Một trong những nghiên cứu xử lý cánh hoa cúc vạn thọ tươi bằng enzyme trước khi chiết phải kể đến nghiên cứu của Barzana và các cộng sự 2002 với 3 enzyme được sử dụng là Viscozyme, Pect
Trang 1Tiến sĩ Hoàng Thị Huệ An (Bộ môn Hóa) đã tận tình hướng dẫn, cho tôi tiếp cận với các phương pháp nghiên cứu hiện đại, hoàn thiện kiến thức và hoàn thành luận văn
Tiến sĩ Trần Thị Hoàng Quyên (Bộ môn Hóa) đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong việc tìm kiếm tài liệu phục vụ cho việc nghiên cứu đề tài này
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Nha Trang, ngày 12 tháng 07 năm 2012
Sinh viên thực hiện
Lương Thị Trúc Mai
Trang 2
MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN i
MỤC LỤC .ii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv
DANH MỤC CÁC HÌNH .vi
MỞ ĐẦU .1
PHẦN 1 TỔNG QUAN 3
1.1 Tổng quan về hoa cúc vạn thọ .3
1.1.1 Tên gọi .3
1.1.2 Phân loại và đặc điểm hình thái 3
1.2 Tổng quan về enzyme .5
1.2.1 Giới thiệu về enzyme Viscozyme 5
1.2.2 Ứng dụng của Viscozyme .6
1.3 Khái quát về lutein 7
1.3.1 Cấu tạo phân tử 7
1.3.2 Tính chất lý-hóa 8
1.3.3 Hoạt tính sinh học 9
1.3.4 Ứng dụng 10
1.3.5 Các nguồn lutein trong tự nhiên .11
1.4.2 Tính chất lý-hóa 13
1.4.3 Hoạt tính sinh học 13
1.4.4 Ứng dụng 14
1.5 So sánh khả năng hấp thụ của lutein và lutein ester 15
1.6 Các nghiên cứu xử lý hoa cúc vạn thọ bằng enzyme .15
PHẦN 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21
2.1 Đối tượng nghiên cứu 21
2.1.1 Nguyên liệu-Hóa chất 21
Trang 32.1.1.1 Nguyên liệu: 21
2.1.1.2 Hóa chất: .21
2.1.2 Dụng cụ, thiết bị 21
2.1.2.1 Dụng cụ: .21
2.1.2.2 Thiết bị .21
2.2 Phương pháp nghiên cứu 22
2.2.1 Phương pháp xử lý nguyên liệu 22
2.2.2 Xác định thành phần khối lượng của nguyên liệu 22
2.2.3 Xác định một số thành phần của hoa 22
2.2.3.1 Xác định lutein tổng số: .22
2.2.3.2 Xác định % TL khô của hoa 23
2.2.4 Bố trí thí nghiệm 23
2.2.4.1 Quy trình chiết lutein ester từ cánh hoa cúc vạn thọ sau khi xử lý bằng Viscozyme 23
2.2.4.2 Xây dựng quy trình xử lý hoa cúc vạn thọ bằng Viscozyme 24
2.2.5 Thử nghiệm chiết lutein ester từ hoa cúc vạn thọ đã được xử lý bởi 33
2.2.6 Phương pháp xử lý số liệu 33
PHẦN 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34
3.1 Kết quả một số thành phần chính của hoa cúc vạn thọ .34
3.2 Kết quả bố trí thí nghiệm 35
3.2.1 Kết quả xác định nồng độ enzyme Viscozyme thích hợp 35
3.2.2 Kết quả xác định tỉ lệ Viscozyme:nguyên liệu thích hợp 36
3.2.3 Kết quả xác định pHtối ưu 37
3.2.4 Kết quả xác định tốc độ ủ, lắc thích hợp 38
3.2.6 Kết quả xác định thời gian ủ thích hợp 40
3.3 Đánh giá hiệu suất chiết của phương pháp chiết mới so với phương pháp truyền thống chiết lutein ester 43
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN .45
TÀI LIỆU THAM KHẢO 46
PHẦN PHỤ LỤC .50
Trang 4Food and Agriculture Organization
Độ hấp thụ Butylat Hydroxytoluen
Hệ số pha loãng
Tổ chức nông lương của Liên Hợp Quốc
Ultraviolet-Visible Volume/volume
Giờ Ete dầu hoả Vòng/phút Trọng lượng khô
Tử ngoại-khả kiến Thể tích/thể tích v/w
w/w
Volume/weight Weight/weight
Thể tích/ khối lượng Khối lượng/khối lượng
Trang 5DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1 Hàm lượng lutein cho phép được có trong thực phẩm 11
Bảng 1.2 Các nguyên liệu có chứa lutein trong tự nhiên 12
Bảng 3.1 Thành phần khối lượng của hoa cúc vạn thọ .34
Bảng 3.2 Một số thành phần chính của hoa cúc vạn thọ .34
Bảng 3.3 Kết quả thử nghiệm quy trình xử lý hoa cúc vạn thọ với Viscozyme 43
Trang 6DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1 Hoa cúc vạn thọ Châu Phi 5
Hình 1.2 Quá trình thủy phân thành tế bào cánh hoa cúc vạn thọ 6
Hình 1.3 Cấu trúc phân tử của lutein 8
Hình 1.4 Cấu tạo phân tử lutein ester 13
Hình 2.1 Sơ đồ quy trình dự kiến chiết lutein ester từ hoa cúc vạn thọ 24
Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ Viscozyme thích hợp 27
Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỉ lệ Viscozyme:nguyên liệu 28
Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỉ lệ pH thích hợp 29
Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tốc độ lắc thích hợp 30
Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ lắc thích hợp 31
Hình 2.7 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian ủ thích hợp 32
Hình 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ Viscozyme đến hiệu suất chiết lutein ester 36
Hình 3.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ Viscozyme:nguyên liệu đến hiệu suất chiết lutein ester 37 Hình 3.3 Ảnh hưởng của pH đến hiệu suất chiết lutein ester 38
Hình 3.4 Ảnh hưởng của tốc độ ủ, lắc đến hiệu suất chiết lutein ester 39
Hình 3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ, lắc đến hiệu suất chiết lutein ester 40
Hình 3.6 Ảnh hưởng của thời gian ủ đến hiệu suất chiết lutein ester 41
Hình 3.7 Sơ đồ quy trình xử lý hoa cúc vạn thọ bằng Viscozyme 42
Hình 3.8 Dịch chiết chứa lutein ester từ cánh hoa cúc vạn thọ 44
Trang 7
MỞ ĐẦU
Lutein, một sắc tố tự nhiên màu vàng cam thuộc một trong hai nhóm carotenoid, có trong nhiều loài động, thực vật khác nhau Lutein là một trong những carotenoid có nhiều ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm
và dược phẩm nhờ có màu vàng cam rất đẹp và khả năng chống oxy hóa khá
mạnh, do đó, sản phẩm chứa lutein có nhu cầu ngày càng tăng trong thị
trường carotenoid quốc tế [3]
Một trong những nguồn quan trọng nhất để thu lutein là cánh hoa của
Tagetes erecta, thường gọi là cúc vạn thọ Loài cây này rất thích hợp với điều
kiện khí hậu và thổ nhưỡng với nhiều địa phương của nước ta, trong đó có tỉnh Khánh Hòa Đây là yếu tố thuận lợi góp phần hình thành ngành công nghiệp sản xuất và ứng dụng các chế phẩm lutein tại địa phương Khánh Hòa đồng thời đưa hoa cúc vạn thọ trở thành loại cây công nghiệp phục vụ nhu cầu
trong nước và xuất khẩu [3]
Theo các quy trình truyền thống, hoa cúc vạn thọ sau khi thu hoạch được ủ xi-lô, ép bớt nước, sấy khô, nghiền thành bột rồi chiết bằng dung môi hexane Quy trình này có nhiều nhược điểm: có thể gây tổn thất và phân hủy carotenoid trong quá trình ủ xi-lô, sử dụng nhiều dung môi Vì vậy, đã có nhiều công trình nghiên cứu tách chiết lutein bằng các phương pháp khác nhau nhằm thu được hiệu quả kinh tế cao, an toàn cho người sử dụng và thân thiện với môi trường Ngày nay, việc ứng dụng công nghệ enzyme trong các quá trình xử lý hóa học để thay thế một phần các hóa chất là xu thế mới, góp phần làm giảm ô nhiễm môi trường Xử lý hoa cúc vạn thọ bằng enzyme là một giải pháp thay thế để tăng cường hiệu suất thu hồi xanthophyll [9, 22] Gần đây, một số công trình nghiên cứu đồng thời xử lý enzyme và chiết lutein bằng dung môi đã được công bố [7] Trong các công trình này, nhiều loại enzyme đã được đưa vào thử nghiệm để xử lý cánh hoa cúc vạn thọ trước khi
Trang 8chiết với dung môi (như cellulase, pectinase, hemicellulase, Neutrase, xylanase, ), kết quả cho thấy hiệu suất chiết đã được cải thiện đáng kể [6] Một trong những nghiên cứu xử lý cánh hoa cúc vạn thọ tươi bằng enzyme trước khi chiết phải kể đến nghiên cứu của Barzana và các cộng sự (2002) với 3 enzyme được sử dụng là Viscozyme, Pectinex và Neutrase Nghiên cứu này cho thấy rằng việc xử lý hoa cúc vạn thọ bằng Viscozyme đã làm tăng hiệu suất chiết lên đến hơn 45% so với mẫu không xử lý enzyme [7]
Có thể thấy Viscozyme là một enzyme có nhiều tiềm năng trong việc
xử lý hoa cúc vạn thọ trước khi chiết carotenoid Tuy nhiên, cũng như các enzyme thương mại khác, Viscozyme khá đắt tiền nên hiện chưa được sử dụng nhiều trong nghiên cứu và sản xuất thực tế Vì vậy, cho đến nay, cũng chưa thực sự đánh giá hết hiệu quả của Viscozyme trong việc nâng cao hiệu
quả chiết lutein từ cánh hoa cúc vạn thọ Chính vì vậy, đồ án tốt nghiệp “Sử dụng enzyme thương mại Viscozyme cải tiến quy trình chiết lutein ester
từ hoa cúc vạn thọ” đã được thực hiện nhằm nghiên cứu khả năng ứng dụng
Viscozyme trong việc nâng cao hiệu quả chiết lutein ester từ hoa cúc vạn thọ,
từ đó cải tiến quy trình chiết lutein truyển thống
Nội dung nghiên cứu của đề tài:
- Xác định các thông số điều kiện xử lý hoa cúc vạn thọ bằng enzyme Viscozyme nhằm mang lại hiệu suất chiết lutein cao nhất;
- Đề xuất quy trình thử nghiệm chiết xuất lutein từ hoa cúc vạn thọ đã được xử lý bằng enzyme Đánh giá hiệu quả kinh tế của quy trình chiết
Đây là một hướng nghiên cứu khá mới mẻ so với trong nước Vì vậy,
dù đã cố gắng thực hiện, song do kiến thức và kinh nghiệm nghiên cứu hạn chế nên không tránh khỏi những thiếu sót Em rất mong nhận được sự góp ý
từ quý thầy cô và các bạn sinh viên nhằm giúp đề tài có thể được hoàn thiện hơn
Trang 9PHẦN 1 TỔNG QUAN
1.1 Tổng quan về hoa cúc vạn thọ
1.1.1 Tên gọi
Tên Việt Nam: Cúc vạn thọ;
Tên tiếng Anh: marigold;
Tên khoa học: Tagetes spp.;
Họ: Cúc (Asteraceae) [25]
1.1.2 Phân loại và đặc điểm hình thái
Cúc vạn thọ (Tagetes) hay Marigold là một loài hoa có nguồn gốc từ
Trung Mỹ và đã trở thành cây hoa không thể thiếu tại mọi khu vườn Bắc Mỹ, cây rất thích hợp với khí hậu nóng và khô của Mexico và Nam Mỹ Cây được nhà thám hiểm Hernando Cortés đưa về châu Âu vào thế kỷ 14, sau đó, cây
được trồng khắp nơi quanh Địa Trung Hải, rồi mọi nơi trên thế giới [25]
Loài hoa cúc vạn thọ Châu Phi
Tên khoa học là Tagetes erecta, tiếng Anh gọi là African Marigold
Đây thường là giống hoa vạn thọ cây cao nhất và hoa cũng to nhất Đáng kể nhất hiện nay là loài hoa kép, to, nở tròn xoe, không cồi gọi là Ánh Nguyệt (Moonlight), cây cao chừng 40 cm và mọc dày khít nhau Trổ hoa sớm như các giống vạn thọ lai Một loài vạn thọ Châu Phi có hoa kép to và cây cao hơn, khoảng 50−70 cm, hạt đem gieo thường cho nhiều hoa màu sắc khác nhau, từ cam đến vàng, vàng kim, vàng chanh, vàng bơ Tên gọi chung là Gold-n Vanilla Các loài khác của giống này là Golden Age, cây cao hơn 75
cm và Doublon, cây cao đến 1,5 m và hoa rất to với đường kính 12,5 cm [25]
Trang 10Loài hoa cúc vạn thọ Pháp
Tên khoa học là Tagetes patula, tiếng Anh gọi là French Marigold
Loài này thường thấp hơn loài Châu Phi, hoa nhỏ hơn Người dân Âu Mỹ hay trồng các giống hoa đơn một lớp, cánh hoa dài, có cồi
Ví dụ: Giống Oai Vệ (Majestic): cây lùn, cao khoảng 30 cm, hoa vàng đơn, cánh sọc nâu hay sọc màu gõ đỏ, cồi vàng, khiến mọi người chú ý Cây sống ở nơi có khí hậu nóng như đồng bằng nước ta, cây có thể cao hơn 60 cm Giống Kỳ Hoa Sọc Đỏ (Striped Marvel): thân cao đến 75 cm, giống như Oai
Vệ, nhưng sọc đỏ Janie là loài ra hoa sớm nhất và hoa nhiều nhất trong nhóm vạn thọ Pháp Đối với loài này, cây mọc khít, thân lùn, chỉ cao chừng 20 cm, hoa có đường kính 4−5 cm, chỉ cần gieo hạt sau 6 tuần là đã trổ hoa Hoa có nhiều màu sắc khác nhau, có ba màu được ưa thích là vàng, đỏ lửa và vàng kim Loài lùn Naughty Marietta, chỉ cao 25 cm, hoa đơn, cánh bên trong điểm vết nâu Loài Mắt Cọp (Tiger Eyes), cao 30−35 cm là một giống vạn thọ lạ vì cánh đơn đỏ huyết ở viền bìa ngoài hoa, còn bên trong nở như là cúc vàng cam Loài Loạt Nữ Hoàng (Queen Series) hoa nở tựa hoa trà mi, hải đường, cây lùn 25−30 cm, [25]
Loài vạn thọ nhỏ
Tên khoa học là Tagetes tenuifolia, hay Tagetes signata Cây nhỏ, hoa
đơn cánh, có cồi và nhỏ 1−2 cm Loài Stafire Mix hay trồng ở Âu Mỹ, lá thơm mùi chanh bưởi, dễ nhận thấy mùi này khi trời nắng nóng [25]
Loài lai American Marigold
Hoa của loài lai Antigua Yellow có màu vàng tươi, hoa kép to 7−8 cm, trồng ở làng hoa Gò Vấp, Việt Nam Sau 60 ngày gieo hạt đã ra hoa, hoa nở liên tiếp nhiều tháng, thời gian có hoa lâu nhất trong các loài hoa cúc vạn thọ Cây mọc khít và cao 30−50 cm, còn gọi là Inca lùn
Trang 11Loài lai Inca Hybrid hoa kép và rất to, 10 13 cm Cây cao 50−70 cm,
ra hoa sớm và vụ hoa kéo dài, vẫn còn hoa khi các loài hoa cúc vạn thọ khác
đã tàn Chịu nhiệt độ đến 39–400C
Giống tam nhiễm lai triploid, thuộc nhóm Solar series F1 là giống phối hợp cây lùn của vạn thọ Pháp và hoa kép to của vạn thọ Châu Phi, vừa chịu lạnh vừa chịu nóng [25]
Hình 1.1 Hoa cúc vạn thọ Châu Phi
1.2 Tổng quan về enzyme
1.2.1 Giới thiệu về enzyme Viscozyme
Viscozyme L được sử dụng trong đề tài là sản phẩm của hãng Novozyme (Đan Mạch), bao gồm các enzyme hoạt động: cellulase, hemicellulase, xylanase
Đặc tính của sản phẩm Viscozyme :
- Màu sắc: nâu;
- Trạng thái vật lý: lỏng;
- Chất bảo quản: kali sorbat;
Viscozyme là sản phẩm từ chủng nấm mốc Aspergillus aculeatus
Viscozyme chứa các carbohydrase có thể làm phân hủy cellulose và
Trang 12hemicellulose, thành phần chủ yếu của thành tế bào thực vật, nơi ngăn ngừa mất nước và duy trì tính toàn vẹn của tế bào trong thành tế bào, do đó giúp
làm tăng khả năng chiết các chất có bên trong tế bào [26]
+ Xylanase: là một enzyme có tác dụng phá vỡ hemicellulose-một trong những thành phần chủ yếu của thành tế bào
+ Hemicellulase: có tác dụng phá vỡ các thành phần của thành tế bào, chủ yếu là hemicellulose
+ Cellulase: là một phức hệ enzyme có tác dụng thuỷ phân cellulose thông qua việc thuỷ phân liên kết 1,4-β-glucoside trong cellulose (hình 1.2)
Hình 1.2 Quá trình thủy phân thành tế bào cánh hoa cúc vạn thọ
Trang 131.3 Khái quát về lutein
Lutein đã được các Tổ chức FDA ở Mỹ, Canada và EU cho phép sử dụng trong chế biến thực phẩm (mã số E 161b) để tạo màu vàng, vàng cam cho nhiều loại nước giải khát, bổ sung vào trong chăn nuôi gia cầm Kết quả khảo sát cho thấy cúc vạn thọ châu Phi là nguồn nguyên liệu lý tưởng cho việc thu nhận lutein: Cánh hoa có hàm lượng lutein ester khá lớn (1,0-1,6% carotenoid tổng số tính theo trọng lượng khô), trong đó, khoảng 90% lượng carotenoid là lutein và 5% zeaxanthin [18]
Dịch chiết lutein có chứa hơn 80% carotenoid tổng số, trong đó, phần lớn là lutein (70−78%), ngoài ra, còn có zeaxanthin (2−9%) và các carotenoid khác cũng có mặt Bên cạnh đó, trong dịch chiết lutein còn tìm thấy các loại sáp (14%) và các axit béo (1%) Lutein tạo liên kết hóa học với các loại axit béo khác nhau, như acid lauric, mystric và palmitic [13]
Lutein ester là một trong những hợp chất thu được từ chất dầu nhựa lutein (lutein oleoresin) được chiết xuất từ cánh hoa cúc vạn thọ bằng các dung môi hữu cơ Sau khi xà phòng hóa, sản phẩm cuối cùng thu được có thành phần chính là lutein và một phần nhỏ zeaxanthin [13]
1.3.1 Cấu tạo phân tử
Lutein là một dạng tiền thân của vitamin A (provitamin A), có công thức phân tử C40H56O2 (khối lượng phân tử 568,88), là một loại carotenoid có màu vàng cam rất phổ biến trong các mô động-thực vật [3]
Lutein thuộc nhóm oxycarotenoid hay xanthophyll (all-trans lutein;
(3R, 3’R, 6’R) – beta, epsilon – carotene – 3, 3’ – diol ) có chứa 2 vòng đầu mạch và có cấu trúc polyisoprenoid với bộ khungC40 cơ bản chung cho tất cả các carotenoid [13], [21]
Lutein trong tự nhiên thường tồn tại ở cấu hình all-trans
Trang 14Hình 1.3 Cấu trúc phân tử của lutein
Sự có mặt của chuỗi polyen gồm trên 7 nối đôi liên hợp làm cho phân
tử carotenoid có khả năng hấp thụ bức xạ khả kiến, tạo ra ánh sáng màu vàng, cam hay đỏ.Lutein hấp thụ ánh sáng màu xanh, do đó, xuất hiện màu vàng ở nồng độ thấp và màu đỏ da cam ở nồng độ cao [2]
Tính chất hóa học
Hệ thống polyen cũng là nguyên nhân làm cho các phân tử carotenoid ở dạng tự do rất dễ bị oxy hóa và đồng phân hóa bởi các tác nhân ánh sáng, nhiệt độ, acid Tuy nhiên, lutein trong các mô động thực vật
có khả năng liên kết với các acid béo, lipid, lipoprotein, Chính vì vậy, màu sắc và độ bền của carotenoid có thể thay đổi đáng kể so với khi chúng
ở trạng thái tự do, hay trong dung môi hữu cơ [2]
Trang 151.3.3 Hoạt tính sinh học
Theo kết quả nghiên cứu của Wu L (2009), lutein khi được thêm vào
chế độ ăn uống có thành phần lutein thấp có thể làm tăng lutein trong huyết
tương ở những con gà đẻ trứng [18]
Các hợp chất xanthophyll, đặc biệt là lutein, thể hiện tính chống oxy
hóa và bắt giữ các gốc tự do sinh ra trong tế bào Các nghiên cứu đã cho thấy
các chất chiết xuất từ hoa cúc vạn thọ có thể sử dụng là chất dinh dưỡng bổ
sung cho người, dựa trên hoạt tính sinh học quan trọng như: phòng chống ung
thư, bảo vệ chống lại sự oxy hóa tế bào, phục hồi hệ dây chằng trong mô, cơ,
và phòng chống thoái hóa điểm vàng liên quan đến tuổi tác [17]
Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh khả năng chống oxy hóa
của lutein trong việc ngăn ngừa bệnh đục thủy tinh thể, thoái hóa võng mạc ở
người già, [23] Võng mạc vốn có chất zeaxanthin, lutein nội sinh Vào tuổi
già, zeaxanthin và lutein bị giảm sút nên bị thoái hóa điểm vàng Lutein tinh
thể được dễ dàng hấp thu từ thức ăn thông qua việc bổ sung chế độ ăn uống,
trong khi đó, lutein ester yêu cầu thủy phân bởi các enzyme trong ruột [8]
Việc cung cấp một liều lượng vừa đủ lutein và zeaxanthin (10 mg lutein và 2
mg zeaxanthin mỗi ngày) giảm 40% sự thoái hóa điểm vàng có liên quan đến
tuổi tác [24]
Nghiên cứu của Alves-Rodrigues A (2004)cho thấy bổ sung lutein làm
tăng lên sắc tố điểm vàng và tầm nhìn được cải thiện ở những bệnh nhân bị
mắc AMD (bệnh thoái hóa điểm vàng ở mắt, gây mất thị lực ở vùng trung tâm
xảy ra ở những người cao tuổi) và các bệnh mắt khác [23]
Lợi ích của lutein cho người không dừng lại ở sức khỏe của mắt Các
nghiên cứu gần đây cho thấy, các hợp chất xanthophyll, đặc biệt là lutein và
zeaxanthin, có thể giúp duy trì sức khỏe tim mạch bằng cách giảm nguy cơ xơ
vữa động mạch Cụ thể, trong nghiên cứu của Alves-Rodrigues A và Shao A
Trang 16(2004) cũng kết luận lutein và zeaxanthin ức chế các yếu tố gây bệnh võng mạc và bệnh tim mạch [6]
Ngoài ra, lutein có khả năng bảo vệ làn da trước tia cực tím Hòa tan dầu lutein và lutein ester với các dầu thảo dược khác có thể dễ dàng thâm nhập vào da cho thấy hiệu quả chống nắng tốt [20]
1.3.4 Ứng dụng
Xanthophyll là nhóm hợp chất có nhu cầu mạnh mẽ tại các thị trường carotenoid trên thế giới Nhờ có màu vàng cam khá đẹp, hoạt tính chống oxy hóa và khả năng hấp thụ bức xạ từ ngoại, lutein được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực chất màu, mỹ phẩm, dược phẩm
Lutein (E 161b) là một chất màu tự nhiên được sử dụng như là một phụ gia thực phẩm Lutein được sử dụng làm chất màu trong thực phẩm như bánh nướng, kẹo cứng, kẹo cao su, kẹo mềm, đồ uống và nước giải khát, nước ép trái cây, ngũ cốc ăn sáng, sản phẩm từ sữa, trứng, các loại thực phẩm trẻ em, chất béo và dầu, nước sốt, súp, [24]
Lutein ester làm phụ gia trong thức ăn chăn nuôi gia cầm (gà), các loài giáp xác (tôm) và cá (cá hồi) Màu sắc tươi sáng của lòng đỏ trứng, da, và các
mô mỡ được tăng lên đáng kể khi bổ sung lutein vào thức ăn cho những động vật kể trên [8] Nghiên cứu của FAO (2004) đã xác định được hàm lượng lutein cho phép được có trong một số loại thực phẩm (bảng 1.1) [13]
Gần đây, trong thành phần nhiều sản phẩm dưỡng da, đặc biệt là trong kem chống nắng, được bổ sung lutein Sản phẩm có chứa lutein với chức năng
là một chất chống oxy hóa quan trọng giúp gia tăng độ ẩm cho da, mái tóc, móng tay Mỹ phẩm chứa carotene, lutein, licopene chống lão hóa và làm mờ các nếp nhăn [24]
Trang 17
Bảng 1.1 Hàm lượng lutein cho phép được có trong thực phẩm
Danh mục thức ăn Phân loại thực phẩm
theo GFSA
Mức độ sử dụng, mg/kg
Ngũ cốc bữa sáng Ngũ cốc ăn liền, luôn được giữ
Sản phẩm của trứng Trứng lỏng, đông lạnh hay khô
Trái cây đã chế biến
và nước ép trái cây
Nước thịt và nước sốt Nước sốt cà chua 2,6
1.3.5 Các nguồn lutein trong tự nhiên
Lutein là một hợp chất carotenoid vốn xuất hiện nhiều trong các loại
rau xanh có màu đậm (rau bina, cải xoăn, cải lá xanh, ), một vài loại trái cây,
hoa, ngô và lòng đỏ trứng gà
Cánh hoa cúc vạn thọ là một trong những nguồn tự nhiên giàu có nhất của xanthophyll, chủ yếu là lutein [9] Hàm lượng lutein ester trong cánh hoa
Trang 18cúc vạn thọ tươi thay đổi từ 4 mg/kg trong hoa có màu vàng lục đến
800 mg/kg trong cánh hoa màu cam nâu Cánh hoa có màu tối chứa lượng lutein nhiều hơn khoảng 200 lần so với những cánh hoa sáng màu hơn [19]
Bảng 1.2 Các nguyên liệu có chứa lutein trong tự nhiên [10]
Thực phẩm Thành phần lutein, mg/1 chén
Rau bina, (nấu chín) 12–15 (*)
(*) : Tùy thuộc vào từng loại
1.4 Khái quát về lutein ester
1.4.1 Cấu tạo phân tử
Lutein ester được tìm thấy trong tự nhiên như là dạng diester hóa của lutein với hai nhóm acid béo gắn vào hai bên nhóm hydroxyl thường được tìm thấy trong lutein
Trang 19Hình 1.4 Cấu tạo phân tử lutein ester
1.4.2 Tính chất lý-hóa
Tính chất vật lý
Lutein ester có chứa 51% lutein như lutein dipalmitate, phần còn lại là các chất béo trung tính Do lutein ester có chứa các chất béo trung tính nên nó tan trong dầu thực vật Ngoài ra, lutein ester tan trong glycerol và rượu
Tính chất hóa học
Nghiên cứu của Li M (2007) và các cộng sự kết luận rằng lutein ester
ổn định hơn lutein tự do trong điều kiện nhiệt độ, ánh sáng và ít bị oxy hóa hơn, [4]
1.4.3 Hoạt tính sinh học
Theo nghiên cứu của Bowen E (2001), các nhà khoa học đã phát hiện
ra lutein ester có hoạt tính sinh học còn cao hơn lutein ở dạng tự do Phát hiện này đã cung cấp một phương pháp ngăn chặn hoặc ức chế tác hại của các gốc
tự do bằng cách cung cấp một lượng vừa đủ chất chống oxy hóa thành phần là carotenoid bao gồm lutein và lutein ester Liều lượng sử dụng của chất chống oxy hóa tùy thuộc vào nhiều yều tố: trọng lượng cơ thể, tuổi tác, tình trạng sức khỏe, liều lượng thay đổi từ 0,5 mg đến 50 mg; tốt nhất là 0,5 mg đến
30 mg [5]
Trang 20Nghiên cứu khoa học gần đây đã cung cấp bằng chứng rằng chất chống oxy hóa có khả năng bảo vệ tế bào khỏe mạnh khỏi các gốc tự do tấn công, phá hủy Các gốc tự do không ổn định được hình thành trong cơ thể trong quá trình trao đổi chất và tiếp xúc với các nguồn từ môi trường, chẳng hạn như ô nhiễm không khí, khói thuốc lá, và các chất béo trong chế độ ăn uống Khi có một số lượng quá nhiều gốc tự do trong cơ thể, các gốc tự do có thể tấn công các tế bào khỏe mạnh và có thể gây một số bệnh thoái hóa Gốc tự do có liên quan đến nhiều bệnh: ung thư, dạ dày, cổ tử cung, bệnh về phổi, tim mạch, và các bệnh về mắt [5]
Một số thí nghiệm lâm sàng cho rằng, việc tiêu thụ thực phẩm có chứa chất bổ sung lutein ester có thể làm tăng lượng lutein trong huyết thanh Kết quả nghiên cứu cũng đã khẳng định, trong cơ thể lutein tồn tại ở dạng lutein ester [4]
Trong kết quả nghiên cứu của Wu L (2009), lutein và lutein ester khi được thêm vào chế ăn uống có thành phần lutein thấp có thể làm tăng lutein trong huyết tương trong những con gà đẻ trứng Có nhiều báo cáo về việc làm tăng sắc tố lòng đỏ trứng bằng cách bổ sung lutein hoặc lutein ester trong thức
ăn[4]
1.4.4 Ứng dụng
Lutein ester hóa có thể được sử dụng làm giàu lutein, tăng sắc tố trong sản phẩm trứng trong ngành công nghiệp chăn nuôi vì sự ổn định của lutein ester cao hơn lutein tự do [3]
Lutein ester được sử dụng như một chất chống oxy hóa, bằng cách bổ sung, pha trộn vào dược phẩm, sử dụng trong các dạng thuốc uống Các chế phẩm thuốc có thể ở dạng viên nén, viên ngậm, viên nang, [4]
Trang 211.5 So sánh khả năng hấp thụ của lutein và lutein ester
Lutein c/ó khả năng hấp thụ vào cơ thể tốt hơn lutein ester Lutein ester sau khi este hóa, các chất dinh dưỡng tan trong chất béo như vitamin A, E, được hấp thu trực tiếp vào máu ngay ở ruột non Lutein ester tại ruột non, trải qua quá trình thủy phân các acid béo rồi mới được hấp thu vào cơ thể [4] Hơn nữa, nghiên cứu cho thấy, thủy phân lutein ester tại ruột non xảy ra với
hiệu suất thấp dưới 5% [4] Nghiên cứu của Wu L (2009) cho thấy, khi bổ
sung lutein và lutein ester vào thức ăn của gà, kết quả sau 3 ngày cho thấy, nồng độ lutein trong huyết tương với chế độ ăn chứa lutein dạng tự do là 1,90
± 0,17 mg lutein/ml, cao hơn so với mức 1,47 ± 0,13 mg lutein /ml thu được với chế độ ăn uống bổ sung lutein ester Giải thích cho những kết quả này chính là chế độ ăn bổ sung lutein dạng tự do được hấp thụ dễ dàng vào ruột,
so với lutein ester, phải trải qua thủy phân bởi các enzyme trong ruột, mới có thể hấp thu vào máu[4]
Ngoài ra, nhiều nghiên cứu cho thấy lutein ester khá bền, khi vào cơ thể người chỉ bị thủy phân một phần thành lutein dạng tự do (dạng được hấp thụ vào huyết thanh) Vì vậy, để tạo ra những chế phẩm lutein bổ sung cho người, một số quy trình công nghệ đã được cải tiến, thêm bước xà phòng hóa oleoresin để chuyển lutein ở dạng liên kết ester về dạng tự do, sau đó tinh chế
để thu nhận lutein tinh thể [4]
1.6 Các nghiên cứu xử lý hoa cúc vạn thọ bằng enzyme
Việc thu carotenoid từ hoa cúc vạn thọ đã bắt đầu từ nhiều thập kỉ nay Sau khi thu hoạch, hoa cúc vạn thọ được xử lý bằng phương pháp ủ xi-
lô, sau đó ép bớt nước, sấy khô, xay thành bột mịn, rồi chiết xuất lutein ester bằng dung môi và xà phòng hóa để thu được lutein ở dạng tự do
Hạn chế của quy trình này là sử dụng nhiều dung môi để chiết và tinh chế Ngoài ra, quá trình ủ xi-lô và sấy hoa khô cũng gây tổn thất carotenoid nghiêm trọng do khi đó xảy ra quá trình oxy hóa carotenoid bởi không khí
Trang 22nóng, kết quả là hàm lượng carotenoid trong hoa khô chỉ còn lại khoảng 50% carotenoid so với hoa tươi ban đầu [7] Mặc dù kết quả của quá trình ủ xi-lô làm biến đổi thành tế bào, để lộ ra những mô chứa lipid, dẫn đến sự tăng hiệu quả chiết, nhưng trong quá trình này có thể xảy ra sự lên men tự phát làm một lượng đáng kể carotenoid bị mất đi do quá trình oxy hóa tế bào không kiểm soát Hơn nữa, trong quá trình ủ xi-lô do hoạt động của các vi sinh vật để lại một lượng nước của tế bào làm nguyên liệu dễ ẩm mốc.
Trong nghiên cứu của Enrique B A và các cộng sự, người ta đã khảo sát khả năng cải thiện hiệu suất thu hồi xanthophyll trong quy trình xử lý
trên bằng cách bổ sung một hỗn hợp vi sinh vật (gồm 9,8% Flavobacterium IIb, 41% Acinetobacter anitratus, và 49,2% Rhizopus nigricans) kết hợp với
các vi sinh vật nội sinh có trong hoa cúc vạn thọ khi thực hiện ủ xi-lô Kết quả thu được cho thấy hiệu suất thu hồi xanthophyll được cải thiện đáng kể,
cụ thể là 24,9 g/kg trọng lượng nguyên liệu khô so với 12,9 g/kg (mẫu đối chứng chưa cấy vi sinh vật) [19]
Biện pháp xử lý nguyên liệu bằng enzyme thương mại nhằm thay thế cho phương pháp chiết dung môi đã được áp dụng để cải thiện năng suất và chất lượng sản phẩm của quá trình tách chiết một số loại dầu thực vật (ví dụ: dầu hạt cải, dầu đậu tương, mù tạt, cám gạo, hoa hướng dương, thầu
dầu…) Kết quả cho thấy việc xử lý enzyme trước khi chiết cho hiệu suất
chiết dầu hướng dương, dầu hạt cải và dầu carnola cải thiện đáng kể [7] Theo nghiên cứu của Inci Çinar (2005) sử dụng cellulase và pectinase tăng cường hiệu suất chiết carotenoid từ vỏ khoai lang và cà rốt [7]
Đối với hoa cúc vạn thọ chiết xuất lutein từ hoa cúc vạn thọ theo phương pháp truyền thống cho kết quả lutein bị suy thoái và tổn thất một lượng đáng kể carotenoid Nhiều công trình gần đây tập trung vào việc nghiên cứu nâng cao hiệu suất chiết lutein ester sử dụng biện pháp sinh học nhằm cải thiện hiệu quả chiết lutein ester bằng cách phá hủy màng tế bào
Trang 23chứa sắc tố nhờ tác dụng của các enzyme nội sinh, tiết ra từ các chủng vi sinh vật có sẵn trong hoa cúc vạn thọ hay dùng enzyme thương mại như cellulase [17], hỗn hợp cellulase, hemicellulase và pectinase [6] Cũng như đối với một số đối tượng đã nghiên cứu, việc xử lý hoa cúc vạn thọ bằng enzyme đã cải thiện được hiệu suất chiết [23] Trong tất cả trường hợp đã đề cập ở trên, các enzyme thủy phân đã được sử dụng như các tác nhân tương tác trên các thành tế bào, phá vỡ tính toàn vẹn cấu trúc làm lộ ra nhiều nội bào của nguyên liệu để chiết Cụ thể, trong nghiên cứu của Bunea A (2010)
và các cộng sự đã tiến hành thí nghiệm bằng cách sử dụng hỗn hợp enzyme cellulase, hemicellulase và pectinase với các tỉ lệ khác nhau nhằm tìm ra tỉ lệ thích hợp để thu được hiệu suất chiết carotenoid từ cánh hoa cúc vạn thọ cao nhất Kết quả, khi sử dụng hỗn hợp 3 enzyme kể trên với tỉ lệ 0,8 ml cellulase:0,4 ml hemicellulase: 0,8 g pectinase trên 100 g cánh hoa cúc vạn thọ, thu được hàm lượng carotenoid tổng số cao nhất (3320 mg/g trọng lượng khô) [4] Đối với nghiên cứu của Delgado-Vargas và Paredes-Lo'pez
O (1997), cánh hoa được xử lý bằng dung dịch 0,1% (w/w) Econase CEP trong khoảng thời gian 120 giờ cho hiệu suất thu xanthophyll tăng đáng kể (24,7 g/kg khối lượng hoa khô) so với mẫu đối chứng không được xử lý với enzyme (11,4 g/kg khối lượng hoa khô) [10]
Cũng với mục đích sử dụng enzyme xử lý cánh hoa cúc vạn thọ, trong nghiên cứu của Sunita Tekwani và các cộng sự (2010) về tác dụng của cellulase và pectinase trong chiết xuất lutein từ cánh hoa khô, cho thấy hiệu suất chiết lutein với phương pháp có và không sử dụng enzyme tương ứng là 9,2% (w/w) và 5,6% (w/w) Điều đó đã chứng minh được việc xử lý hoa cúc vạn thọ bằng enzyme, pectinase và cellulase cho hiệu suất chiết lutein tăng
một cách đáng kể [23] Trong nghiên cứu của Matoushek (1974) cũng sử
dụng enzyme cellulase để xử lý hoa cúc vạn thọ khô (10% w/v), thời gian xử
lý 16 giờ, pH 4 6, nhiệt độ 450C, sau đó tiến hành chiết bằng cách sử dụng
Trang 24hỗn hợp chloroform hoặc hexane Kết quả, hiệu suất lutein thu được tăng 36% so với mẫu không được xử lý với enzyme [7] Theo nghiên cứu của Delgado-Vargas và Paredes-Lo'pez O (1997), thấy rằng xử lý với enzyme
thu được sản phẩm với thành phần dạng all-trans-lutein cao nhất (25,1 g/kg
trọng lượng khô), tăng đáng kể khi so với mẫu không được xử lý enzyme (11,4 g/kg) Trong cả hai nghiên cứu trên, các đề xuất xử lý enzyme còn nhiều mặt hạn chế, cụ thể là, thời gian của quá trình xử lý dài và loại bỏ một lượng nước đáng kể được sử dụng trong các phản ứng enzyme, dẫn đến cần phải xử lý một lượng nước thải có COD khá cao [10] Ba'rzana và cộng sự (2002) đề xuất một phương pháp đồng thời xử lý enzyme và sử dụng dung môi Trong nghiên cứu này, hỗn hợp của các enzyme thủy phân có thể phá hủy thành tế bào trong dung môi hexane với độ ẩm tương đối Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng, đối với mẫu không xử lý bằng enzyme, chỉ chiết được 44% carotenoid, trong khi việc sử dụng enzyme cho hiệu suất trên 85% bằng cách trộn lẫn enzyme với hoa trước khi chiết [7] Những nghiên cứu trên chỉ ra rằng việc xử lý hoa cúc vạn thọ bằng hỗn hợp enzyme có thành phần chính là cellulase đã nâng cao hiệu suất chiết xanthophyll lên đáng
kể [6]
Một số nghiên cứu sử dụng enzyme Viscozyme để xử lý nguyên liệu trước khi chiết xuất
Trong nghiên cứu của Robert N và các đồng sự (2008), chiết xuất dầu
từ nhân hạt xoài dại gabonensis không sử dụng dung môi hữu cơ, nhưng sử
dụng enzyme để chiết dầu Kết quả cho thấy rằng, quá trình chiết xuất mà không có enzyme cho phép thu được 27,4% dầu từ nhân hạt Khi sử dụng từng enzyme Alcalase, Pectinex và Viscozyme một cách riêng biệt, hiệu suất chiết dầu tương ứng là 35,0; 42,2 và 68,0% Nhóm tác giả đã thực hiện tối
ưu hóa điều kiện chiết suất dầu từ nhân hạt với enzyme Viscozyme, xác định được điều kiện tối ưu như sau: tỉ lệ nhân hạt: nước 0,11:1, nồng độ enzyme
Trang 251,4−2,0%, và thời gian ủ 14−18 giờ Kết quả, sau khi xử lý bột nhân hạt bằng Viscozyme 2% trong 18 giờ, đã thu được hiệu suất chiết dầu 83,0% Trong cùng điều kiện, bằng cách thêm Alcalase 1% trong 2 giờ, hiệu suất 90,0% [14] Các kết quả nghiên cứu gần đây đã chứng minh việc xử lý bột
ớt bằng enzyme Viscozyme L ở nhiệt độ 500C, lắc trong thời gian 7 giờ, tốc
độ 120 vòng/phút, tỉ lệ bột ớt:nước là 1:50 dẫn đến sự gia tăng hiệu suất đáng kể (11% carotenoid và 7% cho capsaicinoid) [21]
Trong nghiên cứu của Danso-Boateng E (2011) đánh giá tác dụng của việc kết hợp sử dụng enzyme Viscozyme L và đồng thời xử lý nhiệt trước khi chiết đối với hoa hướng dương Nhân hạt hướng dương trước khi xử lý với enzyme Viscozyme được nghiền bằng cối hoặc chày để đạt kích thước từ 0,762 mm đến 1 mm Sau đó, 20 g nhân hạt đã được nghiền được cho vào cốc
có môi trường pH 5,0 (pH tối ưu của Viscozyme theo khuyến cáo của nhà sản xuất) Phun 2 ml Viscozyme L vào cốc chứa mẫu, tốc độ lắc 150 rpm, nhiệt độ 500C Theo kết quả thu được, hiệu suất thu hồi dầu, với thời gian xử
lý enzyme 4 giờ và 1 giờ, tương ứng là 51,23% và 41,36% Tuy nhiên, trong thời gian 1 giờ, việc kết hợp sử dụng enzyme đồng thời với xử lý nhiệt thì hiệu suất thu hồi được nâng cao, cụ thể là 47,78% Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy, xử lý nhân hạt hướng dương bằng Viscozyme ở nhiệt độ thường thì cho hiệu suất thu hồi dầu là 53,33%, nhưng khi xử lý bằng Viscozyme kết hợp với phương pháp nổ nhiệt thì hiệu suất được cải thiện đến 55,38% [9] Zheng H và các cộng sự (2009) đã nghiên cứu về sử dụng enzyme Viscozyme nhằm tăng hiệu suất chiết xuất polyphenol từ quả táo Nhóm tác giả đã xử lý quả táo bằng 0,02% Viscozyme, pH bằng 3,7, nhiệt độ 500C, thời gian 12 giờ Kết quả, hiệu suất chiết polyphenol (7,08%) cao hơn nhiều so với mẫu chiết không được xử lý bằng Viscozyme (3,2%) [15]
Một trong những nghiên cứu xử lý cánh hoa cúc vạn thọ tươi bằng enzyme trước khi chiết phải kể đến nghiên cứu của Bárzana và các cộng sự
Trang 26(2002) Ba enzyme được sử dụng là Viscozyme, Pectinex và Nutrase Xử lý bằng Viscozyme tăng hiệu suất lên hơn 45% [22]
Những kết quả trên cho thấy Viscozyme tỏ ra có hiệu quả trong việc
xử lý nhiều loại nguyên liệu khác nhau trước khi chiết dầu Tuy nhiên, những nghiên cứu sử dụng Viscozyme trong xử lý hoa cúc vạn thọ để chiết lutein ester chưa nhiều, do đó chưa thực sự đánh giá được hết hiệu quả của Viscozyme trong việc xử lý hoa cúc vạn thọ Nguyên nhân là do Viscozyme
là một enzyme thương mại khá đắt tiền (Viscozyme có giá £110,5/L), nên ít
được dùng trong nghiên cứu và sản xuất rộng rãi Do đó, chưa thực sự đánh giá được hết hiệu suất chiết lutein từ cánh hoa cúc vạn thọ đã được xử lý với Viscozyme
Có thể nói, việc sử dụng enzyme thương mại Viscozyme để xử lý cánh hoa cúc vạn thọ tươi trước khi chiết mang lại hiệu suất chiết lutein cao
Trang 27PHẦN 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tượng nghiên cứu
2.1.1 Nguyên liệu-Hóa chất
2.1.1.1 Nguyên liệu:
Trong nghiên cứu này, nguyên liệu dùng để chiết lutein ester là cánh hoa
cúc vạn thọ châu Phi (Tagetes erecta L.) được trồng tại huyện Diên Khánh,
tỉnh Khánh Hòa
2.1.1.2 Hóa chất:
- Na2SO4 khan (PA,Trung Quốc);
- PE (PA,Trung Quốc);
- Hexane (PA,Trung Quốc);
- Acetone (PA,Trung Quốc);
- Cân phân tích ± 1 mg (Shimadzu, Nhật);
- Cân phân tích ± 0,1 mg (Satorius, Nhật);
- Tủ sấy ±10
C (Memert, Đức);
- Bể siêu âm Elmasonic S300H (Elma, Đức);
- Quang kế UV-Vis Genesys 20 (Thermo, USA);
Trang 28- Máy lắc ổn định nhiệt (IKA, Đức)
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Phương pháp xử lý nguyên liệu
Tiến hành:
Hoa cúc vạn thọ tươi sau khi thu hoạch được chuyển ngay về phòng thí nghiệm Cánh hoa được cắt tách ra (phần sử dụng), loại bỏ phần đài hoa (phần không sử dụng) Bảo quản cánh hoa tươi ở −200C cho đến khi nghiên cứu (trong thời gian không quá 2 tuần)
Để hiệu chỉnh ảnh hưởng của sự biến đổi hàm lượng carotenoid trong quá trình bảo quản, trước mỗi lô thí nghiệm, xác định lại hàm lượng carotenoid tổng số và hàm lượng nước trong nguyên liệu
2.2.2 Xác định thành phần khối lượng của nguyên liệu
Các phần sử dụng được (cánh hoa) và phần không sử dụng được (đài hoa) sau khi tách riêng được đem cân
Thành phần khối lượng của hoa cúc vạn thọ nguyên liệu được tính bằng công thức:
Phần sử dụng (%) = * 100 %
m
m
0 1
Phần không sử dụng (%) = * 100 %
m
m
0 2
Trong đó:
m0: khối lượng nguyên liệu ban đầu;
m1: khối lượng phần cánh hoa;
m2: tổng khối lượng phần cuống, cánh hoa
2.2.3 Xác định một số thành phần của hoa
2.2.3.1 Xác định lutein tổng số:
Trang 29Nguyên tắc: Chiết hoàn toàn lutein từ mẫu phân tích bằng aceton
Lutein ester chiết được sang dung môi hexane rồi định lượng bằng phương pháp đo quang ở 445 nm (Phụ lục 1)
2.2.3.2 Xác định % TL khô của hoa
Nguyên tắc: Trọng lượng khô của hoa cúc vạn thọ được xác định sau
khi sấy ở 105–1100C đến khối lượng không đổi (Phụ lục 2)
2.2.4 Bố trí thí nghiệm
2.2.4.1 Quy trình chiết lutein ester từ cánh hoa cúc vạn thọ sau khi
xử lý bằng Viscozyme
Trên cơ sở kết quả của một số tài liệu [1], chúng tôi đề xuất quy trình
dự kiến xử lý và chiết carotenoid từ hoa cúc vạn thọ bằng Viscozyme như sau:
Thuyết minh quy trình:
Chuần bị nguyên liệu: Cân chính xác G gam cánh hoa cúc vạn thọ tươi cho vào bình chứa đựng có nắp đậy kín
Xử lý nguyên liệu: Thêm vào nguyên liệu đã chuẩn bị dung dịch Viscozyme có nồng độ, tỷ lệ enzyme: nguyên liệu, pH thích hợp Sau đó, tiến hành ủ nguyên liệu trong điều kiện đã được kiểm soát ở tốc độ, nhiệt độ, thời gian thích hợp
Chiết lutein ester: Cánh hoa cúc vạn thọ sau khi xử lý bằng Viscozyme được chiết bằng hexan với tỷ lệ 4:1 v/w bằng cách sử dụng máy lắc ổn nhiệt ở điều kiện sau: tốc độ lắc 150 rpm; nhiệt độ 300C; thời gian lắc: 18 giờ Sau khi chiết, lọc lấy dịch chiết, làm khan bằng Na2SO4, pha loãng đến thể tích thích hợp rồi đo quang ở 445 nm để xác định hàm lượng lutein chiết được tương tự khi xác định lutein tổng số trong nguyên liệu
Hiệu suất quả xử lý được đánh giá bằng hiệu suất chiết lutein ester và được tính theo công thức sau:
Hiệu suất chiết (%) = (Lutein chiết được /lutein tổng số) x 100%
Trang 31enzyme:nguyên liệu; pH ủ; tốc độ lắc; nhiệt độ ủ; thời gian ủ; trong đó các thông số trên thay đổi như sau:
- Thời gian ủ: 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8 giờ
Việc xác định giá trị thông số thích hợp được thực hiện bằng phương pháp thực nghiệm cổ điển (thay đổi 1 thông số, cố định tất cả các thông số còn lại, từ đó chọn giá trị thích hợp của thông số đang khảo sát)
a) Bố trí thí nghiệm xác định nồng độ Viscozyme thích hợp
Lấy 6 bình nón nút mài Cân chính xác khoảng G g cánh hoa cúc vạn thọ cho vào mỗi bình Tiến hành ủ nguyên liệu với Viscozyme bằng cách cho lần lượt dung dịch enzyme vào các bình nón chứa nguyên liệu hoa, trong đó nồng độ dịch Viscozyme trong các bình lượt thay đổi như sau: 0%; 0,1%; 0,2%; 0,4%; 0,6%; 1%; 1,2%; 1,4%; 1,6% (v/v), còn tỷ lệ dịch enzyme:nguyên liệu là 2:1 pH của dịch Viscozyme được cố định là 5,6 (ứng với pH tự nhiên của dịch Viscozyme trong dịch bảo quản) Đậy kín các bình nón, đem ủ ở 300C, lắc với tốc độ 150 rpm 4 giờ Sau khi ủ, tiến hành chiết
carotenoid rồi so sánh hiệu quả xử lý của Viscozyme (xem mục 2.2.4.1) Từ
đó, xác định được nồng độ Viscozyme thích hợp (Hình 2.2, trang 27)
b) Xác định tỉ lệ Viscozyme:nguyên liệu thích hợp
Tiến hành tương tự như đã mô tả ở mục 2.2.4.2 nhưng với nồng độ
Viscozyme thích hợp đã xác định và tỉ lệ enzyme:nguyên liệu lần lượt thay đổi lần lượt là: 0,1:1; 0,5:1; 1,0:1; 1,5:1; 2,0:1; 2,5:1 (v/w) So sánh hiệu quả
xử lý của Viscozyme trong các trường hợp Từ đó, xác định tỉ lệ Viscozyme:nguyên liệu thích hợp (Hình 2.3, trang 28)
Trang 32c) Xác định pH thích hợp
Tiến hành tương tự như đã mô tả ở mục 2.2.4.2 nhưng với nồng độ
Viscozyme và tỉ lệ Viscozyme:nguyên liệu thích hợp đã xác định.Thay đổi pH môi trường ủ nguyên liệu bằng cách sử dụng các dung dịch đệm có pH thay đổi lần lượt là: 4,0; 5,0; 6,0; 7,0
Đánh giá hiệu quá xử lý của Viscozyme trong các trường hợp Từ đó, xác định tỉ lệ Viscozyme:nguyên liệu thích hợp (Hình 2.4, trang 29)
d) Xác định tốc độ lắc thích hợp
Tiến hành tương tự như đã mô tả ở mục 2.2.4.2 nhưng với nồng độ
Viscozyme, tỉ lệ Viscozyme:nguyên liệu, pH thích hợp đã xác định Lắc các mẫu thí nghiệm với tốc độ lắc thay đổi lần lượt như sau:
100; 150; 200; 250; 300 (rpm) Sau khi ủ enzyme, tiến hành chiết carotenoid và đánh giá hiệu quả xử lý trong từng trường hợp Từ đó, xác định tốc độ lắc thích hợp (Hình 2.5, trang 30)
e) Xác định nhiệt độ ủ thích hợp
Tiến hành tương tự như đã mô tả ở mục 2.2.4.2 nhưng với nồng độ
Viscozyme, tỉ lệ Viscozyme:nguyên liệu, pH, tốc độ lắc thích hợp đã xác định Thay đổi nhiệt độ ủ lần lượt là: 30, 35, 40, 45, 50 (0C)
Sau khi chiết carotenoid, so sánh hiệu quả xử lý nguyên liệu bởi enzyme ở các trường hợp để chọn nhiệt độ ủ enzyme thích hợp (Hình 2.6, trang 31 )
f) Xác định thời gian ủ thích hợp
Tiến hành tương tự như đã mô tả ở mục 2.2.4.2 nhưng với nồng độ
Viscozyme, tỉ lệ Viscozyme:nguyên liệu, pH, tốc độ lắc, nhiệt độ ủ enzyme thích hợp Thay đổi thời gian ủ lần lượt là:
1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8 (giờ)
Sau khi chiết carotenoid, đánh giá hiệu quả xử lý hoa cúc vạn thọ bởi Viscozyme ứng với các mẫu nói trên Từ đó, chọn thời gian ủ thích hợp (Hình 2.7, trang 32)
Dưới đây trình bày các sơ đồ bố trí thí nghiệm nói trên
