ưu cho quá trình lên men GABA là: pH ban đầu = 5 (có sử dụng đệm), nhiệt độ lên men 35°C, ty lệ giống cây 15 % , hàm lượng saccharose bố sung là 5 %, thời gian lên men 36 giờ.
> Việc xử lý nguyên liệu với enzyme proteinase (Flavourzyme) sẽ làm tăng hàm lượng GABA sau lên men tăng lên 1,44 lần với nỗng độ enzyme tối ưu là 4 %.
> Bồ sung coenzyme PLP sẽ làm tăng hàm lượng GABA được tổng hợp lên 1,34 lan ở hàm lượng PLP tối ưu là 100 ug/ml.
> Hàm lượng GABA được tổng hợp bởi Lb plantarum trên môi trường dịch bup giam tại các điều kiện tối ưu là 19.86 mg/g bụp giấm.
Bảng 4.2 Kết quả sinh tổng hợp GABA của nghiên cứu
Hàm lượng GABA sinh tổng
Quá trình hợp (mg/g) Lên men với mẫu tách béo 0.907
Lên men với mẫu tách bã 1417
Lên men với mẫu có tỷ lệ nguyên liệu : ơ 4.04 nước tôt nhât lựa chọn
Lên men tại các điều kiện tôi ưu lựa chọn 10.33
Lên men có xử ly enzyme proteinase 14,76
Lên men có bồ sung coenzyme PLP 19,86
Dựa trên kết quả thu được, một SỐ nghiên cứu tiếp theo được kiến nghị là:
> Thử nghiệm quá trình sản xuất GABA bang phương pháp lên men liên tục dé tăng hàm lượng GABA thu được.
> Tiếp tục hoàn thiện quy trình lên men để áp dụng ở quy mô sản xuất công nghiệp.
HVTT: Nguyễn Thị Bích Liên
DANH MỤC TÀI LIEU THAM KHAO
[1] E Adawy et al., “Characteristic of roselle seeds as a new source of protein and lipid’, Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol 42, pp 1896-1990, 1994.
[2] R Dhakal et al, “Production Of GABA (y- Aminobutyric Acid) By Microorganisms: A Review”, Brazilian Journal of Microbiology, pp 1230-1241, 2012.
[3] S Michaeli and H Fromm “Closing the loop on the GABA shunt in plants: are GABA metabolism and signaling entwined ?” US National Library of Medicine National Institutes of Health, 2015.
[4] M Diana et al., “Gamma-aminobutyric acid as a bioactive compound in foods: a review”, Journal of functional foods, vol 10, pp 407-420, 2014.
[5] C Feehily and K A Karatzas “Role of glutamate metabolism in bacterial responses towards acid and other stresses”, Journal of applied microbiology, vol 114, Issue 1, pp 11-24, January 2013.
[6] R M Dawson et al, Data for Biochemical Research Oxford: Clarendon Press, 1959.
[7] Y Abe et al., “Effect of green tea rich in y aminobutyric acid on blood pressure of Dahl salt-sensitive rats”, American Journal of Hypertens, vol 8(1), pp 74-79, 1995.
[8] R W Olsen and T M DeLorey “GABA Synthesis, Uptake and Release”, American Society for Neurochemistry, 1999.
[9] Z Jin et al., “GABA is an effective immunomodulatory molecule”, Amino Acids, vol 45, pp 87-94, 2011.
[10] H Li and Y Cao “Lactic acid bacterial cell factories for gamma-aminobutyric acid”, Springer, Amino Acids, vol 39, pp 1107-1116, 2010.
[II] A Tarboush e/ a, “Some nutritional and functional properties of Karkade (Hibiscus Sabdariffa) seed products”, Cereal Chemistry, vol 74, pp 352-355, 1997.
[12] J F Morton Roselle In: Fruits of Warm Climates Miami, USA: Florida Flair Books, 1987, pp 281-286.
[13] S.M Robert “Roselle Production: Botanical Description” Internet: http://www.herbs.org/africa/articles/hibiscusmanual html, 2005.
[14] Quezon “Roselle: The dawn of a sunrise’ industry” Internet: http://www quezon.org/Roselle, 2005.
[15] Internet: — https://vi.wikipedia.org/wiki/B%EI%BB%ASp_gi%EI%BA%ASm, 2016.
[16] B B Mohamed et al., “Roselle (Hibiscus Sabdariffa L.) in Sudan, cultivation and their use”, Bulletin of Environment, Pharmacology and Life Sciences, vol 1-6, pp 48 — 54, May 2012.
[17] A Ismail et al., “Roselle seed- nutrition composittion, protein quality and health benefits”, Global science book, vol 2 (1), pp 1-16, 2008.
[18] N A Elneairy “Comparative Studies on Egyptian and Libyan Roselle Seeds as a Source of Lipid and Protein”, Food and Nutrition Sciences, vol.5, pp 2237-2245, 2014.
[19] Nguyễn Công Khan va cộng sự Bang thành phần thực phẩm Việt Nam Hà Nội: Y
[20] S E Ahmed “Some physicochemical and nutritional studies on karkade (hibiscus sabdariffa) seed proteins”, Doctor thesis, University of Khartoum, 1998.
HVTT: Nguyén Thi Bich Lién
[21] L Zoué et al., “Physicochemical and microbiological characterization of linolenic acid-rich oils from seeds of two tropical plants: Corchorus olitorius L and Hibiscus sabdariffa L.”, African Journal of Biotechnology, vol 11(39), pp 9435-9444, May 2012.
[22] R A Holser “Phytosterol Composition of Hybrid Hibiscus Seed Oils” J Agric.
[23] S Atta et al., “Nutrients composition of calyces and seeds of three Roselle (Hibiscus sabdariffa L.) ecotypes from Niger” African Journal of Biotechnology, vol.
[24] R Mohamed et al., “Roselle (Hibiscus sabdariffa) seed oil is a rich source of y — Tocopherol”, Institute of Food Technologists, vol 72, Nr 3, 2007.
[25] P U Rao “Nutrient composition and biological evaluation of mesta (Hibiscus sabdariffa) seeds”, Plant Foods for Human Nutrition, vol 49, pp 27-34, Jan 1996.
[26] B A Anhwange et al., “Nutrtion value and nutritional factor in Hibiscus SabdarIffa”, Journal of Fisheries international, vol.1, pp 73-76, 2006.
[27] Naser Tajabadi ef al., “Optimization of y-Aminobutyric Acid Production by Lactobacillus plantarum Taj-Apis362 from Honeybees”, Molecules, vol 20, pp 6654- 6669, 2015.
[28] J Slonczewskl “Lactobacillus plantarum and its biological implications”.
Internet: https://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Lactobacillus_plantarum_and_its_biological_implications, Oct 26, 2014.
[29] S da Silva Sabo et al., “Overview of Lactobacillus plantarum as a promising bacteriocin producer among lactic acid bacteria”, Food Research International, vol 64, pp 527-536, 2014.
[30] S Y Park et al., “Physiological Characteristics and GABA Production of Lactobacillus plantarum K255 Isolated from Kimchi’ Korean J Food Sci An, vol 33, No 5, pp 595 - 602, 2013.
[31] M Y Marathe and J S Ghosh “Study of proteinase activity of Lactobacillus plantarum NCIM 2083”, International Journal of Genetics and Molecular Biology, vol | (1), pp 001-005, Apr 2009.
[32] S Lahaye and J McIntyre “Lactobacillus plantarum” Internet: https://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Lactobacillus_plantarum, Aug 25, 2010.
[33] J Smetankova et al., “Influence of aerobic and anaerobic conditions on the growth and metabolism of selected strains of Lactobacillus plantarum”, Acta Chimica Slovaca, vol 5, No 2, pp 204-210, 2012.
[34] S I Choi et al., “Improvement of gamma-aminobutyric acid (GABA) production using cell entrapment of Lactobacillus brevis GABA 057”, J Microbiol Biotechnol, vol.
[35] R D Cagno et al., “Synthesis of y-aminobutyric acid (GABA) by Lactobacillus plantarum DSM19463: functional grape must beverage and dermatological applications”, Appl Microbiol Biotechnol, vol 86, pp 731-741, 2010.
[36] Y T Tung et al., “Optimization of Culture Condition for ACEI and GABA Production by Lactic Acid Bacteria”, Journal of food science, vol 76, Nr.9, 2011.
HVTT: Nguyén Thi Bich Lién
[37] A Ratanaburee et a/, “Enhancement of y-aminobutyric acid in a fermented red seaweed beverage by starter culture Lactobacillus plantarum DWI2” Electronic Journal of Biotechnology, vol 14(3), pp 1-13, 2011.
[38] W C Liao et al., “Influence of preprocessing methods and fermentation of Adzuki beans on y-aminobutyric acid (GABA) accumulation by lactic acid bacteria’, Elsevier, pp 1108 — 1115, 2013.
[39] M C Kook et ai, “Enhancement of y-Amminobutyric Acid Production by Lactobacillus sakei B2-16 Expressing Glutamate Decarboxylase from Lactobacillus plantarum ATCC 14917”, J Korean Soc Appl Biol Chem, vol 53(6), pp 816-820, 2014.
[40] N Okai et al., “Disruption of pknG enhances production of gamma-aminobutyric acid by Corynebacterium glutamicum expressing glutamate decarboxylase”, Springer, vol 4:20, 2014.
[41] A Eamarjharn et al., “Effect of incubation time, buffer type and concentration on gamma-aminobutyric acid (GABA) production using Khao Dawk Mali 105 rice bran”, Agriculture and Natural Resources, pp 1-5, 2016.
[42] Nguyen Thi Quynh Hoa et al., “Investigation of Enzymatic Optimization by Flavourzyme and Celluclast for Soy Protein Hydrolysate Powder” International journal of advances in pharmacy, biology and chemistry, vol 3(3), pp 550-562, 2014.
[43] TCVN 4320: 1986 Phuong phap chuẩn bi dung dich dém Tong cuc Tiéu chuan Do lường Chat luong tham định, Bộ Khoa học va Cong nghé cong bó.
[44] TCVN 9706:2013 (ISO 711:1985) Ngii cốc và san phẩm ngũ cốc - xác định độ am (phương pháp chuẩn cơ bản) Tông cục Tiêu chuẩn Do lường Chất lượng thâm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bó.
[45] TCVN 8124 : 2009 (ISO 2171: 2007) Ngữ cốc, đậu đỗ và phụ phẩm - xác định hàm lượng tro bằng phương pháp nung Tông cục Tiêu chuẩn Do lường Chất lượng dé nghị, Bộ Khoa hoc và Công nghệ công bó.
[46] TCVN 9936:2013 (ISO 3188:1978) Tỉnh bột và sản phẩm tỉnh bột - xác định hàm lượng nito bằng phương pháp kjeldahl - phương pháp chuẩn độ Tong cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thắm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bó.
[47] AOAC 920.39, 2003 Crude Fat in Feeds AOAC official Method.
[48] Hà duyên tư Phân tích hóa học thực phẩm Khoa học kỹ thuật Hà Nội, 2009, pp.
[49] TCVN 4884 : 2005 USO 4833 : 2003): Vi sinh vat trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - phương pháp định lượng vi sinh vật trên đĩa thạch - kỹ thuật đếm khuẩn lạc Cục vệ sinh an toàn thực phẩm, Bộ Y Tế ban hành.
[50] H Li et ai, “Pre-staining paper chromatography method for quantification of gamma- aminobutyric acid”, Elsevier, Journal of Chromatography A, vol 1216, pp.
[51] R.A Yunes et al., “GABA production and structure of gadB/gadC genes in Lactobacillus and Bifidobacterium strains from human microbiota’, Elsevier, Anaerobe microorganism, Vol 42, pp 1-8, 2016.
[52] A Ratanaburee et al., “Enhancement of y-aminobutyric acid in a fermented red seaweed beverage by starter culture Lactobacillus plantarum DWI2”, Electronic Journal of Biotechnology, vol 7, 2011.
[53] T K Hyun et al., “Identification of glutamate decarboxylases as aminobutyric acid (GABA) biosynthetic enzyme in soy bean”, Elsevier, Industrial Crop sand Products, vol 49, pp 864-870, 2013.
HVTT: Nguyén Thi Bich Lién
[54] S Q Liu et al., “Influence of Reduced Water Activity on Lactose Metabolism by Lactococcus lactis subsp cremoris at Different pH Values”, Appl Environ Microbiol, vol 64(6), pp 2111-2116, Jun 1998.
[55] Kiểu Hữu Anh Giáo trinh vi sinh vật học thực phẩm Giáo dục, 2010, pp 275.
[56] Nguyễn Đức Lượng Công nghệ enzyme Đại học quốc gia TP.HCM, 2004, pp.
[57] Nguyen Thi Quynh Hoa et al., “Investigation of Enzymatic Optimization by Flavourzyme and Celluclast for Soy Protein Hydrolysate Powder”, International journal of advances in pharmacy, biology and chemistry, vol 3(3), pp.2277 — 4688,
[58] E Z Gomaa “Enhancement of y-amminobutyric acid production by co-culturing of two Lactobacilli strains”, Asian Journal of Biotechnology, vol 7 (3), pp 108-118, 2015.
[59] S.Y Yang et al., “Production of gamma-aminobutyric acid by Streptococcus salivarius subsp thermophilus Y2 under submerged fermentation”, US National Library of Medicine National Institutes of Health, vol 34(3), pp 473-8, 2008.
[60] Y Sakura et al., “Production of gamma aminobutyric acid from alcohol distillery lees by Lactobacilus brevis IFO- 12005”, J.Biosci.Bioeng, vol 93(1), pp 95-97, 2002.
Phụ lục A: Các phương pháp phân tích
Phương pháp: Xác định độ âm băng phương pháp sấy tới khối lượng không đổi.
Nguyên tắc: Dùng không khí nóng làm bay hơi nước trong nguyên liệu, từ chênh lệch khối lượng của mẫu trước và sau khi sấy tính được độ âm của nguyên liệu.
Dung cụ: Chén sấy có nắp, đũa thủy tinh, bình hút âm.
Thiết bị: Cân phân tích 4 số lẻ, tủ say điều chỉnh được nhiệt độ.
Bước 1: Chuan bị thiết bị, dụng cụ
Bật tủ sấy, cai đặt nhiệt độ 105°C.
Rửa sạch, say khô và làm nguội chén sấy trong bình hút am.
Cân khối lượng chén say: m, (g).
Tiếp tục say đến khi khối lượng chén không đổi (chênh lệch khối lượng giữa hai lần cân liên tiếp không quá 0.0005 g).
Cân 5 — 10 g mẫu (đã được xay nghiên) chính xác đến 0.0001 g vào chén sấy.
Cân khối lượng chén say có chứa mẫu: m, (g).
Cho chén say chứa mẫu vào tủ sấy ở 105°C trong 2 giờ.
Làm nguội trong bình hút âm trong 30 phút rồi cân.
Tiếp tục sấy đến khi khối lượng mẫu không đổi (chênh lệch khối lượng giữa hai lan cân liên tiếp không lớn hơn 0.0005 g).
HVTT: Nguyễn Thị Bích Liên ¢ _ Thời gian sấy mỗi lần tiếp theo là 30 phút.
‹ - Cân mẫu khi kết thúc quá trình sấy: m; (g).
Tính kết quả: Độ âm X được tinh bang phan trăm theo công thức: im —m,
Trong đó: mạ: khối lượng chén sây (g) mị: khối lượng chén sây và mau trước khi sây (g) mạ: khối lượng chén sây và mẫu sau khi sây (g)
Kết quả cuối cùng là trung bình cộng của 3 kết quả thử song song, tính chính xác đến 0,1% Chênh lệch kết quả giữa 3 lần thử không được lớn hơn 0.3%.
A2 Xác định hàm lượng tro s* Phương pháp: Vô cơ hóa mẫu.
* Nguyên tắc: Tro hóa mẫu băng nhiệt sau đó xác định hàm lượng tro bằng phương pháp khối lượng.
* Dụng cụ, thiết bị: ¢ Dung cụ: Chén nung thạch anh hoặc sứ, bình hút âm. ¢ - Thiết bị: Cân phân tích 4 số lẻ, tủ sấy, lò nung điều chỉnh được nhiệt độ ở 550°C
Bước 1: Chuẩn bị dụng cụ, thiết bịRửa sạch chén nung bằng nước sạch, sấy trong tủ say 105 °C trong 30 phút sau đó nung trong lò nung ở 525 + 25°C trong 30 phút Làm nguội trong bình hút âm trong
30 phút và cân khối lượng chính xác đến 0.0001 g Quá trình nung được lập lại cho đến khi khối lượng chén không đổi (chênh lệch giữa hai lần cân không quá 0,0005 g).
‹ - Cân I0— 20 g mẫu với độ chính xác 0,0001g và cho vào chén nung đã chuẩn bị.
‹ - Cân khối lượng chén nung đã chứa mẫu. ¢ Say trong tủ sấy ở nhiệt độ 105 °C đến khô ( khoảng 2 — 3 giò).
‹ - Đốt can thận trên bếp điện đến than hóa.
- Nung mẫu ở nhiệt độ 525 + 25°C cho đến khi thu được tro màu trăng ngà (khi có mặt sắt sẽ có màu đỏ gạch, khi có mặt đồng và mangan sẽ có màu xanh nhạt). e Lam nguội trong bình hut âm Quá trình nung được lặp lại cho đến khi chén nung chứa mẫu có khối lượng không đổi (chênh lệch giữa hai lần cân không lớn hơn 0,0005 g).
Hàm lượng tro X được tinh băng phan trăm theo công thức:
Trong đó: mo: khối lượng chén nung (g) mi: khối lượng chén nung và mẫu trước khi nung (g) mạ: khối lượng chén nung và mẫu sau khi nung (g)
Kết quả cuối cùng là trung bình cộng của 3 kết quả thử song song, tính chính xác đến 0,01% Chênh lệch kết quả giữa 3 lần thử không được lớn hơn 0,02%.
HVTT: Nguyễn Thị Bích Liên
A3 Xác định hàm lượng protein (nitơ tổng)
* Phương pháp: Xác định Nito tong Kjeldahl s* Nguyên tắc: