Nghiên cứu hoàn thiện quy trình tiền xử lý và chiết lutein ester từ hoa cúc vạn thọ (tagetes erecta l )

Hoàng Thị Huệ An 2011 đã xây dựng quy trình cải tiến chiết lutein ester từ hoa CVT trong đó enzyme Viscozym được dùng để phân hủy thành tế bào chứa sắc tố của hoa CVT, nhờ đó nâng cao hi

o0o

HOÀNG THỊ ÁNH

NGHIÊN CỨU HOÀN THIỆN QUY TRÌNH TIỀN XỬ LÝ

VÀ CHIẾT LUTEIN ESTER TỪ HOA CÚC VẠN THỌ

(TAGETES ERECTA L.)

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ KỸ THUẬT HÓA HỌC

Nha Trang, tháng 07 năm 2017

o0o

HOÀNG THỊ ÁNH

NGHIÊN CỨU HOÀN THIỆN QUY TRÌNH TIỀN XỬ LÝ

VÀ CHIẾT LUTEIN ESTER TỪ HOA CÚC VẠN THỌ

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi

Các kết quả, số liệu nêu trong luận văn là trung thực và chưa được công

bố trong các công trình khác

Người cam đoan

HOÀNG THỊ ÁNH

LỜI CẢM ƠN Sau hơn ba tháng làm đề tài tốt nghiệp “Nghiên cứu hoàn thiện quy

trình tiền xử lý và chiết lutein ester từ hoa cúc vạn thọ Tagetes erecta L.”

đến nay đề tài này đã được hoàn thành Để đề tài này đạt kết quả tốt đẹp, tôi

đã nhận được sự hỗ trợ, giúp đỡ của nhiều quý thầy cô, bạn bè và gia đình Với tình cảm sâu sắc, chân thành, cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn đến thầy cô, bạn bè và gia đình đã tạo điều kiện giúp đỡ trong quá trình học tập và nghiên cứu đề tài

Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu, Ban Chủ nhiệm khoa Công nghệ Thực phẩm, cùng quý thầy cô giảng viên Bộ môn Công nghệ

Kỹ thuật Hóa học - Trường Đại học Nha Trang đã tạo mọi điều kiện về cơ sở vật chất, cung cấp cho tôi những kiến thức và kĩ năng cần thiết trong suốt thời gian tôi học tập tại trường, giúp đỡ tôi hoàn thành chương trình đào tạo cử nhân ngành Công nghệ Kĩ thuật Hóa Học

in chân thành cảm ơn cán bộ ph trách Phòng Th nghiệm Hoá Trung tâm Th nghiệm – Thực hành đã tận tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi nhất về

cơ sở vật chất, trang thiết bị, giúp tôi hoàn thành tốt đ án chuyên ngành này Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đến

TS HOÀNG THỊ HUỆ AN đã tài trợ toàn bộ nguyên vật liệu th nghiệm, tận tình trực tiếp hướng dẫn, động viên trong suốt quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu, giúp tôi nâng cao kiến thức chuyên môn và hoàn thành tốt đ án tốt nghiệp của mình

Cuối cùng tôi chân thành tri ân gia đình, bạn bè đã luôn luôn bên cạnh quan tâm, hỗ trợ tôi trong suốt thời gian học tập và hoàn thành đ án này

Nha Trang, ngày 04 tháng 7 năm 2017

Sinh viên thực hiện

HOÀNG THỊ ÁNH

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ viii

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN 4

1.1 Tổng quan về hoa cúc vạn thọ 4

1.1.1 Ngu n gốc 4

1.1.2 Đặc điểm hình thái 4

1.1.3 Phân loại CVT 5

1.1.4 Hoạt t nh sinh học và ứng d ng của CVT 5

1.1.4.1 Hoạt t nh sinh học 5

1.1.4.2 Ứng d ng 5

1.2 Tổng quan về lutein và lutein ester 6

1.2.1 Tổng quan về lutein 6

1.2.1.1 Cấu trúc phân tử 6

1.2.1.2 Tính chất vật lí và tính chất hóa học 7

1.2.1.3 Hoạt t nh sinh học 8

1.2.1.4 Ứng d ng của lutein 9

1.2.2 Tổng quan về lutein ester 11

1.2.2.1 Cấu trúc phân tử 11

1.2.2.2 T nh chất vật l và t nh chất hóa học 12

1.2.2.3 Hoạt t nh sinh học và ứng d ng 13

1.2.3 Các ngu n lutein và lutein ester có trong tự nhiên 14

1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết 14

1.4 Phương pháp xử lý hoa CVT bằng Viscozym 17

1.4.1 Sự cần thiết phải xử lý hoa CVT trước khi chiết 17

1.4.2 Phương pháp chiết lutein ester từ hoa CVT đã xử lý enzyme 18

1.5 Tình hình nghiên cứu liên quan đến đề tài 18

1.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 18

1.5.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 21

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Đối tượng nghiên cứu 24

2.1.1 Nguyên liệu CVT 24

2.1.2 Hóa chất 24

2.2 Dụng cụ và thiết bị 24

2.2.1 D ng c 24

2.2.2 Thiết bị 25

2.3 Phương pháp nghiên cứu 25

2.3.1 Chuẩn bị nguyên liệu CVT trước khi chiết 25

2.3.2 Nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện xử lý hoa cúc vạn thọ bằng Viscozym 25

2.3.2.1 Quy trình tổng quát của quá trình xử lý và đánh giá hiệu quả xử lý hoa cúc vạn thọ bằng Viscozym 25

2.3.2.2 Nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện xử lý hoa CVT bằng Viscozym 28

2.3.3 Nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện chiết hoa cúc vạn thọ đã xử lý Viscozym 30

2.3.3.1 Quy trình tổng quát đánh giá hiệu quả chiết carotenoid từ hoa cúc vạn thọ đã xử lý Viscozym 30

2.3.3.2 Nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện chiết carotenoid từ hoa CVT

đã xử lý Viscozym 32

2.3.4 Thử nghiệm quy trình 33

2.4 Phương pháp phân tích 34

2.4.1 Phân t ch thành phần nguyên liệu cúc vạn thọ 34

2.4.1.1 ác định độ ẩm 34

2.4.1.2 Định lượng carotenoid tổng số 34

2.5 Phương pháp xử lý số liệu 34

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

3.1 Một số thành phần hóa học cơ bản của hoa tươi nguyên liệu 35

3.2 Kết quả tối ưu hóa điều kiện xử lí hoa cúc vạn thọ bằng Viscozym 35 3.3 Kết quả tối ưu hóa điều kiện chiết carotenoid 43

3.4 Xây dựng quy trình tối ưu chiết lutein từ hoa cúc vạn thọ 51

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 PHỤ LỤC I

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Tiếng anh Tiếng Việt

dược phẩm

ứng

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số tính chất vật lý của lutein 8 Bảng 1.2 Hàm lượng lutein có trong rau quả 14 Bảng 2.1 Quy hoạch thực nghiệm tối ưu hóa điều kiện xử l Viscozym theo

mô hình bậc 2 phương án CCF 29 Bảng 2.2 Quy hoạch thực nghiệm tối ưu hóa điều kiện chiết carotenoid theo

mô hình bậc 2 phương án CCF 33 Bảng 3.1 Hàm lượng carotenoid tổng số và độ ẩm của nguyên liệu 35 Bảng 3.2 Kết quả tối ưu hóa điều kiện xử lý hoa CVT bằng Viscozym 36 Bảng 3.3 Kết quả phân t ch ANOVA ảnh hưởng của điều kiện xử lý Viscozym đến hiệu suất xử lý 37 Bảng 3.4 Các hệ số của phương trình h i quy mô tả ảnh hưởng của điều kiện

xử lý hoa CVT bằng Viscozym đến hiệu suất xử lý 38 Bảng 3.5 Kết quả tiên đoán điều kiện tối ưu xử lý Viscozym 42 Bảng 3.6 Chi phí enzyme và hexane ứng với các phương án 4 và 5 43 Bảng 3.7 Kết quả tối ưu hóa điều kiện chiết carotenoid từ hoa CVT đã xử lý Viscozym 44 Bảng 3.8 Kết quả phân t ch ANOVA ảnh hưởng của điều kiện chiết đến hiệu suất chiết 45 Bảng 3.9 Các hệ số của phương trình h i quy mô tả ảnh hưởng của điều kiện chiết đến hiệu suất chiết carotenoid 46 Bảng 3.10 Kết quả tiên đoán điều kiện tối ưu chiết carotenoid từ hoa CVT xử

lý Viscozym 50 Bảng 3.11 Tiên đoán hiệu suất chiết ở 50 độ C sau 1,2,3 lần chiết và chi ph

dự kiến 51 Bảng 3.12 Hiệu suất và chi ph tiêu tốn để chiết lutein ester trên mẫu lớn 54

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Hoa cúc vạn thọ Mỹ 4

Hình 1.2 Cấu tạo phân tử lutein dạng đ ng phân all-trans) 7

Hình 1.3 Cấu tạo phân tử của lutein ester 12

Hình 1.4 N ng độ lutein và lutein ester trong huyết thanh 13

Hình 2.1 Sơ đ quy trình tổng quát xử lý và đánh giá hiệu quả xử lý hoa cúc vạn thọ bằng Viscozym 26

Hình 2.2 Mô hình thực nghiệm theo phương án cấu trúc tâm mặt CCF 30

Hình 2.3 Sơ đ quy trình tổng quát đánh giá hiệu quả chiết carotenoid từ hoa cúc vạn thọ đã xử lý Viscozym 31

Hình 3.1 Ảnh hưởng của n ng độ Viscozym (C-Vis , tỷ lệ dịch Viscozym/nguyên liệu Vis/NL và thời gian xử lý Time đến hiệu quả xử lý hoa CVT 39

Hình 3.2 Ảnh hưởng của n ng độ Viscozym (C-Vis và tỷ lệ dịch Viscozym/nguyên liệu Vis/NL đến hiệu quả xử lý 40

Hình 3.3 Ảnh hưởng của n ng độ Viscozym C-Vis và thời gian xử lý Time đến hiệu quả xử lý 40

Hình 3.4 Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch Viscozym/nguyên liệu Vis/NL và thời gian xử lý Time đến hiệu quả chiết carotenoid từ hoa CVT 40

Hình 3.5 Các bề mặt đáp ứng mô tả ảnh hưởng của n ng độ Viscozym

(C-Vis và tỷ lệ dịch Viscozym/nguyên liệu Vis/NL đến hiệu quả chiết carotenoid từ hoa CVT 41

Hình 3.6 Các bề mặt đáp ứng mô tả ảnh hưởng của n ng độ Viscozym

(C-Vis và thời gian chiết Time đến hiệu quả chiết carotenoid từ hoa CVT 41 Hình 3.7 Các bề mặt đáp ứng mô tả ảnh hưởng của tỷ lệ dịch Viscozym/nguyên liệu Vis/NL và thời gian chiết Time đến hiệu quả chiết carotenoid từ hoa CVT 41

Hình 3.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian chiết và số lần chiết đến hiệu quả chiết carotenoid từ hoa CVT 47 Hình 3.9 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian chiết đến hiệu quả chiết carotenoid từ hoa CVT 48 Hình 3.10 Ảnh hưởng thời gian chiết và số lần chiết đến hiệu quả chiết carotenoid từ hoa CVT 48 Hình 3.11 Ảnh hưởng nhiệt độ và số lần chiết đến hiệu quả chiết carotenoid

từ hoa CVT 48 Hình 3.12 Các bề mặt đáp ứng mô tả ảnh hưởng của nhiệt độ và số lần chiết đến hiệu quả chiết carotenoid từ hoa CVT 49 Hình 3.13 Các bề mặt đáp ứng mô tả ảnh hưởng của thời gian chiết và số lần chiết đến hiệu quả chiết carotenoid từ hoa CVT 49 Hình 3.14 Các bề mặt đáp ứng mô tả ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian chiết đến hiệu quả chiết carotenoid từ hoa CVT 49 Hình 3.15 Quy trình tối ưu chiết lutein từ hoa CVT 52 Hình 3.16 Dịch chiết carotenoid ứng với các điều kiện xử lý enzyme và chiết carotenoid khác nhau 55

MỞ ĐẦU

Màu thực phẩm là một trong những ph gia không thể thiếu trong cuộc sống hằng ngày và đặc biệt là trong ngành công nghiệp chế biến thực phẩm Các chất tạo màu có thể là những chất được chiết xuất từ ngu n nguyên liệu

tự nhiên (thực vật) hoặc từ nguyên liệu tổng hợp nhân tạo Hiện nay có khoảng 32 chất ph gia được sử d ng để tạo màu, trong đó có 7 chất nhuộm màu thực phầm nhân tạo được C c Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa

Kỳ (US-FDA) cho phép sử d ng trong trong thực phẩm Đó là Màu anh Biển (Brilliant Blue FCF), Indigotine (màu chàm/xanh tối), Xanh L c ( Fast Green FCF), Màu Đỏ (Allura Red AC), Màu H ng (Erythrosine), Màu Vàng (Tartrazine) và Màu Cam (Sunset Yellow FCF) [22] và khoảng 25 chất màu

tự nhiên Màu tự nhiên là các chất màu được chiết xuất từ thực vật, do các sắc

tố chứa trong lá, hoa, củ, quả Ví d , để có màu đỏ có thể dùng quả gấc, rau dền, cà chua ; màu xanh thì dùng lá dứa, màu vàng dùng củ nghệ, màu tím

có thể dùng lá cẩm Chất màu tự nhiên thường được sử d ng là beta caroten (tiền vitamin A , nước củ cải đường, cà rốt, nghệ, bột đỏ làm từ loại ớt đỏ paprika [18]

Hiện nay trên thị trường xuất hiện rất nhiều loại ph gia tạo màu có ảnh hưởng xấu tới sức khỏe người sử d ng Phẩm màu tổng hợp có mặt trong rất nhiều loại thực phẩm mà chúng ta tiêu th hằng ngày như bánh kẹo, nước ngọt, gia vị, đ hộp, mứt… Tuy nhiên, có một số chất màu tổng hợp tuy đáp ứng được giá trị về mặt nhãn quan nhưng lại tiềm ẩn nguy cơ gây hại tới sức khỏe cao, là nguyên nhân hình thành các khối u, gây ung thư (ví d như Sudan II hay Rhodamine B) [25] Chất màu nhân tạo đã từng gây nên cuộc tranh cãi về sự an toàn của thực phẩm trong nhiều năm và càng gay gắt hơn vào năm 2007 sau khi công bố một nghiên cứu gây tranh cãi của Đại học Southampton ở Anh chứng minh được mối liên hệ giữa tình trạng hiếu động

thái quá ở trẻ em với sự sử d ng thực phẩm tạo màu bở 6 loại phẩm nhuộm tổng hợp sau: E110 (Yellow Sunset), E104 (Quinoline Yellow), E122 (Carmoisine), E129 (Allura Red), E102 (Tartrazine) và E124 (Ponceau 4R) [21].…Do e ngại những tác hại nguy hiểm đến sức khỏe của chất màu tổng hợp nên người tiêu dùng ngày càng có xu hướng ưa chuộng những loại thực phẩm tạo màu bằng chất màu tự nhiên Ngày nay, ngành công nghiệp thực phẩm cũng được khuyến cáo nên sử d ng chất màu có ngu n gốc tự nhiên để đảm bảo an toàn Vì thế, việc nghiên cứu chiết tách chất màu từ ngu n gốc tự nhiên ứng d ng trong công nghiệp thực phẩm là hướng đi đúng đắn và cần thiết hiện nay

Một trong những chất màu tự nhiên dược phép sử d ng để tạo màu cho thực phẩm là lutein ester chiết xuất từ hoa cúc vạn thọ Hoa CVT là loại hoa được tr ng phổ biến ở nước ta Nhiều nghiên cứu đã chứng minh trong cánh hoa CVT có chứa lutein ester với hàm lượng khá cao, hợp chất này ngoài khả năng ứng d ng trong ngành công nghiệp thực phẩm làm chất tạo màu vàng rất đẹp, còn hoạt tính chống oxy hóa khá mạnh và có nhiều ứng d ng trong ngành dược phẩm và mỹ phẩm

Hoàng Thị Huệ An 2011) đã xây dựng quy trình cải tiến chiết lutein ester từ hoa CVT trong đó enzyme Viscozym được dùng để phân hủy thành tế bào chứa sắc tố của hoa CVT, nhờ đó nâng cao hiệu suất thu nhận lutein ester,

đ ng thời cho phép chiết trực tiếp lutein ester từ hoa CVT tươi bằng hexane

Quy trình chiết khi đó qua các công đoạn sau: a) Xử lý Viscozym: Hoa CVT

C); b) Chiết

lutein ester: chiết bằng hexane với tỷ lệ 2/1 l t/kg ở nhiệt độ phòng trong

18 h, chiết 1 lần Khi đó, hiệu suất chiết lutein ester vào khoảng 74% Việc tăng số lần chiết tuy cho hiệu suất chiết cao hơn nhưng không kinh tế vì tiêu tốn nhiều dung môi và chi ph năng lượng để cô đặc dịch chiết Mặc dù quy

trình mới đạt hiệu suất chiết cao hơn nhiều so với khi không dùng enzyme, quá trình chiết rút ngắn lại chỉ qua 1 giai đoạn nhưng kết quả tính toán cho thấy do sử d ng n ng độ và tỷ lệ enzyme khá lớn nên giá thành sản phẩm quá cao so với các sản phẩm hiện có trên thị trường dẫn đến việc khó cạnh tranh với các sản phẩm khác trên thị trường

Nhằm hạ giá thành, tăng t nh cạnh tranh và khả năng thương mại hóa sản phẩm việc đổi mới công nghệ xử lý nguyên liệu, tách chiết carotenoid là hết

sức cần thiết Đó là l do tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu hoàn thiện quy

trình tiền xử lý và chiết lutein ester từ hoa cúc vạn thọ Tagetes erecta L”

Nội dung nghiên cứu của đề tài:

- Nội dung 1: Nghiên cứu hoàn thiện quy trình tiền xử lý hoa cúc vạn thọ

Ý nghĩa khoa học của đề tài

Cung cấp các dẫn liệu khoa học về ảnh hưởng của điều kiện xử lý enzyme và điều kiện chiết đến hiệu suất thu nhận carotenoid từ loài hoa CVT đang sử d ng Từ đó, chọn điều kiện tối ưu để chiết carotenoid từ ngu n nguyên liệu này

Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Làm cơ sở cho việc đề xuất quy trình công nghệ quy mô pilot thu nhận

lutein ester ứng d ng trong công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm

Chương 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về hoa cúc vạn thọ

1.1.1 Nguồn gốc

ngu n gốc tại Trung và Nam Mỹ từ Tây Nam Hoa Kỳ qua Mexico và tới

khắp Nam Mỹ)

1.1.2 Đặc điểm hình thái

CVT là cây thân thảo hằng niên, thân cây cao khoảng 0,6 – 1,0 m Cây thô và thẳng đứng Lá mọc xen kẽ hoặc đối xứng nhau, có rãnh như lông vũ, phiến lá hình mác, vành lá và lưng lá có các đốm dầu, có mùi hăng đặc trưng Cây CVT ưa kh hậu nóng ẩm và đầy đủ ánh sáng Hoa CVT mọc đơn lẻ trên đỉnh, có màu vàng hoặc màu vàng cam, vành của cánh hoa uốn cong Hoa thường nở vào tháng 6 - 10 [20]

Hình 1.1 Hoa cúc vạn thọ Mỹ

1.1.3 Phân loại CVT

G m 3 loại:

Vạn thọ Mỹ: Tên khoa học là Tagetes erecta L., tiếng Anh gọi là

American Marigold Đây là giống Vạn Thọ có cây cao nhất và hoa cũng to nhất

Vạn thọ Pháp: Tên khoa học là Tagetes patula, tiếng Anh gọi là French

Marigold Loài này cho hoa nhỏ hơn nhưng có nhiều màu sắc hấp dẫn hơn loài Châu Mỹ

Vạn thọ nhỏ: Tên khoa học là Tagetes tenuifolia, hay Tagetes signata

Cây nhỏ nên chỉ dùng làm viền ngoài b n hoa cảnh

1.1.4 Hoạt tính sinh học và ứng dụng của CVT

1.1.4.1 Hoạt tính sinh học

- Có hoạt tính kháng khuẩn, kháng vi sinh vật: Hoa CVT có tác d ng kháng khuẩn mạnh, có thể cho vào thuốc mỡ để điều trị các vết thương ở da, các loại mẩn ngứa, lở loét, bệnh nấm da chân… Nghiên cứu dược lý cho thấy cao chiết của hoa CVT với nước và c n có tác d ng ức chế các chủng vi sinh

vật như Bacillus subtilis, Micrococcusluteus, Staphylococcus aureus

- Chứa chất chống oxy hóa và chống viêm: Hoa CVT cũng giàu chất chống oxy hóa như lutein, zeaxanthin - là các carotenoid có tác d ng ngăn ngừa các bệnh liên quan đến mắt như bệnh đ c thủy tinh thể và mù lòa, ngăn ngừa ung thư

1.1.4.2 Ứng dụng

 Trong y học

- Y học cổ truyền: CVT có công d ng chủ yếu trong điều trị các bệnh tiêu hóa như đau dạ dày, tiêu chảy, đau b ng, làm mát dạ dày, gan, mật, trị nôn mửa, kiểm soát ký sinh trùng trong ruột v d : giun và chữa chứng đầy hơi, khó tiêu Ngoài ra, nó còn là một vị thuốc chữa đau răng ở trẻ em

- Y học hiện đại: Ngày nay, CVT sử d ng để tr ch xuất lutein, một chất chống oxy hóa Nó có công d ng cải thiện thị giác, ngăn ngừa các bệnh về mắt như đ c thủy tinh thể, thoái hóa điểm vàng, bệnh sợ ánh sáng…

 Trong nông nghiệp

- Trong tr ng trọt: CVT được sử d ng để đẩy lùi giun tròn, nó có hiệu

quả nhất chống lại các loài tuyến trùng Pratylenchus penetrans gây bệnh cho

cây tr ng Trong các tài liệu của Thái Lan đã chứng minh được CVT có khả năng hấp th thạch t n (arsen t ch lũy khoảng 41% trong lá, do đó có thể cải thiện đất ô nhiễm bởi chất trừ sâu và thuốc bảo vệ thực vật CVT chứa α-tertienyl là một trong những thành phần quan trọng của hoạt t nh sinh học giúp cải thiện đất

- Trong chăn nuôi: Nó được sử d ng làm thực phẩm cho gà, giúp tăng lòng đỏ trứng và màu sắc của vỏ tươi sáng, đậm hơn

 Trong công nghiệp thực phẩm

- Chiết xuất carotenoid từ hoa CVT có màu vàng- cam là chất màu thực phẩm được phép sử d ng ở các nước châu Á trong khối EU, Úc và New Zealand mã số E161b)

sắc ph gia được chiết xuất từ CVT Tại Campuchia, lá non của CVT được

sử d ng như một loại rau gia vị [26]

1.2 Tổng quan về lutein và lutein ester

1.2.1 Tổng quan về lutein

1.2.1.1 Cấu trúc phân tử

Lutein là một sắc tố thuộc họ carotenoid có nhiều ứng d ng trong công nghiệp chất màu thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm nhờ có màu vàng cam rất đẹp và tác d ng chống oxy hóa khá mạnh Lutein được coi là tiền thân của

vitamin A, là dẫn xuất 3,3’-diol của ,-caroten [3] Lutein có công thức phân

- Lutein t n tại ở dạng bột chảy, có màu vàng cam Nếu kết tinh dạng

tinh thể, hình kim, khối lăng tr , đa diện, dạng lá hình thoi

- Lutein là chất t phân cực nên không tan trong nước, kém tan trong các dung môi hữu cơ phân cực như methanole, ethanole,… , nhưng tan tốt hơn trong dung môi hữu cơ phân cực trung bình acetone, acetate ethyl, dichloromethane, acetonitril, tetrahydrofuran

- Hấp th ánh sáng cực đại trong dung môi hexan, ethanole ở 445 nm

4 18

1

1 2

Bảng 1.1 Một số tính chất vật lý của lutein

 Tính chất hóa học

Lutein thuộc họ carotenoid, trong phân tử có chuỗi polyen liên hợp nên lutein rất nhạy cảm đối với acid, các ion kim loại, chất oxy hoá, ánh sáng, nhiệt… Lutein dễ bị oxi hóa bởi oxy không kh hoặc bị đ ng phân hóa bởi nhiệt và ánh sáng, dẫn đến sự nhạt màu hay mất màu Tuy nhiên, nó khá bền vững trong môi trường kiềm

Nhóm hydroxyl ở hai đầu phân tử làm cho lutein dễ dàng tham gia vào các phản ứng oxy hóa, nhờ đó nó có khả năng chống oxy hóa mạnh hơn một

số carotenoid khác Lutein có khả năng hấp th và làm giảm sự nguy hại của các gốc tự do gây ra V d , khi cung cấp một lượng lutein vừa đủ trong võng mạc mắt thì gốc tự do gây hại ở mức thấp nhất [15] Lutein dễ bị oxi hóa trong không kh , do vậy cần bảo quản lutein trong môi trường kh trơ, chân không, bảo quản ở nhiệt độ thấp, nên bao k n và tránh ánh sáng mặt trời Tuy vậy, trong các mô động thực vật lutein có khả năng liên kết với các acid béo, lipid, lipoprotein tạo thành các cấu trúc bền vững hơn so với dạng lutein tự do…

1.2.1.3 Hoạt tính sinh học

Phần lớn chức năng sinh học của chất màu lutein đều dựa trên khả năng hấp th ánh sáng, khả năng dễ bị oxy hóa và khả năng bắt giữ các gốc tự do của phân tử lutein

- Khả năng hấp thụ ánh sáng:

Lutein có khả năng hấp th tia tử ngoại và ánh sáng xanh trong dải bức

xạ khả kiến, do đó có khả năng bảo vệ da, mắt khỏi tác hại của các bức xạ này, ngăn ngừa ung thư da, thoái hóa điểm vàng [8], [11]

- Hoạt tính chống oxy hóa:

Nhiều th nghiệm đã chứng minh rằng, các lutein có khả năng bảo vệ cơ thể khỏi những chứng bệnh hiểm nghèo, như các bệnh về mắt, ung thư, bệnh tim, viêm màng b đào,… Người ta cho rằng, tác d ng này của các phân tử lutein nhờ vào khả năng chống oxy hóa và bắt giữ các gốc tự do sinh ra trong tế bào.Các loại oxy hoạt t nh ROS: Reactive oxygen species)

ở trong tế bào và mô có thể gây tác hại đến DNA, protein, carbohydrat và lipid Sự gây hại này được kiểm soát bởi lutein do nó có khả năng khử các chất gây oxy hóa và dọn sạch các gốc tự do Khả năng chống oxy hóa của lutein có thể được giải th ch bởi cấu trúc hóa học đặc biệt của nó Lutein có hai nhóm hydroxyl làm cho t nh chống oxy hóa trở nên mạnh hơn so với các carotenoid khác (lycopen, -caroten, … Lutein là một oxycarotenoid có tác động loại trừ và ngăn chặn sự xâm nhập của chất gây oxy hóa, gốc tự do qua màng tế bào, giúp ngăn chặn sự oxy hóa lipid, hạn chế sự suy giảm khả năng miễn dịch đối với cơ thể Do đó, lutein có ảnh hưởng mạnh đến sự tăng hoạt t nh chống oxy hóa trong máu và tế bào [7]

1.2.1.4 Ứng dụng của lutein

 Trong công nghiệp thực phẩm

Lutein được EU và các tổ chức FDA ở Canada, Úc, New Zealand cho phép sử d ng làm chất màu trong chế biến thực phẩm mã số E161b với mức 0,5-2 mg/ ngày Lutein ở dạng chế phẩm hòa tan trong nước được sử d ng để nhuộm vỏ ngoài cho giò chả, các bán thành phẩm từ thịt gà, sữa chua, bánh nướng, kẹo, nước giải khát, nước ép trái cây, ngũ cốc điểm tâm, các sản phẩm

từ sữa, trứng, thực phẩm cho trẻ sơ sinh và trẻ mới biết đi, chất béo, dầu, nước thịt, nước sốt và súp hỗn hợp

 Trong công nghiệp dược phẩm

Ngoài khả năng tạo màu, lutein còn có tác d ng chống oxy hóa, hấp th gốc tự do và tia tử ngoại, làm giảm nguy cơ xơ vữa động mạch, giúp duy trì sức khỏe tim mạch, ngăn ngừa ung thư [23] Lutein là carotenoid chủ yếu có

ở điểm vàng, giúp cải thiện khả năng truyền tin qua khe kết nối trong võng mạc, rất cần thiết cho quá trình xử lý hình ảnh và sự phát triển của thần kinh thị giác [19] Đặc biệt, những nghiên cứu gần đây của tập đoàn dinh dưỡng hàng đầu thế giới là DSM Th y Sĩ đã phát hiện lutein chiếm đến 66 - 77% lượng carotenoid hình thành não bộ của người, có chức năng quan trọng trong việc phát triển và k ch th ch khả năng học hỏi, sự hình thành cảm xúc và ghi nhớ của trẻ em, cải thiện tình trạng suy giảm chức năng nhận thức ở người cao tuổi [10] Do vậy, lutein cũng đã được đưa vào trong thành phần của một

số thuốc bổ liều dùng 2-330 mg/kg , trong sữa cho nhũ nhi, trong kem chống nắng

– Lutein là chất ức chế khối u: Lutein cũng đã được kết hợp với giảm nguy cơ bệnh tim và ung thư vú, cổ tử cung và phổi do khả năng chống oxy hóa và n ng độ các chất carotenoid trong các mô của cơ thể, ngay cả trong các giai đoạn bệnh Một nghiên cứu của Đại học Tufts Boston,

lutein trong máu ở mức cao nhất thì khả năng ung thư vú giảm 88% [16]; – Lutein là chất ức chế sự tắc nghẽn mạch máu, viêm khớp, thậm ch có thể giúp giảm đau viêm xương khớp và tàn tật ở 16 triệu người Mỹ Các nhà nghiên cứu tại Viện Y học Quốc gia Hoa Kỳ gần đây đã phát hiện ra rằng những người có n ng độ cao nhất lutein trong máu khoảng 70% t có khả năng bị viêm khớp đầu gối và các mô liên kết khác [16]

– Lutein làm giảm các rối loạn mắt, như thoái hóa điểm vàng, đ c thủy tinh thể Lutein là một chất chống oxy hóa carotenoid xảy ra trong tự nhiên với zeaxanthin Ở người, lutein và zeaxanthin tập trung ở điểm vàng của mắt cũng như ở da, vú và mô cổ tử cung Chế độ ăn uống lutein được coi là một vi chất dinh dưỡng cần thiết cho thị lực bình thường [12] Được sử d ng chủ yếu trong các sản phẩm chăm sóc mắt để làm giảm mệt mỏi thị giác, giảm tỷ lệ mắc chứng thoái hóa điểm vàng do tuổi già AMD: Age-related macular degeneration , đ c thủy tinh thể, bệnh võng mạc,…

 Trong công nghiệp mỹ phẩm

Chủ yếu được sử d ng để làm trắng da, chống nếp nhăn và bảo vệ tia cực

t m Một số chế phẩm kem chống nắng công thức thảo dược chứa lutein ester

chiết suất từ Tagetes erecta L đã được sản xuất Lutein và lutein ester được

hòa tan cùng với các loại dầu thảo dược và các hợp chất không no có thể dễ dàng thâm nhập vào da và cho hiệu quả chống nắng tốt [11] Theo nghiên cứu của Bowen M và ctv 2004 lutein ester có thể được sử d ng như một loại thuốc trong keo vuốt làm cứng tóc, còn lutein tự do được dùng trong keo làm mềm tóc [6]

 Trong chăn nuôi

Lutein được dùng để làm chất ph gia trong chế biến thức ăn nuôi cá cảnh, thức ăn cho gia súc và gia cầm để tạo màu vàng cho da gà và lòng đỏ trứng…

1.2.2 Tổng quan về lutein ester

1.2.2.1 Cấu trúc phân tử

Lutein ester thường được tìm thấy trong tự nhiên dưới dạng monoester hay diester của lutein với một hay hai gốc acid béo gắn với nhóm hydroxyl Lutein ester có trong hoa CVT chủ yếu là dưới dạng lutein dipalmitate Ngoài

ra, còn có lutein dimyristate, lutein myristate - palmitate, lutein palmitate-

stearate, lutein distearate và vết của các ester myristate và stearate Phần còn lại là các chất béo trung t nh

Hình1.3 Cấu tạo phân tử của lutein ester

(Lutein dipalmitate, M = 1044)

1.2.2.2 Tính chất vật lí và tính chất hóa học

 Tính chất vật lí

- Lutein ester tinh thể có màu vàng cam

- Lutein ester không tan trong nước Do lutein ester có chứa các chất béo trung t nh nên nó tan trong chất béo như dầu thực vật Ngoài ra, lutein ester tan trong glycerol, rượu, axeton, các dung môi clo hóa (chloroform, dichloromethylene và các dung môi không phân cực khác hexane, ether dầu

tương đương như trong hexane

- Hấp th ánh sáng mạnh nhất ở bước sóng 445 nm

 Tính chất hóa học

T nh chất hóa học của lutein ester tương tự đối với lutein tự do Hệ thống nối đôi liên hợp trong phân tử lutein ester dễ bị oxy hóa hoặc bị đ ng phân hoá, hydro hóa làm mất màu Do đó, cần bảo quản sản phẩm dưới kh trơ hay chân không, ở nhiệt độ thấp, trong tối, tránh ánh sáng mặt trời Tuy nhiên, do

có các acid béo liên kết với 2 nhóm hydroxyl nên lutein ester bền với nhiệt, ánh sáng và khó bị oxy hóa hơn so với lutein

Lutein ester có thể bị xà phòng hóa với KOH Khi thủy phân lutein

ester, các axit béo được tách ra và thu được lutein tự do

1.2.2.3 Hoạt tính sinh học và ứng dụng

Một số nghiên cứu cho thấy lutein ester có tính sinh khả d ng tương đương hoặc cao hơn lutein tự do Bowen E và ctv., 2001) [6] Tuy nhiên, lutein do không chứa các acid béo ester hóa nên có thể được hấp th trực tiếp vào cơ thể, còn lutein ester phải được thủy phân bởi các enzyme trong ruột r i mới được hấp th vào máu và đi đến các tế bào Lutein ester hấp thu được vào vào máu của con người và có tác d ng hạn chế sự tăng trưởng khối u và sự gia tăng tế bào lympho Tuy nhiên, khả năng hấp th lutein và lutein ester trong cơ thể là không tương đương Nghiên cứu của Oryza Oil & Fat Chemical Co., Ltd cho thấy chỉ có lutein tự do được tìm thấy trong huyết thanh người bất kể chế độ ăn uống, thức ăn như thế nào Điều đó chứng tỏ lutein ester bị thủy phân thành lutein tự do, sau đó mới được hấp thu vào huyết thanh Một số enzyme được gọi là esterase và lipase thực hiện thủy phân của lutein ester trong tiêu hóa Các enzyme này ược sản xuất trong tuyến

t y bởi một cơ chế được quy định bởi sự hiện diện của chất béo trong dạ dày

và tá tràng Vì thế, hoạt t nh sinh học của lutein ester cũng được cải thiện khi được cung cấp cùng với chất béo trong thực phẩm

Hình 1.4 Nồng độ lutein và lutein ester trong huyết thanh

1.2.3 Các nguồn lutein và lutein ester có trong tự nhiên

Lutein có trong lòng đỏ trứng, trái cây, rau, ngũ cốc, và trứng Johnson,

2004 , lá t a tô, rau dền t a, thịt quả b đỏ, Các loại rau có màu xanh đậm cũng chứa lutein nhưng hàm lượng không cao so với các ngu n nêu trên

Bảng 1.2 Hàm lượng lutein có trong rau quả

Rau, hoa, quả Lutein (mg/100g) Rau, hoa, quả Lutein (mg/100g)

Đặc biệt, CVT Mỹ (Tagetes erecta L.) được xem là ngu n tự nhiên giàu

lutein nhất được biết hiện nay với hàm lượng carotenoid tổng số trong cánh hoa khoảng 0,6 – 1,6% (tính theo trọng lượng khô , trong đó trên 92% là lutein Hiện nay, Trung Quốc và Ấn Độ đã lai tạo thành công một số giống CVT có năng suất cao và khả năng t ch lũy lutein lớn hơn nhiều 2 – 2,5 g lutein /kg khô so với các giống trước đây Nhờ vậy, đã làm giảm đáng kể giá thành của các sản phẩm lutein và phát triển mạnh những ứng d ng của lutein trong công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm Thị trường lutein trên thế giới tăng trưởng nhanh trong thời gian gần đây đặc biệt ở Hoa Kỳ, châu

Âu, Ấn Độ, Brazil, Trung Quốc với doanh số bình quân khoảng 233 triệu USD vào năm 2010 và dự báo tăng khoảng 3,6%/năm

1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết

Hiệu suất chiết chịu ảnh hưởng của các yếu tố sau:

 Gradient nồng độ: tức chênh lệch n ng độ chất cần chiết ở trong

nguyên liệu và dung môi Chênh lệch này càng nhiều thì hiệu suất chiết càng cao

 Cấu tạo của nguyên liệu: màng tế bào, chất nguyên sinh, một số

+ Chất nguyên sinh: có thành phần hóa học rất phức tạp và không ổn định, có t nh nhớt, t nh đàn h i, không tan trong nước, không màu và không bền đối với nhiệt, do đó chúng bị mất hoạt t nh sinh học ở nhiệt độ cao Chất nguyên sinh có t nh bán thấm (chỉ thấm đối với dung môi mà không cho chất tan đi qua), do đó phải phá hủy chất nguyên sinh bằng làm đông vón chúng bằng nhiệt hoặc bằng c n trước khi chiết

 Ảnh hưởng của yếu tố kỹ thuật

+ Nhiệt độ: khi nhiệt độ tăng thì hệ số khuếch tán cũng tăng, do đó theo định luật Fick, lượng chất khuếch tán cũng tăng lên Hơn nữa, khi nhiệt

độ tăng thì độ nhớt của dung môi giảm, do đó sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chiết xuất

+ Thời gian: Khi bắt đầu chiết, các chất có phân tử lượng nhỏ thường là hoạt chất sẽ được hoà tan và khuếch tán vào dung môi trước, sau đó

mới đến các chất có phân tử lượng lớn thường là tạp như nhựa, keo Do đó, nếu thời gian chiết ngắn sẽ không chiết được hết hoạt chất trong dược liệu; nhưng nếu thời gian chiết dài quá, dịch chiết sẽ bị lẫn nhiều tạp, gây bất lợi cho quá trình tinh chế và bảo quản Vì vậy, cần phải lựa chọn thời gian chiết sao cho phù hợp với thành phần dược liệu, dung môi, phương pháp chiết

+ Độ mịn: Khi k ch thước nguyên liệu thô quá, dung môi sẽ khó thấm ướt dược liệu, hoạt chất khó được chiết vào dung môi Khi độ mịn dược liệu tăng lên, bề mặt tiếp xúc giữa dược liệu và dung môi tăng lên; theo định luật Fick, lượng chất khuếch tán vào dung môi tăng lên, do đó thời gian chiết xuất

sẽ nhanh hơn

+ Sự khuấy trộn: Khi tiếp xúc với nguyên liệu, dung môi sẽ thấm vào nguyên liệu, hoà tan chất tan Chất tan sẽ khuếch tán từ nguyên liệu vào dung môi qua màng tế bào Sau một thời gian khuếch tán, n ng độ chất tan trong tế bào giảm dần, n ng độ chất tan trong lớp dung môi tăng dần, chênh lệch n ng

độ giữa trong và ngoài tế bào giảm dần, tốc độ quá trình khuếch tán cũng giảm dần, đến một lúc nào đó sẽ xảy ra quá trình cân bằng động giữa hai pha

Do đó, muốn tăng cường quá trình khuếch tán, cần phải tạo ra chênh lệch

n ng độ bằng cách di chuyển lớp dịch chiết ở ph a sát màng tế bào nơi có

n ng độ cao hơn ra ph a xa hơn và di chuyển lớp dung môi ở ph a xa nơi có

n ng độ thấp hơn đến sát màng tế bào Điều này được thực hiện bằng cách khuấy trộn Như vậy bằng cách khuấy trộn, người ta đã tăng cường được tốc

độ khuếch tán

+ Dung môi chiết:

Dựa vào độ phân cực của dung môi người ta phân loại như sau:

 Dung môi không phân cực: ether dầu hoả, xăng, hexane, heptane, benzene, toluene…

 Dung môi phân cực yếu và vừa: chloroform, dichloroethane, acetone, ethyle acetate

 Dung môi phân cực mạnh: nước, glycerin, các loại c n có mạch carbon ngắn methanol, ethanol, isopropanol )

Dung môi t phân cực thì dễ hoà tan các chất không phân cực và khó hoà tan các chất có nhiều nhóm phân cực Ngược lại, dung môi phân cực mạnh thì dễ hoà tan các chất có nhiều nhóm phân cực và khó hoà tan các chất t phân cực Dung môi có độ nhớt càng thấp hay có sức căng bề mặt càng nhỏ thì càng dễ thấm vào nguyên liệu, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chiết xuất

và ngược lại

1.4 Phương pháp xử lý hoa CVT bằng Viscozym

1.4.1 Sự cần thiết phải xử lý hoa CVT trước khi chiết

Theo các quy trình truyền thống, để chiết lutein ester từ cánh hoa CVT thì trước hết hoa cúc vạn thọ được ủ xi-lô để phân hủy thành tế bào thực vật , sau đó đem sấy khô, nghiền mịn r i chiết lutein ester bằng hexane Quá trình này mất nhiều thời gian, tiêu tốn năng lượng và tổn thất đáng kể lutein, hiệu

suất thu h i lutein kém

Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng, hoa CVT tươi rất giàu nước 80–90%)

và cánh hoa lại được bọc bằng một lớp màng cellulose-hemicellulose-pectin phức hợp, nên các dung môi kém phân cực rất khó thâm nhập vào nguyên liệu, do đó hiệu suất chiết rất kém nhất là khi sử d ng phương pháp ngâm chiết thủ công

Để tăng hiệu quả chiết, trước đây thường dùng các tác nhân hóa học như kiềm, acid để phân giải thành tế bào phương pháp hóa học … Gần đây, phương pháp sinh học trong đó xử lý nguyên liệu bằng enzyme cũng đã được

đề xuất để cải thiện hiệu suất và chất lượng của một số sản phẩm Trong quá trình xử lý bằng enzyme, các enzyme tương tác với thành tế bào nguyên liệu,

thúc đẩy các phản ứng thủy phân làm phá vỡ thành tế bào, làm cho các vật liệu bên trong tế bào tiếp xúc nhiều hơn với dung môi chiết, do đó làm tăng hiệu suất chiết

1.4.2 Phương pháp chiết lutein ester từ hoa CVT đã xử lý enzyme

Hiện nay, có nhiều loại enzyme được sử d ng để xử lý ngu n nguyên liệu hoa CVT tươi trước khi tiến hành chiết lutein ester

Nhiều nghiên cứu gần đây có sử d ng enzyme thương mại đã tiết kiệm thời gian, công sức và sự lựa chọn enzyme thương mại cũng rất phong phú Chiết xuất lutein từ cánh hoa CVT được xử lý bằng enzyme thương mại bao

g m: ủ enzyme và chiết lutein Hiệu quả của ủ lên men đã được xác định là yếu tố ch nh ảnh hưởng đến việc thu h i xanthophyll thông qua chiết bằng dung môi Trong giai đoạn này, các vi sinh vật kết hợp với hoa CVT, làm phân hủy cellulose và hemicellulose có trong thành tế bào của các cánh hoa

Sự suy thoái này làm tăng sự thẩm thấu của dung môi vào các tế bào sắc tố trong nguyên liệu trong quá trình chiết Nói chung, trong quá trình lên men, hai loại vi sinh vật được sử d ng là vi sinh vật nội sinh có sẵn trong nguyên liệu và vi sinh vật thương mại được phân lập từ các ngu n tự nhiên Trong cả hai trường hợp, các vi sinh vật có thể được sử d ng một mình hoặc như một

phần của môi trường nuôi cấy trong chuẩn bị khởi đầu cho quá trình lên men

1.5 Tình hình nghiên cứu liên quan đến đề tài

1.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Theo các quy trình truyền thống, hoa CVT sau khi thu hoạch được ủ

xi-lô để phân hủy cellulose trong thành tế bào chứa sắc tố bằng các enzyme nội sinh r i đem ép để loại bỏ nước, sấy khô, nghiền thành bột Sau đó, carotenoid được chiết từ bột hoa CVT bằng hexane Dịch chiết hexane được đem cô dưới áp suất thấp để thu lutein oleoresin dầu nhựa chứa chủ yếu lutein ester Sản phẩm này có thể dùng làm ph gia trong chế biến thức ăn

gia cầm nhằm tăng cường màu màu vàng cho da hay cho lòng đỏ trứng gà,… Lutein oleoresin cũng có thể được xà phòng hóa, sau đó tinh chế để thu lutein

tự do tinh khiết cao ứng d ng làm chất màu thực phẩm hay dược phẩm

Philip, T (1977) [13] đã chiết lutein ester từ bột hoa CVT khô ở nhiệt độ

phòng bằng eter dầu mỏ với tỷ lệ 1:3 w/v Dịch chiết được cô đuổi dung môi

C

cuối cùng chứa 51% lutein ester, có thể dùng làm chất màu bổ sung vào thức

ăn chăn nuôi gia cầm nhưng không th ch hợp làm chất màu thực phẩm hay

dược phẩm cho người do chứa nhiều acid béo và tỷ lệ cis-lutein ester cao nên

có hoạt t nh sinh học kém

Levy, L W., (2001 đã cải tiến quy trình của Philip (1997) để thu sản

phẩm có tỷ lệ trans-lutein ester cao bằng cách bằng cách ngâm chiết bột hoa

CVT khô trong hexane (8 lít/kg ở nhiệt độ phòng Dịch chiết được cô đuổi hexane để thu lutein ester thô Sau đó, thêm isopropanol vào ở nhiệt độ phòng

để hòa tan cis-lutein ester và các tạp chất không phải xanthophyll Chất rắn

còn lại được cô chân không để loại bỏ isopropanol Kết quả thu được sản

phẩm chứa 69% lutein ester trong đó tỷ lệ đ ng phân trans-: cis là 90:10

Nhược điểm của quy trình này là sản phẩm oleoresin cuối cùng vẫn còn chứa

tỷ lệ cis- lutein ester khá cao, chưa đạt yêu cầu về chất lượng lutein ester dùng

làm chất màu thực phẩm hay dược phẩm cho người Nguyên nhân là do

cao, tốn nhiều năng lượng và thời gian để loại bỏ dung môi này ra khỏi sản phẩm

Kumar, S.T.K (2004) [10] đã cải tiến quy trình của Levy 2001 bằng

cách dùng 2-propanone hoặc 2-butanone thay cho isopropanol trong công

đoạn loại bỏ tạp chất và đ ng phân cis-lutein ester có trong oleoresin Như

vậy, dư lượng dung môi có thể cô đuổi ở nhiệt độ phòng Kết quả là đã tăng tỷ

lệ đ ng phân trans- : cis- trong sản phẩm lên t nhất 18:1

Kumar, S.T.K ; P Abdulkadir và cs (2004) [10] đã dùng hexane để chiết

lutein ester từ bột hoa CVT khô đã được cố định và làm giàu carotenoid bằng cách ủ xi lô trong 2– 3 tuần ở pH thích hợp trong điều kiện kỵ khí có kiểm soát và có mặt chất chống oxy hóa)

Juan Liu J.; Fan, S 2009 đã tiến hành chiết lutein ester từ bột hoa CVT

bằng hỗn hợp hexane:acetone : methanol (8:1:1,v/v/v) với tỷ lệ dung môi/nguyên liệu từ 20/1 – 60/1 (lít/kg) ở 200 - 400C với sự hỗ trợ của siêu âm (10 - 60 phút)

Swaminathan (2009) [17] đã đưa ra quy trình chiết lutein từ hoa CVT đã

được ủ xilô trong điều kiện yếm kh để cố định và làm giàu carotenoid Hoa sau khi xử lý được đưa vào máy ép tr c vít (ép 2 lần), vắt kiệt nước đến độ ẩm

75 - 88%, dàn đều, sau đó sấy khô bằng máy thổi không khí nóng (nhiệt độ

10% r i đùn thành viên có k ch thước, tỷ trọng và độ cứng thích hợp Carotenoid ester được chiết bằng hexane theo nguyên tắc chiết ngược dòng

bay hơi màng, r i 1% bằng thiết bị cô chân không và tiếp t c xuống 1000

Nhiều công trình gần đây cũng tập trung nghiên cứu nâng cao hiệu suất chiết lutein ester bằng cách phá hủy màng tế bào chứa sắc tố nhờ tác d ng của các enzyme nội sinh tiết ra từ các chủng vi sinh vật sẵn có trong hoa CVT hoặc dùng enzyme thương mại như cellulase hay hỗn hợp cellulase, pectinase

và hemicellulase

Bên cạnh đó, cũng xuất hiện hướng nghiên cứu hạn chế sự phân hủy lutein ester trong công đoạn chiết bằng cách dùng các kỹ thuật hiện đại như

chiết với sự hỗ trợ của siêu âm, chiết bằng CO2 siêu tới hạn Mặc dù các kỹ thuật chiết hiện đại đã được áp d ng ở khá phổ biến trong phòng thí nghiệm tại các nước tiên tiến nhưng việc áp d ng rộng rãi trong sản xuất công nghiệp còn hạn chế do chi ph đầu tư thiết bị cao, không kinh tế Trong thực tế, lutein ester chủ yếu vẫn chiết được bằng phương pháp ngâm chiết bột hoa CVT khô trong hexane nên mất nhiều thời gian và hiệu suất không cao Vì vậy, việc nghiên cứu cải tiến công nghệ chiết truyền thống nhằm giảm nâng cao hiệu suất thu h i lutein vẫn đang là bài toán đặt ra cho các nhà khoa học trên thế giới

1.5.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Việt Nam có kh hậu gần như nắng nóng quanh năm, rất lý tưởng cho việc phát triển các vùng nguyên liệu CVT ứng d ng trong công nghiệp hóa dược và thực phẩm Năm 2007 Nhà nước đã phê duyệt “Chương trình nghiên cứu khoa học công nghệ trọng điểm quốc gia phát triển công nghiệp hoá dược đến năm 2020” Quyết định số 61/2007/QĐ-TTG), trong đó một trong những

m c tiêu đặt ra là xây dựng quy trình tách chiết lutein từ hoa CVT làm nguyên liệu bào chế thuốc

Ở nước ta, lutein cũng đã được Bộ Y tế đưa vào danh m c các chất màu thực phẩm được phép sử d ng từ năm 2012 Chất màu này hiện vẫn đang được nhập khẩu với giá khá đắt lutein tinh khiết 90% khoảng 8 – 11 triệu VND/kg chưa kể thuế nhập khẩu, ph chuyển hàng Tuy nhiên, cho đến nay

số công trình nghiên cứu liên quan đến vấn đề này ở nước ta rất t

Hoàng Thị Huệ An 2007) [1] đã nghiên cứu xây dựng quy trình thu nhận lutein từ hoa CVT khá đầy đủ từ khâu chọn giống, sấy - bảo quản nguyên liệu cho đến tách chiết và tinh chế để thu nhận lutein tinh thể Tác giả

đã xác định được giống Inca Orange là giống có khả năng t ch lũy lutein cao nhất trong số các giống CVT thường tr ng tại tỉnh Khánh Hòa; đã đưa ra phương pháp xử lý và bảo quản hoa CVT sau thu hoạch nhằm làm giảm thiểu

mức độ tổn thất lutein bảo quản hoa tươi ở -200C nếu chỉ bảo quản ngắn

giả cũng đã xây dựng quy trình chiết tách lutein ester từ hoa CVT bằng acetone 15/1 l t/kg ở nhiệt độ phòng lặp lại 3 lần đối với hoa tươi; 5 lần đối với hoa khô ; sau đó chiết lutein ester sang eter dầu mỏ acetone: eter dầu mỏ

= 1:1 , rửa dịch chiết bằng nước cất r i cô dưới áp suất thấp để thu lutein oleoresin; Quy trình này tốn nhiều dung môi, mất thời gian Nguyên nhân là

do tế bào chứa sắc tố trong nguyên liệu CVT bị bao bọc bằng một màng cellulose phức hợp làm carotenoid rất khó khuếch tán vào dung môi; quá trình chiết lutein ester lại thực hiện ở nhiệt độ phòng nên cần phải chiết nhiều lần, đặc biệt khi chiết nguyên liệu khô Do đó, quy trình chỉ phù hợp với quy mô phòng th nghiệm

Để khắc ph c nhược điểm trên, trong đề tài cấp tỉnh 2012- 2014 tác giả Hoàng Thị Huệ An và cs [4] đã cải tiến quy trình chiết như sau: ử lý hoa

bào nguyên liệu trước khi chiết lutein ester khi đó có thể chiết trực tiếp lutein ester từ nguyên liệu tươi mà không cần qua hai giai đoạn chiết bằng aceton r i

tỷ lệ dung môi/nguyên liệu là 2/1 v/w ; tốc độ lắc: 250 rpm, chiết 1 lần Thời gian chiết: 18 h; số lần chiết: 1 lần kết quả t nh toán cho thấy việc tăng số lần chiết sẽ không có hiệu quả kinh tế Khi đó, hiệu suất chiết lutein ester vào khoảng 74% Tuy quy trình chiết đạt hiệu suất chiết khá cao chỉ với 1 lần chiết nhưng kết quả t nh toán cho thấy hiệu quả kinh tế thấp do sử d ng enzyme với n ng độ và tỷ lệ lớn trong khi Viscozym khá đắt 2,0 -2,2 triệu VNĐ/l t Ngoài ra, với điều kiện xử lý như trên, quá trình phân hủy nguyên liệu quá mạnh, dẫn đến sự tạo thành những sản phẩm keo có độ nhớt cao gây khó khăn cho quá trình tinh chế lutein về sau Một nhược điểm nữa là quá

trình xử lý enzyme sinh ra lượng dịch thải lớn với chỉ số BOD rất cao, gây ô nhiễm môi trường và khó khăn cho việc xử lý dịch thải

Do vậy, vấn đề đặt ra cho đ án này là cải tiến quy trình xử lý hoa CVT bằng Viscozym theo hướng giảm thiểu n ng độ dung dịch Viscozym cũng như tỷ lệ dung dịch enzyme/nguyên liệu Bên cạnh đó, cũng cần xác định điều kiện tối ưu cho phép chiết lutein từ hoa CVT đã xử lý Viscozym theo quy trình cải tiến sao cho hiệu suất chiết cao nhưng chi ph chi ph thấp nhất có thể được

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu CVT

Nguyên liệu sử d ng để chiết tách lutein ester trong nghiên cứu này là

hoa CVT Mỹ Tagetes erecta L được tr ng tại huyện Diên Khánh tỉnh

Khánh Hòa Sau khi thu hoạch, thu cánh hoa, chuyển về phòng th nghiệm, cân thành những lượng ch nh xác đã xác định, cho vào túi polyetylen, cột k n,

2.1.2 Hóa chất

- Na2SO4 khan Trung Quốc , ethanol, acetone, hexane Chemsol, Việt Nam đều thuộc loại tinh khiết phân t ch

- BHT thuộc loại tinh khiết cho tổng hợp Merck, Đức

- Viscozym lỏng của Công ty Novozyme, Đan Mạch : chất lỏng hơi sánh, có màu nâu chứa chủ yếu beta – glucanase (endo-1,3(4)- và một phần xylanase, hemicellulase, cellulase, được pha chế trong dung dịch đệm kali

th ch hợp ngay trước khi dùng

- Nước cất 1 lần: tự chưng cất tại phòng th nghiệm

2.2.2 Thiết bị

- Quang kế UV-Vis (CECIL, Anh)

- Máy lắc ổn nhiệt KS 4000i control IKA, Trung Quốc

- Tủ đông SANAKY Việt Nam

- Tủ lạnh HITACHI Thái Lan)

- Máy đ ng hóa Ultra- Turax Basic T18 IKA, Trung Quốc

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Chuẩn bị nguyên liệu CVT trước khi chiết

Cánh hoa CVT sau khi thu hoạch đưa về phòng th nghiệm được làm sạch loại bỏ phần hư hỏng , trộn đều, cân thành các mẫu có khối lượng xác

2.3.2 Nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện xử lý hoa CVT bằng Viscozym

2.3.2.1 Quy trình tổng quát của quá trình xử lý và đánh giá hiệu quả xử lý hoa CVT bằng Viscozym

Cánh hoa CVT được xử lý bằng Viscozym nhằm phá vỡ thành tế bào nguyên liệu, tạo điều kiện cho dung môi thâm nhập vào bên trong tế bào, hòa tan carotenoid và chiết sắc tố ra khỏi nguyên liệu và đi vào dung dịch

Để tối ưu hóa điều kiện xử lý, dựa vào các kết quả nghiên cứu trước đây chúng tôi lựa chọn các yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hiệu quả xử lý hoa cúc vạn thọ bởi Viscozym là:

Hiệu quả xử lý được đánh giá qua hiệu suất chiết carotenoid:

Hiệu quả xử lý % =

Carotenoid tổng số chiết được

Carotenoid tổng số trong nguyên liệu

ử lý Viscozym

Chiết lutein ester

Đo quang dịch chiết

Đánh giá hiệu quả xử l

Thuyết minh quy trình

 Bước 1: Chuẩn bị nguyên vật liệu

Nguyên liệu là cánh hoa CVT tươi đã được loại bỏ những phần hư hỏng

và các tạp chất

Cân ch nh xác G gam nguyên liệu cho vào thiết bị ủ enzyme có thể đảo trộn

 Bước 2: Xử lý Viscozym

Cho dung dịch Viscozym đã pha loãng từ dung dịch Viscozym đặc đến

n ng độ yêu cầu bằng nước cất vào mẫu hoa CVT đã cân sẵn nói trên Đảo trộn hỗn hợp trong 15 phút để dung dịch enzyme ngấm đều vào nguyên liệu

Để hỗn hợp trong tối, ở nhiệt độ phòng trong khoảng thời gian xác định theo phương án th nghiệm

Sau khi ủ enzyme, tách bỏ hết dịch Thêm ethanol tuyệt đối theo tỷ lệ 1/1 v/w t nh theo khối lượng hoa tươi ban đầu , lắc đều, để yên trong 15 phút Tách

bỏ dịch ethanol cho vào bình chứa dịch thải để chưng cất thu h i tái sử d ng

 Bước 3: Chiết carotenoid

Chiết carotenoid bằng cách cho dung môi hexane chứa 0,1% BHT vào

bã hoa CVT đã xử lý enzyme Sử d ng máy lắc ngang để chiết

Điều kiện chiết được cố định như sau:

- Tỷ lệ hexane/nguyên liệu là 2/1 v/w t nh theo lượng hoa tươi ban đầu

Na2SO4 khan để loại bỏ vết nước còn lại trong dịch chiết r i cho vào bình định mức, đưa đến vạch bằng hexane Pha loãng dung dịch với độ pha loãng

D th ch hợp r i đem đo độ hấp th ở 445 nm dùng hexane làm dung dịch so sánh)

2.3.2.2 Nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện xử lý hoa CVT bằng Viscozym

Để xác định được các thông số tối ưu cho quá trình xử lý Viscozym, chúng tôi sử d ng phương pháp bề mặt đáp ứng RSM: Response Surface Method , trong đó quy hoạch thực nghiệm tối ưu hóa theo mô hình bậc 2 với phương án cấu trúc tâm mặt CCF: Central Composite Face Design

Nhằm giảm lượng enzyme sử d ng so với các nghiên cứu trước đây, khoảng biến thiên của các biến khảo sát được chọn như sau:

- Thời gian xử lý 3 = 1 – 5 giờ

Để đạt hiệu suất xử lý cao đ ng thời tiết kiệm enzyme và giảm tối đa lượng dịch thải của quá trình xử lý, chúng tôi tiến hành tối ưu hóa đa m c tiêu với các hàm m c tiêu phải thỏa mãn yêu cầu như sau:

Y1 % : hiệu quả xử lý cực đại

Y2 = X1.X2.1000/100 = 10X1.X2

phương trình bậc hai:

Y1 = ao + a1X1 + a2X2 + a3X3 + a12X1X2 + a b13X1X3 + a23X2X3 + a11X12 + a22X22 + a33X32Phương án thực nghiệm tối ưu hóa được thiết kế nhờ phần mềm MODDE 5.0 Umetrics, Hoa Kỳ g m 17 th nghiệm trong đó 3 th nghiệm ở