Cải tiến quy trình ly trích DNA từ niêm mạc miệng ứng dụng trong xét nghiệm quan hệ huyết thống

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP HCM KHOA KỸ THUẬT HĨA HỌC BỘ MƠN CÔNG NGHỆ SINH HỌC TĂNG NGỌC KIỀU VY CẢI TIẾN QUY TRÌNH LY TRÍCH DNA TỪ NIÊM MẠC MIỆNG ỨNG DỤNG TRONG XÉT NGHIỆM QUAN HỆ HUYẾT THỐNG Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Mã ngành: 60 42 02 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ Tp HCM, tháng 05 năm 2018 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA - ĐHQG Tp-HCM Cán hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Thúy Hương Cán chấm nhận xét 1: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng Cán chấm nhận xét 2: TS Hoàng Anh Hoàng Luận văn thạc sĩ bảo vệ Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày 26 tháng 05 năm 2018 Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: Chủ tịch: PGS.TS Nguyễn Đức Lượng Thư ký: TS Huỳnh Ngọc Oanh Phản biện 1: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng Phản biện 2: TS.Hoàng Anh Hoàng Ủy viên: Võ Đình Lệ Tâm Xác nhận Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau luận văn sửa chữa (nếu có) CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƢỞNG KHOA KỸ THUẬT HĨA HỌC i ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HỊA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự - Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: TĂNG NGỌC KIỀU VY MSHV: 7140301 Ngày, tháng, năm sinh: 29/06/1989 Nơi sinh: TP.HCM Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Mã số: 60420201 I TÊN ĐỀ TÀI: “Cải tiến quy trình ly trích DNA từ niêm mạc miệng Ứng dụng xét nghiệm quan hệ huyết thống” II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Đề xuất quy trình ly trích phù hợp cho niêm mạc miệng ứng dụng xét nghiệm quan hệ huyết thống Nội dung đề tài bao gồm: - Khảo sát hiệu ly trích số quy trình ly trích DNA, lựa chọn quy trình ly trích phù hợp - Cải tiến quy trình chọn - Ly trích so sánh với ly trích thương mại 10 mẫu ly trích thử nghiệm 200 mẫu, từ đánh giá tính khả thi quy trình đề xuất III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 04/09/2017 IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 17/06/2018 V CÁN BỘ HƢỚNG DẪN: PGS TS Nguyễn Thúy Hương Tp HCM, ngày tháng năm 2018 CÁN BỘ HƢỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO PGS.TS Nguyễn Thúy Hƣơng PGS.TS Nguyễn Thúy Hƣơng TRƢỞNG KHOA KỸ THUẬT HĨA HỌC ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài luận văn thạc sĩ cách hoàn chỉnh, bên cạnh nỗ lực cố gắng thân cịn có hướng dẫn nhiệt tình Quý Thầy Cô, động viên ủng hộ gia đình bạn bè suốt thời gian học tập nghiên cứu thực luận văn thạc sĩ Em xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến cô Nguyễn Thúy Hương - PGS.TS trưởng khoa Công Nghệ Sinh Học Trường Đại Học Bách Khoa TP.HCM, người tận tình truyền đạt kiến thức quý báu, hết lòng giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho em hoàn thành luận văn Cảm ơn kiên nhẫn động viên cô dành cho em suốt thời gian dài thực đề tài Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến ThS Huỳnh Viết Lộc anh chị nhân viên Viện Sinh Học Phân Tử LOCI cung cấp, hỗ trợ trang thiết bị vật tư cho suốt thời gian nghiên cứu thực luận văn Để có nguồn kiến thức cho phép em thực nghiên cứu này, em xin cảm ơn quý thầy cô trường Đại Học Bách Khoa – nơi em gắn bó suốt năm học vừa qua Cuối cùng, tơi xin chân thành cảm ơn đến gia đình, anh chị bạn đồng nghiệp hỗ trợ cho tơi nhiều suốt q trình học tập, nghiên cứu thực đề tài luận văn thạc sĩ cách hoàn chỉnh TP.HCM, tháng năm 2018 Học viên thực Tăng Ngọc Kiều Vy iii TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ Quy trình ly trích thơ DNA đến hai bước thao tác cho thấy nhiều tiền ứng dụng thực tiễn Thêm vào đời hệ Taq polymerase kháng ức chế cho phép thực phản ứng PCR đối tượng mẫu DNA chứa nhiều tạp chất điều kiện cho phép chúng tơi xây dựng quy trình ly trích DNA từ niêm mạc miệng sở cải tiến quy trình ly trích thơ DNA NaOH-SDS (có nồng độ SDS 0.025%) mà kết thử nghiệm cho thấy phù hợp cho phản ứng PCR -STR Tiếp tục khảo sát hiệu ly trích nồng độ SDS khác nhau, đề tài tìm nồng độ SDS phù hợp cho ly trích niêm mạc miệng 0.01% Để đánh giá hiệu quy trình ly trích cải tiến đưa ra, đề tài thực ly trích so sánh quy trình với kit ly trích thương mại 10 mẫu ứng dụng ly trích 200 mẫu So sánh 10 mẫu, quy trình ly trích cải tiến cho cường độ huỳnh quang trung bình thấp kit thương mại kết phân tích xác trùng khớp Trên 200 mẫu, kết cho thấy khơng có mẫu bị ức chế, 90% mẫu cho sản phẩm PCR có cường độ huỳnh quang 100 RFU 100% cho tín hiệu cao 50 RFU Đối cặp mẫu biết mối quan hệ huyết thống, kết trả trùng khớp Ngoài ra, quy trình cịn cho thấy nhiều ưu thao tác gồm hai bước đơn giản, giảm rủi ro, rút ngắn thời gian ly trích cịn 15 phút, giảm giá thành 1/10 so với kit ly trích thương mai hóa thị trường Đề tài sau thực đề xuất quy trình ly trích DNA từ niêm mạc miệng, ứng dụng xét nghiệm quan hệ huyết thống kit PowerPlex ®Fusion System iv SUMMARY The crude DNA extraction process in one or two steps demonstrates many of the potential applications in practice In addition, Taq polymerase’s inhibitors resistance enables PCR amplification without any prior DNA purification, that is a reason for us to construct DNA extraction procedures from buccal swabs on the basis of improved crude DNA extraction procedure by NaOH-SDS Screening of SDS concentrations, we found that 0.01% is appropriate concentration for crude DNA extraction procedure To evaluate the effectiveness of the improved extracting procedure, we compared the PCR performance of the improved procedure with a commercially available kit (E.Z.N.A Forensic DNA kit) on 10 samples and applicated to extract DNA on 200 samples Compared to the 10 samples, the improved extraction procedure had a lower average fluorescence than the commercial kit, but the results were accurate and consistent On 200 samples, the results showed no samples were inhibited, more than 90% of samples for PCR product had fluorescence intensity above 100 RFU and 100% for signal above 50 RFU For pairs of samples that know the parentage relationship, the result is match It also shows that the ability to apply with many advantages (two simple steps, reduce the risk, shorten time - only 15 minutes, reduce the price to 10 time when compared to the commercial kit) These results suggest that, the DNA extraction procedure had built is suitable for DNA testing on Power Plex ®Fusion System kit v LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Tác giả Tăng Ngọc Kiều Vy vi MỤC LỤC Trang NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ ii LỜI CẢM ƠN iii TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ iv LỜI CAM ĐOAN CỦA TÁC GIẢ LUẬN VĂN vi MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Xét nghiệm quan hệ huyết thống 1.1.1 Xét nghiệm dựa nhóm máu 1.1.2 Xét nghiệm dựa hệ kháng nguyên bạch cầu (HLA) 1.1.3 Xét nghiệm dựa đoạn lặp đa hình .4 1.1.3.1 Khái niệm đoạn lặp đa hình 1.1.3.2 Các kỹ thuật xét nghiệm quan hệ HT đoạn lặp đa hình 1.2 Kỹ thuật PCR-STR 1.2.1 Giới thiệu 1.2.2 Phương pháp thực .7 1.3 Các cải tiến DNA polymerase 12 1.4 Các phương pháp ly trích DNA 13 1.4.1 Phương pháp Phenol .13 1.4.2 Phương pháp Boom 14 1.4.3 Ly trích cột lọc .15 1.4.4 Phương pháp ly giải kiềm (alkaline) .15 1.5 Ly trích thơ DNA chất biến tính protein 16 1.5.1 Ưu quy trình ly trích thơ .16 1.5.2 Một số chất biến tính protein 16 1.5.2.1 Chất chaotropic 16 1.5.2.2 Chất tẩy rửa 17 1.6.Tế bào niêm mạc miệng- nguồn mẫu DNA ưu xét nghiệm huyết thống 19 1.6.1 Đặc điểm tế bào niêm mạc miệng .19 1.6.2 Tế bào niêm mạc miệng- nguồn mẫu DNA ưu cho xét nghiệm 19 1.6.3 Các nghiên cứu ly trích thơ DNA 20 CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .23 2.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu 23 2.2 Vật liệu 24 2.2.1 Máy móc- Thiết bị 24 2.2.2 Vật tư- hóa chất 24 2.3 Thu nhận mẫu 24 2.4 Ly trích khảo sát - Lựa chọn quy trình ly trích phù hợp .25 2.4.1 Ly trích mẫu 26 2.4.2 Chạy PCR – Phân tích kết 28 2.4.3 Phân tích kết - Lựa chọn quy trình ly trích phù hợp 28 2.5 Cải tiến quy trình ly trích phù hợp 29 2.6 Đánh giá hiệu quy trình ly trích cải tiến 29 2.6.1.So sánh quy trình cải tiến với quy trình ly trích thương mại .29 2.6.2 Ly trích thử nghiệm 200 mẫu 30 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .32 3.1 Lựa chọn quy trình ly trích phù hợp cho xét nghiệm DNA 32 3.2 Kết cải tiến quy trình ly trích NaOH- SDS 40 3.3 Đáng giá hiệu quy trình ly trích cải tiến 43 3.3.1 So sánh quy trình cải tiến với quy trình thương mại 43 3.3.2 Ứng dụng ly trích thử nghiệm 46 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO .52 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Kết hiển thị Liz scan -WEN Internal Lane Standard Hình 1.2: Kết hiển thị cho Allelic ladder với màu huỳnh quang 10 Hình 1.3: Kết điện di STR kit PowerPlex ®Fusion System 11 Hình 1.4: Ly trích silica 14 Hình 1.5: Cấu tạo hóa học chất tẩy rửa 17 Hình 1.6: Cấu trúc hóa học SDS 18 Hình 1.7: Cấu trúc hóa học triton X100 18 Hình 1.8: Tế bào niêm mạc miệng kính hiển vi 19 Hình 2.1: Sơ đồ nội dung nghiên cứu 23 Hình 2.2: Mẫu niêm mạc miệng TE1X 25 Hình 3.1: Kết điện di STR mẫu ly trích E.Z.N.A.®Forensic DNA Kit 33 Hình 3.2: Kết điện di STR mẫu ly trích triton X100 34 Hình 3.3: Kết điện di STR mẫu ly trích NaOH 35 Hình 3.4: Kết điện di STR mẫu ly trích NaOH + SDS .36 Hình 3.5: Biểu đồ so sánh hiệu ly trích phương pháp 38 Hình 3.6: So sánh hiệu ly trích nồng độ SDS 41 Hình 3.7: So sánh chiều cao peak trung bình hai phương pháp ly trích 45 Hình 3.8: Kết điện di STR mẫu ly trích NaOH+ SDS cải tiến .47 [25] Woodard D L et al “Process for purifying DNA on hydrated silica,” U.S patent 5342931, 1994 [26] Li Yi “A magnetic nanoparticles-based method for DNA extraction from the saliva of stroke patients” Neural regeneration research, Vol.8, No.32, pp 30363046, 2013 [27] Tian et al “Evaluation of Silica Resins for Direct and Efficient Extraction of DNA from Complex Biological Matrices in a Miniaturized Format” Analytical Biochemistry, vol.283, pp.175-191, 2000 [28] H C Birnboim and J Doly “A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA” Nucleic Acids Research, vol.7(6), pp.1513– 1523, 1979 [29] Siun Chee Tan “DNA, RNA, and Protein Extraction: The Past and The Present” Journal of Biomedicine and Biotechnology, Vol.2009, page.10-30, 2009 [30] Giovanni Salvi “Effective interactions between chaotropic agents and proteins” Protein, vol.61, pp.492-499, 2005 [31] Jordi et al “The action of Triton X-100 and sodium dodecyl sulphate on lipid layers Effect on monolayers and liposomes” Micro and Nano Carriers, vol.7, Pages 255-259 , 1990 [32] Natarajan et al “A Modified SDS-Based DNA Extraction Method for High Quality Environmental DNA from Seafloor Environments” Frontiers in Microbiology, vol.7, 2016 [33] Walker JM The Protein Protocols Handbook (Third Edition) New York (NY): Springer-Verlag New York, LLC, 2009 [34] Birnboim HC and Doly J "A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA" Nucleic Acids Res Vol 7, pp 1513–23, 1979 [35] Michael S Adamowicz1 et al “Evaluation of Methods to Improve the Extraction and Recovery of DNA from Cotton Swabs for Forensic Analysis” Plos one, 2014 54 [36] Brenda Richards “Multiplex PCR amplification from the CFTR gene using DNA prepared from buccal brushes/swab” Human Molecular Genetics, Vol No.2 159-163, 1992 [37] Daniel, (1995) “A Simple "Universal" DNA Extraction Procedure Using SDS and Proteinase K Is Compatible with Direct PCR Amplification” Genome Research, vol 4, pp.368-370, 1995 [38] Amy H Walker et al “Collection of Genomic DNA by Buccal Swabs for Polymerase Chain Reaction-Based Biomarker Assays” Environmental Health Perspectives ,Vol 107, pp.517-520, 1999 [39] Klintschar M and Neuhuber F, “Evaluation of an alkaline lysis method for the extraction of DNA from whole blood and forensic stains for STR analysis” J Forensic Sci, vol.45(3), pp.669–673, 2000 [40] Kidon Sung et al “A simple and effcient Triton X-100 boiling and chloroform extraction method of RNA isolation from Gram-positive and Gram-negative bacteria” FEMS Microbiology Letters , vol.229, pp 97-101, 2003 [41] Todd C Lorenz “Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies” Journal of Visualized Experiments 2012 [42] Konat, G.W et al “PCR Technology: Current Innovations” 3st edition, 1994 [43] Wijer et al “Determinants of DNA yield and purity collected with buccal cell samples” Eur J Epidemiol, Vol 24, pp.677–682, 2009 [44] Feigelson et al “Determinants of DNA Yield and Quality from Buccal Cell Samples Collected with Mouthwash” Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention, Vol.10, pp.1005-1008, 2001 55 CHƢƠNG IV: PHỤ LỤC Thí nghiệm lựa chọn quy trình ly trích phù hợp Bảng 1: Cường độ huỳnh quang (RFU) mẫu ly trích Triton X100 Phƣơng pháp ly trích Ký hiệu mẫu Amelogenin D3S1358 T1 96 84 36 24 105 92 45 20 10 10 40 D1S1656 D2S441 QUY TRÌNH A: Ly trích bẳng triton X100 Cường độ huỳnh quang RFU T2 T3 T4 84 73 32 25 92 80 35 23 10 T5 160 135 75 40 15 10 D10S1248 D13S317 Penta E D16S539 D18S51 16 23 16 15 25 18 16 22 15 22 31 20 18 D2S1338 CSF1PO Penta D TH01 vWA D21S11 10 15 10 15 69 59 92 58 58 120 58 60 90 13 100 100 150 120 140 190 5 5 5 25 10 10 15 10 30 33 18 40 39 16 12 28 8 18 20 13 18 20 18 17 18 14 15 10 10 22 15 38 36 23 59 36 TPOX DYS391 D8S1179 D12S391 D19S433 FGA 27 20 D7S820 D5S818 30 80 35 10 D22S1045 Số peak lên 19 % số peak lên 49 Trung bình mẫu 33 Chiều cao peak trung bình phương pháp: % số peak lên trung bình phương pháp 22 56 33 29 74 45 37 55% Bảng : Cường độ huỳnh quang (RFU) mẫu ly trích NaOH Phƣơng pháp ly trích Ký hiệu mẫu Amelogenin D3S1358 D1S1656 D2S441 N1 140 110 60 40 10 10 10 QUY TRÌNH B: Ly trích bẳng NaOH Cường độ huỳnh quang RFU N2 N3 N4 170 90 50 30 15 10 40 N5 130 110 45 35 110 85 40 30 130 100 50 40 10 10 10 50 50 30 30 40 25 20 35 20 25 39 30 20 17 80 80 120 110 100 150 10 10 10 10 D10S1248 10 D13S317 Penta E D16S539 D18S51 40 45 30 10 20 10 15 20 18 10 10 10 20 10 120 120 240 110 120 260 80 120 180 10 10 15 14 10 10 15 10 15 15 15 10 20 15 10 10 15 15 38 40 20 30 35 28 28 25 25 28 28 20 20 24 27 36 12 12 16 15 22 30 77 45 24 62 42 19 49 38 23 59 43 D2S1338 CSF1PO Penta D TH01 vWA D21S11 D7S820 D5S818 TPOX 10 DYS391 D8S1179 D12S391 D19S433 30 FGA D22S1045 Số peak lên 26 % số peak lên 67 Trung bình mẫu 46 Chiều cao peak trung bình phương pháp: % số peak lên trung bình phương pháp 43 63% Bảng : Cường độ huỳnh quang (RFU) mẫu ly trích NaOH + SDS Phƣơng pháp ly trích Ký hiệu mẫu NS1 QUY TRÌNH C: Ly trích bẳng NaOH + SDS Cường độ huỳnh quang RFU NS2 NS3 NS4 NS5 1000 800 260 260 60 60 400 960 720 250 250 60 60 360 1200 1000 380 380 50 50 500 780 690 220 220 50 50 400 1200 950 350 350 80 80 450 60 50 60 50 50 50 380 420 400 50 40 60 40 30 30 310 330 320 50 45 50 40 20 20 460 480 470 50 35 50 20 20 20 310 320 320 80 60 80 50 50 50 420 430 430 100 120 125 90 100 110 120 130 135 90 100 110 120 125 130 120 90 130 100 125 750 750 1200 650 600 1000 1000 900 1600 610 600 960 820 800 1400 50 50 170 40 40 150 80 50 240 40 40 140 50 50 200 100 100 50 60 60 50 100 100 50 80 80 50 100 100 50 50 280 250 250 40 220 210 210 50 350 340 340 30 210 210 210 50 290 285 290 200 200 80 65 15 180 180 70 50 15 270 275 95 85 15 170 180 80 60 20 220 240 120 80 20 10 Số peak lên 39 % số peak lên 100 Trung bình mẫu 242 Chiều cao peak trung bình phương pháp: % số peak lên trung bình phương pháp 10 39 100 208 15 39 100 299 10 39 100 198 15 39 100 277 Amelogenin D3S1358 D1S1656 D2S441 D10S1248 D13S317 Penta E D16S539 D18S51 D2S1338 CSF1PO Penta D TH01 vWA D21S11 D7S820 D5S818 TPOX DYS391 D8S1179 D12S391 D19S433 FGA D22S1045 245 100% Bảng : Cường độ huỳnh quang (RFU) mẫu ly trích kit thương mại(ĐC) Phƣơng pháp ly trích Ký hiệu mẫu O1 2500 D1S1656 D2S441 D10S1248 D13S317 Penta E D16S539 D18S51 D2S1338 CSF1PO Penta D TH01 vWA D21S11 D7S820 D5S818 TPOX DYS391 D8S1179 D12S391 D19S433 FGA D22S1045 Số peak lên % số peak lên Trung bình mẫu Chiều cao peak trung bình phương pháp: % số peak lên trung bình phương pháp O5 2200 2100 2100 1800 2200 1000 900 300 300 1400 1850 900 850 300 300 1300 1850 900 850 200 300 1200 1900 900 850 300 300 1200 1700 800 750 200 200 1100 300 100 200 100 100 100 1100 300 100 300 150 100 100 900 850 1100 200 100 200 100 100 100 880 870 1000 300 100 250 150 100 100 880 850 1000 200 100 150 150 100 100 770 750 880 200 200 400 220 220 370 200 200 300 180 180 240 400 450 370 300 240 2300 2100 4400 1850 1750 3600 1650 1550 3200 1650 1550 2900 1450 1350 2800 150 100 1000 150 150 800 150 120 700 100 100 700 100 100 500 350 350 200 300 300 200 200 250 200 200 200 150 200 200 150 100 960 750 900 100 760 650 760 100 720 630 730 100 680 580 650 100 640 500 640 500 480 270 270 120 120 39 100 759 470 400 230 230 110 100 39 100 661 370 360 200 210 120 110 39 100 608 400 380 190 190 100 100 39 100 595 350 350 220 220 110 100 39 100 530 Amelogenin D3S1358 QUY TRÌNH D: Ly trích đối chứng Cường độ huỳnh quang RFU O2 O3 O4 1000 1300 250 250 400 631 100% Thí nghiệm tối ƣu hóa nồng độ SDS Bảng : Cường độ huỳnh quang (RFU) mẫu ly trích nồng độ SDS 0.045% Nồng độ SDS Ký hiệu mẫu 0045-1 0.045% Cường độ huỳnh quang RFU 0045-2 0045-3 0045-4 0045-5 130 105 60 40 105 92 45 30 125 115 55 40 125 115 50 38 10 10 10 10 180 165 80 50 10 10 15 27 38 30 24 33 26 25 40 22 26 41 26 36 63 38 13 10 14 15 23 10 10 10 19 90 90 130 85 78 120 105 105 160 150 145 210 145 140 220 5 10 10 5 5 20 10 10 10 10 30 10 30 10 29 32 12 22 25 12 31 33 13 42 48 18 46 49 19 20 17 23 34 33 Số peak lên 22 % số peak lên 56 Trung bình mẫu 45 Chiều cao peak trung bình phương pháp: % số peak lên trung bình phương pháp 21 54 38 21 54 47 25 64 58 25 64 68 Amelogenin D3S1358 D1S1656 D2S441 D10S1248 D13S317 Penta E D16S539 D18S51 D2S1338 CSF1PO Penta D TH01 vWA D21S11 D7S820 D5S818 TPOX 25 DYS391 D8S1179 D12S391 D19S433 FGA D22S1045 46 58% Bảng : Cường độ huỳnh quang (RFU) mẫu ly trích nồng độ SDS 0.035% Nồng độ SDS Ký hiệu mẫu 0035-1 0.035% Cường độ huỳnh quang RFU 0035-2 0035-3 0035-4 0035-5 510 420 150 150 35 35 210 600 480 160 160 25 25 220 480 360 120 120 30 30 180 520 420 160 160 30 30 200 480 370 130 130 40 35 180 35 25 35 20 20 20 190 210 210 25 20 25 15 15 15 210 220 210 30 30 30 10 15 15 155 160 155 30 30 30 10 10 10 175 185 185 35 35 35 20 20 20 160 170 180 60 65 70 55 60 70 45 55 60 50 60 60 55 55 60 65 60 45 60 50 470 465 760 410 395 640 330 330 520 350 340 560 320 320 520 30 30 120 30 25 85 20 20 70 20 20 80 15 15 70 60 60 30 35 35 30 30 30 20 30 30 20 30 30 25 30 160 150 155 25 140 130 130 20 120 105 105 20 120 120 125 25 120 110 110 110 115 60 50 10 105 110 55 40 10 90 95 35 28 10 100 105 40 30 10 85 95 45 30 10 Số peak lên 38 % số peak lên 97 Trung bình mẫu 252 Chiều cao peak trung bình phương pháp: % số peak lên trung bình phương pháp 38 97 238 38 97 193 38 97 212 38 97 199 Amelogenin D3S1358 D1S1656 D2S441 D10S1248 D13S317 Penta E D16S539 D18S51 D2S1338 CSF1PO Penta D TH01 vWA D21S11 D7S820 D5S818 TPOX DYS391 D8S1179 D12S391 D19S433 FGA D22S1045 123 97% Bảng : Cường độ huỳnh quang (RFU) mẫu ly trích nồng độ SDS 0.025% Nồng độ SDS Ký hiệu mẫu 0025-1 Amelogenin D3S1358 D1S1656 D2S441 D10S1248 D13S317 Penta E D16S539 D18S51 D2S1338 CSF1PO Penta D TH01 vWA D21S11 D7S820 D5S818 TPOX DYS391 D8S1179 D12S391 D19S433 FGA D22S1045 Số peak lên % số peak lên Trung bình mẫu Chiều cao peak trung bình phương pháp: % số peak lên trung bình phương pháp 0.025% Cường độ huỳnh quang RFU 0025-2 0025-3 0025-4 0025-5 980 750 250 250 60 60 360 1200 1000 380 380 50 50 500 1000 800 260 260 60 60 400 1200 950 350 350 80 80 450 1000 800 260 260 65 60 380 50 40 60 40 30 30 310 330 320 50 45 50 40 20 20 460 480 480 60 50 60 50 50 50 360 400 400 80 60 80 50 50 50 420 430 430 65 55 65 30 30 30 380 400 400 90 100 110 120 130 135 100 120 125 120 125 130 90 110 120 90 130 120 125 90 650 600 1000 900 900 1600 750 750 1200 820 800 1400 750 740 1200 40 40 150 80 50 240 50 50 170 50 50 200 30 30 160 60 60 50 100 100 50 100 100 50 100 100 50 60 60 30 40 220 210 210 50 350 340 340 50 280 250 250 50 290 285 290 30 280 250 250 180 180 70 50 15 10 39 100 209 270 275 95 85 15 15 39 100 297 200 200 80 65 15 10 39 100 241 220 240 120 80 20 15 39 100 277 200 210 80 70 15 15 39 100 235 252 100% Bảng : Cường độ huỳnh quang (RFU) mẫu ly trích nồng độ SDS 0.015% Nồng độ SDS Ký hiệu mẫu 0015-1 Amelogenin D3S1358 D1S1656 D2S441 D10S1248 D13S317 Penta E D16S539 D18S51 D2S1338 CSF1PO Penta D TH01 vWA D21S11 D7S820 D5S818 TPOX DYS391 D8S1179 D12S391 D19S433 FGA D22S1045 Số peak lên % số peak lên Trung bình mẫu Chiều cao peak trung bình phương pháp: % số peak lên trung bình phương pháp 0.015% Cường độ huỳnh quang RFU 0015-2 0015-3 0015-4 0015-5 1750 1500 750 750 250 260 950 2000 1750 760 750 200 200 1200 2000 1750 750 750 250 250 1200 2000 1700 750 740 200 200 1100 1500 1300 600 550 150 200 800 250 150 200 180 150 150 680 670 880 200 100 180 150 110 110 800 780 890 250 100 200 200 100 100 800 760 910 200 100 180 150 100 100 899 790 910 200 100 180 150 100 100 580 540 680 200 210 250 200 200 250 200 230 300 210 210 310 150 150 230 250 255 320 310 230 1650 1550 3100 1450 1350 2800 1470 1400 2800 1450 1350 2800 1100 1000 2000 100 100 700 110 100 500 110 100 500 100 100 600 100 100 400 200 200 120 200 210 150 200 200 180 200 210 180 200 200 150 70 680 520 680 75 600 480 520 80 640 500 630 85 640 500 640 80 440 390 440 350 340 180 180 80 70 39 100 975 320 300 160 160 100 80 39 100 950 350 340 180 170 110 90 39 100 982 340 320 170 170 110 95 39 100 971 285 280 130 130 80 80 39 100 737 517 100% Bảng : Cường độ huỳnh quang (RFU) mẫu ly trích nồng độ SDS 0.01% Nồng độ SDS Ký hiệu mẫu 001-1 0.01% Cường độ huỳnh quang RFU 001-2 001-3 001-4 001-5 2000 1500 770 750 200 200 900 1800 1300 600 600 200 200 900 1800 1600 750 750 250 250 1100 2000 1700 800 800 200 200 1000 2800 1500 1300 1250 300 300 1450 200 100 150 120 100 100 590 585 760 200 100 150 140 100 100 530 520 680 250 70 150 120 100 100 680 670 880 200 100 150 110 100 100 860 850 960 300 150 250 200 150 150 1100 1100 1300 180 180 230 160 160 180 200 210 330 200 200 320 300 350 450 230 190 330 330 450 1200 1100 2400 1050 950 2000 1450 1350 2900 2100 1950 4000 2200 2000 4000 100 100 400 50 50 400 150 150 600 200 200 900 200 200 900 200 200 200 200 200 100 200 200 100 400 400 300 400 400 250 100 530 420 540 50 440 350 450 50 600 480 630 100 840 650 830 100 910 730 900 280 275 140 140 80 80 39 100 840 240 230 140 140 90 80 39 100 735 380 370 170 170 80 70 39 100 947 430 430 220 220 100 100 39 100 1168 450 450 250 250 130 120 39 100 1370 Amelogenin D3S1358 D1S1656 D2S441 D10S1248 D13S317 Penta E D16S539 D18S51 D2S1338 CSF1PO Penta D TH01 vWA D21S11 D7S820 D5S818 TPOX DYS391 D8S1179 D12S391 D19S433 FGA D22S1045 Số peak lên % số peak lên Trung bình mẫu Chiều cao peak trung bình phương pháp: % số peak lên trung bình phương pháp 567 100% Bảng 10 : Cường độ huỳnh quang (RFU) mẫu ly trích nồng độ SDS 0.005% Nồng độ SDS Ký hiệu mẫu Amelogenin D3S1358 D1S1656 D2S441 0005-1 150 110 60 40 10 10 10 0.005% Cường độ huỳnh quang RFU 0005-2 0005-3 0005-4 180 90 60 40 15 10 40 160 135 75 40 15 10 10 50 50 30 30 80 35 20 18 10 20 10 15 20 18 27 120 120 240 110 120 260 120 140 190 100 100 150 10 10 15 14 10 5 5 10 15 10 15 15 15 10 15 10 25 10 38 40 20 30 35 28 28 25 25 40 39 16 12 28 30 33 18 0005-5 92 80 35 23 105 92 45 20 10 10 40 D10S1248 D13S317 Penta E D16S539 D18S51 40 45 30 D2S1338 CSF1PO Penta D TH01 vWA D21S11 D7S820 D5S818 TPOX DYS391 D8S1179 D12S391 D19S433 30 22 31 20 15 25 18 15 20 15 10 22 58 58 120 18 20 18 15 10 FGA D22S1045 Số peak lên 26 % số peak lên 67 Trung bình mẫu 47 Chiều cao peak trung bình phương pháp: % số peak lên trung bình phương pháp 30 77 46 29 74 45 23 59 36 22 56 33 42 67% Thí nghiệm ly trích so sánh với kit thƣơng mại (10 mẫu) Bảng 11.1: Cường độ huỳnh quang (RFU) mẫu ly trích kit thương mại QT ly trích CODE Nhóm tuổi E.Z.N.A.®Forensic DNA Kit 1-DC 2-DC 3-DC 50-60 tuổi 4900 4700 1500 1500 1450 1450 5600 4500 1200 1200 1500 1500 800 700 4400 3500 1600 1600 2300 2300 2300 2100 2100 2000 5000 4500 8000 7000 600 500 2600 2500 2400 2400 4000 4000 4000 4000 1800 3200 1650 3200 2500 1700 2600 2300 1800 1700 1000 1500 1700 3500 3100 2600 2100 4300 Số peak lên Số peak cao dƣới 50 RFU Amelogenin D3S1358 D1S1656 D2S441 D10S1248 D13S317 Penta E D16S539 D18S51 D2S1338 CSF1PO Penta D TH01 vWA D21S11 D7S820 D5S818 TPOX DYS391 D8S1179 D12S391 D19S433 FGA D22S1045 Chiều cao peak TB/mẫu Chiều cao peak trung bình 3200 4000 1200 1400 1100 1000 200 200 3000 2800 2400 2200 1500 1400 1600 1500 1400 1350 4000 3900 4200 1000 1000 4200 2200 2000 2800 4800 4800 1800 1700 1500 1200 3600 3400 2200 1200 1100 200 200 4000 3500 2100 2000 2000 1900 3600 1500 1500 4000 4100 7600 7300 450 450 2800 2800 2000 2000 3800 4-DC 3200 3200 1900 1900 1800 1500 3200 1100 1000 1000 1000 250 200 2600 2200 2100 1800 1500 900 1500 1400 2100 3200 3200 3200 3200 800 750 2100 2000 3200 3200 5-DC 6-DC 20-30 tuổi 4900 5100 4900 1600 1400 2800 2600 800 400 450 450 100 100 3600 3000 2900 2700 1100 1000 700 600 200 200 4000 4000 6400 5600 700 700 1400 1300 800 800 400 350 150 950 900 2800 2300 1000 1000 1700 3800 4000 1400 1400 1100 1100 3300 3000 900 800 2000 400 400 2800 2800 1900 1800 1400 1100 2100 1800 1200 1200 3800 3500 7600 400 400 2000 1900 1700 1700 1500 1450 1200 2400 1800 2300 2300 3200 2600 1600 1500 850 700 7-DC 8-DC 3600 3600 3500 1850 1900 1900 900 900 2500 2400 900 800 900 900 300 300 2100 2100 1500 1500 1250 1100 1200 1050 1100 1150 3200 3200 5200 3900 500 500 2000 2000 2000 1300 1300 1300 1200 1400 1100 2100 2100 2000 1400 2800 650 600 1300 1200 600 400 500 500 100 100 1100 1000 900 900 650 600 750 600 500 500 1500 1500 4000 200 200 1100 900 600 600 500 500 500 850 750 1000 950 950 2100 700 600 150 160 9-DC 10-DC Dưới tuổi 2200 2400 1000 1000 900 900 1600 1500 800 600 700 700 150 150 1300 1200 1300 1200 800 650 1100 800 2000 2900 4200 2400 1000 1000 2000 1950 1950 700 650 100 100 1000 950 3600 700 300 1000 900 500 450 330 2400 2300 500 500 1200 1100 1100 800 700 650 500 700 700 1100 900 1200 850 850 800 650 6800 600 600 1700 1500 1700 1600 800 800 500 450 1000 2500 1800 4000 3400 3500 2500 2000 1900 1100 800 900 1300 1250 2900 2200 2450 2400 1600 1550 450 450 45 40 44 43 44 45 44 45 44 40 0 0 0 0 0 2637 2238 2536 1852 1801 1958 1747 876 1076 1293 2470 400 1839 800 1081 1000 650 1600 1400 1300 800 1500 1200 200 200 Bảng 11.2: Cường độ huỳnh quang (RFU) mẫu ly trích quy trình tối ưu NaOH + SDS tối ƣu QT ly trích CODE Nhóm tuổi 1-TU 2-TU 4000 4000 1700 1700 1600 1500 440 3850 900 800 1100 1100 500 400 3600 2800 1600 1600 1700 1600 1400 1400 1000 900 3700 3700 7600 6500 400 400 1300 1300 1050 1000 2100 3900 3850 3800 800 1900 1000 2800 2300 1900 1800 1400 1200 800 1100 1600 1850 3400 3100 2500 2000 4350 Số peak lên Số peak cao dƣới 50 RFU Amelogenin D3S1358 D1S1656 D2S441 D10S1248 D13S317 Penta E D16S539 D18S51 D2S1338 CSF1PO Penta D TH01 vWA D21S11 D7S820 D5S818 TPOX DYS391 D8S1179 D12S391 D19S433 FGA D22S1045 Chiều cao peak TB/mẫu Chiều cao peak trung bình 3-TU 4-TU 50-60 tuổi 3200 3700 1200 1400 1200 1100 200 200 2800 2500 2300 2200 1600 1600 1750 1750 1300 1200 3800 3900 4300 1100 950 4200 2150 2100 2800 5-TU 6-TU 7-TU 8-TU 20-30 tuổi 4800 4800 1900 1700 1600 1200 3600 3300 2200 1200 1100 200 150 4000 3500 2250 2000 2000 1900 3600 1450 1500 4000 4100 7600 7500 450 450 2800 2800 2100 2000 3800 3200 3150 1900 1900 1900 1500 3200 1200 1000 900 1000 300 200 2500 2200 2000 1800 1500 1000 1500 1400 2000 3300 3200 3200 3300 800 750 2150 2000 3200 3170 4900 5100 4800 1600 1350 2700 2500 800 350 450 500 100 110 3700 3000 2950 2700 1000 1050 700 600 350 200 4000 4000 6400 5300 700 700 1300 1350 800 700 350 350 150 900 1000 2800 2100 1000 1000 1650 3100 4000 1000 1000 500 400 1500 1400 400 300 600 100 100 2500 2200 800 650 650 400 650 600 300 300 3000 3000 8000 150 150 500 500 400 400 300 300 200 1350 1000 1500 1200 1400 1200 600 500 100 100 9-TU 10-TU Dưới tuổi 3600 3600 3450 1850 1900 1880 850 900 2550 2400 900 850 900 900 400 350 2100 2100 1600 1700 1250 1100 1200 1100 1100 1150 3100 3200 5400 3900 500 600 2000 2000 2350 1300 1300 1300 1290 1400 1100 2100 2100 2000 1400 2800 700 600 1350 1200 600 500 500 500 100 100 1000 1100 900 850 650 600 750 600 450 500 1500 1500 4000 200 200 1100 900 600 600 500 500 500 850 750 1100 950 950 200 700 600 150 150 2200 2450 1000 1000 900 900 1600 1550 800 500 700 600 150 150 1300 1300 1300 1200 800 650 1100 800 2100 2900 5600 2500 1100 1100 1500 1500 1500 700 650 150 150 1200 1100 4000 800 300 1000 900 600 500 3400 2300 2300 500 500 1200 1100 1100 900 700 650 500 800 700 1100 900 1350 850 850 800 650 6800 800 800 1700 1600 1700 1700 800 800 450 500 950 2500 1800 4000 3400 3450 2500 2000 1900 1100 900 900 1300 1200 2900 2200 2300 2400 1700 1550 450 500 45 40 44 43 44 45 44 45 44 40 0 0 0 0 0 1914 2223 2547 1854 1783 1096 1774 837 1084 1441 2228 400 1626 850 1120 1100 700 2000 1400 1300 800 1600 1200 300 300 Bảng 12: Danh sách mẫu có peak cao 100 RFU CODE Amelogenin D3S1358 D1S1656 D2S441 D10S1248 D13S317 Penta E D16S539 D18S51 D2S1338 CSF1PO Penta D TH01 vWA D21S11 D7S820 D5S818 TPOX DYS391 D8S1179 D12S391 D19S433 FGA D22S1045 Sốvùng có peak cao dƣới 50 RFU Chiều cao peak TB/mẫu 50 52 63 74 76 79 91 96 122 145 147 157 196 1000 1000 900 2700 2800 1400 1300 1300 1100 2700 2100 700 500 600 600 130 70 2000 2750 1500 1300 1300 700 1300 1200 600 500 1900 1900 7600 1300 1300 1300 800 810 800 750 1700 1700 900 800 500 400 1000 900 300 200 200 150 50 50 1300 1100 750 550 550 450 500 400 150 150 2100 1900 2800 2500 150 150 550 400 400 400 800 920 920 350 430 250 500 400 70 70 2400 2800 3200 1400 1300 1200 1100 2400 2000 400 400 800 4200 230 250 560 560 430 420 250 230 100 90 840 2400 2400 1500 1400 1000 800 1200 1100 1100 2000 400 2200 2200 1200 1100 600 500 1600 1100 500 400 450 400 80 80 1400 1300 1100 1000 800 700 800 800 400 300 2250 2250 3600 2800 300 300 800 800 1000 1000 1300 1250 1000 1400 1500 1600 950 1100 1000 400 300 1100 1200 650 550 400 450 1100 950 350 200 300 300 50 50 880 700 550 250 460 420 480 450 350 350 900 950 1750 1700 200 200 500 450 450 400 300 300 200 350 320 640 600 640 500 320 300 150 120 1 400 400 400 200 100 100 100 80 50 550 500 750 650 250 250 200 150 1000 1000 850 125 125 300 500 260 260 180 210 150 750 380 230 200 200 180 200 200 150 70 370 500 500 1000 1000 1000 900 800 800 400 750 750 2000 1750 1750 1250 950 1000 600 1339 400 360 320 320 330 640 350 480 480 500 450 900 650 1300 1200 2400 650 550 150 150 100 1250 1100 1200 1200 1800 600 600 100 100 900 800 100 100 600 600 400 800 800 100 100 1100 1200 650 550 400 450 1100 950 350 200 300 300 50 50 880 700 550 250 460 420 480 450 350 350 900 950 1750 1700 200 200 500 450 450 400 300 300 200 350 320 640 600 640 500 320 300 150 120 1 1 1 1 464 510 1016 1069 1189 1472 527 724 364 450 450 300 200 50 50 1000 750 450 300 200 150 100 150 100 100 1300 1300 1200 1200 150 150 400 350 250 200 150 180 150 1200 700 300 300 450 450 170 180 60 60 420 420 420 320 420 450 450 450 1400 2500 200 150 600 550 550 500 550 1400 1200 400 400 700 400 300 2400 2400 2400 2400 650 2400 900 800 300 250 2000 900 100 70 900 9000 1400 900 80 80 3000 2600 1600 1500 800 950 900 1000 500 400 400 1500 1600 2000 6600 200 200 1500 1700 600 600 1000 700 1200 1200 1700 7600 4700 100 1000 200 200 150 150 200 100 900 800 3000 1700 3200 100 600 500 1400 950 700 500 400 300 250 450 430 230 150 150 130 80 80 360 360 230 250 380 220 440 330 330 350 1200 900 750 100 100 750 300 300 250 200 250 480 230 200 200 460 350 380 320 220 250 1000 950 300 250 900 900 600 500 180 180 80 80 1350 1300 1100 1000 1800 1100 700 550 600 3050 3000 4000 2300 300 300 1400 1000 900 1100 800 800 1115 527 ... cho niêm mạc miệng ứng dụng xét nghiệm quan hệ huyết thống Nội dung đề tài bao gồm: - Khảo sát hiệu ly trích số quy trình ly trích DNA, lựa chọn quy trình ly trích phù hợp - Cải tiến quy trình. .. Công Nghệ Sinh Học Mã số: 60420201 I TÊN ĐỀ TÀI: ? ?Cải tiến quy trình ly trích DNA từ niêm mạc miệng Ứng dụng xét nghiệm quan hệ huyết thống? ?? II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Đề xuất quy trình ly trích. .. 2.5 Cải tiến quy trình ly trích phù hợp 29 2.6 Đánh giá hiệu quy trình ly trích cải tiến 29 2.6.1.So sánh quy trình cải tiến với quy trình ly trích thương mại .29 2.6.2 Ly trích