Kết tủa là một phương pháp để tách protein ra khỏi hỗn hợp. Phương pháp kết tủa vẫn là một quá trình quan trọng khi thu nhận và tinh sạch protein ở quy mô phòng thí nghiệm và công nghiệp và đóng vai trò quan trọng trong việc xử lý mẫu trước khi sử dụng phương pháp sắc ký. Hiệu quả của việc chạy sắc ký phụ thuộc rất lớn vào
những bước ban đầu liên quan đến quá trình kết tủa (Englard and Seifer 1990). Chức năng chính của quá trình kết tủa là làm giàu nồng độ protein cần tách chiết. Protein kết
tủa từ một thể tích lớn của dung dịch thô ban đầu có thể hòa tan lại sau đó bằng một lượng đệm nhỏ hơn. Quá trình này cũng dễ dàng khi thực hiện ở quy mô lớn, thiết bị sử dụng đơn giản, không đắt tiền và không làm biến tính những sản phẩm có hoạt tính sinh học (Glatz 1990). Để kết tủa protein cần thu nhận có thể bổ sung một lượng lớn muối như ammonium sulfate, hoặc dùng polymer như polyehtylene glycol (PEG), hoặc dung môi hữu cơ ái nước như acetone hoặc ethanol (Scopes, 1994). Tuy nhiên phương pháp sử dụng muối hoặc dung môi hữu cơ là hay sử dụng nhất.
Dựa trên khả năng kết tủa của các enzyme ở nồng độ muối khác nhau, người ta sử dụng (NH4)2SO4 để kết tủa phân đoạn enzyme. Bằng cách này, người ta được một
số protein tạp ở giai đoạn đầu của quá trình làm sạch enzyme. Ngoài muối (NH4)2SO4
ra, người ta còn sử dụng một số dung môi hữu cơ để kết tủa enzyme. Phương pháp kết tủa thường làm enzyme biến tính rất nhanh. Vì thế, trước khi tiến hành kết tủa, người ta phải tiến hành làm lạnh các chất kết tủa và cả dung dịch enzyme.
15 Các cơ chất kết tủa protein bao gồm những cation và anion vô cơ như: NH4+, K+, Na+, SO4+, PO4+, Cl-, Br-, NO3-, ClO4-, I-, SCN-. (England and Seifer 1990; Shin và cộng sự 1992; Scopes 1994; Baldwin 1996).
Những dung môi hữu cơ dùng để kết tủa protein như là: ethanol, acetone, methanol, n-propanol (England and Seifer 1990; Scopes 1994).
1.1. Kết tủa protein enzyme bằng muối trung tính
Muối nồng độ cao có tác dụng với phân tử nước bao quanh protein enzyme và làm chuyển hóa điện tích, làm thay đổi tính hòa tan của enzyme.
Nhiệt độ kết tủa có thể ở 35 – 40oC, nhưng để tránh khả năng làm mất hoạt tính enzyme, người ta thường phải làm lạnh dung dịch muối và dung dịch enzyme trước khi trộn hai loại dung dịch này với nhau.
Kết tủa bằng muối là phương pháp kết tủa protein phổ biến nhất. Ở nồng độ muối thấp, độ hòa tan của protein thường tăng lên khá ít, không đáng kể (salting in).
Nhưng ở nồng độ muối cao, độ hòa tan của protein giảm rõ rệt (Salting out) và protein bị kết tủa.
16
Hình 1.6: Hình biểu diễn độ hòa tan của protein vào nồng độ muối trung tính
(Adapted from scopes 1994)
Việc thêm nồng độ muối cao làm giảm lực đẩy điện tích giữa những nhóm tích điện cùng dấu trên bề mặt protein và phá vỡ lớp áo nước bao xung quanh phân tử cầu protein. Các ion muối cạnh tranh với nước để bao quanh phân tử protein, kết cục, ở
nồng độ muối cao phù hợp sẽ có khả năng phá vỡ lớp áo nước. Khi đó dung dịch muối ái nước trở thành một dung môi hòa tan protein kém, làm cho protein bị kết tủa. Số lượng điện tích và sự phân bố điện tích, các nhóm phân cực không ion hóa (nonionic polar groups), và những nhóm kỵ nước trên bề mặt protein xác định nồng độ muối cần thiết để làm kết tủa protein. Kích thước và hình dạng protein cũng góp phần tạo nên tính chất kết tủa của protein. Điều này làm cho những protein có tính chất cơ bản tương tự nhau sẽ kết tủa tương đối giống nhau trong hỗn hợp protein và đây là phương pháp kết tủa không đặc hiệu.
Những muối có hiệu quả kết tủa cao thường là những đa anion như sulfate, phosphate, và citrate. Còn đối với cation thì thường là những cation hóa trị một hay sử dụng như NH4+ > K+ > Na+. Bởi vì độ hòa tan cao ở khoảng nhiệt độ rộng 0 – 30oC và tỷ trọng của dung dịch bão hòa thấp hơn (khi so sánh với những muối khác), nên ammonium sulfate thường được sử dụng hơn những loại muối khác.
1.2. Kết tủa protein enzyme bằng dung môi hữu cơ:
Dung môi hữu cơ có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng hòa tan của enzyme, ảnh hưởng solvat hóa của phân tử nước xung quanh phân tử enzyme bị thay đổi, tương tác giữa các phân tử enzyme sẽ tăng lên.
Khi tiến hành kết tủa enzyme bằng những dung môi hữu cơ cần hết sức lưu ý đến nhiệt độ, nên bắt buộc ta khi tiến hành kết tủa enzyme phải làm lạnh cả dung môi hữu cơ và dung dịch enzyme. Mức độ nhạy cảm nhiệt độ của enzyme khi có mặt các dung môi hữu cơ thường mạnh hơn mức độ nhạy cảm của enzyme với nhiệt độ khi có mặt của muối vô cơ. Người ta thường tiến hành kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ ở nhiệt độ từ 3 – 10oC. Tỷ lệ và nồng độ các dung môi hữu cơ dùng để kết tủa enzyme
17 được xác định bằng thực nghiệm cho từng loại enzyme và từng nồng độ enzyme có trong dung dịch enzyme.
Kết tủa protein bằng dung môi hữu cơ đặc biệt quan trọng khi sử dụng ở quy mô công nghiệp (Curling 1980). Việc sử dụng dung môi hữu cơ ở quy mô phòng thí nghiệm có một ít nhược điểm, mặc dù cũng có một số ưu điểm so với phương pháp kết tủa bằng muối. Những dung môi hữu cơ như ethanol hoặc acetone được thêm vào trong dung dịch chứa protein có những tác động khác nhau và kết quả dẫn đến protein bị kết tủa. Tác động chủ yếu là làm giảm hoạt tính của nước. Khi đó hằng số điện môi
bị giảm khi thêm dung môi hữu cơ vào dẫn đến làm giảm năng lượng solvate hóa của nước để phân tử protein ái nước tích điện, và vì thế độ hòa tan của protein bị giảm và xảy ra quá trình kết tủa.
Hai loại dụng môi được sử rộng rãi nhất là ethanol và acetone, bên cạnh đó một số dung môi khác như methanol, n-propanol, i-propanol và dioxane cũng hay được sử dụng.
Yêu cầu về dung môi sử dụng phải hòa tan hoàn toàn trong nước, không phản ứng với protein, và có hiệu quả kết tủa tốt. Nhiệt độ kết tủa yêu cầu phải giữ ở nhiệt độ thấp, nếu nhiệt độ cao thì protein sẽ bị biến tính khi có mặt dung môi. Một ưu điểm rõ ràng khi kết tủa protein bằng dung môi đó là có thể thực hiện ở nhiệt độ âm, vì tất cả các hỗn hợp bởi dung môi và nước có điểm đông đặc dưới 0oC. Hầu hết protein bị kết tủa bởi acetone hoặc ethanol ở nồng độ khoảng 20 – 50% v/v. Ở nồng độ dung môi 50% chỉ những protein phân tử lượng nhỏ hơn 15000 Da kết tủa trong dung dịch.