Luận văn thạc sĩ Công nghệ thực phẩm: Ứng dụng kỹ thuật màng để phân riêng Gamma Aminobutyric acid (Gaba) từ canh trường lên men cám gạo

Khảo sát ảnh hưởng quá trình tiền xử lý canh trường lên men cám gạo trong quá trình phân riêng GABA sử dụng màng siêu lọc.. TOM TAT LUAN VANKỹ thuật phân riêng băng màng siêu lọc được ứn

MO DAU 1.1 Dat van dé

Gamma aminobutyric acid (GABA) là một axit amin, là chất dẫn truyền xung thần kinh trong hệ thống thần kinh trung ương, đóng vai trò như hoạt chất sinh học điều hòa hoạt động sống của tế bào than kinh, đồng thời góp phan hỗ trợ cải thiện sức khỏe cho con người GABA trong quá trình sinh hoạt, lao động trong điều kiện môi trường tốt, sẽ dần bị cạn kiệt Nếu hàm lượng GABA bị thiếu hụt sẽ dẫn đến sự lo lang, khó chịu, mat ngủ[1] Vì vậy, GABA là thành phan quan trọng cần bồ sung cho cơ thể.

Hiện nay, nhiều hướng nghiên cứu tong hợp GABA từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau cũng như là từ nhiều điều kiện tổng hop GABA từ chuyển hóa hóa học cũng như là chuyển hóa sinh học Trong đó, con đường chuyển hóa GABA từ glutamate băng vi khuẩn đang được quan tâm chú trọng Với nguồn nguyên liệu cám gạo đã được thủy phân bằng tổ hợp enzyme protease đạt hiệu quả thủy phân protein cao đồng thời tăng hàm lượng axit glutamic [2] cũng là nguồn co chất chính cho vi khuẩn Lactobacillus brevis sinh tong hợp GABA Tại Việt Nam, theo nghiên cứu của Trịnh Tat Cường và cộng sự, ứng dụng dịch cám gạo làm nguồn cơ chất cho chủng

Lactobacillus cũng đạt được hiệu qua cao Kook và cộng sự (2010) cũng đã chứng minh chung Lactobacillus lên men dịch cám gạo sinh tổng hop GABA đạt hiệu qua cao với nông độ GABA là 660mM.

Mặt khác, việc thu nhận GABA từ canh trường lên men gặp khó khăn vì trong canh trường lên men chứa nhiều thành phan phức tạp như sinh khối của vi khuẩn, các tap chất khác trong quá trình sinh tong hop của vi khuẩn Việc sử dung màng siêu lọc

PES 45 kDa trong quá trình phân riêng GABA từ canh trường lên men cũng được nghiên cứu với hiệu suất thu h6i GABA đạt được 88,6% và độ tinh sạch là 6,2%[3].

Ngoài ra, kết hợp kỹ thuật siêu lọc với kỹ thuật diafiltration cũng đem lại hiệu quả cao trong việc thu nhận và tinh sạch GABA từ canh trường lên men [4] Điều này chứng tỏ ứng dụng kỹ thuật phân riêng bằng màng trong việc thu nhận và tinh sạch GABA từ canh trường lên men là khả thi. Ở Việt Nam, tính đến nay, năm 2016, chưa có nghiên cứu công bố về ứng dụng kỹ thuật phân riêng bang màng trong quá trình thu nhận và tinh sạch GABA từ canh trường lên men.

Chính vì vậy, dé tài “ Ung dụng kỹ thuật màng dé phân riêng GABA từ canh trường lên men cám gạo” được tiên hành nghiên cứu.

Góp phan nâng cao hiệu quả trong ngành sản xuất lúa gạo thông qua việc khai thác một cách có hiệu quả nguồn phế liệu cám dé tạo ra sản phẩm có giá trị gia tăng cao, đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng. Ứng dụng thành tựu công nghệ màng, nâng cao giá trị canh trường cám gạo giàu hoạt chất sinh học đồng thời góp phân tạo điều kiện thuận lợi cho công đoạn nâng cao độ tinh sạch băng kỹ thuật sắc ký.

Khảo sát khả năng ứng dụng kỹ thuật lọc màng để tinh sạch GABA từ canh trường cám gạo lên men bang vi khuẩn LD brevis.

Khảo sát các yếu tô ảnh hưởng đến quá trình phân riêng GABA từ canh trường cám gạo sử dụng màng siêu lọc để tăng hiệu quả quá trình phân riêng, nhằm làm giàu GABA trong canh trường lên men cám gạo sử dụng vi khuẩn Lb.brevis.

1 Xác định thành phần hóa học của canh trường lên men cám gạo 2 Khảo sát ảnh hưởng của quá trình tiền xử lý canh trường cám gạo đến quá trình phân riêng GABA sử dụng màng siêu lọc.

3 Khảo sát ảnh hưởng của áp suất vận hành thiết bị đến quá trình phân riêng

GABA từ canh trường lên men cám gạo sử dụng màng siêu lọc.

4 Xây dựng mô hình toán học cho quá trình phân riêng GABA từ canh trường lên men cám gạo.

5 Khảo sát ảnh hưởng của giải pháp bố sung nước đến quá trình phân riêng

GABA từ canh trường lên men cám gạo sử dụng màng siêu lọc.

Với kết quả thực nghiệm thu được, dé tài có thé ứng dụng trong quá trình thu nhận và tinh sạch các hợp chât sinh học từ canh trường lên men cám gạo.

TONG QUAN 2.1 Tổng quan về GABA

Gamma aminobutyrie acid (GABA) được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1883 trong thực vật và trong sản phẩm chuyên hoá của vi sinh vật Đến năm 1950, GABA được phát hiện ra là thành phan thiết yếu trong hệ thống than kinh ở động vật có vú.

Gamma aminobutyric acid (GABA) là acid amin phi protein gồm có 4 cacbon (hình 2.1), là một thành phan quan trọng trong nhóm acid amin tự do.

Hình 2.1 Công thức cau tao của Gamma Aminobutyric Acid trong môi trường nước|5]

GABA tổn tại ở ba dạng: rắn, lỏng và khi[6] GABA là ion lưỡng tính tại giá tri pK 4.03 và 10,56, chứa nhóm cacboxyl cho proton và nhóm amino nhận proton, ngoài ra nhóm amino của nó gắn tại vị trí cacbon y và ở dưới dạng không liên kết[7] Ở trạng thái khí, GABA cuộn lại nhiều lần để tạo ra lực hút tĩnh điện giữa hai nhóm amin và cacboxyl Theo tính toán hóa học để phá vỡ cau trúc này cần một năng lượng khoảng50 kcal/mol Ở trạng thái rắn, GABA luôn có dạng mạch thăng Dưới dạng mạch thăng, GABA luôn có cau trúc hình học dạng trans ở nhóm amin cuối và dang cis ở nhóm cacboxyl kết thúc Cau trúc này sẽ giúp cho phân tử GABA liên kết dễ dàng với các phân tử khác Ở trạng thái lỏng, GABA tôn tại ở nhiều dạng cấu trúc khác nhau bao gồm dạng gấp khúc, dạng mạch thăng Chính nhờ kha năng ton tại ở nhiều dạng cau trúc khác nhau này tạo cho GABA có nhiều chức năng sinh học quan trong[8].

2.1.2 Chức năng sinh lý của GABA

GABA đóng vai trò như hoạt chất sinh học điều hòa hoạt động sống của tế bào thần kinh, đồng thời góp phân hỗ trợ cải thiện sức khỏe cho con người.

GABA thúc day sự trao đối chất của các tế bào não bằng cách tăng cung cấp oxy và kích thích máu lên não và ức chế sự bài tiết của vasopressin (hormon chống bài niệu) băng cách tác động vào các hành não tủy Sự thay đổi nông độ GABAergic liên quan đến các bệnh về thần kinh như: bệnh Huntington, bệnh Parkinson, bệnh mất trí nhớ do tudi già, co giật, bệnh Alzheimer, hội chứng chứng tâm than phân liệt [9] Theo Okada và cộng sự (2000) đã chứng minh sử dung 26,.4mg GABA gạo mam mỗi ngày đem lại hiệu quả cao trong quá trình điều trị các rối loan thần kinh, mat ngủ, tram cảm và các rồi loạn tự phát trong suốt thời kỳ mãn kinh GABA sử dụng thường xuyên có khả năng giảm đau và lo lắng và giảm ham lượng lipit trong máu [10] [11] GABA còn có khả năng ngăn ngừa bệnh thận mãn tính, giúp ngăn ngừa bệnh tiểu đường thông qua việc điều tiết insulin [12].

GABA còn góp phần làm tăng nồng độ của hormone tăng trưởng trong huyết tương và tỷ lệ tong hợp protein trong não[ 13]

GABA còn có thể ức chế sự tăng sinh tế bào ung thư hoặc ngăn chặn quá trình di căn của các tế bào ung thư gan, đại tràng | I4]

GABA tham gia duy trì điều hòa cân băng nội môi dưới tác động của tia cực tím.

GABA có tác dụng giảm viêm trong viêm khớp dạng thấp, giảm sự thiếu máu cục bộ [5], cải thiện chức năng thị giác đồng thời tăng cường trí nhớ và ngăn ngừa béo phì.

Ngoài ra, GABA còn có tác dụng hạ huyết áp bằng cách mở rộng các mạch máu; theo nhiều nghiên cứu việc sử dụng thực phẩm chứa GABA có kha năng hạ huyết áp ở chuột và người một cách tự nhiên, đồng thời, nếu tiêm trực tiếp GABA (50-200 jg) sẽ làm giảm áp lực của động mạch và nhịp tim ở chuột Wistar.[5]

Chính vì những lợi ích trên, GABA được xem là một thành phân hoạt tính sinh học có trong thực phẩm va dược phẩm | 15]

2.1.3 Cơ chế sinh tổng hợp GABA

Quá trình chuyển hóa sinh học từ glutamate thành GABA sử dụng các chủng probiotics được chú trọng quan tâm do điều kiện phản ứng nhẹ, hiệu quả tong hợp cao, an toàn và giá thành thấp [16] Ở vi khuẩn, GABA tham gia vào quá trình trao đôi chất trong chu trình Kreb, trong đó, phản ứng chủ yếu dé tổng hợp GABA được thực hiện dưới phản ứng xúc tac của enzyme glutamate decarboxylase (GAD, EC 4.1.1.15) Day là phản ứng khử a-carboxyl trực tiếp của L-glutamte:

Glutamate + H” > GABA + CO; (1.1) GAD là một enzyme trong dịch tế bao chịu ảnh hưởng bởi L-glutamate, pyridoxal 5’-phosphate (vitamin B6) Gan đây, một số chủng LAB đã được nghiên cứu khả năng tong hợp GABA cao thông qua sự hiện diện của enzyme GAD, đây là yếu tô quan trọng quyết định trong quá trình sinh tổng hợp GABA Nhìn chung, GABA được chuyển hóa bởi nhóm vi khuẩn axit lactic dưới điều kiện môi trường axit và quá trình khử cacboxyl của enzyme GAD cùng với quá trình sinh tổng hợp trong chủng

2.1.4 Quá trình sản xuất GABA từ nhóm vi khuẩn acid lactic Đã có nhiều tài liệu nghiên cứu sản xuất GABA từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau và cũng như từ nhiều nhóm vi khuẩn, nam mốc khác nhau[17][18][19][20] Tuy nhiên, nguồn GABA trong thực phẩm được sản xuất từ nhóm vi khuẩn axit lactic LAB được công nhận an toàn cho người sử dụng [1], ngoài ra, LAB cũng có thể sinh tong hop cac chất hữu cơ tao hương thơm và các thuộc tính cảm quan đặc biệt cho các sản phẩm thực phẩm Bên cạnh đó, sự hiện diện của vi khuẩn có lợi này trong thực phẩm góp phan ức chế sự tăng trưởng của vi sinh vật gây bệnh, duy trì chất lượng dinh dưỡng và nâng cao tuổi thọ của các loại thực phẩm Nhóm vi khuẩn LAB được phân lập từ kim chi và hạt đậu xanh lên men (tên thương mai: Phyto-GABA) là nguồn san xuất GABA an toan va được ứng dụng trong công nghiệp sản xuất GABA tại các công ty thực phẩm, dược phẩm ở Nhat bản và được xuất khẩu dưới dạng nguyên liệu thô sang thị trường Trung Quốc [21].

Trong quy trình sản xuất GABA, môi trường MRS là môi trường tối ưu cho sự sinh trưởng của nhóm vi khuẩn LAB [22] Dé tang hàm lượng GABA cần tiến hành nghiên cứu thành phần môi trường phù hợp nham tăng khả năng sinh tong hợp GABA của vi khuan LAB[23], ngoài ra, tối ưu thành phan môi trường san xuất GABA nhằm giảm giá thành sản xuất GABA, có thé ứng dụng trong quy mô công nghiép[23] [24].

Nhìn chung, tối ưu thành phần môi trường sản xuất GABA tùy thuộc vào nhóm vi khuẩn LAB sinh tong hợp GABA Lb.brevis được phân lập từ kim chi [23], là trực khuẩn Gram ( ), không có khả năng di động, là một trong những vi khuẩn pho biến nhất ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp sản xuất GABA [1]

Qua bang 2.1 đã cho thay chủng vi khuẩn Lb.brevis có khả năng sinh tong hop GABA dat hiệu quả cao, ngoài ra khối lượng phân tử GAD của vi khuẩn Lb.brevis (bảng 2.2) thể hiện hoạt tính của enzyme GAD chuyển hóa axit glutamate thành GABA cao hơn so với các loại vi khuẩn khác.

Trong nhiễu sản phẩm lên men giàu GABA sử dụng vi khuẩn Lb brevis sinh tong hợp GABA từ các nguồn nguyên liệu khác nhau: nước ép việt quất, rượu shochu, phô mai, sữa tươi, đậu nành, cám gạo đạt được năng suât cao (Bang 2.1)

Bảng 2.1 Sản xuất GABA bởi các chủng vi khuân Lb.brevis được phân lập từ nhiều nguồn khác nhau [1][16]

Chúng Nguồn Môi trường nuôi cấy Năng suất tạo ph n lập GABALb brevis NCL912 Paocai MT giàu dinh dưỡng 35,62 g/LLb brevis BJ20 Kim chi Nước thai & bột gạo 2,465 g/LLb brevis Paocai MT MRSS 31,10 g/LLb brevis [FO — 12005 NP Kome shochu kusu 1,04 g/LLb brevis NCL912 Paocai MT giàu dinh dưỡng 103,719 g/LLb brevis GABA 057 NP MT GYP 23,38 g/L

Lb brevis GABA 100 NP MSG 13 g/L Lb brevis Sữa tươi MT GYP 4.599 g/L

NP: Not provided; MRS medium: de Man, Rogosa and Sharpe medium; MRSS: MRS medium with sodium glutamate; GYP medium: Glucose yeast extract poly-peptone medium; MSG: Monosodium glutamate.

Bang 2.2 Tinh chat cua GAD tir Lb paracasei, Lb brevis, L lacfis[25 |

Lb paracasei Lb brevis L lactis

Khối lượng phân tử (kDa)

SDS-PAGE 57 60 54 Loc gel 110 120 ND PHopt 5,0 42 4.7 Topt 50°C 30°C ND Ảnh hưởng của 10mM NaCl - - ND Ảnh hưởng của 10Mm CaCl, + ND ND

ND: Chưa phát hiện (-): không ảnh hưởng (+): ảnh hưởng

SDS-PAGE: Tinh sạch GAD bằng phương pháp Laemmli sử dụng sắc ký cột Các yếu tổ ảnh hưởng đến khả năng sinh tong hop GABA của vi khuẩn Lb.brevis: pH, nhiệt độ, thời gian lên men và thành phần dinh dưỡng của môi trường lên men Điều kiện lên men tối ưu dựa vào hoạt tính sinh học của enzyme GAD trong tế bào vi khuẩn Lb.brevis Trong quá trình khử cacboxyl glutamate xảy ra trong tế bao vi khuẩn sẽ sử dung proton và giải phóng GABA (theo 1.1),dan đến kiềm hóa môi trường bên trong tế bào vi khuẩn Dé thu được hàm lượng GABA tối ưu, cần phải duy trì pH 5 trong môi trường lên men tạo điều kiện tối ưu cho enzyme GAD hoạt động[ l |

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Khảo sát ảnh hưởng thông số vận hành ]

Vv Xây dựng mô hình toán học của quá trình phân riêng GABA tu canh trường lên men cám gạo

TT @ơ (7) (YO) 5 Khảo sỏt ảnh hưởng của giải phỏp bụ , hà sung nước đến quá trình phân riêng

Anh hưởng của giải pháp bố sung nước đến quá trình phân riêng GABA từ canh trường cám gạo.

Hình 3.4 Sơ đô nội dung nghiên cứu

3.2.2 Nội dung 1: Xác định thành phân hóa hoc của canh trường cám gao lên men s* Mục đích

Xác định thành phân hóa học của canh trường cám gạo lên men, từ đó, chọn ra các phương pháp xử lý nguyên liệu phù hợp cho nghiên cứu.

“+ Thông số đánh giá - Hàm lượng chất khô tổng — phương pháp phân tích theo phụ lục 1.1 - Hàm lượng đường tong — phương pháp phân tích theo phụ lục 1.2.2

- Hàm lượng đường khử - phương pháp phân tích theo phụ lục 1.2.3

- Hàm lượng acid amin tổng — phương pháp phân tích theo phụ lục 1.3

- Hàm lượng protein hòa tan — phương pháp phân tích theo phụ lục 1.4 - Hàm lượng GABA — phương pháp phân tích theo phụ lục 1.5

3.2.3 Nội dung 2: Khao sát anh hưởng của quá trình tiền xử lý dịch cám gạo lên men dén khả năng ph n riêng cua màng siêu lọc s Mục dich Đánh giá ảnh hưởng của quá trình tiền xử lý canh trường cám gạo đến quá trình phân riêng sử dụng màng siêu lọc, từ đó, lựa chọn phương pháp xử lý canh trường cám gạo phù hợp trước khi đem đi xử lý bang thiết bị phân riêng sử dụng màng siêu lọc. s* Phương pháp thực hiện

Tiến hành xử lý các mẫu ở các điều kiện khác nhau:

- Mau đối chứng (mẫu DC): dịch lên men được tiến hành lọc thô qua giấy lọc thường, sử dụng bơm chân không.

- Mau xử lý bằng phương pháp ly tâm: dịch lên men được ly tâm với tốc độ

6.000 rpm, thời gian ly tâm 30’.

- Mẫu xử lý băng mang vi lọc: dịch lên men được tiễn hành lọc qua giấy lọc MF với kích thước lỗ lọc 0,45m, sử dụng bơm chân không.

- Mau lọc thô kết hop sử dụng màng vi lọc: dịch lên men được tiễn hành lọc thô qua giấy lọc thường, sau đó dịch thu được sẽ đem lọc qua giấy lọc MF với kích thước 16 lọc 0,45m, sử dụng bơm chân không.

- Mau ly tâm kết hợp sử dụng màng vi lọc: mẫu sau khi ly tâm xong, được đem lọc tiếp qua màng MF với kích thước lỗ lọc 045m, sử dụng bơm chân không.

Nhập liệu 200ml dịch lên men vào thiết bị siêu lọc, thực hiện quá trình siêu lọc với các điều kiện: áp suất vận hành 6 bar, nhiệt độ vận hành là 28 + 2°C , tốc độ khuấy

100rpm Sau 30 phút, tiến hành lẫy mẫu và đo thời gian.

- D6 phân riêng GABA, độ phân riêng axit amin, độ phân riêng protein, độ phân riêng đường tổng.

3.2.4 Nội dung 3: Khảo sát ảnh hướng áp suất vận hành đến kha năng ph n riêng cúa màng siêu lọc s Mục dich Áp suất là động lực của quá trình phân riêng bằng màng Do đó, mục tiêu của nội dụng nghiên cứu này là khảo sát ảnh hưởng của áp suất vận hành đến hiệu quả phân riêng GABA từ canh trường cám gạo. s* Phương pháp thực hiện

Dung dịch nhập liệu được xử lý bằng phương pháp phù hợp được chọn ra từ thí nghiệm ở nội dung 2 Kế đến, tiễn hành thay đổi áp suất vận hành trong khoảng 2.16.8.10 bar, nhiệt độ vận hành là 28+2°C, tốc độ khuấy 100rpm Sau khi đã điều chỉnh các thông số 6n định được 30 phút, tiễn hành lay mẫu và do thời gian.

- Độ phân riêng GABA, độ phân riêng acid amin, độ phân riêng protein, độ phân riêng đường tổng.

3.2.5 Nội dung 4: Xây dựng mô hình toán học cho quá trình phân riêng GABA từ canh trường lên men cám gao. s Mục dich Xây dựng mô hình toán học phù hợp với quá trình phân riêng GABA từ canh trường lên men cám gạo sử dụng màng siêu lọc từ đó có thể dự đoán được hiệu quả phân riêng của GABA khi sử dụng màng siêu lọc. s* Phương pháp thực hiện

Dung dịch nhập liệu được xử lý bằng phương pháp phù hợp được chọn ra từ thí nghiệm ở nội dung 2 Ấp suất vận hành được lựa chọn từ nội dung 3, nhiệt độ vận hành là 28+2°C, tốc độ khuấy 100rpm.

- Độ phân riêng GABA, độ phân riêng acid amin, độ phân riêng protein, độ phân riêng đường tong:

- Độ tinh sạch cua GABA, độ tinh sạch của acid amin, độ tinh sạch cua protein, độ tinh sạch cua đường tong;

3.2.6 Nội dung 5: Khao sát anh hưởng của giải pháp bỗ sung nước vào dòng không qua màng đến kha năng ph_n riêng của màng siêu lọc s* Mục đích Đánh giá ảnh hưởng của giải pháp bố sung nước đến khả năng tinh sạch GABA từ canh trường cám gạo lên men sử dụng màng siêu lọc, từ đó, dé xuất chế độ bố sung nước phù hợp. s* Phương pháp thực hiện

Dung dịch nhập liệu được xử lý bằng phương pháp phù hợp được chọn ra từ thí nghiệm ở nội dung 2 Kế đến, cố định áp suất vận hành đã chọn được từ thí nghiệm ở nội dung 3, nhiệt độ vận hành là 28+2°C 200ml dịch lên men được cô đặc đến khi đạt đến hệ số cô đặc nhất định Sau đó, bổ sung nước (điều chỉnh pH 4,5) vào dòng không qua màng với các tỉ lệ nước bo sung so với dòng permeate lần lượt là: 1:1(A);

0.75:1(B); 0,5:1(C); 0,25:1(D) và tiếp tục đến hệ số cô đặc băng với hệ số cô đặc ban đầu.

-Độ phân riêng GABA, độ phân riêng acid amin, độ phân riêng protein, độ phân riêng đường tong:

-Độ tinh sạch cua GABA, độ tinh sạch của acid amin, độ tinh sạch cua protein, độ tinh sạch của tổng:

-Hiệu suất thu hồi GABA, hiệu suất thu hồi acid amin, hiệu suất thu hồi protein, hiệu suất thu hồi đường tong.

3.3.1 Xác định hàm lượng chất khô tong

Ap dụng phương pháp say khô sản phẩm đến khối lượng không đổi. Độ âm mẫu được xác định bang khối lượng mất đi của mẫu sau khi say dén khéi lượng không đổi.

3.3.2 Phương pháp xác định đường tổng và khử

Phương pháp xác định đường tổng và đường khử theo BeMiller [49]

3.3.2.1 Xác định hàm lượng đường tổng bằng phương pháp axit sulfuric-phenol i Nguyên tắc Hàm lượng đường tổng được xác định bang phương pháp quang phố so màu.

Khi có mặt của axit mạnh, carbohydrate bị phân hủy thành các dẫn xuất furanCác dẫn xuất furan này sẽ ngưng tụ với phenol tạo thành hợp chất màu vàng cam rất bên Cường độ màu được xác định tại bước sóng 490 nm Hàm lượng đường tong được xỏc định dựa trờn đường chuẩn của chất chuẩn là ứlucose tinh khiết. ii Cách tiễn hành

3.3.2.2 Xác định hàm lượng khử bằng phương pháp axit dinitrosalicylic (DNS) i Nguyên tắc Hàm lượng đường tổng được xác định bang phương pháp quang phổ so mau, sử dụng thuốc thử DNS tạo dẫn xuất có màu cam và được xác định tại bước sóng 540nm.

Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ đường khử trong mẫu kiếm tra Dựa trên đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử DNS sẽ xác định được hàm lượng đường khử trong mẫu nghiên cứu. ii Cách tiền hành

Xem phụ lục 1.2.3 3.3.3 Phương pháp xác định hàm lượng axit amin

Phương pháp xác định hàm lượng axit amin theo Hwang [50|

Phản ứng tạo màu của ninhydrin với các acid amin ơ -amino acid + 2 ninhydrin -> CO, aldehyde hỗn hợp màutím 3H;O Hàm lượng axit amin được xác định bằng phương pháp quang phố so màu, sử dụng thuốc thử ninhydrin, được xác định tại bước sóng 570nm Dựa trên đường chuẩn cua glycine chuẩn với thuốc thử ninhydrin sẽ xác định được hàm lượng axit amin trong mẫu nghiên cứu.

Xem phụ lục 1.3 3.3.4 Phương pháp xác định hàm lượng protein hòa tan

Phương pháp xác định hàm lượng protein hòa tan theo phương pháp Folin [51]

ỨCR = — (3.5)

KET QUA VA BAN LUẬN 4.1 Thanh phan hóa học của canh trường cám gạo lên men

Một số tính chất hóa lý của canh trường lên men cám gạo được thể hiện trong bang 4.1:

Bảng 4.1 Một số tinh chất hóa lý của canh trường lên men cám gạo

Chỉ tiêu Đơn vị Giá trị

Mật độ tế bào cfu/ml log 9,53 + 0,16 pH 452+0,12 Chat kho % 8740.14

Protein hòa tan mg/L 32.894.7 + 930.4 Amino acid mg/mL 21.01 +146 Đường tong mg/L

Dich cám gạo thủy phân bởi tổ hop enzyme ơ-amylase va enzyme protease được bố sung các nguôn cơ chất: nitơ, cacbon và khoáng nhằm hỗ trợ cho quá trình lên men của vi khuẩn Lactobacillus brevis Thời gian lên men kéo dài trong 48 giờ, ở nhiệt độ 32°C Việc sử dụng kết hop enzyme thủy phân cám gạo nhằm khai thác triệt dé hàm lượng glutamate có trong cám gạo, là nguồn cơ chất trong quá trình sinh tong hợp GABA của vi khuân L.brevis[1], ngoài ra tích lũy thêm ngu6n cacbon và nito trong cám làm nguồn co chất co ban cho vi khuẩn sinh trưởng và phát triển Kết thúc quá trình lên men, hàm lượng GABA thu được tương đối cao 9,507 g/L, đạt năng suất xấp xỉ 1% so với hàm lượng cám gạo ban đầu sử dụng Trong những nghiên cứu trước đây sử dụng vi khuan Lactobacillus brevis, trên môi trường tong hợp GYP (glucose yeast extract poly-peptone medium), hàm lượng GABA thu được 4.5992 g/L [16], so với trên môi trường tổng hợp thì hàm lượng GABA được sinh tổng hợp trên môi trường cám gạo thủy phân đạt được hiệu suất tốt hơn gấp hai lần so với trên môi trường GYP.

Hon thé nữa, trong nghiên cứu của Bae Jin Lee và cộng sự, tong hợp GABA trên môi trường bột gạo cũng chi thu được 2,465 g/L thấp hơn 3,86 lần so với môi trường dịch cám gạo đã thủy phân. Điều này chứng tỏ, điều kiện môi trường lên men cám gạo với sự hỗ trợ của td hợp enzyme, đã giúp cho vi khuẩn L.brevis sinh tong hợp GABA đạt được hiệu qua cao, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình phân tách và tỉnh sạch GABA sử dụng màng siêu lọc sau này.

Tuy nhiên, canh trường lên men cám gạo là môi trường phức tạp ngoài GABA còn rất nhiều sản phẩm của quá trình lên men đặc biệt là sinh khối và tế bào của vi khuẩn Chính những tạp chất này sẽ làm cản trở quá trình phân riêng GABA từ canh trường lên men cám gạo và làm giảm hiệu quả thu hồi và tinh sạch của GABA[23]. Đặc biệt là nồng độ protein hòa tan trong canh trường còn khá cao xấp xi 33 g/L cũng sẽ làm xảy ra hiện tượng tập trung nồng độ và hiện tượng tắc nghẽn màng trong quá trình phân riêng màng siêu lọc Do đó, canh trường lên men cám gạo trước khi đem di phân riêng GABA bằng màng siêu lọc cần phải qua các quá trình tiền xử lý nhằm loại bỏ những tạp chất không mong muốn hỗ trợ cho quá trình phân riêng GABA bằng màng siêu lọc.

4.2 Ánh hưởng của quá trình tiền xử lý canh trường lên men cám gạo đến quá trình phân riêng GABA bằng màng siêu lọc

4.2.1 Ánh hưởng của quá trình tiền xử lý canh trường lên men cám gạo đến độ phân riêng các cau tứ trong quá trình phân riêng sw dụng màng siêu lọc

Canh trường lên men cám gạo qua các phương pháp tiền xử đã loại một phan tạp chất, huyền phù, protein bị tủa trong quá trình lên men, trong khi đó nông độ các hợp chất hòa tan trong canh trường đều được giữ lại đặc biệt là thành phân axit amin và

Mau DC Loc tho MF Ly tam Ly tam + MF MF

Trong bảng 4.2, nồng độ chat khô của các mẫu qua các phương pháp tiền xử lý khác nhau có nông độ thấp hơn so với mẫu đối chứng Đối với mẫu lọc thô kết hợpMF thì nồng độ chất khô giảm 0,15g/100 ml so với mẫu đối chứng Đối với phương pháp ly tâm.ly tâm kết hợp MF và phương pháp loc MF thì nồng độ chất khô lần lượt cao hơn 0,2g/100ml, 0,25g/100ml và 0.05g/100ml so với mẫu đối chứng Điều này cũng tương tự với Wei Zhe và cộng sự, sau khi ly tâm tốc độ cao 16.000rpm, thì nồng độ chất khô cũng giảm từ 4,05g/100ml xuống 3,85¢/100ml Trong đó, nông độ GABA trong mẫu ly tâm kết hop loc MF vẫn giữ được với nồng độ 10.337mg/L, lần lượt cao hơn so với các mẫu DC, mẫu loc thô MF va mẫu lọc MF là 83 mg/L, 840 mg/L,1737,5 mg/L Mac dù nồng độ GABA trong mẫu ly tâm cao hơn so với mẫu ly tâm kết hợp lọc MF 160 mg/L nhưng độ tinh sạch GABA của mẫu ly tâm kết hợp lọc MF cao hơn mẫu ly tâm 0,03% Ngoài ra, theo Wei Zhe và cộng sự, độ tinh sạch GABA sau quá trình tiền xử lý tăng từ 3,19% lên 3,32%, trong khi đó với phương pháp ly tâm kết hợp lọc MF thi độ tinh sạch GABA thu được là 12,38% Điều này chứng tỏ, phương pháp ly tâm kết hợp lọc màng MF phù hợp cho quá trình tiền xử lý canh trường lên men cám gạo trước khi đem lọc siêu lọc Tuy nhiên các thành phần hóa học trong dòng nhập liệu cũng ảnh hưởng đến quá trình phân riêng bằng màng siêu loc[34], do đó cần phải đem các mẫu trên đi qua lọc siêu lọc nhằm đánh giá hiệu quả phân riêng GABA cũng như là độ tinh sạch GABA của các mẫu Từ đó lựa chọn phương pháp tiền xử lý phù hợp chuẩn bị cho quá trình siêu lọc băng màng IkDa.

Nông độ chất khô 87+0,14 855+007? |85+014) |835+007 |§865+007 Nông độ 9497 + 10495 + 10337 + 8599 5 + GABA (mg/L) | 9507 + 148,49" 148.40" 222 74" 593.97 222 74 Nông độ protein hòa 26431,6 + 243553 + 20139,5 + 294605 + tan(mg/L) 32894,7 + 930.4" | 74,43! 688,5° 1082,99° 390,778 Nông độ axit amin (mg/ml) | 21,01 + 146° 20,140,512" | 26,28+0,96" | 2624+ 1,71" | 29,43 + 0,69!

Nông độ đường tổng 33212,6 + 33660,9 + 337299 + 326897 + (mg/L) 33293,1 + 934,68" | 414.51! 329177 2982 85 390,13”

* Giá trị có ký hiệu khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa (p