Kỹ thuật sắc ký, trong đó kỹ thuật sắc ký loại trừ kích thước được dùng phổ
biến trong tách chiết và tinh sạch protein enzyme. Kỹ thuật loại trừ kích thước còn thường được gọi với những tên khác như sắc ký lọc gel (gel fitration chromatography) và sắc ký thẩm thấu gel (gel permeation chromatography), sắc ký gel, sắc ký loại trừ (Chi-san Wu, 2004). Cơ sở của kỹ thuật sắc ký loại trừ kích thước là dựa vào sự khác nhau nhau về kích thước, hình dạng và phân tử lượng của protein enzyme có trong hỗn
18 hợp để tách chúng ra. Ngoài ra, phương pháp này còn có khả năng xác định khối lượng phân tử của những protein có trong mẫu phân tích. Vì thể tích rửa giải phụ thuộc vào khối lượng phân tử và thông số cột nên những phân tử có cùng kích thước sẽ rửa giải cùng một thời gian trên cùng một cột sắc ký. Chính vì vậy, sau khi tiến hành chạy những mẫu protein chuẩn, có thể xác định kích thước của mẫu protein cần phân tích.
Hình dạng của phân tử protein enzyme ảnh hưởng lên tốc độ di chuyển của các phân tử, vì những protein hình cầu sẽ có tốc độ di chuyển khác với những protein dạng hình sợi. Vì vậy, để có thể mô tả chính xác phân tử lượng của protein, thì các mẫu protein
sử dụng phải có cùng hình dạng với nhau. Ngoài ra, có thể bổ sung ure hoặc guanidine chloride để duỗi mạch protein, vì thế sự ảnh hưởng bởi yếu tố cấu hình protein sẽ được hạn chế trong quá trình chạy sắc ký (Chi-san Wu, 2004).
Tóm lại bằng phương pháp sắc ký loại trừ kích thước người ta có thể tách các chất có trọng lượng phân tử khác nhau có trong hỗn hợp (như polymer, polysaccharide, acid nucleic, protein). Người ta có thể dùng kỹ thuật này để loại muối
thay cho quá trình thẩm tích. Ngoài ra, trong quá trình tinh chế protein enzyme, chúng còn được sử dụng để cô đặc dung dịch protein enzyme.
Kỹ thuật sắc ký có nhiều ưu điểm khi phân tách hỗn hợp protein nên đây là một bước không thể thiếu trong quy trình thu nhận và tinh chế enzyme như: protease có hoạt tính chymotrypsin (Magnus M. Krisjánsson và cộng sự, 1991), lipase từ
Penicillium citrinum (N. Krieger và cộng sự, 1999), α-amylase từ Bacillus licheniformsi (M. Damodara Rao và cộng sự, 2002), glucoamylase từ Aspergillus niger (A. A. Amirul và cộng sự, 1996)... Hầu hết trong các quá trình tinh chế enzyme,
tùy vào mức độ tinh sạch của chế phẩm mà chỉ cần xử lý loại trừ kích thước hoặc kết hợp sắc ký hấp phụ, trao đổi ion… Chính vì như vậy, khi nghiên cứu về thu nhận cũng như tinh chế lactase, kỹ thuật sắc ký loại trừ kích thước hoặc sắc ký lọc gel hoặc sắc ký thẩm thấu gel là một công đoạn rất quan trọng. Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu tinh sạch lactase đồng thời xác định tính chất của chế phẩm thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau. I.Rasouli và P.R.Kulkarni (1995) nghiên cứu thu nhận lactase từ Aspergillus niger, kết tủa bằng muối ammonium sulfate với các phân đoạn (0-40, 40-60 và 60-80%) ở 4oC; kết tủa bằng acetone với tỉ lệ sử dụng 1:1, 1:1,5; sử
19 dụng kết hợp acetone và muối ammonium sulfate. Kết quả của phương pháp kết tủa bằng ammonium sulfate, ở phân đoạn 60 – 80% hoạt tính riêng đạt cao nhất (440 U/mg protein), hiệu suất thu hồi đạt khoảng 60,5%. Ở phương pháp kết tủa bằng aceton, hiệu quả kết tủa tốt nhất với tỉ lệ 1:1,5, hoạt tính đạt cao nhất 547 U/mg và hiệu suất 68%. Khi sử dụng kết hợp kết tủa bằng muối ammonium sulfate với phân đoạn 0 – 50% và acetone tỉ lệ 1:1,5, hiệu quả kết tủa cao nhất với hiệu suất thu hồi đạt 40%, hoạt tính riêng đạt 1453 U/mg.
Willemiek HΜ van Casteren và cộng sự (2000) tiến hành tinh sạch lactase từ
Aspergillus aculeatus bằng sắc ký hiệu năng cao cột DEAE Sepharose, sắc ký lọc gel
cột MonoS HR 5/5 và sắc ký lọc gel cột Superdex 200 HR 10/30. Enzyme β- glactosidase thu nhận từ Aspergillus aculeatus gồm có 2 loại, một loại có hoạt tính trên
pnp-β-D-Galp và một loại khác có hoạt tính exopolysaccharides là EPS B891. Sau khi
tinh chế thu được kết quả sau:
pnp-β-D-Galp EPS B891
Hoạt tính riêng (U/mg)
Hiệu suất thu hồi* (%)
Hoạt tính riêng (U/mg)
Hiệu suất thu hồi* (%)
DEAE Sepharose
Không mô tả được
Không mô tả
được 21 64
MonoS HR 27 20 69 22
Superdex 200 24 13 72 17
*Hiệu suất thu hồi so với hoạt tính trên mẫu protein enzyme thô sau khi kết tủa
Năm 2005, S.K.Akolkar cộng sự nghiên cứu các phương pháp phá vỡ tế bào
Lactobacillus acidophilus bằng cách siêu âm, nghiền, đồng hóa, xử lý hóa chất và sốc
nhiệt. Enzyme được tinh sạch bằng kỹ thuật siêu lọc (cut off 50 kDa) và dòng retentate được cho qua sắc ký cột (Sephadex G-200). Kết quả, phương pháp nghiền và đồng hóa cho thấy hoạt tính lactase cao nhất khoảng 2000 U/ml. Trong khi những phương pháp còn lại khoảng 500 – 1000 U/ml. Hoạt tính riêng của lactase khoảng 570 U/mg và hiệu suất thu được 15,65%. Chế phẩm thu được có hoạt tính cao hơn, ổn định hơn so với
20 lactase thương mại tách từ Kluyveromyces lactis. Phân tử lượng của lactase từ
Lactobacillus acidophilus được xác định khoảng 518 kDa.
S. O’Connell và cộng sự (2006) đã tinh sạch lactase từ Kluyveromyces marxianus bằng cách kết hợp sắc ký lọc gel, sắc ký trao đổi ion và sắc ký hấp phụ
hydroxylapatile. Kluyveromyces marxianus được nuôi cấy trong môi trường có nguồn carbon là lactose. Tế bào Kluyveromyces marxianus được phá vỡ bằng cách sử dụng
sóng siêu âm. Tinh sạch qua sắc ký trao đổi ion (vật liệu DEAE-Sepharose CL 6B).
Sau đó enzyme đã tinh sạch một phần cho vào sắc ký cột Sephacryl S200-HR rồi cuối
cùng là qua sắc ký hấp phụ hydroxylapatile. Phân tử lượng được xác định bằng phương pháp điện di SDS-PAGE với nồng độ gel 8% và chất nhuộm màu là
Coomassie brilliant blue R-250. Kết quả xác định được khối lượng phân tử bằng phương pháp điện di là 123 kDa, trong khi phương pháp lọc gel là 251 kDa. Nhiệt độ tối ưu là khoảng 37oC và pH tối ưu 6,8. Chế phẩm lactase có hoạt tính riêng khoảng 791 U/mg và hiệu suất khoảng 53%.
Gần đây nhất, năm 2011, M.M. Patil và cộng sự đã tách lactase từ Bacillus sp MTCC-864. Sau khi nhân giống, sinh khối được đưa đi đồng hóa để thu dịch chiết nội bào, sau đó tinh sạch bởi sắc ký cột (sephacryl-200) ở nhiệt độ phòng và thu được chế phẩm enzyme thô. Kết quả sắc ký cột, phân đoạn 16 và 19 có được hoạt tính lactase cao nhất khoảng 350àmol ONP/min/ml. Nhiệt độ tối ưu khoảng 50oC, và hoạt tớnh duy trì được khoảng 75% thậm chí ở 60oC khoảng 30 phút.
N. H. M. R. Mozumder và cộng sự (2012) đã nghiên cứu tách chiết và tinh sạch
một phần lactase từ vi khuẩn Lactobacillus phân lập từ yogurt. Enzyme lactase thu
được đạt hoạt tính cao nhất 850,69 U/l và hoạt tính riêng đạt 50,04 U/mg. Dịch bào chứa enzyme được kết tủa bởi ammonium sulfate, sau đó sử dụng sắc ký trao đổi anion (DEAE cellulose) và kết quả đạt được với hoạt tính riêng 62,8 U/mg và độ tinh sạch 1,47 lần. Khi xác định tính chất chế phẩm, kết quả cho thấy lactase có pH tối ưu là 6,0 và nhiệt độ tối ưu ở 70oC.