CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.6. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
2.6.1. Định lượng Protein hòa tan bằng phương pháp Lowry [18]
Nguyên tắc
Để xác định nồng độ protein ta sử dụng phương pháp Lowry. Phương pháp này
dựa vào phản ứng Biuret, trong đó các liên kết peptide của protein phản ứng với Cu trong môi trường kiềm để tạo ra Cu+, ion Cu+ tạo ra sẽ phản ứng với thuốc thử Folin tạo ra dung dịch màu xanh tím, cường độ màu phụ thuộc vào thành phần tyrosin và tryptophan trong protein.
Trước tiên để xác định nồng độ protein tan trong mẫu thí nghiệm, ta sẽ phải xây dựng đường chuẩn bằng một loại protein tinh khiết thường là albumin. Từ đường chuẩn, khi có giá trị mất độ quang sẽ xác định được nồng độ protein tan.
Giá trị mật độ quang được đo bằng máy quang phổ hấp thu UV – Vis tại bước sóng λ = 750nm.
Phương pháp này được sử dụng chính xác nhất với những dung dịch có nồng độ protein từ 0,01 đến 1 mg/ml.
Cách thực hiện
Xây dựng đường chuẩn:
Hóa chất:
Pha dung dịch serum albumin chuẩn có nồng độ: 2 mg/ml.
Dung dịch A: Cân 4g NaOH và 20g Na2CO3 pha trong 1000ml nước cất.
Dung dịch B: Cân 0,5g CuSO4.H2O pha trong dung dịch Natri-Kali Tartrat 1%.
Dung dịch C: Hỗn hợp của hai dung dịch A và B theo tỉ lệ 50:1.
Thuốc thử Folin pha loãng bằng nước cất tỉ lệ 1:2.
38
Cách tiến hành:
Cho vào ống nghiệm 1 ml mẫu và 5 ml dung dịch C, để yên trong 10 phút.
Cho vào 0,5 ml thuốc thử Folin, lắc đều, để yên 30 phút.
Đo độ hấp thu A ở bước sóng λ = 750 nm.
Từ đó lập được đường chuẩn C = f(A).
Xác định protein tan trong mẫu thí nghiệm:
Cho vào ống nghiệm 1 ml mẫu và 5 ml dung dịch C, để yên trong 10 phút.
Cho vào 0,5ml thuốc thử Folin, lắc đều, để yên 30 phút.
Đo độ hấp thu A ở bước sóng λ = 750nm.
Dựa vào phương trình đường chuẩn, từ giá trị độ hấp thu sẽ xác định được hàm lượng protein tan có trong mẫu thí nghiệm.
2.6.2. Xác định hoạt tính của lactase bằng cơ chất ONPG [22]
Nguyên tắc
Hoạt tính -galactosidaza được xác định bằng cách cho enzym phản ứng với cơ chất tổng hợp o-nitrophenyl--D-galactoside (ONPG). Dưới tác dụng của enzym ONPG sẽ thủy phân thành galactose và o-nitrophenol. o-Nitrophenol khi giải phóng sẽ chuyển hỗn hợp phản ứng sang màu vàng và hấp thụ ở bước sóng 420 nm. Phản ứng được dừng lại bằng cách thêm Na2CO3 vào để đưa hỗn hợp phản ứng về pH 11. Từ đây, ta có thể xác định được hoạt độ enzym khi đo hỗn hợp phản ứng giữa - galactosidase và ONPG. Một đơn vị hoạt tính (U) -galactosidase là lượng enzym cần thiết để giải phóng 1 mol o-nitrophenol trong 1 phút ở 30oC theo điều kiện thí nghiệm.
39
ONPG – O-Nitrophenyl Galactoside D-Galactose ONP – O-Nitrophenol
Hình 2.1: Sự phân giải ONPG dưới tác dụng của lactase (Clark và cộng sự, 2012)
Phản ứng có thể thực hiện được đối với các tế bào cho phép ONPG thấm qua để vào tế bào chất. Tuy nhiên, khi có sự hiện diện của những tế bào này, sự hấp thu ở 420 nm là tổng của sự hấp thu của o-nitrophenol và sự phân tán ánh sáng do hiện diện của các tế bào. Phần ánh sáng phân tán có thể được xác định bằng cách đo sự hấp thu ở 550 nm (o-nitrophenol không được hấp thụ ở bước sóng này). Ánh sáng phân tán ở 420 nm bằng 1,75 lần ánh sáng phân tán ở 550 nm, vì vậy sự hấp thu của o-nitrophenol được xác định bằng OD420 – 1,75 OD550.
Dựng đường chuẩn ONP
Pha ONP 0,003M: Hòa tan 208,7 mg ONP vào 50 ml ethanol, định mức đến 500 ml nước.
Hút 10 ml ONP 0,003M định mức lên 100 ml như vậy 1ml dung dịch ONP này chứa 0,3 μmol ONP.
Pha ONP với các nồng độ thay đổi từ 0 – 0,18 μmol/ml với bước nhảy 0,02 μmol/ml.
Đo độ hấp thu của các nồng độ ONP vừa pha ở 420 nm và lập được đường chuẩn C = f(A).
β-galactosidase
40
Xác định hoạt tính lactase Bảng 2.3: Các bước xác định hoạt tính lactase
Mẫu thử Đối chứng
ONPG 3mM 1 ml Enzyme 1 ml
Lắc đều để ổn định ở 37oC
Enzyme 1 ml
Na2CO3 10% 1 ml ONPG 3 mM 1 ml Lắc đều để ổn định trong 10 phút
Na2CO3 10% 1 ml
Đo OD ở bước sóng 420 nm
OD = ODmẫu thử - ODđối chứng
Từ độ hấp thu OD, dựa vào đường chuẩn ONP sẽ xác định được nồng độ ONP tạo thành ở mỗi mẫu thí nghiệm.
2.6.3. Phương pháp xác định hàm lượng lactose trong sữa [3,30]
Nguyên tắc:
Khi lactose phản ứng với methylamine trong môi trường kiềm nóng tạo sản phẩm có màu tím-đỏ, độ hấp thu cực đại ở 540 nm (Nickerson và cộng sự, 1975;
Amutha và cộng sự, 2010).
Dựng đường chuẩn đường lactose
Chuẩn bị dung dịch lactose chuẩn: Hòa tan 2,6315g lactose trong 200ml acid benzoic loãng 0,1% (w/v). Hút 15, 20, 25, 30 và 35 ml định mức lên 250ml. Khi đó, nồng độ lactose 0,75,1,00, 1,25, 1,50 và 1,75 mg/ml.
41
Xử lý mẫu:
Lấy 4ml sữa phản ứng với 0,5ml acid zinc acetate-phosphotungtic (ZAPT), cộng thêm 0,5 ml nước.
Lọc bằng giấy lọc whatman thu dịch lọc.
Cho 0,25ml dịch lọc với 0,25ml NaOH 1M, làm loãng bằng 4,5ml nước.
Lọc bằng giấy lọc whatman thu mẫu đã xử lý.
Xác định phần trăm lactose trong sữa:
Lấy 2,5ml mẫu thử cho vào ống nghiệm. Song song lấy vào ống nghiệm khác 2,5ml nước cất làm mẫu đối chứng.
Cho 2,5ml đệm glycine-NaOH pH 12,7 vào mẫu thử và mẫu đối chứng .
Tiếp tục cho 0,25ml dung dịch methylamine-HCl 5%.
Cuối cùng là 0,25ml dung dịch sodium sulfile 1%.
Giữ ống nghiệm ở 65oC trong 25 phút sau đó làm lạnh nhanh trong nước đá với thời gian 2 phút. Sau đó để ống nghiệm chứa mẫu ổn định trong 5 phút.
Đo OD ở bước sóng 540nm: ΔOD= ODmt-ODđc.
Dựa vào đường chuẩn lactose xác định nồng độ lactose trong mẫu thử.