Những vấn đề như trên sẽ có thể được giải quyết bằng cách sử dụng enzyme lactase phân giải lactose trong sữa và những sản phẩm từ sữa thành glucose và galactose mà cơ thể có thể hấp thụ
TỔNG QUAN
LACTASE
Lactase là tên gọi thông thường của -D-galactosidase (-D-galactoside galactohydrolase, EC 3.2.1.23) có khả năng thủy phân lactose thành các đường đơn galactose và glucose (Gekas V, López-Leiva M; 1985) Ngoài ra, lactase còn có khả năng xúc tác phản ứng transglycosyl tạo galacto-oligosaccharides (Prenosil J.E và cộng sự, 1987)
Lactase thủy phân các liên kết O-glycosyl tại các phần glycone của cơ chất (hình 1.1) Một số tác động có thể làm thay đổi hoạt tính của enzyme như sự thay thế nhóm hydroxylmethyl trên carbon số 6 bởi nhóm methyl hoặc một nguyên tử hydro
Kết quả làm cho enzyme này có hoạt tính trên -L-arabinoside và
-D-fucoside Ngoài ra, lactase có thể bị mất hoạt tính nếu cơ chất bị methyl hóa ở carbon số 2, 3, 4, hoặc 6; mất cấu trúc vòng pyranose; hoặc cấu hình thay đổi từ β sang α Khi thay thế oxy bằng lưu huỳnh cũng làm enzyme mất hoạt tính nhưng không mất liên kết ái lực
Hình 1.1: Sự thủy phân lactose bằng lactase
Hoạt tính của lactase ở người giảm sau khi cai sữa, và điều này làm cho một số người giảm khả năng tiêu thụ lactose Vì vậy, lactase đã được ứng dụng trong ngành
3 dược nhằm hỗ trợ quá trình tiêu hóa lactose và ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm sản xuất sữa và những sản phẩm từ sữa nghèo lactose
Lactase thủy phân lactose theo hai cơ chế [5,9]:
Thủy phân lactose tạo thành glucose và galactose:
Sử dụng enzyme thủy phân lactose là một trong những kỹ thuật sinh học quan trọng nhất trong công nghiệp thực phẩm
Năm 1994, Jacobson đã sử dụng enzyme lactase từ Escherichia coli để nghiên cứu cơ chế thủy phân lactose thành glucose và galactose Trung tâm hoạt động của lactase được giả định có chứa cysteine và histidine thực hiện chức năng cho và nhận proton tương ứng Cysteine với nhóm sulfhydryl đóng vai trò nhóm cho proton, trong khi histidine với vòng imidazole đóng vai trò tâm ái nhân thuận lợi cho sự phân cắt liên kết glycoside trong quá trình thủy phân liên kết β-glycoside của lactose (Mahoney 1998, Zhow and Chen 2001).
Enzym lactase có khả năng thủy phân lactose thành glucose và galactose, đem lại ứng dụng quan trọng trong công nghiệp thực phẩm, đặc biệt là trong sản xuất sữa và các chế phẩm từ sữa.
Hình 1.2: Cơ chế thủy phân lactose bởi lactase (© Dr Noel Sturm 2003)
Phản ứng chuyển nhóm galactosyl tạo oligosaccharide
Trong quá trình thủy phân lactose, enzyme lactase còn có khả năng gắn nhóm glactosyl vào các phân tử đường, kết quả tạo ra những phân tử oligosaccharide Nguồn β-linkage
4 thu nhận enzyme, bản chất enzyme và nồng độ cơ chất sẽ quyết định số lượng cũng như bản chất oligosaccharide hình thành thông qua phản ứng chuyển nhóm galactosyl
Nồng độ cơ chất cao và lượng nước sử dụng ít hơn sẽ tăng hiệu suất tạo oligosaccharide Mặc dù cơ chế phản ứng này chưa được hiểu rõ ràng, nhưng có thể liên quan đến sự chuyển đổi liên kết galactose 1,4 thành liên kết 1,6.
Các phân tử oligosaccharide có mặt trong thực phẩm có nhiều tác động có lợi đến sức khỏe người tiêu dùng Các phân tử oligosaccharide sẽ thúc đẩy sự phát triển và tập hợp vi khuẩn có lợi (Hsu và cộng sự 2005) Hơn thế nữa, oligosaccharide còn có khả năng giảm hàm lượng cholesterol trong máu, thúc đẩy việc hấp thụ calci trong thức ăn và thúc đẩy tổng hợp các vitamin nhóm B (Onishi và cộng sự 1995)
Hình 1.3: Phản ứng chuyển galactosyl xúc tác bởi lactase
Bảng 1.1: Cấu trúc của một số oligosaccharide được tạo thành với xúc tác của lactase trên cơ chất lactose (Nguồn: Mahoney 1998)
Disaccharide β-D-Gal (16)-D-Glc Allolactose β-D-Gal (16)-D-Gal Galactobiose β-D-Gal (13)-D-Glc β-D-Gal (12)-D-Glc β-D-Gal (13)-D-Gal
Trisaccharides β-D-Gal (16)-β-D-Gal (16)-D-Glc 6’ digalactosyl-glucose β-D-Gal (16)-β-D-Gal (14)-D-Glc 6’ galactosyl-lactose β-D-Gal (16)-β-D-Gal (16)-D-Gal 6’ galactotriose β-D-Gal (13)-β-D-Gal (14)-D-Glc 3’ galactosyl-lactose β-D-Gal (14)-β-D-Gal (14)-D-Glc 4’ galactosyl-lactose
Pentasaccharide β-D-Gal (16)-β-D-Gal (16)-β-D-Gal 6’ trigalactosyl-lactose
Lactase được phân bố rộng rãi trong tự nhiên do có nhiều chức năng như vai trò chức năng của nó như vai trò trong tiêu hóa, thoái hóa lysosomal, vai trò trong quá trình dị hóa Tuy nhiên, lactase được tìm thấy phổ biến ở thực vật, ruột động vật có vú và ở các vi sinh vật như nấm mốc, nấm men và vi khuẩn
Nguồn từ động thực vật:
Enzyme lactase được tìm thấy nhiều trong mô thực vật, có vai trò nhất định liên quan đến quá trình sinh học như tăng trưởng của cây, chín trái và thủy phân lactose
Những nghiên cứu sinh học phân tử đã làm sáng tỏ vai trò của lactase đối với sự sinh trưởng của cây và chín trái Lactase có vai trò quan trọng đối với quá trình chín của trái hồng vì làm giảm đáng kể nồng độ galactosyl trong vách tế bào và thủy phân liên kết với pectin Enzyme lactase từ đu đủ thủy phân vách tế bào và làm mềm trái trong suốt quá trình chín (Lazan và cộng sự, 2004) Hầu như pH tối ưu cho enzyme lactase từ thực vật nằm ở khoảng pH acid Enzyme lactase tách từ quả hạnh có pH tối ưu 5,5, nhiệt độ tối ưu 50 0 C, duy trì được 89% hoạt tính sau 2 tháng lưu giữ ở 4 o C Ở động vật hữu nhũ, enzyme lactase nằm trong đường tiêu hóa, đặc biệt nhiều ở những động vật mới sinh ra (Husain, 2010)
Nguồn gốc từ vi sinh vật:
Enzyme cellulase trong ruột ở vị trí vi nhung mao của tế bào nhầy, thuộc nhóm enzyme nội bào trong vi khuẩn và nấm men Enzyme này có thể là nội bào hoặc ngoại bào trong nấm sợi.
Bảng 1.2: Nguồn lactase từ vi sinh vật (Panesar và cộng sự, 2010)
Nguồn gốc Vi sinh vật
Alicyclobacillus acidocaldarius subsp rittmannii Arthrobacter sp
Bacillus acidocaldarius, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus subtilis, Bacillus megaterum, Bacillus stearothermophilus
Bacteriodes polypragmatus Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis Clostridium acetobutylicum,
Clostridium thermosulfurogens Corynebacterium murisepticum Enterobacter agglomerans, E cloaceae Escherichia coli
Klebsiella pneumoniae L acidophilus, L.bulgaricus, L helviticus, L kefiranofaciens, L lactis, L sporogenes, L themophilus, L delbrueckii
Leuconostoc citrovorum Pediococcus acidilacti, Pediococcus pento
Propioionibacterium shermanii Pseudomonas fluorescens Pseudoalteromonas haloplanktis Streptococcus cremoris, Streptococcus lactis, Streptococcus thermophius
Thermus rubus, Thermus aquaticus Trichoderma reesei
Nấm mốc Alternaria alternate, Alternaria palmi
Aspergillus foelidis, Aspergillus fonsecaeus, Aspergillus fonsecaeus, Aspergillus carbonarius, Aspergillus oryzae
Auerobasidium pullulans Curvularia inaequalis Fusarium monilliforme, Fusarium oxysporum Mucor meihei, Muco pusillus
Neurospora crassa Penicillum canescens, Penicillum chrysogenum, Penicillumexpansum Saccharopolyspora rectivergula
Bullera singularis Candida pseudotropicalis Saccharomyces anamensis, Saccharomyces lactis, Saccharomyces fragilis
Kluyveromyces bulgaricus, K fragilis, K lactis, K marxianus
Lactase thu từ các nguồn khác nhau có đặc tính và cấu trúc riêng (trọng lượng phân tử, chiều dài chuỗi amino acid, vị trí các trung tâm hoạt động, pH và nhiệt độ hoạt động tối ưu (bảng 1.5)) Lựa chọn nguồn lactase phù hợp phụ thuộc vào điều kiện phản ứng thủy phân lactose Enzyme thương mại thường có pH acid (pH tối ưu < 5) sử dụng trong xử lý chế biến whey chua, hoặc pH trung tính (pH tối ưu 5,5–7,0) sử dụng trong sữa hay whey ngọt Hoạt tính của các lactase phụ thuộc sự hiện diện của các ion
LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS
Theo khóa phân loại của Bergey thì L acidophilus thuộc:
Đặc điểm sinh học chung của vi khuẩn hình que Gram dương là chúng có hình dạng đơn lẻ, tạo thành đôi hoặc thành chuỗi ngắn, với chiều rộng khoảng 0,6 - 0,9 micromet và chiều dài khoảng 1,5 - 6 micromet Chúng không có tiêm mao, không di động, không sinh bào tử và không chịu được nồng độ muối cao.
Hình 1.5: Hình ảnh vi khuẩn Lactobacillus acidophilus (Sciencephotolibrary)
Vi sinh vật không chứa cytochrome nên không phản ứng với benzen Thêm vào đó, vì là vi sinh vật vi hiếu khi, nên sự sinh trưởng trên bề mặt môi trường rắn được gia tăng bằng cách giảm lượng không khí hoặc giảm áp suất oxy và tăng 5 – 10% CO2
Bảng 1.6: Tính chất sinh lý và hóa lý của Lactobacillus acidophilus (Kurmann và
Sinh lý Thành phần thành tế bào
Vi hiếu khí Loại Peptidoglycan Lys-D Asp
Thành phần phospholipid / teichoic acid Glycerol
Thành phần base của DNA (mol % G+C) 34 – 37 Đồng phân acid lactic DL
Chuyển hóa đường Lên men đồng hình
Hầu hết các giống của L acidophilus có thể lên men amygdalin, cellobiose, fructose, galactose, glucose, lactose, maltose, mannose, salicin, sucrose, trehalose và aesculine Thực tế, lactose là loại đường duy nhất có mặt trong sữa, hiện vẫn chưa có báo cáo về việc L acidophilus sử dụng sucrose hiệu quả hơn lactose hay không Hơn
13 thế nữa, glucose và fructose có thể được L acidophilus sử dụng, ngược lại galactose thì mức độ sử dụng không rõ rệt Glucose có thể được chuyển hóa theo con đường
Embden-Meyerhof-Parnas và acid lactic là sản phẩm chính của quá trình (lên men đồng hình) Hiệu suất sản sinh acid lactic là 1,8mol/mol glucose, kèm theo một lượng nhỏ những cơ chất khác Acetaldehyde là sản phẩm từ quá trình chuyển hóa lactose, mặc dù trong một số ví dụ thì nó được tạo ra từ quá trình chuyển hóa những cơ chất chứa nitrogen, như là threonine, hoạt tính threonin aldolase rất cao cũng được phát hiện ở L acidophilus Điều kiện sinh trưởng: Nhiệt độ tối ưu khoảng 35 – 40 o C, có khả năng chịu được nồng độ acid thay đổi từ 0,3% – 1,9%, pH tối ưu nằm khoảng 5,5 – 6 L acidophilus đòi hỏi điều kiện sinh trưởng phức tạp Để vi khuẩn L.acidophilus sinh trưởng và phát triển, môi trường cần cung cấp nguồn carbon, protein, vitamin B, dẫn xuất acid nucleic, acid béo tự do không bão hòa, nguồn khoáng (magie, mangan, sắt) và hàm lượng oxy thấp Ngoài ra, sự có mặt của các nhóm thiol trong whey protein có khả năng hỗ trợ sự sinh trưởng của L.acidophilus, ngược lại pepton và trypsin lại kích thích việc sản sinh acid Thêm nước ép cà chua (như nguồn đường đơn giản, khoáng, và vitamin B) vào sữa gầy để thúc đẩy sự gia tăng sinh trưởng và hoạt tính của L acidophilus (như cải thiện khả năng sử dụng đường và pH thấp hơn) Vì lẽ đó, những chất dinh dưỡng quan trọng này nên có mặt trong môi trường để tạo điều kiện sinh trưởng tốt nhất cho giống L acidophilus, trong những nghiên cứu gần đây về môi trường tối ưu của L acidophilus, Tail landier và cộng sự đã kết luận rằng điều kiện tối ưu là pH 6,0, 30 o C, 40 g/L glucose, 20 g/L peptone, 20 g/L dịch chiết nấm men, 5 g/L natri acetate và 3 g/L natri citrate
Những lợi ích khi sử dụng giống Lactobacillus acidophilus :
Giống lactobacilli thường được sử dụng trong công nghiệp như là những probiotic
Thủy phân lactose trong điều kiện ôn hòa, thích hợp sử dụng đối với những sản phẩm từ sữa
Không có hoặc ít gây ra phản ứng phụ
Đây là giống vi sinh vật an toàn khi sử dụng vì thế enzyme có nguồn từ chúng có thể sử dụng mà không cần quá tinh sạch (Vasiljevic and Jelen 2002)
Chúng có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh bằng cách sản sinh ra acid, hydro peroxide và bacteriocins (Chang và cộng sự 2001)
Có thể chịu được giá trị pH thấp (Vinderola and Reinheimer 2003).
PHƯƠNG PHÁP KẾT TỦA ENZYME
Kết tủa là phương pháp tách protein khỏi hỗn hợp quan trọng, ứng dụng nhiều trong nghiên cứu phòng thí nghiệm và sản xuất công nghiệp, đồng thời là tiền đề cho quá trình sắc ký hiệu quả Mục đích của kết tủa là làm giàu protein mục tiêu, cho phép tách chiết từ dung dịch thô có thể tích lớn sang dung dịch đệm thể tích nhỏ hơn Quá trình này dễ thực hiện ở quy mô lớn, thiết bị đơn giản, tiết kiệm chi phí và không gây biến tính sản phẩm sinh học Các tác nhân kết tủa phổ biến bao gồm muối như ammonium sulfate, polyme như polyehtylene glycol (PEG) hoặc dung môi hữu cơ ưa nước như acetone và ethanol.
Dựa trên khả năng kết tủa của các enzyme ở nồng độ muối khác nhau, người ta sử dụng (NH4)2SO4 để kết tủa phân đoạn enzyme Bằng cách này, người ta được một số protein tạp ở giai đoạn đầu của quá trình làm sạch enzyme Ngoài muối (NH4)2SO4 ra, người ta còn sử dụng một số dung môi hữu cơ để kết tủa enzyme Phương pháp kết tủa thường làm enzyme biến tính rất nhanh Vì thế, trước khi tiến hành kết tủa, người ta phải tiến hành làm lạnh các chất kết tủa và cả dung dịch enzyme
15 Các cơ chất kết tủa protein bao gồm những cation và anion vô cơ như: NH 4+ , K + , Na + , SO 4+ , PO 4+ , Cl - , Br - , NO 3- , ClO 4- , I - , SCN - (England and Seifer 1990; Shin và cộng sự 1992; Scopes 1994; Baldwin 1996)
Những dung môi hữu cơ dùng để kết tủa protein như là: ethanol, acetone, methanol, n-propanol (England and Seifer 1990; Scopes 1994)
1.1 Kết tủa protein enzyme bằng muối trung tính
Muối nồng độ cao có tác dụng với phân tử nước bao quanh protein enzyme và làm chuyển hóa điện tích, làm thay đổi tính hòa tan của enzyme
Nhiệt độ kết tủa có thể ở 35 – 40 o C, nhưng để tránh khả năng làm mất hoạt tính enzyme, người ta thường phải làm lạnh dung dịch muối và dung dịch enzyme trước khi trộn hai loại dung dịch này với nhau
Kết tủa bằng muối là phương pháp kết tủa protein phổ biến nhất Ở nồng độ muối thấp, độ hòa tan của protein thường tăng lên khá ít, không đáng kể (salting in)
Nhưng ở nồng độ muối cao, độ hòa tan của protein giảm rõ rệt (Salting out) và protein bị kết tủa
Hình 1.6: Hình biểu diễn độ hòa tan của protein vào nồng độ muối trung tính
Việc thêm nồng độ muối cao làm giảm lực đẩy điện tích giữa những nhóm tích điện cùng dấu trên bề mặt protein và phá vỡ lớp áo nước bao xung quanh phân tử cầu protein Các ion muối cạnh tranh với nước để bao quanh phân tử protein, kết cục, ở nồng độ muối cao phù hợp sẽ có khả năng phá vỡ lớp áo nước Khi đó dung dịch muối ái nước trở thành một dung môi hòa tan protein kém, làm cho protein bị kết tủa Số lượng điện tích và sự phân bố điện tích, các nhóm phân cực không ion hóa (nonionic polar groups), và những nhóm kỵ nước trên bề mặt protein xác định nồng độ muối cần thiết để làm kết tủa protein Kích thước và hình dạng protein cũng góp phần tạo nên tính chất kết tủa của protein Điều này làm cho những protein có tính chất cơ bản tương tự nhau sẽ kết tủa tương đối giống nhau trong hỗn hợp protein và đây là phương pháp kết tủa không đặc hiệu
Những muối có hiệu quả kết tủa cao thường là những đa anion như sulfate, phosphate, và citrate Còn đối với cation thì thường là những cation hóa trị một hay sử dụng như NH4 + > K + > Na + Bởi vì độ hòa tan cao ở khoảng nhiệt độ rộng 0 – 30 o C và tỷ trọng của dung dịch bão hòa thấp hơn (khi so sánh với những muối khác), nên ammonium sulfate thường được sử dụng hơn những loại muối khác
1.2 Kết tủa protein enzyme bằng dung môi hữu cơ:
Dung môi hữu cơ có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng hòa tan của enzyme, ảnh hưởng solvat hóa của phân tử nước xung quanh phân tử enzyme bị thay đổi, tương tác giữa các phân tử enzyme sẽ tăng lên
Khi tiến hành kết tủa enzyme bằng những dung môi hữu cơ cần hết sức lưu ý đến nhiệt độ, nên bắt buộc ta khi tiến hành kết tủa enzyme phải làm lạnh cả dung môi hữu cơ và dung dịch enzyme Mức độ nhạy cảm nhiệt độ của enzyme khi có mặt các dung môi hữu cơ thường mạnh hơn mức độ nhạy cảm của enzyme với nhiệt độ khi có mặt của muối vô cơ Người ta thường tiến hành kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ ở nhiệt độ từ 3 – 10 o C Tỷ lệ và nồng độ các dung môi hữu cơ dùng để kết tủa enzyme
17 được xác định bằng thực nghiệm cho từng loại enzyme và từng nồng độ enzyme có trong dung dịch enzyme
Kết tủa protein bằng dung môi hữu cơ đặc biệt quan trọng khi sử dụng ở quy mô công nghiệp (Curling 1980) Việc sử dụng dung môi hữu cơ ở quy mô phòng thí nghiệm có một ít nhược điểm, mặc dù cũng có một số ưu điểm so với phương pháp kết tủa bằng muối Những dung môi hữu cơ như ethanol hoặc acetone được thêm vào trong dung dịch chứa protein có những tác động khác nhau và kết quả dẫn đến protein bị kết tủa Tác động chủ yếu là làm giảm hoạt tính của nước Khi đó hằng số điện môi bị giảm khi thêm dung môi hữu cơ vào dẫn đến làm giảm năng lượng solvate hóa của nước để phân tử protein ái nước tích điện, và vì thế độ hòa tan của protein bị giảm và xảy ra quá trình kết tủa
Hai loại dụng môi được sử rộng rãi nhất là ethanol và acetone, bên cạnh đó một số dung môi khác như methanol, n-propanol, i-propanol và dioxane cũng hay được sử dụng
Yêu cầu về dung môi sử dụng phải hòa tan hoàn toàn trong nước, không phản ứng với protein, và có hiệu quả kết tủa tốt Nhiệt độ kết tủa yêu cầu phải giữ ở nhiệt độ thấp, nếu nhiệt độ cao thì protein sẽ bị biến tính khi có mặt dung môi Một ưu điểm rõ ràng khi kết tủa protein bằng dung môi đó là có thể thực hiện ở nhiệt độ âm, vì tất cả các hỗn hợp bởi dung môi và nước có điểm đông đặc dưới 0 o C Hầu hết protein bị kết tủa bởi acetone hoặc ethanol ở nồng độ khoảng 20 – 50% v/v Ở nồng độ dung môi 50% chỉ những protein phân tử lượng nhỏ hơn 15000 Da kết tủa trong dung dịch.
TINH SẠCH LACTASE BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ
Kỹ thuật sắc ký, trong đó kỹ thuật sắc ký loại trừ kích thước được dùng phổ biến trong tách chiết và tinh sạch protein enzyme Kỹ thuật loại trừ kích thước còn thường được gọi với những tên khác như sắc ký lọc gel (gel fitration chromatography) và sắc ký thẩm thấu gel (gel permeation chromatography), sắc ký gel, sắc ký loại trừ (Chi-san Wu, 2004) Cơ sở của kỹ thuật sắc ký loại trừ kích thước là dựa vào sự khác nhau nhau về kích thước, hình dạng và phân tử lượng của protein enzyme có trong hỗn
18 hợp để tách chúng ra Ngoài ra, phương pháp này còn có khả năng xác định khối lượng phân tử của những protein có trong mẫu phân tích Vì thể tích rửa giải phụ thuộc vào khối lượng phân tử và thông số cột nên những phân tử có cùng kích thước sẽ rửa giải cùng một thời gian trên cùng một cột sắc ký Chính vì vậy, sau khi tiến hành chạy những mẫu protein chuẩn, có thể xác định kích thước của mẫu protein cần phân tích
Hình dạng phân tử protein enzyme ảnh hưởng đến tốc độ di chuyển của nó Protein hình cầu di chuyển khác với protein hình sợi Do đó, để mô tả chính xác phân tử lượng protein, cần sử dụng mẫu protein có hình dạng giống nhau Ure hoặc guanidine chloride có thể được sử dụng để làm duỗi mạch protein, hạn chế ảnh hưởng của cấu hình protein trong quá trình sắc ký (Chi-san Wu, 2004).
Tóm lại bằng phương pháp sắc ký loại trừ kích thước người ta có thể tách các chất có trọng lượng phân tử khác nhau có trong hỗn hợp (như polymer, polysaccharide, acid nucleic, protein) Người ta có thể dùng kỹ thuật này để loại muối thay cho quá trình thẩm tích Ngoài ra, trong quá trình tinh chế protein enzyme, chúng còn được sử dụng để cô đặc dung dịch protein enzyme
Kỹ thuật sắc ký có nhiều ưu điểm khi phân tách hỗn hợp protein nên đây là một bước không thể thiếu trong quy trình thu nhận và tinh chế enzyme như: protease có hoạt tính chymotrypsin (Magnus M Krisjánsson và cộng sự, 1991), lipase từ
Penicillium citrinum (N Krieger và cộng sự, 1999), α-amylase từ Bacillus licheniformsi (M Damodara Rao và cộng sự, 2002), glucoamylase từ Aspergillus niger (A A Amirul và cộng sự, 1996) Hầu hết trong các quá trình tinh chế enzyme, tùy vào mức độ tinh sạch của chế phẩm mà chỉ cần xử lý loại trừ kích thước hoặc kết hợp sắc ký hấp phụ, trao đổi ion… Chính vì như vậy, khi nghiên cứu về thu nhận cũng như tinh chế lactase, kỹ thuật sắc ký loại trừ kích thước hoặc sắc ký lọc gel hoặc sắc ký thẩm thấu gel là một công đoạn rất quan trọng Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu tinh sạch lactase đồng thời xác định tính chất của chế phẩm thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau I.Rasouli và P.R.Kulkarni (1995) nghiên cứu thu nhận lactase từ Aspergillus niger, kết tủa bằng muối ammonium sulfate với các phân đoạn (0-40, 40-60 và 60-80%) ở 4 o C; kết tủa bằng acetone với tỉ lệ sử dụng 1:1, 1:1,5; sử
19 dụng kết hợp acetone và muối ammonium sulfate Kết quả của phương pháp kết tủa bằng ammonium sulfate, ở phân đoạn 60 – 80% hoạt tính riêng đạt cao nhất (440 U/mg protein), hiệu suất thu hồi đạt khoảng 60,5% Ở phương pháp kết tủa bằng aceton, hiệu quả kết tủa tốt nhất với tỉ lệ 1:1,5, hoạt tính đạt cao nhất 547 U/mg và hiệu suất 68% Khi sử dụng kết hợp kết tủa bằng muối ammonium sulfate với phân đoạn 0 – 50% và acetone tỉ lệ 1:1,5, hiệu quả kết tủa cao nhất với hiệu suất thu hồi đạt 40%, hoạt tính riêng đạt 1453 U/mg
Willemiek HΜ van Casteren và cộng sự (2000) tiến hành tinh sạch lactase từ
Aspergillus aculeatus bằng sắc ký hiệu năng cao cột DEAE Sepharose, sắc ký lọc gel cột MonoS HR 5/5 và sắc ký lọc gel cột Superdex 200 HR 10/30 Enzyme β- glactosidase thu nhận từ Aspergillus aculeatus gồm có 2 loại, một loại có hoạt tính trên pnp-β-D-Galp và một loại khác có hoạt tính exopolysaccharides là EPS B891 Sau khi tinh chế thu được kết quả sau: p np-β-D-Gal p EPS B891
*Hiệu suất thu hồi so với hoạt tính trên mẫu protein enzyme thô sau khi kết tủa
Năm 2005, S.K.Akolkar cộng sự nghiên cứu các phương pháp phá vỡ tế bào
Kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp nghiền và đồng hóa đem lại hoạt tính lactase cao nhất, đạt 2000 U/ml Trong khi các phương pháp còn lại như siêu âm, xử lý hóa chất và sốc nhiệt chỉ đạt hoạt tính từ 500 đến 1000 U/ml Chế phẩm lactase thu được sau khi tinh sạch bằng kỹ thuật siêu lọc và sắc ký cột có hoạt tính riêng khoảng 570 U/mg và hiệu suất thu hồi là 15,65% Đặc biệt, chế phẩm này có hoạt tính cao hơn và ổn định hơn so với các chế phẩm lactase hiện có trên thị trường.
20 lactase thương mại tách từ Kluyveromyces lactis Phân tử lượng của lactase từ
Lactobacillus acidophilus được xác định khoảng 518 kDa
S O’Connell và cộng sự (2006) đã tinh sạch lactase từ Kluyveromyces marxianus bằng cách kết hợp sắc ký lọc gel, sắc ký trao đổi ion và sắc ký hấp phụ hydroxylapatile Kluyveromyces marxianus được nuôi cấy trong môi trường có nguồn carbon là lactose Tế bào Kluyveromyces marxianus được phá vỡ bằng cách sử dụng sóng siêu âm Tinh sạch qua sắc ký trao đổi ion (vật liệu DEAE-Sepharose CL 6B)
Sau đó enzyme đã tinh sạch một phần cho vào sắc ký cột Sephacryl S200-HR rồi cuối cùng là qua sắc ký hấp phụ hydroxylapatile Phân tử lượng được xác định bằng phương pháp điện di SDS-PAGE với nồng độ gel 8% và chất nhuộm màu là
Coomassie brilliant blue R-250 Kết quả xác định được khối lượng phân tử bằng phương pháp điện di là 123 kDa, trong khi phương pháp lọc gel là 251 kDa Nhiệt độ tối ưu là khoảng 37 o C và pH tối ưu 6,8 Chế phẩm lactase có hoạt tính riêng khoảng 791 U/mg và hiệu suất khoảng 53%
Gần đây nhất, năm 2011, M.M Patil và cộng sự đã tách lactase từ Bacillus sp MTCC-864 Sau khi nhân giống, sinh khối được đưa đi đồng hóa để thu dịch chiết nội bào, sau đó tinh sạch bởi sắc ký cột (sephacryl-200) ở nhiệt độ phòng và thu được chế phẩm enzyme thô Kết quả sắc ký cột, phân đoạn 16 và 19 có được hoạt tính lactase cao nhất khoảng 350àmol ONP/min/ml Nhiệt độ tối ưu khoảng 50 o C, và hoạt tớnh duy trì được khoảng 75% thậm chí ở 60 o C khoảng 30 phút
N H M R Mozumder và cộng sự (2012) đã nghiên cứu tách chiết và tinh sạch một phần lactase từ vi khuẩn Lactobacillus phân lập từ yogurt Enzyme lactase thu được đạt hoạt tính cao nhất 850,69 U/l và hoạt tính riêng đạt 50,04 U/mg Dịch bào chứa enzyme được kết tủa bởi ammonium sulfate, sau đó sử dụng sắc ký trao đổi anion (DEAE cellulose) và kết quả đạt được với hoạt tính riêng 62,8 U/mg và độ tinh sạch 1,47 lần Khi xác định tính chất chế phẩm, kết quả cho thấy lactase có pH tối ưu là 6,0 và nhiệt độ tối ưu ở 70 o C.
TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU
Như đã đề cập, chế phẩm lactase đã thu hút nhiều sự quan tâm nghiên cứu toàn cầu Các công trình thu nhận và tinh sạch lactase đã được tiến hành, đồng thời các tính chất tối ưu về nhiệt độ, pH và động lực học của chế phẩm này cũng đã được xác định.
Riêng ở Việt Nam, hiện nay vẫn chưa có nhiều nghiên cứu về thu nhận chế phẩm lactase tinh sạch, nhưng ở lĩnh vực công nghệ sinh học đã có những nghiên cứu về tái tổ hợp gen, tạo ra những giống vi sinh vật sinh tổng hợp lactase hàm lượng cao, hoạt tính cao Nguyễn Thu Hà và cộng sự (2006) nghiên cứu sự biểu hiện của gen tổng hợp lactase ở 2 chủng Lactobacillus reuteri L103 và L461 Đây là nghiên cứu hoàn toàn cơ bản, cho thấy 2 enzyme biểu hiện ở 2 tiểu phần (2 chuỗi peptide có trọng lượng là 35kDa và 85kDa) Các enzyme này có khoảng pH hoạt động khá hẹp, một enzyme hoạt động ở pH 3,8 – 4,0 (chủng L461) và một enzyme hoạt động ở pH 4,6 – 4,8 (chủng L103) Kết quả nghiên cứu này sau đó được trình bày tại Hội nghị lần thứ V, trường Đại học Khoa học Tự Nhiên Hà Nội, 2006 và đã đăng trong tạp chí quốc tế
Nhóm tác giả này về sau có một số nghiên cứu tinh sạch để sử dụng tổng hợp galactooligosaccharides mang hoạt tính sinh học
Nhóm nghiên cứu của tác giả Trần Văn Đang có 2 bài báo, tập trung vào nghiên cứu enzyme tái tổ hợp Một là nghiên cứu biểu hiện β-glucosidase trong E coli BL21 (Tạp chí Khoa học, Đại học Huế số 55, 2009) Một nghiên cứu khác là nhân dòng và phân tích trình tự gen mã hóa β-glucosidase từ chủng Bacillus subtilis G1.
ỨNG DỤNG CỦA CHẾ PHẨM LACTASE
Ứng dụng chủ yếu của lactase là thủy phân lactose Lactose có thể bị thủy phân bằng acid ở nhiệt độ cao 150 o C hoặc bằng enzyme ở chế độ ôn hòa hơn không làm giảm pH của sản phẩm Thủy phân bằng enzyme có ưu điểm: không có sản phẩm phụ, không làm thoái hóa các thành phần trong sản phẩm sữa, không tạo ra những hương vị, màu, mùi không mong muốn Hơn nữa, sữa xử lý bằng enzyme duy trì được giá trị dinh dưỡng, đặc biệt là khi glucose và galactose không bị loại bỏ
1.6.1 Ứng dụng trong công nghiệp sữa và các sản phẩm từ sữa
22 Trong sữa và các sản phẩm từ sữa có chứa lượng lớn lactose Sữa bò chứa 4,5 – 5% lactose, hơn một phần ba lượng chất khô trong sữa, xấp xỉ 20% trong kem và 72% chất khô của whey Lactose có chức năng sinh học quan trọng đó là thúc đẩy sự phát triển của các vi khuẩn đường ruột và cung cấp galactose, một thành phần dinh dưỡng cần thiết giúp hình thành các galacto-oligosaccharide và các galactolipid trong não
Tuy nhiên, một số lượng lớn dân cư (khoảng 75%) không thể tiêu hóa lactose vì thiếu gen mã hóa enzyme này Đối với người thiếu enzyme lactase, khi có một lượng lactose lớn trong ruột có thể gây ra các triệu chứng như: đầy hơi, đau bụng, chuột rút và tiêu chảy (tình trạng lâm sàng được gọi là không dung nạp lactose)
Những người không dung nạp được lactose thường được khuyến cáo tránh tiêu thụ sữa và sản phẩm sữa Nhưng, những người này vẫn có thể tiêu hóa được sữa và các sản phẩm từ sữa nếu như trước đó thành phần lactose trong nguyên liệu đã được xử lý Đối với các sản phẩm sữa không lên men:
Trong kem, sữa đông lạnh, whey và sữa cô đặc hàm lượng lactose cao có thể dẫn đến việc hình thành những tinh thể lactose, kết quả hình thành trong sản phẩm những cấu trúc bột, cát hoặc sạn Sử dụng lactase trong quá trình sản xuất những sản phẩm như vậy có thể giảm nồng độ lactose đến những giá trị thích hợp, và vì vậy cải thiện một số chất lượng kỹ thuật và cảm quan của sản phẩm như là tăng khả năng tiêu hóa, cấu trúc sản phẩm mềm hơn, mịn hơn… (Zadow 1993) Ngoài ra, việc sử dụng enzyme lactase trước khi đông tụ có thể giảm hàm lượng lactose đến một lúc không còn ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm Đối với sản phẩm lên men từ sữa:
Gyuricsek và Thompson báo cáo rằng yogurt sản xuất từ sữa đã thủy phân lactose có thể gia tăng tốc độ sản sinh acid, nhờ vậy giảm thời gian lên men, và vị acid bị khử đi nhờ glucose và galactose, nhờ vậy sản phẩm yogurt phù hợp với người tiêu dùng hơn Ngoài ra,glucose và galactose còn giúp làm tăng vị ngọt đáng kể cho các sản phẩm (khoảng 50%) Do đó, có thể giảm số lượng chất ngọt bổ sung trong sữa chua, kết quả là giảm năng lượng trong sản phẩm
23 Tương tự, trong sản xuất phô mai, Gyuricsek và Thompson cho thấy rằng chế biến phô mai từ sữa thủy phân lactose sẽ giảm thời gian lên men, khối đông ít bị vỡ và đảm bảo tính nguyên vẹn, khối đông đồng nhất và sử dụng nhiệt độ môi trường thấp hơn
Sữa thủy phân là một sản phẩm sữa tươi đã được phân hủy thành các phân tử đơn giản hơn, thường được gọi là đường đơn Khi sữa thủy phân được sử dụng để sản xuất phô mai cheddar, quá trình sản xuất bị thay đổi đáng kể Sữa thủy phân là một nguồn đường lactose, cung cấp sự phát triển cho các vi khuẩn có lợi trong quá trình lên men phô mai Đường lactose cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình đông tụ protein sữa Do đó, sử dụng sữa thủy phân trong sản xuất phô mai cheddar ảnh hưởng đến chất lượng và hương vị của sản phẩm.
Với thời gian tác động của rennet giảm, quá trình sinh acid diễn ra nhanh hơn, rút ngắn thời gian đông tụ và cheddaring So sánh với phô mai truyền thống, phô mai cheddar từ sữa thủy phân lactose có thời gian đông tụ tương đương nhưng sở hữu hương vị, hình dạng, cấu trúc và thời gian đông tụ vượt trội.
1.6.2 Ứng dụng trong công nghiệp tận dụng whey
Ngành công nghiệp sản xuất phô mai tạo ra sản phẩm phụ là dịch whey, khoảng 150 triệu tấn hàng năm trên toàn thế giới Dịch whey có thành phần dinh dưỡng đa dạng, bao gồm 44-52 g/l lactose, 6-8 g/l protein và 4,3-9,5 g/l khoáng chất Đây là một nguồn dinh dưỡng giá trị, cung cấp các loại đường, axit amin và khoáng chất thiết yếu.
Một phần whey từ quá trình sản xuất phô mai được dùng để sản xuất whey protein concentrate (WPI) bằng phương pháp siêu lọc Tuy nhiên, một lượng lớn whey (xấp xỉ 47%) lại bị loại bỏ vào môi trường và lên đất Quá trình thủy phân sơ bộ lactose bằng lactase sẽ giúp gia tăng hiệu quả quá trình xử lý và có thể thu được các chế phẩm sinh học (lactate, acetate, ethanol, buthanediol ), các biopolymer và sinh khối Một ứng dụng khác của nước whey là dùng để sản xuất syrup và các sản phẩm lên men bằng cách thủy phân lactose bằng enzyme
Sản xuất syrup: Độ ngọt của lactose thấp hơn so với sucrose, tuy nhiên, khi lactose bị thủy phân thì độ ngọt tăng đáng kể Độ ngọt tương đối phụ thuộc vào nhiều nhân tố, chủ yếu là do nồng độ Sản xuất syrup lactose từ whey là một hướng tận dụng whey có nhiều lợi
24 ích Trong đó sản xuất ra syrup là một ứng dụng đầy tiềm năng vì đây là một nguyên liệu phù hợp trong công nghiệp sản xuất caramel, vì nó ổn định hơn, hạn chế hiện tượng lại đường như trường hợp dùng đường nghịch đảo
Sản xuất các sản phẩm lên men:
Dịch whey được tận dụng trong sản xuất protein đơn bào và sản xuất cồn Tuy nhiên, có một trở ngại khi tận dụng dịch whey là vì nguồn carbon chủ yếu trong dịch whey là lactose, mà chỉ có một vài giống vi sinh vật có khả năng sử dụng lactose Một số loài nấm men đã được khảo sát dùng để sản xuất cồn từ whey Kluyveromyces fragilis được xác định là có khả năng lên men hiệu quả nhất, nhưng chỉ có 55% lactose được chuyển thành cồn Nguyên nhân, có thể là do nấm men không có khả năng chịu được nồng độ cồn cao vì lactase được sinh tổng hợp bởi nấm men khá nhạy cảm với cồn Trong trường hợp, đối với whey đã thủy phân lactose, những vi sinh vật có khả năng chịu được nồng độ cồn cao như Saccharomyces cerevisiae có thể được sử dụng nhằm tăng hiệu suất chuyển hóa Năm 2007, mô hình lên men ethanol bán liên tục trong môi trường dịch whey sử dụng đồng thời nấm men S.cerevisiae cố định và enzyme β-D-galactosidase được phát triển và cho thấy kết quả rất tốt Ứng dụng trong sản xuất Galacto-oligosaccharide (GOS):
GOS được hình thành đồng thời trong quá trình thủy phân lactose do hoạt tính chuyển galactosyl của lactase Tổng lượng oligosaccharide thay đổi từ 1 – 45% trong tổng các saccharide hiện diện và phụ thuộc vào nguồn gốc của enzyme Khả năng ứng dụng lactases để sản xuất các oligosaccharide có chứa galactose đã được báo cáo vào đầu những năm 1950 Sau đó nghiên cứu được tập trung vào các phương pháp tối ưu hóa các điều kiện cho sản xuất Gần đây, các tác động tích cực của oligosaccharide đối với sức khỏe con người đã được báo cáo GOS thuộc nhóm prebiotic, có khả năng hỗ trợ sự phát triển của các probiotic – hệ vi sinh đường ruột có lợi cho sức khỏe con người (Bifidobacteriumsp và Lactobacillus.sp.) Các oligosaccharide khác hỗ trợ các hoạt động trao đổi chất của tất cả các vi khuẩn đường ruột còn GOS được chọn lọc cho vi khuẩn probiotic có tính acid
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
VẬT LIỆU VÀ HÓA CHẤT
Lactobacillus acidophilus được cung cấp từ bộ sưu tập giống của Bộ môn Sinh học, trường Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh
L acidophilus được giữ trong môi trường MRS agar, bảo quản ở 4 o C
Môi trường MRS dịch thể (MT1):
Môi trường MT1 dùng để hoạt hóa giống và nhân giống:
Hoạt hóa giống: sử dụng 20 ml MT1
Nhân giống: sử dụng 100 ml MT1
Môi trường MRS agar (MT2):
Môi trường MTS dịch thể bổ sung thêm agar 20 (g/l) sẽ tạo thành môi trường MRS agar
Môi trường MT2 được dùng để giữ giống
Môi trường lên men cảm ứng sinh tổng hợp lactase (MT3):
Các hóa chất sử dụng trong phân tích đều do công ty Merck (Đức) sản xuất
Sữa: sữa tiệt trùng 100% do Vinamilk sản xuất
2.1.4 Thiết bị và dụng cụ:
Thiết bị: Máy đo quan phổ hấp thu UV – Vis Thermo Spectronic, máy siêu âm
– Sonics vibracell VC750, máy ly tâm – Sigma – Aldrich, máy lắc, bể điều nhiệt, máy đo pH, tủ cấy, tủ ấm, tủ sấy, nồi hấp tiệt trùng, cân phân tích, cân điện tử, hệ thống sắc ký thẩm thấu gel (GPC) Agilent 1100series, máy khuấy từ
QUY TRÌNH THU NHẬN VÀ LÀM SẠCH LACTASE
Hoạt hóa trên môi trường MT1
Chế phẩm lactase Nhân giống trên môi trường MT1
Lên men trên môi trường MT3
SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU
Dung môi hữu cơ Acetone, Ethanol, Isopropanol
Muối trung tính NaCl, (NH4)2SO4
KHẢO SÁT PHƯƠNG PHÁP THU ENZYME THÔ
XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT CHẾ
KHẢO SÁT KHẢ NĂNG THỦY PHÂN LACTOSE SỮA TƯƠI
Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính chế phẩm
Khảo sát ảnh hưởng của pH lên hoạt tính chế phẩm
Tính chất động học Km và Vmax
Khảo sát thời gian thủy phân Khảo sát tỷ lệ lượng chế phẩm và thể tích sữa
THUYẾT MINH QUY TRÌNH THU NHẬN VÀ LÀM SẠCH LACTASE
Lên men thu nhận tế bào L acidophilus sinh tổng hợp lactase
Hoạt hóa giống: Dùng que cấy lấy một ít sinh khối từ ống thạch nghiêng vào chai thủy tinh chứa 20 ml MT1, lắc 100 vòng/phút trong 20 giờ ở nhiệt độ phòng
Nhân giống: Dùng pipetman chuyển 1 ml giống đã được hoạt hóa vào erlen chứa 100 ml MT1, lắc 100 vòng/phút ở nhiệt độ phòng
Lên men: Sau 18 giờ nhân giống tế bào L acidophilus nằm cuối pha log, chuyển 1% (v/v) giống sang MT3, lắc 100 vòng/phút trong 35 giờ để lên men sinh tổng hợp lactase
Khi quá trình lên men kết thúc, thu sinh khối bằng cách ly tâm canh trường 5000 vòng/phút trong 20 phút, ở 4 o C Sau đó, sinh khối được rửa với dung dịch đệm sodium phosphate 0,05 M (pH = 7,0) hai lần Tiếp tục ly tâm 5000 vòng/phút, trong 20 phút, ở 4 o C thu sinh khối ướt Sinh khối này được bảo quản ở -20 o C cho đến khi sử dụng
2.4.2 Phá vỡ tế bào L acidophilus giải phóng lactase
L acidophilus là một vi khuẩn sinh tổng hợp lactase nội bào, nên để thu nhận được lactase phải tiến hành phá vỡ tế bào nhằm giải phóng lactase nội bào Đây là một công đoạn quan trọng, vì giai đoạn này sẽ quyết định hàm lượng protein enzyme được giải phóng ra Nghiên cứu phương pháp phá vỡ tế bào L acidophilus giải phóng lactase được học viên cao học Nguyễn Thị Thùy Dung thực hiện, kết quả phương pháp xử lý tế bào bằng sóng siêu âm đem lại hiệu quả cao Trong thí nghiệm này, học viên đã khảo sát ảnh hưởng của nồng độ huyền phù (thay đổi từ 2,5 – 15% (w/v)), công suất siêu âm (thay đổi từ 225 W – 450 W), thời gian siêu âm (2 phút – 5 phút) và tối ưu hóa quá trình xử lý sóng siêu âm Kết quả chế độ thích hợp xử lý siêu âm tế bào L acidophilus với thể tích mẫu 15 ml là:
Nồng độ huyền phù sử dụng: 5% (w/v)
Thời gian siêu âm: 3,2 phút
Với kết quả thu được của học viên Nguyễn Thị Thùy Dung được, chế độ xử lý sóng siêu âm được áp dụng vào trong giai đoạn phá vỡ tế bào L.acidophilus này, sau đó sẽ thu dịch chứa enzyme thô và tiếp tục các công đoạn tinh sạch chế phẩm
Sau quá trình phá vỡ tế bào, ly tâm hỗn hợp 5000 vòng/phút trong 20 phút ở 4 o C để loại các mảnh vỡ tề bào, thu dịch chứa enzyme lactase
Trong quá trình sản xuất men lactase, giai đoạn kết tủa đóng vai trò quan trọng trong việc loại bỏ protein không mong muốn Nghiên cứu này khảo sát hiệu quả loại bỏ protein lactase bằng các tác nhân kết tủa khác nhau, bao gồm muối trung tính và dung môi hữu cơ, nhằm tối ưu hóa quy trình thu chế phẩm enzyme lactase thô.
Chế phẩm lactase sau khi kết tủa, được tái hòa tan trong dung dịch đệm sodium phosphate 0,05M; pH 7,0 Dịch enzyme thô sẽ được loại tác nhân kết tủa rồi tiến hành xử lý bằng sắc ký lọc gel, đối với trường hợp muối trung tính kết tủa hiệu quả nhất thì sẽ loại tác nhân kết tủa bằng phương pháp thẩm tích, đối với trường hợp dung môi hữu cơ là tác nhân kết tủa hiệu quá nhất thì sẽ để bay hơi tự nhiên
Sau khi cho mẫu xử lý bằng sắc ký lọc gel sẽ thu được phân đoạn chứa lactase tức là sẽ thu được lactase tinh sạch, với chế phẩm tự do này sẽ được tiến hành xác định tính chất và khảo sát khả năng thủy phân lactose trong sữa tươi
BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM
2.5.1 Khảo sát phương pháp thu enzyme thô
Trong thí nghiệm này, để thu được enzyme thô sẽ tiến hành khảo sát khả năng kết tủa của muối trung tính ((NH4)2SO4, NaCl) và dung môi hữu cơ (ethanol, isopropanol và acetone) để chọn ra tác nhân kết tủa protein lactase hiệu quả nhất
Muối trung tính: ((NH 4 ) 2 SO 4 , NaCl)
Chọn loại tác nhân thích hợp sao cho hiệu suất thu hồi enzyme và độ tinh sạch của chế phẩm lactase là cao nhất
Thông số cố định: thể tích dung dịch enzyme, thời gian, nhiệt độ
Thông số thay đổi: Nồng độ muối thay đổi như sau:
Nồng độ (NH 4 ) 2 SO 4 : 76,1%, 65,7%, 56,1%, 47,2%, 39%, 31,4% và 25,1% w/v (độ bão hòa tương ứng là 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%)
Hàm mục tiêu: Hiệu suất thu hồi và hoạt tính enzyme
Các mẫu được tiến hành lặp lại 3 lần
Chuẩn bị dung dịch bào chứa enzyme và muối
Hút 10 ml dung dịch enzyme (4 o C) cần kết tủa, cho vào ống nghiệm và bổ sung muối ở dạng tinh thể với hàm lượng như đã dự kiến Khuấy nhẹ để muối hòa tan hoàn toàn trong dung dịch
Để yên dung dịch sau khi tủa khoảng 30 phút ở 2 – 4 o C
Ly tâm lạnh hỗn hợp (4 o C) ở 6000 vòng/phút trong 15 phút
Đổ bỏ phần dịch lỏng phía trên
Hòa tan kết tủa bằng dung dịch đệm natri phosphate pH 7,0
Xác định hoạt tính lactase và hàm lượng protein thu được
Dung môi hữu cơ: (ethanol, isopropanol, acetone)
Chọn dung môi và tỉ lệ thích hợp để hiệu suất thu hồi enzyme và hoạt tính lactase cao nhất
Thông số cố định: thể tích dung dịch enzyme, thời gian, nhiệt độ
Thông số thay đổi: tỉ lệ dung môi so với dung dịch enzyme Tỷ lệ thể tích giữa dung môi và enzyme (Vdung môi:Venzyme)thay đổi lần lượt như sau: 90:10; 85:15;
Hàm mục tiêu: Hiệu suất thu hồi và hoạt tính enzyme
Các mẫu được tiến hành lặp lại 3 lần
Chuẩn bị dung dịch bào chứa enzyme và các dung môi: acetone, ethanol, isopropanol
Hút dung dịch enzyme (4 o C) cần kết tủa, cho vào ống nghiệm và bổ sung dung môi (-18 o C) với tỉ lệ như đã dự kiến
Để yên dung dịch sau khi tủa khoảng 30 phút ở 2 – 4 o C
Ly tâm lạnh (4 o C) ở 6000 vòng/phút trong 15 phút
Đổ bỏ phần dịch lỏng phía trên
Hòa tan kết tủa bằng dung dịch đệm natri phosphate pH 7,0
Xác định hoạt tính lactase và hàm lượng protein thu được
2.5.2 Xác định phương pháp tinh chế:
Mẫu protein lactase thô sau khi kết tủa được tái hòa tan và tiến hành tinh sạch bằng hệ thống sắc ký loại trừ kích thước – sắc ký thẩm thấu gel (Algilent 1100series GPC Analysis System) Hệ thống này mang đến nhiều ưu điểm:
Năng suất cao với thời gian phân tích mẫu ngắn
Phân tách hỗn hợp polymer thành các phân đoạn riêng biệt
Xác định sự phân bố khối lượng phân tử của các polymer
Thích hợp tinh sạch thu nhận mẫu vì thành phần mẫu không bị phá hủy hay biên đổi trong quá trình xử lý
Trong hệ thống sắc ký thẩm thấu gel, các cột thương mại phổ biến để phân tích hỗn hợp protein gồm ProSEC 300S, Toyo Soda TSK-PW và Waters Ultrahydrogel ProSEC 300S thích hợp cho protein trong dung dịch muối Toyo Soda TSK-PW loại PWXL-CP chuyên phân tách protein dạng cation Waters Ultrahydrogel phân tách hỗn hợp protein không ion hoặc trong dung dịch muối, đệm phosphate, citrate, acetate Đối với mẫu protein lactase thô, do dung môi hữu cơ là tác nhân kết tủa hiệu quả nhất nên ProSEC 300S không phù hợp So sánh giữa Toyo Soda TSK-PW và Waters Ultrahydrogel, Ultrahydrogel phù hợp hơn với mẫu nghiên cứu Ngoài ra, Ultrahydrogel còn nhiều ưu điểm khác.
Khoảng pH hoạt động rộng (2 – 12)
Có thể dùng cho dung dịch muối (0,5M – 1,0M)
Có thể chịu được nồng độ dung môi hữu cơ cao (lên đến 20%)
Có thể chịu được Urea, SDS hoặc những chất hoạt động bề mặt khác
34 Vậy, quá trình tinh sạch được thực hiện bằng hệ thống sắc ký loại trừ kích thước – sắc ký thẩm thấu gel (Algilent 1100series GPC Analysis System) sử dụng cột Ultrahydrogel 250
Pha dung dịch đệm natri phosphate 0,05M, pH 7,0
Lọc dung dịch đệm vừa pha qua màng membrane 0,45 μm
Chế độ chạy sắc ký lọc gel:
Lượng mẫu một lần bơm 0,2 ml
Lưu lượng dòng 1 ml / phút
Cân bằng cột và rửa giải bằng sodium phophate 0,05M, pH 7,0 o Thu nhận mẫu chạy ra khỏi cột ở mỗi peak Xác định hoạt tính lactase o Xác định phân tử lượng lactase tinh sạch bằng phương pháp điện di SDS-PAGE
2.5.3 Xác định tính chất của chế phẩm lactase:
Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính chế phẩm
Xác định nhiệt độ tối ưu
Tiến hành xác định hoạt tính của chế phẩm ở nhiều giá trị nhiệt độ khác nhau và cố định giá trị pH cố định Nhiệt độ tối ưu của chế phẩm được định nghĩa là nhiệt độ mà tại đó hoạt tính lactase là cao nhất
Thông số cố định: pH (7,0), nồng độ cơ chất (3 mM), thời gian (10 phút)
Thông số thay đổi: nhiệt độ khảo sát thay đổi như sau: 30 o C, 35 o C, 40 o C, 45 o C, 50 o C, 55 o C, 60 o C, 65 o C, 70 o C
Hàm mục tiêu: hoạt tính lactase
Các mẫu được tiến hành lặp lại 3 lần Độ bền nhiệt của chế phẩm
Giữ chế phẩm ở nhiều giá trị nhiệt độ khác nhau Sau những khoảng thời gian xác định, tiến hành đo hoạt tính hoạt tính enzyme thu được Khảo sát độ bền nhiệt của chế phẩm trong khoảng thời gian thay đổi
Thông số cố định: pH, nồng độ cơ chất (3 mM)
Thông số thay đổi: nhiệt độ ủ chế phẩm: 30 o C, 35 o C, 40 o C, 45 o C, 50 o C, 55 o C, 60 o C, 65 o C, 70 o C và tại mỗi nhiệt độ đó, sau những mốc thời gian: 10 phút, 30 phút, 60 phút, 120 phút, 150 phút, 180 phút xác định hoạt tính lactase
Hàm mục tiêu: hoạt tính lactase
Các mẫu được tiến hành lặp lại 3 lần
Khảo sát ảnh hưởng của pH lên hoạt tính chế phẩm
Tiến hành xác định hoạt tính của chế phẩm ở những giá trị pH của dung dịch phản ứng khác nhau Phản ứng được thực hiện tại nhiệt độ tối thích của chế phẩm
Thông số cố định: nhiệt độ (40 o C), nồng độ cơ chất (3 mM), thời gian (10 phút)
Thông số thay đổi: pH thay đổi khoảng 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0;
Hàm mục tiêu: Hoạt tính lactase
Các mẫu được tiến hành lặp lại 3 lần
Các thông số động học của chế phẩm
Mục đích: So sánh khả năng xúc tác của các chế phẩm thông qua 2 thông số động học quan trọng là Km và Vmax
Nội dung: Xác định Km và Vmax theo phương pháp Lineweaver & Burk
Thông số cố định: nhiệt độ tối ưu, pH tối ưu
Thông số thay đổi: Nồng độ cơ chất khoảng 0,6 – 5,4 μmol/mL
Các mẫu được tiến hành lặp lại 3 lần
2.5.4 Khảo sát khả năng thủy phân lactose trong sữa tươi
Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ lactase
Thông số cố định: thể tích sữa 10 ml, thời gian thủy phân 2 giờ, nhiệt độ tối ưu của lactase
Thông số thay đổi: lượng enzyme
Hàm mục tiêu: Hiệu suất thủy phân lactose trong sữa
Chọn tỷ lệ chế phẩm có hiệu suất thủy phân lactose trong sữa cao nhất
Khảo sát ảnh hưởng của thời gian thủy phân
Thông số cố định: tỷ lệ chế phẩm lactase, thể tích sữa
Thông số thay đổi: thời gian thay đổi từ 1 đến 4 giờ
Hàm mục tiêu: Hiệu suất thủy phân lactose trong sữa
CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
2.6.1 Định lượng Protein hòa tan bằng phương pháp Lowry [18]
Để xác định nồng độ protein, phương pháp Lowry dựa vào phản ứng Biuret Phản ứng này xảy ra khi liên kết peptide trong protein tương tác với Cu trong môi trường kiềm, tạo thành ion Cu+ Sau đó, ion Cu+ này phản ứng với thuốc thử Folin, tạo ra dung dịch màu xanh tím Cường độ màu sắc của dung dịch này phụ thuộc vào hàm lượng tyrosine và tryptophan trong protein Do đó, phương pháp Lowry cho phép đo đạc nồng độ protein dựa trên cường độ màu của phản ứng Biuret.
Trước tiên để xác định nồng độ protein tan trong mẫu thí nghiệm, ta sẽ phải xây dựng đường chuẩn bằng một loại protein tinh khiết thường là albumin Từ đường chuẩn, khi có giá trị mất độ quang sẽ xác định được nồng độ protein tan
Giá trị mật độ quang được đo bằng máy quang phổ hấp thu UV – Vis tại bước sóng λ = 750nm
Phương pháp này được sử dụng chính xác nhất với những dung dịch có nồng độ protein từ 0,01 đến 1 mg/ml
Pha dung dịch serum albumin chuẩn có nồng độ: 2 mg/ml
Dung dịch A: Cân 4g NaOH và 20g Na2CO3 pha trong 1000ml nước cất
Dung dịch B: Cân 0,5g CuSO4.H2O pha trong dung dịch Natri-Kali Tartrat 1%
Dung dịch C: Hỗn hợp của hai dung dịch A và B theo tỉ lệ 50:1
Thuốc thử Folin pha loãng bằng nước cất tỉ lệ 1:2
Cho vào ống nghiệm 1 ml mẫu và 5 ml dung dịch C, để yên trong 10 phút
Cho vào 0,5 ml thuốc thử Folin, lắc đều, để yên 30 phút
Đo độ hấp thu A ở bước sóng λ = 750 nm
Từ đó lập được đường chuẩn C = f(A)
Xác định protein tan trong mẫu thí nghiệm:
Cho vào ống nghiệm 1 ml mẫu và 5 ml dung dịch C, để yên trong 10 phút
Cho vào 0,5ml thuốc thử Folin, lắc đều, để yên 30 phút
Đo độ hấp thu A ở bước sóng λ = 750nm
Dựa vào phương trình đường chuẩn, từ giá trị độ hấp thu sẽ xác định được hàm lượng protein tan có trong mẫu thí nghiệm
2.6.2 Xác định hoạt tính của lactase bằng cơ chất ONPG [22]
Hoạt tính -galactosidaza được xác định bằng cách cho enzym phản ứng với cơ chất tổng hợp o-nitrophenyl--D-galactoside (ONPG) Dưới tác dụng của enzym ONPG sẽ thủy phân thành galactose và o-nitrophenol o-Nitrophenol khi giải phóng sẽ chuyển hỗn hợp phản ứng sang màu vàng và hấp thụ ở bước sóng 420 nm Phản ứng được dừng lại bằng cách thêm Na2CO3 vào để đưa hỗn hợp phản ứng về pH 11 Từ đây, ta có thể xác định được hoạt độ enzym khi đo hỗn hợp phản ứng giữa - galactosidase và ONPG Một đơn vị hoạt tính (U) -galactosidase là lượng enzym cần thiết để giải phóng 1 mol o-nitrophenol trong 1 phút ở 30 o C theo điều kiện thí nghiệm
ONPG – O-Nitrophenyl Galactoside D-Galactose ONP – O-Nitrophenol
Hình 2.1: Sự phân giải ONPG dưới tác dụng của lactase (Clark và cộng sự, 2012)
Phản ứng có thể thực hiện được đối với các tế bào cho phép ONPG thấm qua để vào tế bào chất Tuy nhiên, khi có sự hiện diện của những tế bào này, sự hấp thu ở 420 nm là tổng của sự hấp thu của o-nitrophenol và sự phân tán ánh sáng do hiện diện của các tế bào Phần ánh sáng phân tán có thể được xác định bằng cách đo sự hấp thu ở 550 nm (o-nitrophenol không được hấp thụ ở bước sóng này) Ánh sáng phân tán ở 420 nm bằng 1,75 lần ánh sáng phân tán ở 550 nm, vì vậy sự hấp thu của o-nitrophenol được xác định bằng OD420 – 1,75 OD550
Pha ONP 0,003M: Hòa tan 208,7 mg ONP vào 50 ml ethanol, định mức đến 500 ml nước
Hút 10 ml ONP 0,003M định mức lên 100 ml như vậy 1ml dung dịch ONP này chứa 0,3 μmol ONP
Pha dung dịch ONP với các nồng độ khác nhau từ 0 đến 0,18 μmol/ml, tăng dần 0,02 μmol/ml Đo độ hấp thụ của các dung dịch ONP ở bước sóng 420 nm, xác định đường chuẩn C = f(A) Sau đó, sử dụng dung dịch β-galactosidase để tiến hành đánh giá hoạt tính enzyme.
Xác định hoạt tính lactase Bảng 2.3: Các bước xác định hoạt tính lactase
ONPG 3mM 1 ml Enzyme 1 ml
Lắc đều để ổn định ở 37 o C
Na2CO3 10% 1 ml ONPG 3 mM 1 ml Lắc đều để ổn định trong 10 phút
Na2CO3 10% 1 ml Đo OD ở bước sóng 420 nm
OD = ODmẫu thử - ODđối chứng
Từ độ hấp thu OD, dựa vào đường chuẩn ONP sẽ xác định được nồng độ ONP tạo thành ở mỗi mẫu thí nghiệm
2.6.3 Phương pháp xác định hàm lượng lactose trong sữa [3,30]
Khi lactose phản ứng với methylamine trong môi trường kiềm nóng tạo sản phẩm có màu tím-đỏ, độ hấp thu cực đại ở 540 nm (Nickerson và cộng sự, 1975;
Dựng đường chuẩn đường lactose
Chuẩn bị dung dịch lactose chuẩn: Hòa tan 2,6315g lactose trong 200ml acid benzoic loãng 0,1% (w/v) Hút 15, 20, 25, 30 và 35 ml định mức lên 250ml Khi đó, nồng độ lactose 0,75,1,00, 1,25, 1,50 và 1,75 mg/ml
Lấy 4ml sữa phản ứng với 0,5ml acid zinc acetate-phosphotungtic (ZAPT), cộng thêm 0,5 ml nước
Lọc bằng giấy lọc whatman thu dịch lọc
Cho 0,25ml dịch lọc với 0,25ml NaOH 1M, làm loãng bằng 4,5ml nước
Lọc bằng giấy lọc whatman thu mẫu đã xử lý
Xác định phần trăm lactose trong sữa:
Lấy 2,5ml mẫu thử cho vào ống nghiệm Song song lấy vào ống nghiệm khác 2,5ml nước cất làm mẫu đối chứng
Cho 2,5ml đệm glycine-NaOH pH 12,7 vào mẫu thử và mẫu đối chứng
Tiếp tục cho 0,25ml dung dịch methylamine-HCl 5%
Cuối cùng là 0,25ml dung dịch sodium sulfile 1%
Giữ ống nghiệm ở 65 o C trong 25 phút sau đó làm lạnh nhanh trong nước đá với thời gian 2 phút Sau đó để ống nghiệm chứa mẫu ổn định trong 5 phút
Đo OD ở bước sóng 540nm: ΔOD= ODmt-ODđc
Dựa vào đường chuẩn lactose xác định nồng độ lactose trong mẫu thử.
CÔNG THỨC TÍNH TOÁN
2.7.1 Công thức xác định hoạt tính lactase của enzyme tự do (U/ml):
a: nồng độ ONP (μmol/ml)
t: thời gian thủy phân ONPG (phút)
2.7.2 Công thức xác định hoạt tính riêng enzyme lactase (U/mg) r pro
mpro: hàm lượng protein hòa tan trong 1 ml chế phẩm (mg)
2.7.3 Hiệu suất thu hồi protein enzyme (H, %) được xác định theo công thức:
Với:Ut là tổng đơn vị hoạt độ của chế phẩm
U0 là tổng đơn vị hoạt độ của dịch enzyme ban đầu
2.7.4 Độ tinh sạch của chế phẩm (DTS, lần) được xác định theo công thức:
Với: Urt là hoạt độ riêng của chế phẩm
Ur0 là hoạt độ riêng của dịch enzyme ban đầu
2.7.5 Hàm lượng lactose trong 1ml sữa: lactose 25 m a (mg) Với: a: nồng độ lactose trong mẫu thử (mg/ml)
2.7.6 Hiệu suất lactose thủy phân (H tp , %):
Với: L1: Hàm lượng lactose trong sữa trước thủy phân (mg)
L2: Hàm lượng lactose trong sữa sau khi thủy phân (mg)
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
NGUYÊN LIỆU BAN ĐẦU
Sau khi lên men với điều kiện trình bày trong phần 2.4.1, tiến hành thu nhận sinh khối L acidophilus sinh tổng hợp lactase Sinh khối thu được đem xử lý sóng siêu âm để phá vỡ tế bào giải phóng lactase với chế độ trình bày trong phần 2.4.2 Kết quả sau khi phá vỡ tế bào thu được dịch bào chứa enzyme lactase thô như sau:
Nồng độ protein hòa tan: 0,489 ± 0,08 (mg/ml)
Hoạt tính riêng: 3,140 ± 0,070 (U/mg protein)
Mục tiêu của đề tài là xác định phương pháp tinh chế enzyme lactase từ dịch trích enzyme Dịch bào chứa lactase được sử dụng để khảo sát các bước tinh sạch bằng phương pháp kết tủa và sắc ký thẩm thấu gel Hiệu suất thu hồi protein enzyme và độ tinh sạch của chế phẩm sẽ được tính toán và so sánh dựa vào hoạt tính và hoạt tính riêng ban đầu của của enzyme lactase trong dịch trích.
KHẢO SÁT TÁC NHÂN KẾT TỦA PROTEIN ENZYME
Tiến hành kết tủa dịch bào chứa enzyme lactase bằng muối NaCl theo trình tự nêu trong phần 2.5.1.1 Các kết tủa sau đó được hòa tan trong cùng thể tích đệm natri phosphat ban đầu (15 ml) và được phân tích về nồng độ protein và hoạt độ lactase Kết quả thu được được trình bày trong Bảng 3.1 và Hình 3.1.
Bảng 3.1: Kết quả tinh sạch lactase bằng sodium chloride
Nồng độ NaCl Nồng độ protein
Các giá trị trong bảng biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn của 3 mẫu độc lập Các giá trị có ký hiệu khác nhau biểu thị sự khác nhau có nghĩa (P < 0,05)
Hình 3.1: Biểu đồ biễu diễn hiệu quả kết tủa protein enzyme của các tác nhân NaCl
Trong các tác nhân kết tủa protein, thì NaCl là một tác nhân rất rẻ tiền, dễ kiếm đồng thời tác động biến tính bất thuận nghịch protein thấp Khi sử dụng NaCl để thu nhận, làm giàu protein lactase cho thấy nếu tăng nồng độ muối bão hòa (w/v) từ 15 – 35% thì hiệu suất thu hồi protein enzyme tăng từ 12,15% – 25,77%, ngược lại độ tinh
Hiệu suất thu hồi Protein enzyme (%) Độ tinh sạch (lần) Độ tinh sạ ch ( lầ n)
45 sạch của protein enzyme đạt cao nhất là 2,22 lần ở nồng độ bão hòa 25% Điều này có thể lý giải là do khi tăng nồng độ bão hòa lên 30 và 35% thì ngoài hàm lượng protein lactase còn có những protein tạp kết tủa làm cho độ tinh sạch của enzyme không cao
Tuy muối NaCl có nhiều ưu điểm nhưng hiệu quả kết tủa đạt được không cao, với hiệu suất thu hồi cao nhất chỉ 25,77% Do đó, cần phải lựa chọn một tác nhân khác để kết tủa protein enzyme hiệu quả hơn.
3.2.2 Kết tủa bằng (NH 4 ) 2 SO 4
Kết quả thí nghiệm: Thí nghiệm được tiến hành theo trỉnh bày ở mục 2.5.1.1 với tác nhân kết tủa là muối amonium sulfate Kết quả thí nghiệm thu được như sau (bảng 3.2 và hình 3.2)
Bảng 3.2: Kết quả tinh sạch lactse bằng muối ammonium sulfate
Nồng độ (NH 4 ) 2 SO 4 Độ bão hòa
Nồng độ protein (mg/ml)
Hoạt tính U/ml U r (U/mg protein)
Các giá trị trong bảng biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn của 3 mẫu độc lập Các giá trị có ký hiệu khác nhau biểu thị sự khác nhau có nghĩa (P < 0,05)
Hình 3.2: Biểu đồ biễu diễn hiệu quả kết tủa protein enzyme của các tác nhân
Kết quả thí nghiệm cho thấy, hiệu suất thu hồi lactase tăng từ 9,58% đến 43,61% tương ứng khi sử dụng nồng độ amonium sulfate bão hòa tăng từ 40% đến 100% Điều này cho thấy khi sử dụng càng nhiều muối thì khả năng phá vỡ lớp màng hydrat hóa càng cao, dẫn đến kết tủa càng nhiều protein enzyme làm cho hoạt tính tổng càng tăng
Bên cạnh đó độ tinh sạch tăng dần khi tăng nồng độ bão hòa của amonium sulfate và đạt cao nhất là 2,40 lần ở độ bão hòa 90% Lý giải về độ tinh sạch này cũng tương tự trường hợp NaCl, tức là độ bão hòa tăng, làm protein kết tủa càng nhiều trong đó bao gồm cả protein enzyme và protein tạp Vì vậy khi mức độ kết tủa protein tạp càng cao thì độ tinh sạch của chế phẩm càng thấp
Ali Noori Abed (2010) khi trích ly và tinh sạch lactase từ não cừu mới sinh đã tiến hành kết tủa protein enzyme bằng tác nhân ammonium sulfate Kết quả với hàm lượng ammonium sulfate bão hòa 20% thu hồi được 3,91% và độ tinh sạch đạt được là 0,074, trong khi hàm lượng ammonium sulfate bão hòa 60% thì thu hồi được 26,53% với độ tinh sạch 1,188 lần Ngoài ra, Patil và cộng sự, (2011) thu nhận enzyme lactase
Hiệu suất thu hồi Protein enzyme (%) Độ tinh sạch (lần)
47 từ Bacillus MTCC-864 bằng cách kết tủa bởi tác nhân ammonium sulfate, kết quả phân đoạn 40 – 60% bão hòa cho hiệu quả kết tủa tốt nhất Riêng Bart và cộng sự (2002) chứng minh rằng nồng độ ammonium sulfate tốt nhất là khoảng 30 – 70% khi kết tủa thu enzyme lactase có nguồn gốc từ Bacillus coagulans RCS3 Trong khi đó Mozumder và cộng sự (2012) báo cáo rằng đối với lactase từ lactobacillus nồng độ ammonium sulfate thích hợp nhất là 80% Từ những nghiên cứu trên, cho thấy tác nhân ammonium sulfate có hiệu suất thu hồi không cao và độ tinh sạch của chế phẩm enzyme thô đạt được cũng khá thấp Kết quả cũng khá tương ứng với nghiên cứu chúng tôi thực hiện khi hiệu suất thu hồi 43,15% và độ tinh sạch đạt 2,4 lần
Để đạt hiệu suất thu hồi và độ tinh khiết mong muốn của chế phẩm enzyme, cần sử dụng muối ammonium sulfate ở nồng độ bão hòa 90% để kết tủa protein do cân nhắc cả chi phí về tác nhân kết tủa.
Kết quả thí nghiệm: Tiến hành kết tủa dịch bào chứa enzyme lactase với tác nhân acetone theo trình từ trình bày trong phần 2.5.1.2, kết tủa thu được đem hòa tan trong 15ml đệm sodium phosphate và xác định nồng độ protein, hoạt tính lactase Kết quả thu được trình bày trên bảng 3.3 và hình 3.3
Bảng 3.3: Kết quả tinh sạch enzyme lactase bằng tác nhân acetone
Tỷ lệ Nồng độ protein
Hoạt tính U/ml U r (U/mg protein)
Các giá trị trong bảng biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn của 3 mẫu độc lập Các giá trị có ký hiệu khác nhau biểu thị sự khác nhau có nghĩa (P < 0,05)
Hình 3.3: Biểu đồ biễu diễn hiệu quả kết tủa protein enzyme của tác nhân acetone
Tỷ lệ V dung môi : V enzyme
Hiệu suất thu hồi Protein enzyme (%) Độ tinh sạch (lần) Độ tinh sạch (lần )
49 Acetone là một tác nhân kết tủa enzyme có ưu điểm về giá thành rẻ, có độ an toàn cao và khả năng biến tính bất thuận nghịch enzyme thấp Kết quả cho thấy khi tăng tỉ lệ Vdung môi:Venzyme từ 50:50 lên 70:30 thì hiệu suất thu hồi tăng từ 5,03% đến 87,92% Nhưng nếu tiếp tục tăng tỉ lệ dung môi và enzyme đến tỉ lệ 90:10 thì hiệu suất thu hồi protein enzyme sẽ giảm xuống và chỉ đạt 28,72% Điều này có thể lý giải là do khi tăng tác dung kết tủa thì hàm lượng protein kết tủa sẽ tăng, làm tăng hoạt tính tổng của dịch enzyme sau khi tủa Tuy nhiên nếu hàm lượng acetone sử dụng quá nhiều sẽ dẫn đến quá trình biến tính bất thuận nghịch enzyme xảy ra, làm biến tính một số protein bao gồm cả enzyme, làm cho hoạt tính tổng của dịch enzyme sau khi tủa giảm xuống Và vì vậy, cần phải cân nhắc về hiệu suất thu hồi protein enzyme để chọn lựa nồng độ thích hợp
TINH SẠCH CHẾ PHẨM BẰNG SẮC KÝ
Sau công đoạn kết tủa, enzyme thô được tinh chế bằng kỹ thuật sắc ký thẩm thấu gel Kỹ thuật này sử dụng cột Ultrahydrogel 250 và trong thời gian 18 phút, đã tách thành công 4 phân đoạn protein khác nhau Kết quả sắc ký được thể hiện trong hình 3.7.
Hình 3.7: Kết quả phân tích hỗn hợp protein bằng sắc ký lọc gel (GPC – Algilent
1100) trên cột Ultrahydrogel 250 với đầu dò RID
56 Mỗi phân đoạn protein thu được đều đem xác định hoạt tính lactase Tuy nhiên, chỉ có phân đoạn có thời gian lưu 6 – 8 phút có hoạt tính lactase, ba phân đoạn còn lại không có hoạt tính (bảng 3.6)
Bảng 3.6: Kết quả xác định hoạt tính những phân đoạn thu được sau khi tiến hành xử lý sắc ký thẩm thấu gel mẫu enzyme thô
Phân đoạn Hoạt tính lactase (U/ml)
Kết quả về hiệu quả lọc gel được trình bày trong bảng 3.7 Sau khí tiến hành lọc gel mẫu enzyme thô, hiệu suất thu hồi protein enzyme đạt được 58,57% và độ tinh sạch tăng lên 14,31 lần so với enzyme thô trích ly được sau khi phá vỡ tế bào
Bảng 3.7: Kết quả tinh sạch enzyme qua các công đoạn kết tủa và sắc ký thẩm thấu gel
Hoạt tính Hiệu suất (%) Độ tinh sạch (lần)
Enzyme kết tủa 0,25 0,099 1,380 14,005 89,93 4,46 Enzyme sau thẩm thấu gel 1,5 0,020 0,899 44,928 58,57 14,31
Vậy lactase tự do sau khi tinh chế có hoạt tính riêng đạt 44,928 U/mg protein
Gần đây, một nghiên cứu được thực hiện bởi N H M R Mozumder và cộng sự (2012) tinh sạch lactase trên đối tượng vi khuẩn Lactobacillus phân lập từ yogurt sau khi kết tủa bởi ammonium sulfate và sử dụng sắc ký trao đổi anion (DEAE cellulose)
57 kết quả chế phẩm có hoạt tính riêng đạt 62,8 U/mg protein nhưng độ tinh sạch chỉ 1,47 lần Điều này cho thấy, giống vi khuẩn Lactobacillus có hoạt tính riêng gần bằng nhau (44,928 U/mg protein và 62,8 U/mg protein) Nhưng đối tượng L acidophilus thì sinh tổng hợp ngoài lactase ra còn nhiều protein tạp khác nên độ tinh sạch đạt đến 14,31 lần, trong khi đối tượng Lactobacillus phân lập từ yogurt thì chủ yếu tổng hợp lactase và ít protein tạp nên độ tinh sạch chỉ 1,47 lần
Thông qua kết quả kết quả nghiên cứu về sự phân bố khối lượng phân tử protein (hình 3.8) đã xác định phân tử lượng của lactase trong khoảng 40 – 50 kDa
Hình 3.8: Khối lượng phân tử của phân đoạn có thời gian lưu 6 – 8 phút
Mẫu enzyme tinh sạch được tiến hành chạy điện di SDS-PAGE để xác định phân tử lượng, kết quả trình bày ở hình 3.9, cho thấy chế phẩm lactase tinh sạch chỉ có 1 vạch đậm có khối lượng phân tử là 40 kDa và 1 vạch rất mờ và mảnh có khối lượng phân tử 50kDa Kết quả điện di đã kiểm chứng được độ sạch của chế phẩm và hoàn toàn phù hợp với kết quả thẩm thấu gel
Hình 3.9: Kết quả điện di SDS-PAGE mẫu enzyme tinh sạch với thang chuẩn M (PAGE-Ruler unstained, Fermentas), M là thang chuẩn, 1 là mẫu chế phẩm lactase tinh sạch
Kết quả cho thấy enzyme lactase trong nghiên cứu có kích thước phân tử nhỏ khi so với một số enzyme lactase thu nhận từ một số vi sinh vật khác như β- galactosidse từ Kluyveromyces marxianus (123 kDa) (S O’Connell và cộng sự, 2006), lactase từ Ecoli (khoảng 540 kDa) (Gikas và López-Leiva., 1985), từ Aspergillus aculeatus (120 kDa) (Willemiek HM van Casteren và cộng sự, 2004)… điều này sẽ dẫn đến một số lợi ích khi tham gia xúc tác phản ứng enzyme như là sự cản trở của cấu hình không gian trong quá trình xúc tác phản ứng được hạn chế, nhờ vậy enzyme sẽ dễ dàng tiếp xúc cơ chất để phân cắt liên kết.
XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT CỦA CHẾ PHẨM
3.4.1 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme
Kết quả khảo sát hoạt tính lactase khi thay đổi nhiệt độ phản ứng trong khoảng 30 – 70 o C được trình bày ở hình 3.10:
Hình 3.10: Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến hoạt tính lactase
Khi nhiệt độ phản ứng tăng từ 30 đến 40 o C, thì tốc độ phản ứng enzyme cũng tăng theo, nguyên nhân là do các phân tử có động năng lớn hơn thúc đẩy cơ chất gắn kết vào trung tâm hoạt động của enzyme Tuy nhiên, khi nhiệt độ tiếp tục tăng thì tốc độ phản ứng enzyme bắt đầu giảm và hoạt tính còn lại rất thấp khi nhiệt độ phản ứng khoảng 70 – 75 o C, nguyên nhân khi nhiệt độ càng cao thì cấu hình không gian của enzyme càng bị biến đổi tác động lên trung tâm hoạt động của enzyme dẫn đến giảm hiệu quả xúc tác Từ kết quả về khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến hoạt tính lactase cho thấy enzyme lactase thu nhận có nhiệt độ tối ưu ở nhiệt độ 40 o C, kết quả này tương tự nghiên cứu của Ismail và cộng sự (2010) khi khảo sát nhiệt độ tối ưu cho sự hoạt động của lactase từ L.acidophilus NRRL 4495 Bên cạnh đó, trong khoảng nhiệt độ phản ứng 70 – 75 o C, thì hoạt tính còn lại dưới 5% cho thấy rằng enzyme lactase dễ dàng vô hoạt ở nhiệt độ trên 70 o C Ở 45 o C, hoạt tính tương đối khoảng 90%, điều này thuận lợi cho việc ứng dụng chế phẩm ở quy mô công nghiệp vì đôi khi nhiệt độ không được chính xác ở 40 o C, với sự dao động nhỏ của nhiệt độ cũng không ảnh hưởng đánh kể đến hoạt động của enzyme Ngoài ra khi chế phẩm dễ dàng vô hoạt ở 70 o C, đối với những sản phẩm sữa và những sản phẩm chế biến từ sữa, trong quá trình sản xuất sử dụng enzyme này để thủy phân lactose thì sau đó dễ dàng đình chỉ phản ứng bằng chế độ nhiệt (thanh
60 trùng…) để đảm bảo chất lượng sản phẩm ổn định trong thời gian bảo quản và tiêu thụ
3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme
Giá trị pH của môi trường phản ứng sẽ tác động đến sự phân ly của các nhóm chức phân ly trên phân tử protein enzyme, và sự thay đổi pH của môi trường còn ảnh hưởng đến sự phân ly của cơ chất Do đó, cần phải tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng của giá trị pH môi trường đến hoạt tính của enzyme
Tiến hành khảo sát hoạt tính lactase khi thay đổi pH môi trường phản ứng trong khoảng 3,0 – 9,0 bằng các dung dịch đệm là: acetate 0,05M, pH 3 – 4,5; phosphate 0,05M, pH 5 – 8, borate, pH 8,5 – 9 và thu được kết quả được trình bày ở hình 3.11:
Hình 3.11: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính lactase
Từ hình 3.11 cho thấy hoạt tính của enzyme tăng dần khi pH tăng từ 3 – 7,5 và nếu tiếp tục tăng pH thì hoạt tính sẽ giảm xuống đạt khoảng 40% ở pH 9,0 Hoạt tính của chế phẩm lactase cao nhất ở pH khoảng 7 – 7,5 Ở pH 6,5, hoạt tính tương đối của chế phẩm cũng khá cao, khoảng 90% so với điểm cực đại Ngoài ra ở pH dưới 4,5 thì hoạt tính gần như không đáng kể Với khoảng pH này, đối với việc sử dụng chế phẩm để sản phẩm sản phẩm sữa không chứa lactose khá thích hợp vì pH của sữa khoảng 6,5, vì vậy mà hoạt động thủy phân của chế phẩm lactase vẫn tốt Ngoài ra, để ức chế hoạt động của chế phẩm, ngoài việc dùng yếu tố nhiệt, thì đối với một số sản phẩm lên
61 men từ sữa như sữa chưa, yogurt hay phô mai thì chính pH cũng là một trong những nhân tố làm cho enzyme không thể hoạt động
3.4.3 Độ bền nhiệt của chế phẩm
Hình 3.12: Độ bền hoạt tính của lactase tinh sạch theo thời gian ở những nhiệt độ khác nhau
Khi khảo sát về độ bền nhiệt của chế phẩm lactase, ủ chế phẩm ở những nhiệt độ 35 o C, 40 o C, 45 o C và 50 o C sau đó xác định hoạt tính lactase trong khoảng thời gian 10, 30, 60, 90, 120, 150, 180 phút cho thấy nhiệt độ càng cao thì tốc độ giảm hoạt tính theo thời gian của chế phẩm càng lớn Ở khoảng 35 – 40 o C, sau 3 giờ, hoạt tính còn lại của chế phẩm hơn 50%, trong khi đó ở 50 o C thì hoạt tính chỉ còn 10% Chúng tỏ, chế phẩm tự do thường có độ ổn định nhiệt không cao, do không có những tác nhân che chở, bảo vệ để cho chế phẩm hoạt động hiệu quả, theo thời gian những tác động môi trường phản ứng sẽ làm thay đổi cấu hình không gian enzyme, làm cho trung tâm hoạt động của enzyme thay đổi, dẫn đến hoạt tính chế phẩm giảm Để làm tăng độ bền nhiệt của chế phẩm có thể dùng phương pháp cố định để tạo những chất mang bảo vệ enzyme trong quá trình phản ứng (J.H German, 1997)
TÍNH CHẤT ĐỘNG HỌC CỦA CHẾ PHẨM
Bảng 3.8: Tương quan giữa nồng độ cơ chất và tốc độ phản ứng
S (mM) V (mol/phút) 1/S (mM -1 ) 1/V (phút/mol)
Trong thí nghiệm xác định tính chất động học của enzyme, chúng tôi sử dụng ONPG làm cơ chất phản ứng, nồng độ cơ chất thay đổi từ 0,6 mM – 5,4 mM Hằng số động học Vmax và Km được tính toán từ phương trình Lineweaver – Burk (đồ thị 6) và giá trị Vmax và Km lần lượt là 2,3 μmol/phút và 0,73 mM
Hình 3.13: Đồ thị xác định K m và V max theo phương pháp Lineaweaver Burk
In studies exploring the kinetic properties of lactase, it was found that Kluyveromyces marxianus DSM5418 and Peninciulium chrysogenum exhibited Michaelis constants (Km) of 4.7 mM and 1.8 mM, respectively (S O'Connell et al., ).
63 2006; Nagy và cộng sự, 2001) So với giá trị Km từ trong nghiên cứu này là 0,73mM, điều này cho thấy khả năng tiếp cận cơ chất để thủy phân của enzyme lactase từ L acidophilus cao hơn so với enzyme nguồn gốc từ Kluyveromyces marxianus
DSM5418 và Peninciulium chrysogenum Vì enzyme lactase mà chúng tôi thu nhận có phân tử lượng nhỏ (40 kDa), cho nên sự cản trở tiếp xúc giữa cơ chất và trung tâm hoạt động của enzyme do yếu tố không gian được hạn chế.
KHẢO SÁT KHẢ NĂNG THỦY PHÂN LACTOSE TRONG SỮA TƯƠI
3.6.1 Khảo sát tỷ lệ lượng chế phẩm và thể tích sữa
Trong mỗi mẫu sữa 10ml bổ sung chế phẩm lactase tinh sạch với thể tích lactase tinh sạch thay đổi từ 1 đến 6 ml (tương ứng hoạt tính tổng thay đổi từ 0,599U đến 3,594U) Hiệu suất thủy phân lactose được tính bằng phần trăm lactose trong sữa đã thủy phân trên lượng lactose có trong sữa ban đầu Kết quả, khi thay đổi hàm lượng chế phẩm sử dụng thủy phân lactose trong sữa tươi được trình bày ở hình 3.14
Hình 3.14: Biểu diễn hiệu suất thủy phân lactose sữa tươi theo lượng enzyme lactase sử dụng
Với kết quả trình bày ở hình 3.14, hiệu suất thủy phân lactose trong sữa tăng khi tăng hàm lượng chế phẩm lactase tinh sạch từ 1 đến 6ml và hiệu suất thủy phân cao nhất là 63,58% Tuy nhiên, mẫu sữa thủy phân bởi 5ml chế phẩm lactase đạt hiệu suất thủy phân là 62,47%, khi phân tích ANOVA kết quả cho thấy hiệu suất thủy phân khi sử dụng 5ml chế phẩm và 6ml chế phẩm khác nhau không có nghĩa Điều này có
Hiệu suất thủy phân lactose (%)
64 nghĩa rằng, nếu ta tiếp tục tăng lượng chế phẩm thủy phân lactose, thì hiệu suất thủy phân lúc này sẽ tăng nhưng không đáng kể Nguyên nhân là các enzyme lactase bị ức chế ngược bởi thành phần galactose làm cho hoạt động của enzyme không còn tốt như trước
3.6.2 Khảo sát thời gian thủy phân lactose trong sữa tươi
Trong thực nghiệm này, thời gian thủy phân được điều chỉnh từ 1 đến 4 giờ để xác định thời điểm diễn ra quá trình thủy phân lactose hiệu quả nhất Kết quả khảo sát thời gian thủy phân lactose được minh họa trong Hình 3.15.
Hình 3.15: Biểu diễn hiệu suất thủy phân lactose theo thời gian
Khi thay đổi thời gian thủy phân từ 1 đến 4 giờ, kết quả cho thấy hiệu suất thủy phân tăng dần Tuy nhiên hiệu suất thủy phân ở 3 giờ và 4 giờ lần lượt là 67,79% và 70,45%, 2 giá trị này khác nhau không có nghĩa khi phân tích ANOVA một nhân tố với mức ý nghĩa 5% Điều này chứng tỏ, sau khi thủy phân lactose trong khoảng 3 giờ, nếu tiếp tục tăng thời gian thủy phân thì hiệu suất thủy phân tăng không đáng kể
Nguyên nhân của hiện tượng này là do nồng độ sản phẩm cao đã làm cho chiều phản ứng theo hướng làm giảm nồng độ sản phẩm, tức là hoạt động của enzyme lactase khi này bị kìm hãm ngay chính sản phẩm mà nó sinh ra (Panesar và cộng sự, 2007) Ngoài ra, còn có thể là khi kéo dài thời gian thủy phân, chất béo trong sữa cản trở sự tiếp xúc giữa lactose và lactase (Roy và cộng sự, 2003)
Hiệu suất thủy phân lactose (%)
Thời gian thủy phân (giờ)
