1.2.2 Mục tiêu cụ thểSử dụng phương pháp trao đổi ion nhăm tinh sạch GABA dat hiệu suất cao từ canh trường lên men cám gạo sử dụng các vi sinh vật có lợi Lactobacillus brevis.1.3 Nội dun
NGUYEN LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thông tin về nguyên liệu cám gạo:
- Nguồn gốc: Nhà máy xay xát lúa gạo Tư Rô ¢ Dia chỉ: 126/1a đường Phan Văn Hón, ap 1, xã Xuân Thới Thượng, huyện
Hóc Môn, TP.HCM. ¢ Sản lượng: 30 tan/ngay ¢ _ Thông số kĩ thuật của nguyên liệu cám thé hiện qua bảng 3-1 Bang 3-1 Thông số của cám nguyên liệu trong nghiên cứu
Thông số Cám Mức độ nghiền (% khối lượng) 6—7
Ti lệ thu hồi (% khối lượng) 6+0,5
Cám gạo ngay sau khi lay trực tiếp từ nhà máy sẽ được đưa vào quy trình xử lý cám, phục vụ cho nghiên cứu Sau khi xử lý cám sẽ được bảo quản lạnh ở nhiệt độ dưới 0 °C.
Cám gạo được xử lý theo quy trình trong hình 3-1 [13].
Hình 3-1 Quy trình xứ ly cam gao
* Hap Cam gao sau khi thu nhan tu cac nha may xay xat sé duoc hap ở nhiệt độ 95 °C + 5 °C, thời gian 10 phút để vô hoạt các enzyme gây hư hỏng dầu như lipase, lipoxygenase và peroxidase có trong cám, ngăn can sự oxy hóa và làm ồn định nguyên liệu cám sau này. s* Sấy Sau khi hap vô hoạt enzyme, cám chuyển qua sấy ở nhiệt độ là 60 °C đến khi độ âm đạt 5 — 6%, thời gian sây 30 phút/mẻ/500g, nhằm thuận lợi cho quá trình tách béo tiếp theo. s* Tach béo
Tiến hành tách béo bằng phương pháp trích ly trong dung môi hexane, trong thiết bị trích ly có vỏ áo điều nhiệt Tỉ lệ dung môi : cám là 3:1 (w/w), trích ly ở nhiệt độ phòng 30 °C, thời gian trích ly là 48 giờ.
Sau quá trình trích ly, pha rắn được tách riêng Pha lỏng được đưa qua thiết bị chưng cat dé tách dung môi và thu hồi béo của cám gạo. s* Sấy Sau khi trích ly, cám được đem sấy khô để bay hết dung môi Cám tách béo được đựng trong bao nhựa (polypropylene), hàn ghép mí và bảo quản lạnh ở nhiệt độ
4°C để chuẩn bị cho quá trình nghiên cứu.
3.1.2 Vi khuẩn Lb brevis Thí nghiệm này sử dụng vi khuẩn Lactobacillus brevis VTCC — B — 397 được phân lập từ cải chua của Bao tàng giống chuẩn Vi sinh vật (VTCC), Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Ha Nội Gidng được giữ trong môi trường thạch nghiêng MRS bao quan ở 4 — 10 °C Mỗi tháng tiến hành cấy chuyền định kỳ để giữ giống.
3.1.3 Enzyme thủy phân Enzyme được bảo quản trong tủ lạnh nhiệt độ 5 — 10 °C.
Thông tin về enzyme được trình bày tại bảng 3-2.
3.1.4 Nhựa trao đổi ion Nhựa Cation Purolite C100 được sản xuất bởi Purolite Manufacturing Plant,
Dac tính kỹ thuật cua nhựa Cation Purolite C100 [33]:
— Cấu trúc mang là gel polystyrene liên kết ngang với nhóm sulfonic acid (-SO3H), hạt hình cầu vàng đến màu nâu nhóm chức chức năng là nhóm acid sulfonic, ion linh động là Na".
— Khoảng pH hoạt động là từ 0 đến 14, nhiệt độ hoạt động 0 — 120 °C, ty trọng 850 g/l, khả năng trao đối khối lượng > 1,7 mmol/ml, kích thước hạt 0,315 — 0,525 mm.
Trước khi sử dụng lần đầu, nhựa Cation Purolite C100 được xử lý bang cach ngâm trong HCI 1 N sau 6 giờ có khuấy đảo dé tăng sự tiếp xúc của nhựa với HCI.
Sau 6 giờ nhựa tiếp tục rửa lại với nước cất trong 12 giờ Cuối cùng nhựa được chuyển thành dang hydrogen mới sử dung cho việc chạy trao đối ion Nhựa sau khi sử dụng sẽ được hoàn nguyên theo cách xử lý nhựa lần dau [34].
Bang 3-2 Thông tin về enzyme sử dụng trong nghiên cứu Ténenzyme Nhóm enzyme Xuất xứ Nguồn gốc sản Trạng thái Hoạt độ Totp PHotp xuat riêng Termamyl® a-amylase Hang Novo BaccHlus Chat long I20KNU-T/g 90—100°C 60-80
120L Nordick, Licheniformis mau nau Alcalase® 2,4 Endopeptidase Dan Mach Bacillus 24 AU-A/g 55-70 °C 65-85
Flavourzyme® Hỗn hợp của Aspergillus Dang ran, 500 LAPU/g, 50-55°C 5,0-7/0
500 MG endoproteases oryzae mau nau va exopeptidases
3.2 Hóa chất, dụng cụ, thiết bị 3.2.1 Hóa chất v
LN NNN
bang 32 > Xử ly nguyên liệu ¥
Lọc _> Bã lọc Ỷ Điều chỉnh dịch men Ỷ
Hình 3-2 Quy trình nghiên cứu tinh sạch GABA từ nguyên liệu cam gao tach béo sử dụng chung LD brevis
Tiến hành khảo sát quá trình xử lý các nguyên liệu ở các điều kiện khác nhau để đánh giá hiệu quả sinh tổng hợp GABA.
Các mẫu thí nghiệm sau khi được xử lý sẽ được lọc qua vải lọc băng máy lọc chân không để loại bỏ bã tạo thuận lợi cho quá trình lên men sinh tong hop GABA.
> Diéu chinh dich men Cac mau thi nghiém duoc diéu chinh pH = 5,0 trước khi lên men.
Các mẫu thí nghiệm được đem thanh trùng ở nhiệt độ 80 °C, thời gian 30 phút để tiêu diệt vi sinh vật, ngăn ngừa tạp nhiễm, ảnh hưởng đến quá trình sinh tong hop GABA của vi khuân Ld brevis.
Các mẫu sau thanh trùng được làm nguội về nhiệt độ 30 — 32 °C trước khi lên men.
Mẫu được tiến hành lên men với thông số quá trình: s* Lượng giống giống cấy: 10% v/v với mật độ tế bảo trong ống giống 10° cfu/ml. s Nhiệt độ (°C): 30 °C s* Thời gian lên men: 48 gid
> Nuôi cay Mụi trường MRS lỏng được chuẩn bị theo tỉ lệ 55,15 ứ MRS hũa tan với 1000 ml nước cất Sau đó, môi trường MRS được hấp tiệt trùng ở 121 °C, trong 20 phút.
Lb brevis trước khi sử dụng được đem đi nhân giống - Giống trước khi lên men được tiễn hành hoạt hoá dé đảm bao sự 6n định.
- Nhân giống: Dùng que cấy tron lay phần khuẩn lạc vi khuẩn trong ống men giống gốc, cay vào ống nghiệm có chứa sẵn 10 ml môi trường MRS lỏng đã tiệt
Dịch lên men được chạy loc qua mang UF kích thước 1000 Dalton ở áp suất 6 bar trong thời gian 7 giờ, hệ số cô đặc (concentration factor) là 3 thu dòng permeate cho quá trình tiếp theo.
> Trao doi ion Khi nhéi nhựa vảo cột cần giữ cột thang đứng trên giá, khóa vòi bên dưới Nhựa trao đôi được cho vào gần đây cột, sau đó rót day cột băng dung dịch đệm mở khóa cho nhựa lang xuống Khi nhỏi cột hoàn tat cần cân băng cột bằng cách cho dung dich đệm chảy qua và kiểm tra pH của dung dịch chảy ra khỏi cột Dong permeate sau quá trình lọc sẽ được xử lý chỉnh pH rồi lọc dich đó trước khi nạp vào cột trao đôi ion.
Sau khi nạp hết lượng mẫu vào cột để yên khoảng 30 — 40 phút dé mẫu tiếp xúc cân băng với nhựa Sau đó cho dung dịch đệm để rửa các chất không bám vào nhựa và rửa giải băng dung dịch đệm có gradient muối NaCl từ 0,5 — 1,0M.
Hình 3-3 Mô hình trao đổi ion e: chất A ©: chât B ®: chât C
3.3.1.2 Sơ đồ nghiên cứu Nội dung của các thí nghiệm trong nghiên cứu này được trình bay tóm tat trong sơ đồ biểu diễn ở hình 3-3.
( Nội dung 1: Khảo sát đặc ) trưng của quá trình đăng nhiệt hap phụ ion
(Noi dung 2: Khảo sát các yếu ó ảnh hưởng quá trình trao đổi ion nhăm thu nồng độ GABA cao trong dung dịch
( Thị nghiệm 2: Xây dựng phương trình `
Thí nghiệm 1: Xác định thời gian cân băng của nhựa trao đôi ion đăng nhiệt hấp phụ của nhựa trao đổi ion
Thí nghiệm 3: Khảo sát sự ảnh hưởng của dung dịch rửa giải đến quá trình giải hap phụ
Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng tốc độ dòng chảy đến quá trình trao đối ion
Thí nghiệm 5: Khao sát ảnh hưởng nồng độ muối NaCl trong dung dịch đệm rửa giải đến quá trình giải hấp phụ
Hình 3-4 Sơ đồ nội dung thí nghiệm nghiên cứu
3.3.2 Nội dung 1: Khảo sát đặc trưng quá trình đăng nhiệt hấp phụ của nhựa trao doi ion
3.3.2.1 Thí nghiệm 1: Xác định thời gian cân bằng của nhựa trao đổi ion s* Mục đích
Xác định thời gian thiết lập cân bang dựa vào sự thay đối nồng độ GABA trong nhựa theo thời gian. s* Phương pháp thực hiện
Cho 0,2 g GABA; 0,2 g acid glutamic; 0,1 g glucose; 0,05 g NaCl và 100 ml nước cất vào cốc dung tích 200 ml Sau đó cho tiếp 5 g nhựa, lắc liên tục trên máy khuấy từ với 100 lần/ phút, ở nhiệt độ phòng Sau những khoảng thời gian xác định:
30 phút, 60 phút, 90 phút, 120 phút, 150 phút, 180 phút thì lẫy mẫu để phân tích nồng độ GABA còn lại trong dung dịch.
Căn cứ vào số liệu thực nghiệm, xác định thời gian trao đôi ion đạt tới trạng thái cân bằng là thời điểm nồng độ GABA trong dung dịch không thay đồi theo thời gian.
Mỗi mẫu khảo sát lặp lại ba lần, kết quả lấy giá trị trung bình.
* Thông số khảo sat - Nông độ GABA trong dung dich sau khi nhựa hấp phụ — phụ lục 1.6.
- Nông độ GABA trong nhựa trao đổi ion.
3.3.2.2 Thí nghiệm 2: Xây dựng phương trình đăng nhiệt hấp phụ của nhựa trao đổi ion s* Mục dich
Xác định đường đăng nhiệt của nhựa trong quá trình trao đôi ion nhằm đánh giá khả năng hấp phụ ion của nhựa ở trạng thái cân bằng. s* Phương pháp thực hiện
Thí nghiệm tiễn hành với các mẫu dung dịch cùng thể tích 100 ml có 0,2 g acid glutamic; 0,1 g glucose; 0,05 g NaCl và chỉ thay đôi khối lượng cua GABA lan luot là: 0,2 g; 0.4 g; 0,6 g; 0,8 g Cỏc mẫu cú cựng khối lượng nhựa trao đối là 5 ỉ, tần số khuấy là 100 lần/ phút Các thí nghiệm được thực hiện ở nhiệt độ phòng trong thời gian can băng đã được xác định ở thí nghiệm 1 Các mẫu sẽ được phân tích nông độGABA còn lại trong dụng dịch sau thời gian cân băng.
Mỗi mẫu khảo sát lặp lại ba lần, kết quả lấy giá trị trung bình.
* Thông số đánh giá - Nông độ GABA trong dung dịch sau khi nhựa hấp phụ — phụ lục 1.6.
- Nông độ GABA trong nhựa trao đổi ion.
3.3.3 Nội dung 2: Khảo sát các yếu to ảnh hưởng quá trình trao đổi ion nhằm thu được nông độ GABA cao trong dung dịch
3.3.3.1 Thí nghiệm 3: Khảo sát sự ảnh hưởng của dung dich rửa giải đến giải hấp phụ. s* Mục đích
Xác định loại dung dịch đệm nào rửa và rửa giải tốt nhất dé thu nông độ GABA cao nhất. s* Phương pháp thực hiện
Dung dịch cám gạo lên men sau khi qua lọc mang UF thành phan còn lại là amino acid, glucose, mudi khoang Dua vao tinh chất tích điện tích của amino acid, néu pH < pl thi amino acid tích điện dương và ngược lại pH > pI thi amino acid tích điện âm Cho nên pH của dung dịch đệm rửa và rửa giải được chọn sẽ năm giữa pl của các amino acid, điển hình ở đây là giá tri pI của GABA va các amino acid còn lại Dựa vào bảng giá trị điểm đăng điện cho thay các amino acid có pl trong khoảng
5 — 6 va pI cua GABA là 7,3 Vi vậy pH của dung dịch rửa giải được chọn khảo sát la pH = 5; pH = 5,5; pH = 6; pH = 6,5; pH = 7.
Chon các dung dịch rửa giải với pH khác nhau dựa vào bang 2-7 như sau: dung dịch đệm acetate (pH = 5, pH = 5,5), dung dịch đệm citrate (pH = 6, pH = 6,5) va dung dịch đệm phosphate (pH = 7) Sau đó chỉnh pH dịch cám lên men qua lọc màng
UF lần lượt với từng dung dịch đệm ở các pH khảo sát của thí nghiệm là pH (5; 5.5:
6; 6,5; 7) Đông thời rửa cột trước khi nap mẫu bằng các dung dịch đệm khảo sát (khoảng 100 ml/lan rửa) Sau khi chỉnh pH dịch xong tiến hành lọc dịch rồi đưa dịch mẫu nạp với cột trao đôi ion với tốc độ dòng 0,012 mm/s cho đến khi hết dịch mẫu.
KẾT QUÁ VÀ BÀN LUẬN 4.1 Thành phan dịch lên men qua lọc UF
Nông độ các thành phan dịch lên men qua loc UF kích thước mao quản 1000 Dalton ở áp suất 6 bar trong thời gian 7 gid, hệ số cô đặc là 3 thể hiện ở bang 4-1
Bang 4-1 Nông độ các thành phan dịch lên men qua lọc UF
Chỉ tiêu Đơn vị Giá trị
Duong khu mg/ml 5,26 + 0,12 GABA mgil 6000 + 148
Qua bảng 4-1 cho thay dich sau loc ngoai GABA van con nhiéu thanh phan khac như protein (chiếm 16% chat khô), acid amin (chiếm 31,3% chất khô), đường tổng (chiếm 30,36% chất khô) và đường khử (chiếm 9.8% chất khô) Lượng GABA chỉ chiếm khoảng 11,2% tức là độ tinh sạch chỉ 11,2% Chính vì thế dé tăng độ tinh sạch, dịch lọc sẽ được tiễn hành chạy trao đối ion với nhựa ion nhăm loại các thành phan khac ra khoi dung dich.
4.2 Xây dựng phương trình dang nhiệt hap phụ cúa nhựa ion
4.2.1 Xác định thời gian cân bằng của nhựa ion Kết quả xác định thời gian cân bang của nhựa ion được trình bày ở bảng 4-2 và hình 4-1.
Bang 4-2 Số liệu ảnh hưởng thời gian đến quá trình trao doi ion của nhựa
Thời gian (phút) 30 60 90 120 150 180 Nông độ GABA trong dung dịch 1750412 1625490 1500410 1400440 1400400 1400+0,0
(mg/l) Nong d6 GABA trong nhựa ion 50403 75+02 100402 12,0+40,10 120400 120+00
Hình 4-1 Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình trao doi ion Từ kết quả thực nghiệm cho thấy thời gian dé hệ thiết lập cân bang trong khoảng 120 phút Tuy nhiên ở thời gian 30 phút đầu nhựa đã hấp phụ hơn 40% so với thời điểm hệ đạt cân băng Đến thời điểm 90 phút nhựa hấp phụ gan như là tuyệt đối (khoảng 83% so với lúc cân bằng) Nếu tiếp tục tăng thời gian sau 120 phút thì nồng độ GABA trong nhựa không đồi Vậy thời gian cân băng của nhựa ion với dung dich chứa GABA là 120 phút Thời gian này sẽ sử dụng để tiến hành xây dựng phương trình đăng nhiệt hấp phụ ở thí nghiệm tiếp theo.
4.2.2 Phương trình đẳng nhiệt hấp phụ của nhựa trao doi ion Kết quả kha năng hấp phụ của nhựa trao đôi ion được trình bảy ở bảng 4-3 và hình 4-2.
Bang 4-3 Số liệu ảnh hưởng nồng độ ban đầu đến quá trình trao đối ion
Nông độ GABA ban dau ¡ong 2000 4000 6000 8000 trong dung dich (mg/l) Nông độ GABA trong dung dịch tại thời gian cân bằng 670+5,6 1400444 3000+38 4650+33 6300+76 (mg/l)
Nong do GABA trong nhya 6 6491 120+01 20.0408 270407 3404155 trao đôi ion (mg/g)
Nong độ GABA trong nhựa trao đỗi ion tai thời đi `—— Or
Nong độ GABA trong dung dich (mg/l)
Hình 4-2 Đường dang nhiệt trao đối ion của nhựa Qua số liệu thực nghiệm trên đã dựng được đường đăng nhiệt trao đối của nhựa và GABA Từ hình 4-2 cho thấy, đường đăng nhiệt được đặc trưng bởi sự tăng nhanh lượng GABA bị hấp phụ ở vùng nông độ khảo sát Dé tìm quy luật trao đổi ion giữa nhựa và GABA tiến hành xét các phương trình đăng nhiệt sau:
Từ phương trình 2.1 ở mục 2.3.1.1 sẽ đưa phương trình Langmuir về dạng tuyến tính, phương trình trở thành:
XxX oR Xx Ke ^ ow ` lôi re rn ° Biêu diễn môi quan hệ giữa C va x dưới dạng đồ thi:
C (mg/l) 670 1400 3000 4650 6300 ô 101,52 116,67 150,00 172,22 185 29 Đồ thị của phương trình đăng nhiệt Langmuir theo lý thuyết là một đường thăng Hình 4-3 thể hiện quan hệ giữa C và = từ các kết quả thực nghiệm không phải là đường thang Vi vậy sự trao đổi ion của nhựa và GABA không tuân theo phương trình Langmurr.
Hình 4-3 Quan hệ giữa C va C/X
Kiểm chứng độ tin cậy của phương trình giữa C va = với phương trình y =
0,0238x + 57,479 băng phương pháp phân tích phương sai, được thé hiện ở bảng bên dưới 4-4.
Bang 4-4 Phân tích phương sai của phương trình hồi quy tuyến tính
Các giá trị df SS MS F F tra bang phan tich
Giá tri F = 11,85 < F).4.099 = 21,20 cho thay giá trị hồi quy mức độ tin cậy 99% rất không có ý nghĩa thong kê.
Xét phương trình Freundlich 2.2 ở mục 2.3.1.1, logarit hai về của phương trình
2.2 được phương trình sau: logX = logk + nlogC
Biéu diễn mối quan hệ giữa logC và logX dưới dạng đồ thị : logC 2,83 3,15 3,48 3,67 3,80 logX 0,82 1,08 1,30 1,43 1,53
Hinh 4-4 Quan hé giira logC va logX
Từ hình 4-4 có thé nhận thay đồ thi biểu diễn mối quan hệ giữa logC và logX là
4-5. một đường thăng với phương trình y = 0,721x — 1,2068 (*) Kiểm chứng độ tin cậy của phương trình (*) băng phương pháp phân tích phương sai, được thé hiện ở bảng
Bang 4-5 Phân tích phương sai của phương trình hồi quy tuyến tính
Các giá trị df SS MS F F tra bang phan tich
Giá trị F = 1911,65 > F,3.0.99 = 34,12 cho thấy giá trị héi quy mức độ tin cậy99% rat có ý nghĩa thông kê.
Từ phương trình (*) có thé suy ra được giá trị hằng số k, n là: n= 0,721, k 0,062 Từ các hăng số k, n suy ra phương trình đăng nhiệt Freundlich có dạng
Từ phương trình đăng nhiệt Freundlich X =0,062xC°TM sẽ tinh được lượng nhựa trao đối ion dé nhdi vào cột ion trong các thí nghiệm tiếp theo Với nồng độ GABA trong dịch lên men C = 6000 mg/I thì nong độ GABA bi nhựa trao đôi ion hấp phụ X = 32,8 mg/g Vậy lượng nhựa trao đôi ion cần sử dụng để hấp phụ 32,8 mg/g
4.3 Anh hưởng dung dich rửa giải đến qua trình giai hap phụ
Kết quả khảo sát ảnh hưởng dung dịch rửa giải đến quá trình trao đôi ion được thể hiện ở các hình 4-5, 4-6, 4-7, 4-8.
Từ đồ thị 4-5 cho thay ở các dung dịch rửa giải khác nhau thì từ 0 phút đến 40 phút nông độ GABA tức thời thu được tăng dan và giảm dan từ 40 phút đến 100 phút.
Bên cạnh đó, ở thời gian 40 phút nông độ GABA đạt giá trị cực đại lần lượt ở các pH là 874 mg/l (pH = 5); 913 mg/l (pH = 5,5); 984 mg/I (pH = 6); 1022 mg/l (pH = 6,5);
597 mg/l (pH =7) Qua hình 4-6 cho thay trong thời gian giải hap phụ nồng độ GABA tích lũy ở dung dịch rửa giải có pH = 6,5 là cao nhất 4751 mg/l.
Mặt khác, hình 4-6 còn cho thay duoc nong độ GABA tích lũy ở các dung dich rửa giải đều tăng dan theo thời gian Tuy nhiên, nồng độ GABA tăng không đều ở mỗi khoảng thời gian rửa giải Ở 50 phút đầu nồng độ GABA tích lũy tăng vọt đều đạt trờn 2000 mứ/1, nồng độ GABA đạt cao nhất 3181 mg/l (pH = 6,5) Cũn ở 50 phỳt tiếp theo nông độ GABA tăng cham lại, chi tăng dưới 2000 mg/l Cụ thể là trong 50 phút sau nồng độ GABA chỉ tăng 1198 mg/l (pH = 5.0), 1256 mg/l (pH = 5,5), 1502 mg/l (pH = 6,0), 1397 mg/l (pH = 6,5), 1167 mg/l (pH = 7.0) Bên cạnh đó có thé dự đoán qua đồ thị 4-6 nếu tiếp tục thời gian rửa giải sau 100 phút thi nồng độ GABA tích lũy sẽ tăng chậm lại và đạt can băng.
Nong độ GABA tức thời trong dòng ra (mg/]) 200 DNjo)jo)
Hình 4-5 Nong độ GABA tức thời thu được ở các pH dung dịch rửa giải s* Chi thích:
—m—:pH] = 5,0; ~*®—: pH= 5,5; —&—: pH = 6,0; ——: pH = 6,5; —®: pH = 7,0
Nong độ GABA tích lũy trong dòng ra 1000 500
Hình 4-6 Nồng độ GABA tích lũy theo các thời điểm thu được ở các pH dung dịch rửa giải s* Chu thích:
—=—:pH = 5,0; -*-: pH= 5,5; —&—: pH = 6,0; —: pH = 6,5; —®: pH = 7,0
Mặc dù ở pH = 6,5 nồng độ GABA có giá trị cao nhất nhưng cũng không thé kết luận dung dịch đệm nay rửa giải tốt nhất Vì thé dé làm rõ hơn cần phải xét hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch GABA trong dung dịch sau rửa giải (thé hiện hình 4-7 và hình 4-8) Qua biểu đồ 4-7 và 4-8 cho thay từ pH = 5 đến pH = 7, hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch đều tăng dan theo thời gian Tuy nhiên, hai đại lượng này tăng không đều ở mỗi khoảng thời gian rửa giải Ở 50 phút đầu hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch đều tăng vọt trên 30%, đạt cao nhất ở pH = 6,5 lần lượt là 55,9% (hiệu suất thu hồi) và 44,71% (độ tính sạch) Còn ở 50 phút tiếp theo hiệu suất và độ tinh sạch tăng chậm lại, chỉ tăng dưới 25% Cụ thể là trong 50 phút sau hiệu suất và độ tinh sạch tăng lần lượt: 19,97% và 17,12% (pH = 5,0); 20,94% và 17,95% (pH = 5,5); 25% và 20% (pH
= 6,0); 23,28% và 18,63% (pH = 6,5); 19,45% và 17,16% (pH = 7,0) Bên cạnh đó có thé dự đoán qua đồ thị 4-7, 4-8 nếu tiếp tục thời gian rửa giải sau 100 phút thì hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch tích lũy sẽ tăng chậm lại và đạt cân bang.
80 nN wxOo oo t thu hồi (%) nN œ éu sua +- QW jo)
Hình 4-7 Hiệu suất thu hồi GABA theo các thời điểm thu được ở các pH dung dịch rửa giải s* Chi thích:
—m—:pH = 5,0; “®—: pH= 5,5; —&—: pH = 6,0; ——: pH = 6,5; —®: pH = 7,0
Hình 4-8 Độ tỉnh sạch GABA theo các thời điểm thu được ở các pH dung dịch rửa giải s* Chu thích:
——,pH]ẽ = 5,0; ~*—: pH= 5,5; —&—: pH = 6,0; ——: pH = 6,5; —đ: pH = 7,0
Mặt khác qua hình 4-7 và 4-8 còn cho thay từ pH = 5 đến pH = 6.5 thì hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch tăng nhưng khi tăng pH lên 7 thì hai đại lượng này giảm Điều này được lý giải như sau: khi dịch mẫu chỉnh về pH = 5 hau hết các giá tri pI của amino acid đều lớn hơn pH của dịch trừ aspartic acid, glutamic acid Chính vì thế các amino acid cũng tích điện dương giống như GABA chúng sẽ tranh nhau gắn vào nhựa ion nên tỉ lệ nhựa ion gắn với GABA sẽ không cao, do đó mà phần trăm hiệu suất thu hồi và cả độ tinh sạch đều thấp nhất Tiếp tục tăng pH lên 5,5; 6 và 6,5 thì số lượng amino acid tích điện dương giảm dan nên khả năng GABA gan với nhựa ion sẽ tăng cao vì vậy mà hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch cũng tang va đạt giá tri cao nhất ở pH
= 6,5 Tuy nhiên khi tăng pH lên 7 thì hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch giảm mạnh là do giá trị pH = 7 gần với giá trị điểm đăng điện pI của GABA nên khả năng tích điện của nó giảm Chính vì thế trong quá trình rửa một lượng lớn GABA bị rửa ra khỏi cột ion.
Trong hai nghiên cứu gần đây của tac gia Hui Zhang et al (2007) và HengwenChen et al (2016), hai tác giả cũng khảo sát ảnh hưởng pH đến quá trình trao đối ion của GABA với khoảng pH khảo sát là từ 5 — 7 Tuy nhiên kết quả nghiên cứu của Hui
Zhang et al (2007) thi nong độ GABA đạt cực dai pH là 5,6 và sau đó giảm dần tới giá trị pH = 7 [35], nhưng theo Hengwen Chen et al (2016) thì nồng độ GABA tăng dan trong khoảng pH đó [36] Những kết quả trên cũng phù hop với kết quả nghiên cứu của dé tài này, tức là trong khoảng pH từ 5 — 6 nồng độ GABA sẽ tăng nhưng sau đó sẽ giảm đến pH = 7 Ngoài ra một nghiên cứu khác của Rodica Radian and Baruch I Kanner cũng chọn điều kiện pH tối ưu là 6,6 để tiễn hành thí nghiệm tinh sạch GABA [37], tác giả chon pH = 6,6 làm điều kiện thí nghiệm cũng gần giống với kết quả thu được từ thí nghiệm 4.3 là pH = 6,5 Tóm lại khi so sánh kết quả của thí nghiệm 4.3 với các đề tài nghiên cứu trước đó thì pH tối ưu của mỗi đề tài khác nhau có thé là do phương pháp thí nghiệm khác nhau, loại nhựa trao đối ion khác nhau.
Vậy dung dịch đệm rửa giải tốt nhất là dung dịch có pH ở 6,5, do đó dé khảo sát tốc độ dòng ở thí nghiệm tiếp theo sẽ chọn dung dịch đệm ở pH này.
KET LUẬN VA KIEN NGHỊ 5.1 Kết luận
Sau quá trình nghiên cứu và thực hiện, đề tài đã đạt được những kết quả sau: e Quá trình trao đôi ion của nhựa cation và GABA trong dung dịch khảo sát đạt cân bằng ở thời gian 120 phút Bên cạnh đó quá trình này tuân theo phương trình dang nhiệt hấp phụ Freundlich X =0,062 xC°”' Với nồng độ GABA trong dịch lên men C = 6000 mg/I thì nồng độ GABA bị nhựa trao đối ion hap phụ X = 32,8 mg/g.
Vậy lượng nhựa trao đồi ion cần sử dụng để hấp phụ 32,8 mg/g GABA trong dịch là
183 g. e Các yếu tô như dung dịch rửa giải, tốc độ dòng và nồng độ muối rửa giải ảnh hưởng rất nhiều đến quá trình tinh sạch GABA trong dung dịch Nong độ GABA thu được sau khi trao đối ion với cột sử dụng dung dịch rửa giải pH = 6,5, tốc độ dòng 0.012 mm/s và nông độ NaC1 0.8 M trong 100 phút thu được 5610 mg/l Hiệu suất thu hồi đạt 93,57%; độ tỉnh sạch đạt 73,87% và phương trình nồng độ GABA tức thời theo thời gian là C(t) = 885,45 x exp(—0,0009 x ứ - 40)”).
5.2 Kién nghi Dựa trên kết quả thu được một số nội dung nghiên cứu tiếp theo cần thực hiện: e Khảo sát thêm thời gian rửa giải dé tăng hiệu suất thu hồi va độ tinh sạch. e Nghiên cứu phương pháp tinh chế GABA trong dich sau tinh sạch thành tinh thể. e Nghiên cứu và phát triển quy trình tinh sạch dé ứng dụng vào quy mô công nghiệp.
