Luận văn thạc sĩ Công nghệ thực phẩm: Nghiên cứu khả năng kháng nấm Aspergillus Niger của nano chitosan ứng dụng trong bảo quản thanh long

NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Tạo chế phẩm nano chitosan bằng phương pháp tạo gel ion với sodiumtripol yphosphate - Xac định ngưỡng gây bệnh của nam Aspergillus niger trên quả thanh longBình Thu

ĐẠI HỌC QUOC GIA TP HCMTRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

HUỲNH CÔNG TÀI

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG NÁMASPERGILLUS NIGER CỦA NANO CHITOSAN ỨNG

DUNG TRONG BAO QUAN THANH LONG

Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩmMã số: 60 54 01 01

LUẬN VÁN THẠC SĨ

TP HO CHÍ MINH, tháng 12 năm 2015

Cán bộ hướng dẫn khoa học : TS Trần Bích Lam

Cán bộ cham nhận xét 1 : PGS TS Nguyễn Tiến Thắng

Cán bộ chấm nhận xét 2 : TS Nguyễn Hoài Hương

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, DHQG Tp HCMngày 05 tháng 01 năm 2016

Thanh phan Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:(Ghi rõ họ, tên, học ham, học vi của Hội đông cham bảo vệ luận văn thạc sĩ)1 GS.TS.Déng Thị Anh Dao - Chủ tịch hội đồng

2 PGS.TS Nguyễn Tiến Thang - Phản biện 13 TS Nguyễn Hoài Hương - Phản biện 24 TS Tôn Nữ Minh Nguyệt - Ủy viên5 TS Trần Thị Ngọc Yên - Ủy viên thư kýXác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyênngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

CHỦ TỊCH HỘI ĐÔNG TRUONG KHOA KY THUẬT HÓA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAMTRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIEM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Huỳnh Công Tài MSHV: 13111027Ngày, tháng, năm sinh: 16/09/1989 Nơi sinh: Tây NinhChuyên ngành: Công nghệ thực phẩm Mã số: 60 54 01 01I TEN DE TÀI: “Nghiên cứu kha năng kháng nắm Aspergillus niger của nanochitosan ứng dụng trong bảo quản thanh long”

H NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

Tạo chế phẩm nano chitosan bằng phương pháp tạo gel ion với sodiumtripol yphosphate

- Xac định ngưỡng gây bệnh của nam Aspergillus niger trên quả thanh longBình Thuận

- Khao sát kha năng ức chế của nano chitosan lên sự sinh trưởng và phát triểncủa A.niger trong điều kiện in vitro

- _ Đánh giá ảnh hưởng của nano chitosan đến sự sinh trưởng va phát triển củaA.niger ở điều kiện in vivo trên quả thanh long Binh Thuận

- Đánh giá hiệu quả bảo quản thanh long bằng nano chitosan thông qua sựthay đổi các chỉ tiêu hóa lý của quả trong quá trình bảo quản

HI NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 06/07/2015

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VU: 04/12/2015v CÁN BỘ HƯỚNG DAN: TS Tran Bích Lam

giúp đỡ của nhiều cá nhân và tập thê.

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Trần Bích Lam, ngườiđã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn

Xin cùng bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới các thầy cô thuộc bộ môn Côngnghệ thực phẩm, Khoa Kỹ thuật Hóa học trường Đại học Bách Khoa Tp Hồ ChíMinh, đã trang bị cho tôi những kiến thức bồ trợ vô cùng có ích để thực hiện luậnvăn của mình.

Xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu và ban chủ nhiệm khoa công nghệ thựcphẩm trường Cao Đăng Nghề TP Hồ Chí Minh đã hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợinhất về trang thiết bị trong thời gian tôi thực hiện luận văn

Cuối cùng xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, những người đã luôn bêntôi, động viên và khuyến khích tôi trong quá trình thực hiện luận văn của mình

Tháng 12 năm 2015Học viên

Huỳnh Công Tài

ABSTRACT

In recent decades, thanks to its safety to the consumer, the using of biologybased coating in general and of chitosan nanoparticles based coating in specifichave been getting concern from many researchers around the world In this study,the inhibitory effect of chitosan nanoparticles on Aspergillus niger was investigatedboth in the in vitro and in vivo experiments Then, the quality of dragon fruitscoated with chitosan nanoparticles was evaluated after storaged at 15°C for 35 days.The result gained from in vitro experiment indicated that chitosan nanoparticles atthe same concentration 0,04%, with particle size 42 nm had the best inhibitoryeffect on A.niger at 79,26%, while the other two size 157 nm and 241 nm had lowerinhibitory effect at 56,30% and 58,89% respectively In the in vivo experiment, withthe same droplet size 42 nm, chitosan nanoparticles at 0,14% concentration showedthe best inhibitory effect among the investigated concentration points: 0% ; 0,06% ;0,08% ; 0,1%; 0,12%; and 0,14% After storaged at 15°C and 85% relativehumidity for 35 days, the dragon fruits coated with chitosan nanoparticles at 0,14%concentration and 42 nm droplet size got the weight loss ratio, pH, total solublesolid content and vitamin C loss ratio, decreased by 45 6% ; 4,3% ; 4,8% and 34,1%,respectively over the control The changing in total sugar and reducing sugar tookplace with a slower speed compared with the control The dragon fruits treated withchitosan nanoparticles also has better appearance The results of this study showthat chitosan nanoparticles is probably used in preservation to maintain the qualityof dragon fruit for 35 days at 15°C

TOM TAT LUAN VAN

Trong nhiều thập niên trở lại đây, phương pháp bảo quan rau quả sử dungmàng bao sinh học nói chung và mang bao chitosan nói riêng được rất nhiều sựquan tâm của nhiều nhà nghiên cứu trên thế giới, nhờ vào mức độ an toàn của nóđối với người tiêu dùng Trong nghiên cứu này, tôi thực hiện khảo sát đánh giá khảnăng kháng nam Aspergillus niger của nano chitosan trong cả hai điều kiện in vitrova in vivo, đồng thời đánh giá kết quả bao quan thanh long có xử lý nano chitosantrong 35 ngày ở 15°C Kết quả thu được trong thí nghiệm in vitro là ở cùng nồng độ0,04% nano chitosan có kích thước hat 42 nm cho hiệu lực ức chế A.niger là 79,26%tốt hơn ở hai kích thước 157 nm va 241 nm có hiệu lực ức chế lần lượt là 56,30% và58,89% Trong thí nghiệm in vivo, ở cùng kích thước hạt 42 nm, nano chitosan cónông độ 0,14% cho hiệu quả ức chế A.niger tốt hơn các nông độ còn lại là : 0,12% ;0,10% ; 0,06% ; 0,06% Sau 35 ngày bao quản ở 15°C kết hợp nhúng nano chitosancó nồng độ 0,14% và kích thước hạt 42 nm thì thanh long có tỉ lệ hao hụt khốilượng, pH, hàm lượng chất khô hòa tan và tỉ lệ hao hụt vitamin C giảm lần lượt là45,6%; 43%; 48% và 34,1% so với mẫu đối chứng Sự biến thiên hàm lượngđường khử và đường tong cũng diễn ra chậm hơn Ngoại quan của quả có xử lýnano chitosan là khá tốt so với mẫu đối chứng Kết quả thu được cho thấy nanochitosan có khả năng được ứng dụng trong bảo quản thanh long nhăm kéo dài thờigian bảo quản lên 35 ngày ở 15°C

LOI CAM DOAN CUA TÁC GIÁ

Tac giả xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu cua ban than tac giả Cackết quả nghiên cứu và các kết luận trong luận văn là trung thực, không sao chép từbat kỳ một nguồn nao và dưới bất kỳ hình thức nào Việc tham khảo các nguồn tàiliệu đã được thực hiện trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo theo đúng yêu cau

Tháng 12 năm 2015Học viên

Huỳnh Công Tài

LOI CAM 09 ABSTRACT ou liTOM TAT LUẬN VAN -G- Gv SE E111 1111111151111 11 1E E1 rrrki iiiLOI CAM DOAN CUA TAC GIA Wu eseesseesseesseesseeeseeesnesusesusesusesisesusennsennsesusennneneees ivMỤC LỤC G0000 nọ TH VvDANH MỤC BẢNG s1 1111211 5 911191 11 1119191 111g 11g91 ng gi viiiDANH MUC HÌNHH G1191 3 51919151 1 9 911195 5101115111 0 11118 gu ng: ixDANH MỤC CAC TU VIET TAT uuccccccccececescssscececessscscececsesevacscececsevavsceceesevevacees xi0009.100157 |1 Lý do chọn để tài + 65661 E1 321 15151521 211115 111101011115 11 011101010101 01 1 y0 |2 Mục tiêu nghiÊn CỨU - . G5 G0000 cọ 23 Đối tượng và phạm vi nghiên CỨU ¿- - 2 22+ +£+E+E£E+E+E£e+xerererrerered 2A Nội dung nghiÊn CỨU << <5 0990010101199 re 35 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của để tầi cncnn 2n g1 reo 3CHƯƠNG 1: TONG QUAN TÀI LIỆU 5c- 55c 22+ccteeEkerrkerrkrerkkrrkk 41.1 Tổng quan về quả thanh long ở Việt Nam ¿+5 52 22+ £e+x+zezscxez 41.2.Thuc trạng bao quản thanh long ở Việt Nam S111 se 61.2.1 Xử lý nhiệt trước khi bảo quản - - << cv re 61.2.2 Bảo quản ở nhiệt độ thấp - ¿+ E2 + 22223 E235 EEE E111 111 Eee, 71.2.3 Xử lý thuỐc - 5c SE 12221 19212121211 111111 231111111111 011111 11111111 c 71.3.Téng quan về nắm mốc Aspergillus ni€T - + 525552 Ss+s+x£s+s+sezscxez 8L.3.1 Giới thiệu CHUNG - - c0 nọ re 81.3.2 Đặc điểm hệ sợi NAM oo cecceeeeececeseccececscececessevscsceceesevevscececsecaceceeeevavacees 91.3.3 Câu tạo cơ quan sinh SAN c.ceccccsccsesessssessssssessssesesessesesessesesecscsesecseseseeseaeees 91.4 Tổng quan về chitosan và nano Chitosan c.ccceccscssesssessssesesesesesesseseseeseseeeeees 101.4.1 Tổng quan v6 Chitosan cccccccccccscsscsessesssessesssessesesessesesessesesesseseseseessseeeeees 101.4.2 Hoạt tinh và cơ chế kháng khuẩn của Chitosan -. - 55+: 111.4.3 Hoạt tính kháng khuẩn của nano ChitOsan cccccecsssessesesesessseseessseseees 13

1.4.4 Độc tính của ChIfOSaN -cc G0001 11110 111111 1 111v x54 141.4.5 Các phương pháp tạo nano chIfOSaI - - - - << - c9 1 ke 141.5 Những công trình nghiên cứu liên quan đến dé tài -. - 25555: 18CHUONG 2: NGUYEN LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 212.1 Đối tượng nghiÊn CỨU ¿+ SE SE+E£EESE#EEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEErrkrkrrrrrrree 212.1.1 Nguyén liệu thanh Ïong - - << «s1 S000 ng ke 212.1.2 Nguyên liệu chifOSa1n <0 nọ ve 212.1.3 Nam mốc Aspergillus niger ccccccccsessssssessssssesessesssesssssssesssesesssseeseseseees 212.2 Phương pháp nghiÊn CỨU (<1 900001 re 222.2.1 Sơ đồ tiễn trình nghiên cứu -¿- + 2 252252 S£+E+E££E+EvEerrterrerrerered 222.2.2 BG trí thí nghiệm - ¿2E 2 SE SE 1 E9 E1 E1E1E151511 2111111111111 1 111 e 222.2.2.1 Thí nghiệm xác định ngưỡng gây bệnh nhân tạo của nam A.niger trênquả thanh long - - - - << 5 1100001 0 222.2.2.2 Thí nghiệm xác định khả năng ức chế của nano chitosan lên sự pháttriển của nắm A.niger trong điều kiện in VirO ¿5-5-5 +c+c£scszezescee 232.2.2.3 Khảo sát khả năng kháng nam A.niger của nano chitosan trong điềukiện in Vivo trên quả thanh ÏOnng - - - << <5 11190101011 ng ke 252.2.2.4 Khao sát hiệu quả bảo quản thanh long ở điều kiện 15°C kết hợp vớimàng bao NANO ChI{OSâII - - - G G0000 0 nọ ve 262.2.3 Phương pháp tao nano chifOSa1n - - SH ng, 272.2.4 Phương pháp phân tích đường khử, đường tỐng - - 55c: 302.2.4.1 Thiết bị và hóa Chat - - tk 51112121 E111 1151 1E 111111 1g ree 302.2.4.2 Phương pháp phân tích đường tổng ¿ 2-25 c2 s£s+s+escee: 302.2.4.3 Phương pháp định lượng đường Khử - << ssesssseeks 3l2.2.5 Phương pháp phân tích ham lượng vitamin C, -««««++<<<< «<2 33CHƯƠNG 3 KET QUA NGHIÊN CỨU VÀ BAN LUẬN - 353.1 Kết quả thí nghiệm tạo nano chitOsan - + 222252 ++x+x£ezxerrerrerered 353.2 Kết quả thí nghiệm xác định ngưỡng gây bệnh nhân tạo của nam A.niger trênqua thanh long 373.3 Kết quả thí nghiệm xác định khả năng ức chế của nano chitosan lên sự pháttriển của nam mốc A.niger trong điều kiện in VifTO - - + 2 5552s+s+s+£szcscs2 39

3.4 Kết quả thí nghiệm khảo sát kha năng kháng nắm A.niger của nano chitosantrong điều kiện in vivo trên quả thanh long - + 2 25+ s+s+x£s+x+xezscxez 433.5 Kết quả khảo sát thời gian bảo quản thanh long bao nano chitosan ở điều kiện

15°C 453.5.1 Sự hao hụt khối lượng -. ¿- 5-5562 E2 E1 1 1212111121 1111 1111k 463.5.2 Sự thay đổi plH - - + S411 1 211111111515 11 1111111111111 01 01011111 cv 493.5.3 Sự thay đôi hàm lượng chất ran hòa fan - s2 vEseserkes 503.5.4 Sự thay đôi hàm lượng vitamin CC ¿5s s+c+cecxsrcrerkerrerrereree 523.5.5 Sự thay doi hàm lượng đường khử, đường tổng - 54

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ . - 6 5xx £EsEsEsEseeersesed 58

4.1 en LO + + S2 S333 311 E11151511515151151515151101 111111111111 1111 710111 1y 58AQ ‹ 0/1 59TÀI LIEU THAM KHẢO G-G G63 539191 3E 9191 1 1 111121 1E 1121 eo 60Phụ lục A: CÁC PHƯƠNG PHAP TIEN HANH THÍ NGHIỆM - 67Phụ lục B: SO LIEU THO KET QUA THI NGHIỆM - - 2 2 2 +s2s+s+s+ee: 71Phụ lục C: CAC THIET BI SỬ DUNG TRONG LUẬN VAN : 78

Bang 2 4: Thông số dựng đường chuẩn xác định hàm lượng đường khử 32

Bang 3 1: Kết quả tạo nano chitOSan ¿5-5-5556 SE‡E#EEEEEESEEEEEEEEErkrkrrkrerreee 35Bảng 3 2: Bảng kết quả tỉ lệ bệnh trong thí nghiệm xác định ngưỡng gây bệnh 38

Bang 3 3: Két quả ảnh hưởng của nông độ và kích thước nano chitosan lên sự naymâm và phát triên của NAM MOC Ả.1IØ€TF - << << s1 00 re 41Bang 3 4: Bảng kết quả thí nghiệm xác định kha năng kháng nam A.niger của nanochitosan có kích thước hat 42nm trong điều kiện iw VIVO 5-5- 525555552 44Bảng 3 5: Bang tỉ lệ hao hụt khối lượng qua qua 35 ngày bảo quản 46

Bang 3 6: Bang thay đổi pH qua 35 ngày bảo quản ở 15C 5-5-5552 55¿ 49Bang 3 7: Bảng hàm lượng chat rắn hòa tan qua 35 ngày bảo quản 6 1%PC 50

Bang 3 8: Bang ham lượng vitamin C qua 35 ngày bảo quan ở 15°C 52

Bang 3.9: Sự thay đối ham lượng đường khử qua 35 ngày bảo quản ở 15°C 54

Bảng 3 10: Sự thay đối hàm lượng đường tổng qua 35 ngày bảo quản ở 15°C 55

Bang 3 11: Kết qua bảo quan sau 35 ngày ở 15°C icccccccsssessssesssessessssesesseseseseees 57

DANH MỤC HÌNHHình 1 1: Hình thái Aspergillus SJD 9000 ke 9Hình 1 2: Cau tạo hóa học của chitin và Chitosan c.cccssccessssesscscececsecececesseveveeees 10

Hình 1 3: Sơ đồ tạo nano chitosan băng phương pháp khâu mạch nhũ tương 14

Hình 1 4: Sơ đồ tạo nano chitosan băng phương pháp kết tủa -. - -: 15

Hình 1 5: So đồ tạo hạt nano chitosan bang phương pháp hop giọt nhũ tương 16

Hình 1 6: So đồ tạo nano chitosan băng phương pháp tao gel ion - 17

Hình 1 7: Sơ đồ tạo hạt nano chitosan bang phương pháp mixen đảo 18

Hình 1 8: So đồ tiến trình thí nghiệm cscs 25252232 +ESEE£E£EcEErrxrkrree 22Hình 2 1: Nguyên lý hình thành hat nano chitosan bằng phương pháp tạo gel ion 28Hình 2 2: Phương trình đường chuẩn xác định hàm lượng đường tong 31

Hình 2 3: Phan ứng tao màu giữa đường khử va thuốc thử DNS 32

Hình 2 4: Phương trình đường chuẩn xác định hàm lượng đường khử 33

Hình 3 1: Nano chitosan được tạo theo công thức NCT Ï ««<<<++2 35Hình 3 2: Nano chitosan được tạo theo công thức NCT 2 - << <<x+2 36Hình 3 3: Nano chitosan được tạo theo công thức NCT 3 << <<++2 36Hình 3 4: Kết quả lây bệnh nhân tạo trên quả thanh long bằng bào tử nắm mốc0/7428 8.88 .ẦẦẦ ốỐ- 38Hình 3 5: Kết quả thí nghiệm in vitro ở kích thước nano chitosan là 42 nm 39

Hình 3 6: Kết quả thí nghiệm in vitro ở kích thước nano chitosan là 157 nm 39

Hình 3 7: Kết quả thí nghiệm in vitro ở kích thước nano chitosan là 241 nm 40

Hình 3 8: Kết quả thí nghiệm xác định khả năng kháng nam A.niger của nanochitosan có kích thước 42 nm trong điều kiện in vivo trên quả thanh long 44

Hình 3 9: Biểu đồ tỉ lệ hao hụt khối lượng quả qua 35 ngày bảo quan 46

Hình 3 10: Đồ thị sự thay đổi pH qua 35 ngày bảo quản ở 15C 49

Hình 3 11: So sánh sự thay đôi ham lượng chat ran hòa tan qua 35 ngày bảo quản ở

Hình 3 12: So sánh sự thay đôi hàm lượng vitamin C qua 35 ngày bảo quản ở 15°C

DANH MỤC CÁC TU VIET TAT

Potato Dextro A gar

Minimum inhibition concentration

Percentage inhibition of radial growth

Đối chứngScanning electron microscope

Dinitro salysilic acid

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Thanh long là loại trái cây có giá trị dinh dưỡng cao và ngày càng nhậnđược nhiều sự quan tâm và đón nhận của các thị trường tiêu thụ trên thế gIỚI.Cụ thể là chỉ trong đầu năm 2015 thanh long Việt Nam có thêm 3 thị trườngxuất khâu chính ngạch là Newzealand, Úc, và Ấn Độ

Mặc dù diện tích trồng thanh long chỉ chiếm 3,1% tổng diện tích trồng câyăn quả của Việt Nam, nhưng loại trái này đang đóng góp tới 55% tổng giá trịxuất khẩu Hiện nay thanh long Việt Nam xuất khẩu qua 40 nước trên thé giớituy nhiên thị trường xuất khẩu chính của trái thanh long vẫn là Trung Quốcchiếm tới 70 — 80% kim ngạch xuất khẩu, các thị trường khác chỉ chiếm tỉ lệthấp như: châu Âu 4%, Mỹ 3%, Nhật 1,5% cho thay sự phụ thuộc rất lớn củathanh long Việt Nam vào thị trường Trung Quốc, việc này đem đến nhiều nguycơ bat 6n về quá trình tiêu thụ thanh long mà nếu như chúng ta không làm chủđược sẽ rất dé dẫn đến ứ đọng nguồn hàng không tiêu thụ được như đã xảy ravới một số nồng sản khác [1]

Do vậy, việc phát triển các phương pháp nhằm kéo dài thời gian bảo quảndé trái thanh long Việt Nam dé dàng tiếp cận và tăng kha năng cạnh tranh ở cácthị trường xa để có thể chủ động hơn về thị trường tiêu thụ thanh long củamình đang là một vẫn đề cấp thiết

Thanh long sau thu hoạch dễ bị hư hỏng khi bảo quản mà chủ yếu do cácchủng nắm mốc sau gây ra: Colletotrichum gloeosporioides, Aspergillus niger,Aspergillus flavus, Penicillium,va Botryosphaeria sp [2] Trong đó, hư hỏng donam mốc A.niger và bệnh than thư do Colletotrichum gloeosporioides gây rachiếm tỉ lệ lớn [3]

Một số phương pháp xử lý thanh long sau thu hoạch hiện đang được sửdụng ở Việt Nam như: xử lý hóa chất (carbenadazim, anolyte), chiếu xạ, xử lýhơi nước nong Tuy nhiên, với thực trạng về van dé vệ sinh an toàn thựcphẩm cũng như van dé ô nhiễm môi trường thì xu hướng của ngành côngnghiệp thực phẩm nói chung hay công nghệ sau thu hoạch nói riêng đang

nghiên cứu rất nhiều đó là sử dụng màng bao chitosan và các chế phẩm của nó.Chitosan là một trong những hợp chất sinh học có khả năng ứng dụngtrong bảo quản rau quả sau thu hoạch do nó có đặc tính kháng nam, khángkhuẩn và là một chế phẩm sinh học được xem là an toàn cho người tiêu dùng.

[4]

Một ưu điểm nữa của việc sử dung mang bao chitosan là nó giúp han chếquá trình hô hấp, giảm được sự thay đổi màu sắc và giữ được cấu trúc của rauquả [4] Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rang chitosan có kha năng ức chế mạnh sựphát triển của nắm gây thối trên trái cây Bên cạnh đó, có nhiều nghiên cứucũng đã cho thấy răng việc sử dụng chitosan dưới dạng nano cho hiệu quả bảoquản tốt hơn chitosan thông thường, từ đó mở ra một hướng nghiên cứu mớitrong quá trình ứng dụng chế phẩm sinh hoc chitosan vao lĩnh vực bảo quanrau quả.

Từ những van dé trên, tôi quyết định thực hiện dé tài “Nghiên cứu khanăng khang nam Aspergillus niger của nano chitosan ứng dụng trong bảo quanthanh long ”

2 Mục tiêu nghiên cứu- Xác định được khả năng kháng nắm Aspergillus niger của nano chitosan

trong điều kiện in vitro và in vivo.- Đánh giá khả năng bảo quản thanh long bằng màng bao nano chitosan ở

điều kiện nhiệt độ 15°C.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- _ Trái thanh long: nghiên cứu thực hiện trên quả thanh long vỏ đỏ ruột trangđược trồng ở tỉnh Bình Thuận, là địa phương có diện tích trồng và sản lượngthanh long lớn nhất cả nước

- Chung nam mốc Aspergillus niger có nguồn gốc từ Trung tâm nghiên cứuvà phát triển nông nghiệp công nghệ cao Thành Phố Hỗ Chí Minh

4.Chế phẩm chitosan dùng để tạo nano chitosan: dạng bột được mua từ côngty TNHH Hùng Tiến, khu công nghiệp Trà Nóc 1, thành phố Cần Thơ Nanochitosan được tạo thành bằng phương pháp tạo gel ion với sodiumtripolyphosphate

Acid acetic dùng trong thí nghiệm tao nano chitosan: sử dung cua công tyMerck KGaA

Mỗi trường PDA: sử dụng của công ty Merck KGaANội dung nghiên cứu

- Tạo chế phẩm nano chitosan băng phương pháp tạo gel ion với sodiumtripol yphosphate

- Xác định ngưỡng gây bệnh của nam Aspergillus niger trên quả thanh longBình Thuận.

- Khao sát khả năng ức chê của nano chitosan lên sự sinh trưởng va phát triêncủa Aspergillus niger trong điều kiện in vitro

- Đánh giá ảnh hưởng cua nano chitosan dén sự sinh trưởng và phat trién cuaA.niger ở điều kiện in vivo trên quả thanh long Bình Thuận

- Đánh giá hiệu quả bảo quản thanh long bằng nano chitosan thông qua sự thayđôi các chỉ tiêu hóa lý của quả qua quá trình bảo quản.

5. Y nghĩa khoa hoc và thực tiễn của đề tàiÝ nghĩa khoa học: cung cấp dữ liệu khoa học về khả năng kháng nắmAspergillus niger của nano chitosan trong điều kiện in vitro va in vivo.Y nghia thuc tién: dé xuất nong độ nano chitosan có hiệu quả ức chế tốt nắmmốc Aspergillus niger có thể ứng dụng nhăm kéo dài thời gian bảo quảnthanh long phục vụ cho xuất khẩu

1.1 Tổng quan về qua thanh long & Việt NamThanh long (hay còn gọi là Pitaya theo tên Mỹ La Tỉnh) đã có từ rất lâu nhưngmới chỉ được biết đến rộng rãi trên thị trường thế giới trong những thập niên gầnđây Ba giống thanh long chính thường được trồng cho mục đích thương mại làthanh long vỏ do ruột trắng (Hylocereus undatus), thanh long vo do ruột do(Hylocereus costaricensis), và thanh long vỏ vàng ruột trang (Hylocereusmegalanthus).

Thanh long đã được người Pháp du nhập vào Việt Nam cách day hon 100 năm[5] Việt Nam hiện trồng chủ yếu là sản phẩm thanh long vỏ đỏ ruột trang thanhlong vỏ đỏ ruột đỏ giống Đài Loan hoặc giống Long Dinh 1 cũng bắt đầu đượctrồng thử nghiệm tại một số vùng và được ưa chuộng do sản lượng tốt hơn, màu sắcđẹp hơn nhưng diện tích vẫn còn hạn chế, không đáng kế so với diện tích thanh longvỏ đỏ ruột trắng Ngoài ra, Viện Cây ăn quả Miền Nam cũng mới lai tạo thành cônggiống thanh long Long Định 5 có vỏ đỏ ruột tím hồng và rất nhiều tính năng ưu việtnhư năng suất cao, chất lượng tốt, ít nhiễm côn trùng, bệnh hại và đặc biệt là có màusắc đẹp Tuy nhiên, giống này cũng chỉ mới đưa vào sản xuất thử vào năm 2012

Việt Nam là một trong những nước có diện tích và sản lượng thanh Long lớnnhất Châu Á và là nước xuất khẩu thanh Long lớn nhất thế giới (Công ty T&C,2012) Năm 2013, Việt Nam có 28.700 ha diện tích trồng thanh long với tông sanlượng đạt 520.000 tan Thanh long hiện đang được trồng ở 30 tỉnh/thành của ViệtNam nhưng đặc biệt phát triển ở các vùng chuyên canh quy mô lớn như Bình Thuận,Tiên Giang và Long An (Vinafruits, 2013) Ba tỉnh này chiếm 93,6% tổng diện tíchthanh long cả nước và chiếm đến 95 5% tong sản lượng Trong đó, Binh Thuan lànơi có diện tích và sản lượng thanh long lớn nhất (chiếm 73,2% về diện tích và 76,9%về sản lượng); kế đến là Tiền Giang (10,9% về diện tích và 10,9% về sản lượng) vàđứng thứ ba là Long An (9,5% về diện tích và 8,1 % về sản lượng) Do sản xuất vàtiêu thụ thanh long đạt hiệu quả kinh tế cao trong 3 năm trở lại đây nên diện tíchcanh tác tăng rất nhanh (Bình Thuận tăng 143%, Tiền Giang 169% và Long An tăng

190% năm 2013 so với năm 2011) Một số tỉnh phía Bắc, Trà Vinh và Vĩnh Longcũng đã bắt đầu trồng và thu hoạch thanh long nhưng tỷ trọng thấp (64%) (SởNông nghiệp & Phát triển Nông thôn các tỉnh Bình Thuận, Tiền Giang và Long An,2013).

Bang 1 1: Diện tích và sản lượng thanh long tại Việt Nam [6]

Diện tích % SO VỚI cả Sản lượng % SO VỚI cảDia phương , k ,

(ha) nuoc (tan) nuocCa nước 28.700 100,0 520.000 100,01 Bình Thuận 21.000 73.2 400.000 76,92 Tiền Giang 3.139 10.9 56.823 10.93 Long An 2.748 95 42.303 8,1

Thanh long hiện dang là mặt hang mang lại kim ngạch xuất khẩu cao nhấttrong tất cả các mặt hàng rau quả tươi của Việt Nam Mặc dù diện tích trồng thanhlong chỉ chiếm 3,1% tong diện tích trông cây ăn quả của Việt Nam, nhưng loại tráinày đang đóng góp tới 55% tổng giá trị xuất khẩu rau quả [1]

Trái thanh long Việt Nam đã có mặt ở 40 quốc gia và vùng lãnh tho, trong đócó cả các thị trường được coi là khó tính như Mỹ, Châu Au, Nhật Bản Tuy nhiênhiện nay, thanh long đạt chuẩn xuất khâu sang các thị trường khó tính và mang lạigiá tri cao như Mỹ, Nhat, Han Quốc, Châu Âu vẫn chưa đáp ứng đủ nhu cầu của thịtrường do không gom đủ hàng sản xuất đạt chuẩn mà nhà nhập khẩu mong muốn

Tính đến cuối năm 2014, tỉnh Bình Thuận có diện tích sản xuất thanh long lớnnhất so với cả nước (24.212 ha) với sản lượng thu hoạch hàng năm trên 500.000 tấn

Chỉ riêng các doanh nghiệp của tỉnh Bình Thuận trong năm 2014 xuất khâuvào 14 thị trường, trong đó Trung Quốc là thị trường tiêu thụ chủ lực (ước tính 80-85% sản lượng) Tuy nhiên, SỐ lượng và kim ngạch xuất khẩu chính ngạch vào thịtrường Trung Quốc chiếm tỷ trọng rất thấp (khoảng 5%) còn hầu hết thanh longBình Thuận xuất khẩu sang thị trường Trung Quốc theo hình thức buôn bán biênmậu chủ yếu qua cặp cửa khẩu Tân Thanh (Lạng Sơn, Việt Nam) — Pò Chài (QuảngTây, Trung Quốc) [1]

sản xuất và kinh doanh thanh long đang ngày càng trở nên cấp thiết và rất cần nhận

được sự quan tâm của các bên liên quan trong và ngoài chuỗi cung ứng thanh long

Thêm vào đó, để đáp ứng nhu cầu tiêu thụ trong nước và xuất khẩu, TrungQuốc đang có chính sách khuyến khích người dân phát triển trồng thanh long trêndiện tích lớn tại hai tỉnh Quảng Đông và Quảng Tây, phía Nam Trung Quốc (diệntích hiện nay là 20.000 ha) Mặc dù việc sản xuất thanh long tại Trung Quốc khôngthuận lợi (do ảnh hưởng bởi thời tiết, khí hậu nên năng suất và sản lượng thanh longcủa Trung Quốc sẽ không nhiều và bị gián đoạn trong mùa lạnh); tuy nhiên đây làthị trường tiêu thụ hầu hết sản lượng thanh long của Việt Nam nói chung và BìnhThuận nói riêng, do vậy trong thời gian tới, thanh long Việt Nam sẽ phải cạnh tranhvới thanh long Trung Quốc ngay tại thị trường tiêu thụ, ngoài cạnh tranh về giá cảcòn phải cạnh tranh về cả những vấn đề liên quan đến chất lượng cũng như rào cảnkỹ thuật trong thương mại mà Trung Quốc có thé sẽ áp dụng trong tương lai [1]1.2 Thực trạng bảo quản thanh long ớ Việt Nam

Quả thanh long có thời gian tồn trữ ngắn do có cường độ hô hấp cao Nếu bảoquản ở điều kiện thường, vỏ quả sẽ bị nhăn lại chỉ sau 7 — 8 ngày bảo quản Thànhphan hóa học của quả thay đối nhiều trong quá trình bảo quản [2]

1.2.1 Xử lý nhiệt trước khi bao quanXử lý quả bằng hơi nước nóng được ứng dụng đầu tiên ở Florida 1992 dé trừrudi Dia Trung Hải trên quả cam [7] Xử lý nhiệt trước khi bảo quản nhăm loại bỏcác mam bệnh trên bề mặt hoặc trong một vài lớp tế bào biéu bì của rau quả thườngtiền hành trong thời gian ngắn (vài phút) Nhiệt được cung cấp cho rau quả theo mộtvài cách: nhúng trong nước nóng, bằng hơi nước nóng hoặc băng không khí khônóng Xử lý nhiệt băng hơi nóng chủ yếu hiệu quả trong việc diệt côn trùng nhưngkhó dé diệt trừ được nắm mốc; Xử lý nhiệt bằng không khí khô nóng có khả năngdiệt cả côn trùng và nắm mốc nhưng có thể làm bỏng vỏ quả đối với những quả cóvỏ mỏng: Xử lý nhiệt bang nước nóng thường được sử dụng nhiều nhất vì nó là môitrường truyền nhiệt hiệu quả hơn không khí Xử lý nhiệt cũng được sử dụng để ức

chế quá trình chin hoặc tao ra sức dé kháng với tôn thương lạnh và ton thương trongvỏ trong suốt thời gian bảo quan, vì thé có thé kéo dài thời gian bảo quản và thờigian tiêu thụ trên thị trường Xử lý quả thanh long trước khi bảo quản để đảm bảoan toàn sinh học của các nước nhập khẩu, và hệ thống các siêu thị Xử lý ở mức độthấp nhiệt độ ở tâm quả 46,5°C trong thời gian 20 phút thì chất lượng quả được duytrì [5]

1.2.2 Bao quản ở nhiệt độ thấpBảo quản ở nhiệt độ thấp là biện pháp hữu hiệu nhất trong việc hạn chế quátrình hô hấp, hạn chế sự chín của quả và ngăn cản sự phát triển của vi sinh vật, đảmbảo kéo dài thời gian bảo quản của rau quả tươi Đây là phương pháp bảo quản dựatheo nguyên lý tiềm sinh nghĩa là làm chậm, ức chế hoạt động sống của rau quả vàvi sinh vật nhờ đó làm chậm thời gian hư hỏng thối rữa của rau quả Như ta đã biếtnhiệt độ môi trường bảo quản càng thấp thì càng có tác dụng ức chế các quá trìnhsinh lý sinh hóa xảy ra trong rau quả và hoạt động của vi sinh vật Tuy nhiên, nhiệtđộ môi trường bao quản lạnh phải từ 20°C đến nhiệt độ gần điểm đóng băng củadịch bào để tránh hiện tượng ton thương lạnh [8] Qua thanh long có thể giữ đượcchất lượng thương mại trong khoảng 7 ngày ở 20C, 14 ngày ở 14°C, nhưng ở nhiệtđộ thấp hơn 6°C xuất hiện hiện tượng ton thuong lanh voi nhirng đóm nâu trên bềmặt quả [9]

1.2.3 Xử lý thuốcDùng chế phẩm acid gibberelic với liều 2g cho 12 lít nước, xịt đều quanh trái,có tác dụng làm tai thanh long xanh hơn và cứng hơn Xử lý trước khi thu hoạch từ1 — 3 ngày Với cách này thanh long có thé bảo quan tươi được 10 — 20 ngày [10]

Aspergillus niger là loài nắm pho biến nhất xuất hiện trong thực phẩm, đượcxác định là tác nhân gây nên bệnh mốc đen trên nhiều loại thực phẩm, đặc biệt là

trên các loại rau quả sau thu hoạch Nó còn là loài nắm mốc xuất hiện pho bién nhattrên các loại hat như: đậu phộng, ốc chó, hạt phi [11]

A.niger được xem là loài vi sinh vật có nhiều ứng dụng quan trong nhất trongcông nghệ vi sinh Nó đã được ứng dụng cho công nghệ lên men sản xuất acid citricvà các enzyme ngoại bào trong nhiều thập kỷ qua [12]

A.niger là loài phố biến nhất trong chi Aspergillus, phân bố rộng rãi trên cáccơ chat tự nhiên, trong các sản pham nông công nghiệp va ở nhiễu vùng địa lý khácnhau trên thế giới Hiện nay, A.niger được sử dụng chủ yếu trong công nghiệp sảnxuất enzyme (điển hình như a - amylase, glucoamylase, pectinase, protease,cellulase), trong công nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp sản xuất một số acidhữu cơ như acid citric, acid gluconic [13] [14] [15]

A.niger là loài phổ biến nhất gây bệnh thối hỏng trên nhiều loại trái cây tươivà rau củ như: Táo, đào, cam, nho, dâu tây, xoài, thanh long, hành tây, tỏi, càchua [3]

Theo các nghiên cứu ở thập niên 70 của thế kỷ XX, bắt đầu từ nghiên cứuphân chia nhóm của Whittaker đến giới của Alexopolous và Mims đã dé nghị khóaphân loại cho giới nam nói chung và A.niger nói riêng như sau: [16]

- - Ngành: Amastigomycota- - Ngành phụ: Ascomycotina- Lop: Ascomycetes

- Lop phụ: Plectomycetidae- Bo: Eurotiales

- Ho: Eurotiaceae

- Gidng: Aspergillus- Loai: Aspergillus niger

1.3.2 Đặc điểm hệ sợi namKhuan ty của nam chi tăng trưởng ở ngọn va có vách ngăn, gdm hai loại:- Khuan ty dinh dưỡng: khuẩn ty phát triển trong co chất, có kích thước nhỏ,

màu trăng Các khuẩn ty bén chặt thành một khối rất dai, ăn sâu vào môi

trường nuôi cây dé hút dưỡng chất Khi già hệ sợi ngã sang màu vàng.- Khuan ty sinh sản: khuẩn ty phát triển trong không khí, có kích thước lớn

hơn khuẩn ty dinh dưỡng rất nhiều, trong suốt Khuẩn ty sinh sản hướng vàokhông khí dé lay oxy, có khả năng tạo bào tử khi già

Tóm lại, khi già hệ sợi có nhiều biến đối: một số khuẩn ty dinh dưỡng tạothành các hạch nam làm hệ sợi ngã sang màu vàng Trong khi đó, khuẩn ty sinh sanhình thành các bào tử đính làm cho bé mặt khuẩn lạc có mau den [11]

1.3.3 Cau tạo cơ quan sinh sảnAspergillus niger là loại nam không có giai đoạn sinh san hữu tinh, A nigersinh sản vô tính chủ yếu bang bào tử đính

Hinh 1 1: Hinh thai Aspergillus sp.

(a) khối bào tử đính, (b) bào tử đính, (c) tế bào géc , (d) cuống thé bình và thé bìnhCơ quan sinh sản có dạng như hoa cúc, gồm các phan: bào tử đính phát triểntừ một tế bào có đường kính lớn hơn, màng dày hơn các đoạn lân cận của hệ sợinắm gọi là tế bào gốc Từ tế bào gốc tạo thành sợi cuống không vách ngăn, kéo dàivới phần đỉnh phông to tạo thành túi hình cầu, không mau cho đến vàng nhạt Xung

quanh bé mặt túi là các cuống thể bình màu nâu, dài 10 + 15 ym, là nơi sinh ra cácthé bình Thể bình có một tầng hoặc hai tang Các bào tử đính được tạo thành nốitiếp nhau trong miệng thé bình thành chuỗi hướng gốc, không phân nhánh (bào tử ởngay miệng thé bình là bào tử non nhất, càng xa miệng thé bình là bào tử càng già).Bào tử đính hình cầu, thường det, đường kính 4 + 5 wm, nhưng thường nhỏ hơn.Loài A niger được phân biệt với các loài khác trong chi Aspergillus bởi khối bào tửđính màu den [11]

1.4 Tổng quan về chitosan và nano chitosan1.4.1 Tổng quan về chitosan

Chitosan, một polymer sinh học được sản xuất từ chitin là thành phần có trongvỏ các loài giáp sát, côn trùng, và là thành phần tham gia cấu tạo thành tế bào ở mộtsố loài nam [17]

Chitosan được tạo thành từ phản ứng deacetyl hóa chitin bằng phương pháphóa học hoặc phương pháp enzyme.

Crustaceans Fungi Insects

CH, CH;

CO CoO

NH CH:0H Vv NH a ersOL HO- + —mo HO ,

Hình 1 2: Cấu tạo hóa học của chitin và chitosan

Hoạt tính sinh học, độ tinh khiết, và khối lượng phân tử của chế phẩmchitosan được tạo thành phụ thuộc vào nguồn gốc và phương pháp thực hiện phảnứng deacetyl hóa chitin Với chitosan thì tính chất hóa lý chủ yếu quyết định đếnthuộc tính chức năng của nó chính là khối lượng phân tử và mức độ deacetyl hóa

[18]

Chitosan được xem là hợp chất sinh học rất ít hoặc không độc đối với conngười (LD50 = 16g/kg ở chuột), va là hợp chất sinh học có tính kháng virus, kháng

khuẩn, kháng nắm, và chồng oxy hóa [19]

1.4.2 Hoạt tinh va cơ chế kháng khuẩn của chitosanHoạt tính kháng khuẩn của chitosan rất khác nhau tùy thuộc vào mức độdeacetyl hóa, khối lượng phân tử, nông độ và thời gian phơi nhiễm [20] [21]

Hiệu quả kháng tốt nhất trên các loài vi khuẩn gram (-) như: Escherichia coli,Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium, Pseudomonas fluorescens VàVibrio parahaemolyticus, Co chế tác dụng chủ yêu là lên thành phan mang tế bào.Chitosan cũng cho hiệu quả ức chế trên các loài vi khuẩn gram CG) như:Staphylococcus aureus, Staphylococcus simulans, Listeria monocytogenes, Bacillusmegaterium, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus bulgaricus va Bacillus cereus.

[22]Ngoài ra chitosan còn cho hoạt tính khang ca trong thu nghi¢m in vitro va invive trên nhiều loài nam như : Ramularia cercosporelloides, Aspergillus niger,Aspergillus parasiticus, Alternaria alternata, Botrvtis cinerea,Colletrotichumsloeosporioides, Rhizopus stolonifer, Sclerotinia sclerotiorum,Nhizoctema solana, va Fusarium solani [17]

C6 nhiéu co ché giai thich cho hoat tinh khang khuan của chitosan được đưa ra,và nó hoạt động theo cơ chế nào còn thy thuộc vao đối tượng tác dung và tính chat

nhat và được công nhận rộng rãi nhật đó là hiệu qua ức chê có được là do sự tươngtac mạnh mẽ của các nhóm amino mang điện tích dương trên mach cua phân tirchitosan và các thành phân mang điện tích âm như các prolein, acid amin,

phospholipid trên màng té bào của nhiều loại nam và vi khuẩn [23] [24] Nhữngtương tác như vậy sẽ làm tốn thương và thay đổi tính thâm qua mang, dẫn đến sựgiải phóng các hợp chất nội bào như glucose và lactate dehydrogenase Sự nhạycảm của một số loài nam đối với chitosan phụ thuộc vào hàm lượng các acid béokhông no có trong thành tế bào của nó, và đây cũng là một trong những tiêu chi déphan loại các loài nắm là nhạy cam với chitosan (hàm lượng acid béo cao) haykháng lat chitosan Cham hượng acid béo thấp) |251126]

Chitosan giúp tao ra một lop mang bao vệ bền ngoài, làm giảm cường độ hôhap của qua, hạn chế sự thoát hơi nước, giúp quả giữ được chất lượng lâu hơn trongquá trình báo quản [27] [28]

Một trong những cơ chế tác động của chưosan là sự tương tác vớt các thànhphần kim loại cần cho sự phát triển của nam và vi khuẩn như Cu, Fe, Mg thongqua các nhóm amino va các nhóm hydroxyl trên phân tử chitosan, đặc biệt là sựtương tác tại vỊ trí carbon số 3 trên mạch siucosamine Cơ chế tác dụng này phụthuộc vào mức độ deacetyl hóa của chitosan, loại kim loại va pH của dung dich [29]

Một cơ chế tác độn g quan trọng nữa là tương tác giữa chitosan với DNA, điềunày xảy ra khi các chitosan phân tử lượng thấp xâm nhập vào té bao, tương tác nàysẽ ức chê quá trình phiên mã các RNA và quá trình sinh tông hợp protein [30]

Chitosan còn có hoạt tính kích hoạt cơ chế phòng vệ của thành tế bào thực vậtthông qua sự tăng cường sản xuất phytoalexins, protease inhibitor, lignin, các hợpchat phenol (acid ferulic, acid salicylic, acid p-coumaric) và các enyme phòng vệnhư chitinase, chitosanase, ølucanase va phenylalanine ammoni-lyase Hoạt tinhkhang khuẩn của nano chitosan thay đổi phụ thuộc vào khối lượng phân tử, nông do,mức độ deacetyl hóa, thay đối theo từng loài vi sinh vật cũng như theo thời gian tiếpxúc khác nhau [31]

1.4.3 Hoạt tính kháng khuẩn của nano chitosanNano chitosan được tạo thành từ các phương pháp khác nhau hay từ các loạichitosan có khối lượng phân tử và mức độ deacetyl hóa khác nhau sẽ có những kíchthước va khả năng ứng dụng khác [32]

Hoạt tính kháng khuẩn của micro và nano chitosan đã được ứng dụng trongngành dược phẩm nhiều năm qua, các kết quả nghiên cứu đã được thực hiện chỉ rarang kích thước nano càng nhỏ thì hiệu quả kháng khuẩn đối với Escherichia coli vàStaphylococcus aureus càng tăng lên do sự gia tăng diện tích tiếp xúc với màng tếbào, và xảy ra sự kết tụ trên bề mặt thành tế bào vi khuẩn [17]

Một số nhà nghiên cứu đã giải thích thêm sự gia tăng hoạt tính của nanochitosan so với chitosan là do khi các điện tích âm trên màng tế bảo tương tác vớinano chitosan làm thay đổi tính thấm của màng, lúc này vừa xảy ra sự rò rỉ cácthành phan nội bào vừa có sự xâm nhập mạnh mẽ cua nano chitosan vào bên trongtế bào do có kích thước nhỏ, quá trình này sẽ làm cho tế bào chết nhanh hơn

Cơ chế của sự kháng khuẩn còn được giải thích là do nano chitosan tạo ra cácđộc chất đối với tế bào thông qua quá trình oxy hóa chất béo làm hủy hoại các thànhphân trong tế bào như carbohydrate, protein và DNA [33]

Nano chitosan còn đóng vai trò như một chất tạo phức, là chất liên kết cóchọn lọc với các kim loại vết, làm ảnh hưởng đến hoạt động một SỐ enzyme trong tébao do đó ức chế sự tăng trưởng của vi sinh vật

Nanno chitosan kích hoạt một số phản ứng phòng vệ trong mô vật chủ déchống lại các tác nhân gây bệnh từ bên ngoài môi trường bằng việc kích ứng chohoạt động san sinh các enzyme bảo vệ như chitinase, chitosanase, glucanase vaphenylalanine ammonia-lyase Đồng thời làm tăng việc tổng hợp các hợp chất.phytoalexin, chất ức chế protease và lignin, các hợp chất phenolic (axit ferulic, axítsalicylic, axit p-coumaric) là các thành phan quan trong trong hoạt động bảo vệ vậtchủ trước sự xâm nhập của các tế bào gây bệnh [34]

1.4.4 Độc tinh cua chitosanNhiều nghiên cứu đã chỉ ra rang mức độc tinh của nano chitosan năm tronggiới hạn cho phép để ứng dụng trong hóa sinh học [4]

Trong nghiên cứu cua Hirano và cộng sự năm 1990 cũng như trong mộtnghiên cứu khác của Li và cộng sự năm 1992 đã kết luận là chitosan là hợp chấtthích ứng sinh học, là hợp chất không sinh kháng nguyên, không độc và có hoạt tínhsinh học [35] [36]

Chitosan đã được công nhận an toàn và được sử dụng như một loại phụ gia tạiNhật Bản năm 1983 và tại Hàn Quốc năm 1995, [37]

1.4.5 Các phương pháp tao nano chitosan1.4.5.1 Phuong pháp khadu mach nhũ tươngHỗn hợp nhũ tương nước trong dau (w/o) được tao ra bang cách phân tán dung

dịch chitosan trong dầu Những giọt lỏng được làm bên bởi chất hoạt động bé mat

Dung dich nhũ tương sau đó được khâu mach băng tác nhân tạo nối thích hợp nhưglutaraldehyde Hai nhóm —CHO của glutaraldehyde sẽ phan ứng với nhóm —NH2của chitosan dé khâu mạch tạo hat nano chitosan

Dung dich chitosan | | Pha dau (V lon)

_ #Nitti tương (w:o)

Tac nhan tao noi |

Hình 1.3: So đỗ tạo nano chitosan bằng phương pháp khâu mạch nhũ tương

1.4.5.2 Phương pháp kết tủaPhương pháp nay sử dụng tính chất của chitosan là không tan trong dung dichkiềm Bởi vậy, chitosan sẽ bị kết tủa, tạo giọt ngay khi dung dich chitosan tiếp xúcvới dung dịch kiểm Dung dịch kiểm có thể là NaOH, NaOH-metanol hoặcethandiamine Dung dich chitosan sẽ được một thiét bi nén phun vao dung dichkiém dé tao hat nano.

| Thiet bi

nen phun

Dung dich kiếmHình 1 4: Sơ đồ tạo nano chitosan băng phương pháp kết tủa1.4.5.3 Phương pháp hợp giọt nHĩ tương

Phương pháp này lần đầu được sử dụng vào năm 1999 Phương pháp này sửdụng nguyên tắc của cả hai phương pháp: tạo nối ngang nhũ tương và kết tủa Thayvì sử dụng tác nhân tạo nối ngang, kết tủa tạo ra bang cách cho các giọt chitosan kếthợp với các giọt NaOH Một hệ nhũ tương bền chứa dung dịch chitosan cùng vớithuốc tạo ra trong paraffin lỏng Đồng thời, một hệ nhũ tương bền khác chứa dungNaOH cũng được tạo ra theo cách như trên Khi cả hai hệ nhũ tương này được trộnlại với tôc độ khuây cao, các giọt từ môi hệ sẽ va chạm một cách ngâu nhiên, hợplại và kết tủa thành những hạt nhỏ

Khuay toc do cao

Tao hat nano clutosan

Dung địch polyamon

17

* Khuay toc do cao

> Dung dich chitosan

| o

“———* Hat nano chitosan

Hình 1.6: Sơ đồ tạo nano chitosan băng phương pháp tạo gel ion1.4.5.5 Phương pháp mixen đảo

Trong phương pháp này, người ta hòa tan chất hoạt động bề mặt vào dung môihữu cơ để tạo ra những hạt mixen đảo Dung dịch lỏng chứa chitosan và thuốc đượcthêm từ từ với tốc độ khuấy không đổi dé tránh làm đục dung dịch Pha lỏng đượcgiữ sao cho hỗn hợp trở thành pha vi nhũ trong suốt Sau đó tác nhân tạo nối ngangduoc thêm vào va khuấy qua đêm Cô quay loại dung mỗi Phần còn lại phân tán lạitrong nước Dung dich muối thích hợp được thêm vao để kết tủa chất hoạt động bémặt Hỗn hợp được ly tâm Phần dung dịch ở trên chứa hạt nano mang thuốc đượcchiết ra, cho qua màng thấm tách 1 giờ Đông cô chất lỏng thu được cho ta bộtthuốc

PK cai em -TDEC-CGHA Hav hỏi

> `#: : a = =| chitosan, thuộc | -= sere | ==! đưngmôi

@ Hat nano_„¿ Chat hoat

Năm 2012, Zengxin Ma và cộng sự thực hiện nghiên cứu đánh giá khả năngkháng bệnh đốm nâu của chitosan trên quả đào và thu được kết quả là cả chitosanvà oligochitosan đều có hiệu quả trong việc giảm thiểu tỉ lệ bệnh đốm nâu trên quảđào đồng thời làm tăng tính kích kháng của các enzyme chống oxy hóa như catalase,peroxidase, J-1 ,3-glucanase và chitinase khi dùng ở nông độ 0,5 hay 5 g/L [38]

Trong một nghiên cứu của mình được công bố năm 2013, Asgar Ali và cộngsự đã kết luận là hạt nano chitosan có kích thước 600 nm nông độ 1% có hiệu quảtrong việc kiểm soát bệnh thán thư trên quả thanh long, giúp kéo dài thời gian bảoquản 28 ngày ở điều kiện nhiệt độ 10 + 2 °C, độ âm là 80 + 5% (hiệu quả hơn 200nm và 1000 nm) [2]

Cũng trong một nghiên cứu khác cua Asgar Ali năm 2010, ông đã thu đượckết quả là chitosan giúp hạn chế sự thất thoát khối lượng, duy trì câu trúc cũng nhưtính chất cảm quan của quả đu đủ sau 5 tuần bảo quản ở 12°C, độ âm 85 — 90% [39]

Cũng trong năm 2012, một nghiên cứu về hoạt tính kháng nắm của chitosandưới dạng nano được công bố bởi N.Zahid và cộng sự Nhóm nghiên cứu đã thựchiện khảo sát kha năng kháng nam của nano chitosan ở 3 kích thước hat nano khácnhau là 200nm, 600nm, và 1000nm lên đối tượng là nấm Colletotrichum

gloeosporioides phân lập được từ quả thanh long Kết qua thu được là nano chitosancó kích thước hạt 600nm cho hiệu quả ức chế tốt hơn so với các kích thước còn lạicũng như khi so với chitosan dạng bình thường [40]

Cũng trong năm 2012 này, N.Zahid và một nhóm đồng sự khác đã thực hiệnnghiên cứu đánh giá hiệu qua của nano chitosan so với chitosan thông thường trongviệc kháng lại các tác nhân nắm mốc gây bệnh trên các loại quả là đu đủ, chuối vàthanh long Kết quả một lần nữa khang định là nano chitosan cho hiệu quả khángnam tốt hon, cùng với đó nghiên cứu cũng cho thay là nano chitosan kích thước 200nm cho hiệu quả tốt nhất trên chuối, nhưng đối với Thanh long thì là 600 nm [41]

Năm 2012, N Zahid và cộng sự cũng đã công bố một nghiên cứu cho thấyrang chitosan sử dụng ở nông độ lớn hơn 1,5% có gây ra những ảnh hưởng xấu đếnchất lượng của trái cây [40]

Aspergillus niger và Colletotrichum gloeosporioides là 2 trong số các nammốc chính gây hư hỏng quả thanh long [42]

Cũng trong năm 2012, một đề tài nghiên cứu của Ling Yien Ing và cộng sự đãcho ra kết quả là chủng nam mốc Aspergillus niger chỉ bi ức chế bởi nano chitosanđược tạo thành từ chitosan có khối lượng phân tử cao là 310 kDa, mà không bị ứcchế bởi nano chitosan được chuẩn bị từ chitosan có khối lượng phân tử thấp là 70kDa [43]

Năm 2006, T.T Hoa và cộng sự đã công bố kết quả nghiên cứu về phươngpháp xử lý hơi nước nóng trên thanh long cho kết quả là phương pháp xử lý hơinước nóng có thể giúp kéo dài thời gian bảo quản thanh long lên 4 tuân ở nhiệt đô5 [5]

Thanh long bảo quản băng chế phẩm nắm men đối kháng Candida sake L1.5.4kết hợp với màng bao ăn được CT27 cải tiến ở điều kiện nhiệt độ lạnh 8 — 10°Cđược 30 ngày [42]

Năm 2011, Dương Thị Ánh Tuyết và cộng sự đã nghiên cứu chế tạo nanochitosan băng phương pháp tao gel ion làm chất hấp phụ protein ứng dung trongdẫn truyền thuốc Kết quả cho thấy với tỷ lệ chitosan/STPP là 6:1 tại pH 4 cho chếphẩm nano chitosan có kích thước nhỏ nhất 48/70 nm Sử dụng chế phẩm này làm

chất hap phụ protein cho thay khả năng hấp phụ cao 96,41 % (1,93 mg/mg) tại 0,5mg hạt nano chitosan |44|

Năm 2011 Nguyễn Anh Dũng và cộng sự đã thực hiện thành công ở quy môphòng thí nghiệm quy trình tao hat nano chitosan, sản phẩm hat nano chitosan cókích thước trung bình từ 80 — 106 nm Hat nano chitosan này được sử dụng làm tádược hấp phụ chất kích thích miễn dịch cho vaccin cúm A/HINI Theo NguyễnAnh Dũng nghiên cứu cho thay, hạt nano chitosan giúp gia tăng kha năng đáp ứngmiễn dịch, khả năng hình thành kháng thé đặc hiệu với kháng nguyên cúm A/HINIkhi được thí nghiệm trên chuột [45]

Trong lĩnh vực kháng khuẩn, mới đây La Thị Kim Ngân và cộng sự đã côngbố kết quả sử dung nano chitosan tạo ra bằng phương pháp say phun với kích thướchạt 95,5 — 395 nm và điện thé zeta là 39,3 - 45,7 mV ứng dung khángStaphylococcus aureus Két quả nghiên cứu cũng cho thay nano chitosan ức chếmạnh mẽ sự phát triển của S.aureus, nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) ở mức 201g/mL thấp hơn rất nhiều so với chitosan thông thường hoặc thuốc kháng sinhamoxicillin [46]

Vào năm 2008, Marisa thực hiện dé tài nghiên cứu ảnh hưởng của phươngpháp chiếu xạ đến chất lượng của quả thanh long sau 12 ngày bảo quản ở 10°C Kếtquả cho thấy hàm lượng chất khô hòa tan, hàm lượng acid cũng như hàm lượngđường fructose không bi ảnh hưởng nhiễu, trong khi đó hàm lượng glucose, sucrosevà hàm lượng đường tổng giảm theo sự gia tăng liều chiếu xạ từ 0, 200, 400, 600 và800 Gy [47]

CHUONG 2: NGUYEN LIEU VA PHUONG PHAP NGHIEN CUU

2.1 Đối tượng nghiên cứu2.1.1 Nguyên liệu thanh long

Đặc điểm thanh long Bình Thuận:Quả hơi tròn, cudng quả dài, cứngVỏ quả dày

Ti lệ thịt qua: 68 — 72%Thịt quả chắc, ngọtNong độ chất khô 11 — 12%pH: 48-5

Quả thanh long được thu hoạch ở thời điểm 30 ngày kế từ sau khi nở hoa.Khối lượng quả trung bình: 540 — 650 g

2.1.2 Nguyên liệu chitosan

Chitosan sử dụng ở dạng bột mịn, có nguôn goc từ vỏ tôm, được sản xuât bởiCông ty TNHH Hùng Tiến, với các thông số kỹ thuật sau:

Khối lượng phân tử: 57/7 kDaMức độ deacetyl hóa: 97,2 %Màu sắc: màu vàng nhạtNgoại quan: dạng bột mịnTính tan: Khôn tan trong nước, tan trong dung dịch acid loãng tạo thànhdung dịch keo trong suốt màu vàng

Độ âm: 11%2.1.3 Nam mốc Aspergillus niger

Ching nam mốc A.niger dùng trong thí nghiệm có nguồn gốc từ Trung tâmnghiên cứu và phát triển nông nghiệp công nghệ cao Thành phố Hỗ Chí Minh

2.2 Phương pháp nghiên cứu2.2.1 So đồ tiến trình nghiên cứu

Í Xác định ngưỡng gây bệnh trên )

L thanh long của nam A.niger ]

*

Xác định khả năng ức chế củanano chitosan lên sự phát triểncủa nam A.niger trong điều

% Tiến hànhA.niger được nuôi cay trên môi trường PDA, thu bào tử và pha loãng thành các

nồng độ: 10” bào tit/mL, 10° bào tử/mL,, 10° bào tit/mL, 10* bào tử/mL, 10° bào

tu/mL.- Thanh long > rửa sạch bang nước > lau sạch bên ngoài quả bang cồn 70°

> rửa lại bằng nước cat.- Lay 5 vết bệnh giống nhau trên mỗi quả, 3 quả cho một nông độ Tạo vết

thương trên quả bang dao nhọn với độ sâu và rộng là Imm> cay 10 jul bàotử ở các nông độ vào mỗi vết thương > để khô tự nhiên

- Pat mẫu quả vào khay nhựa đã được sát trùng băng cồn 70”, sau đó ủ mẫu ởnhiệt độ phòng và tiễn hành theo dõi thời gian hình thành vết bệnh và tỉ lệbệnh ở các công thức.

s* Cac chỉ tiêu theo dõi

- Thoi gian hình thành vết bệnh (h)- Theo dõi tỷ lệ bệnh ở các công thức Ty lệ bệnh được tính theo công thức

sau:

Trong đó:

+ TLB: tỉ lệ bệnh (%)+ Vb: tổng số vết bệnh hình thành+ Ve: tong số vết thương nhân tao

2.2.2.2 Thí nghiệm xác định khả năng ức chế của nano chitosan lên sự pháttriển của nam A.niger trong điều kiện in vitro

s* Nguyên tacBào tử nam A.niger sẽ được cay lên trên các đĩa môi trường PDA có bổ sungnano chitosan ở các nồng độ khác nhau Theo dõi khả năng phát triển của chúngthông qua thời gian nảy mam và tốc độ phát triển đường kính tản nam Ở nông độ

mà thời gian nảy mâm càng chậm và đường kính tan nam càng nhỏ thi kha năng ứcchê càng cao.

>,x.% Tiến hành

Tiến hành khảo sát kha năng ức chế A.niger của nano chitosan ở 3 kích thướclà: 42 nm, 157 nm, 241 nm được tạo thành theo phụ lục A.2

Cay 10wl bào tử nam theo công thức thu được từ thí nghiệm xác địnhngưỡng gây bệnh vào giữa đĩa petri đã chuẩn bị sẵn

U dia nam đã cay ở 30C, tiến hành theo dõi tốc độ phát triển của tản nam,tiền hành đo kích thước 1 lần/ngày băng thước kẹp

Thí nghiệm được bé trí trên đĩa petri với 21 công thức, lặp lại 3 lần trên môitrường PDA Các đĩa môi trường PDA được bổ sung nano chitosan theo 21 côngthức như trong bang 2.1

Bảng 2 1: Bồ trí thí nghiệm xác định khả năng kháng nam A.niger của nano

chitosan trong điêu kiện in vitroNông độ nano

chitosan

0.02% L0.04% 410.06% |0.08% |0.10% |0.12% 10.14%

Kích thước hạt42 nm CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 CT6 CT7

157 nm CT8 CT9 CT10 | CT11 | CT12 | CT13 |CT14241 nm CT15 |CT16 | CT 17 |CT18 |CTI9 |CT20 | CT 21

>,x.%Các chỉ tiéu theo doi

Thời gian nảy mam (h)Đường kính tan nam (mm)Xác định hiệu lực ức chế được tinh theo ty lệ phan trăm (%) ức chế tốc độphát triển của đường kính tản nam, PIRG (%) (Percentage Inhibition ofRadial Growth).

2

0

aq 100 (%)

PIRG (%) =

Trong đó:

R¡: đường kính tan nam ở công thức đối chứng (mm)Ra: đường kính tản nắm ở công thức thí nghiệm (mm)2.2.2.3 Khảo sát kha năng kháng nắm A.niger của nano chitosan trong điềukiện in vivo trên qua thanh long

s* Nguyên tacTiến hành tạo vết thương nhân tạo trên quả thanh long, sau đó thực hiện việcphủ màng nano chitosan ở các công thức khác nhau rồi lây bệnh nhân tạo bằng bàotử nắm A.niger và theo dõi sự phát triển của bệnh Ở công thức mà số vết bệnh tạothành càng ít, đường kính bệnh càng nhỏ thì hiệu quả kháng nam càng cao

“> Tiến hànhKích thước nano chitosan thu được từ thí nghiệm in vitro là: 42 nmThí nghiệm được bố trí theo các thông số trong bang 2.2

Bang 2 2: Bồ trí công thức thí nghiệm in vivo

Nông độ dung dịch 0% | 0.06% | 0.08% | 0.10% | 0.12% | 0.14%

nano chitosanCông thức ĐC | CTI CT2 CT 3 CT4 CT5- Thanh long > rửa sạch bằng nước > để khô > lau sạch bên ngoài quả bang

cồn 70” > rửa lại bằng nước cất > để quả khô tự nhiên

- Nong độ bào tử cấy lên các vết thương là 10° (bào tử/mL)

- Sau khi qua đã khô, sử dung dao nhọn để tạo vết thương nhân tạo trên quathanh long với độ sâu và rộng là Imm, mỗi quả lây 5 vết bệnh, 3 quả chomột nông độ

- _ Tiến hành tạo màng bao trên bé mặt quả băng cách nhúng quả vào dung dichnano chitosan theo các công thức đã bồ trí, sau đó dé khô tự nhiên

- Cây 10 pl bào tử nam đã chuẩn bị ở trên cho vào các vết thương đã tạo.- Cho các mẫu quả vào rô nhựa được lót giay vô trùng, tiến hành ủ bệnh ở

nhiệt độ phòng Sau khi vết bệnh bắt đầu hình thành, tiến hành đo đường

kính vết bệnh hăng ngày bang thước và xác định mức độ phát triển bệnh ởcác công thức thí nghiệm.

s* Các chỉ tiêu theo dõi

- Thoi gian hình thành vết bệnh (h)- _ Đường kính các vết bệnh (mm)- Theo dõi tỷ lệ bệnh ở các công thức

Ty lệ bệnh được tính theo công thức:

Ve °Trong đó:

+ TLB: tỉ lệ bệnh (%)+ Vb: tổng số vết bệnh hình thành+ Ve: tong số vết thương nhân tao

2.2.2.4 Khảo sát hiệu quả bảo quản thanh long ở điều kiện 15°C kết hợp với

màng bao nano chitosanThí nghiệm được thực hiện đồng thời trên mẫu có nhúng nano chitosan vamẫu đối chứng không nhúng nano chitosan rồi so sánh các kết qua thu được

% Cách tiễn hànhThanh long > rửa sạch bằng nước > dé khô tự nhiên nhúng quả vào dungdịch nano chitosan trong 2 phút > để khô tự nhiên > bảo quản trong r6 nhựa có lótgiấy vô trùng ở nhiệt độ 15°C, độ âm 85% Theo dõi trong thời gian 35 ngày

s* Các chỉ tiéu theo dõi

a Hao hụt khối lượng tự nhiênKhối lượng quả trước và sau thời gian bảo quản sẽ được xác định băng cânphân tích Số lượng mẫu dùng để theo sối khối lượng là 5 quả cho mỗi công thức.Tiến hành cân xác định khối lượng sau mỗi 7 ngày bảo quản

Hao hụt khối lượng tự nhiên sẽ được tính bang công thức: