Tối ưu hóa quy trình chiết lutein ester từ hoa cúc vạn thọ Tagetes erecta L. đã được xử lý bằng Viscozyme

LỜI CẢM ƠN Sau hơn 3 tháng thực hiện đồ án tốt nghiệp “Tối ưu hóa quy trình chiết lutein ester từ hoa cúc vạn thọ Tagetes erecta L. đã được xử lý bằng Viscozyme” đến nay đề tài đã được hoàn thành. Trong thời gian qua cũng như trong suốt quá trình học tập tại trường, ngoài nỗ lực phấn đấu của bản thân em đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của quý thầy cô, gia đình và bạn bè. Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trường Đại học Nha Trang, Ban Chủ nhiệm khoa cùng quý thầy cô khoa Công nghệ Thực phẩm và cán bộ phụ trách Phòng Thí nghiệm Hoá (Trung tâm Thí nghiệm – Thực hành) đã tận tình giúp đỡ, truyền đạt kiến thức và tạo điều kiện thuận lợi nhất về cơ sở vật chất, trang thiết bị, giúp chúng em có hoàn thành tốt đồ án tốt nghiệp này.

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC HÌNH vii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 4

1.1 Tổng quan về cây cúc vạn thọ 4

1.1.1 Nguồn gốc và đặc điểm của cây cúc vạn thọ 4

1.1.2 Phân loại 4

1.2.3 Ứng dụng 5

1.2 Tổng quan về lutein và lutein ester 8

1.2.1 Tổng quan về lutein 8

1.2.1.1 Cấu tạo phân tử của lutein 8

1.2.1.2 Tính chất lý-hoá của lutein 8

1.2.1.3 Ứng dụng của lutein 9

1.2.2 Tổng quan về lutein ester 12

1.2.2.1 Cấu tạo phân tử của lutein ester 12

1.2.2.2 Tính chất lý-hóa 12

1.2.2.3 Hoạt tính sinh học của lutein ester 13

1.3 Các phương pháp chiết lutein ester 14

1.3.1 Các phương pháp chiết lutein ester từ hoa cúc vạn thọ không xử lý enzyme 14

1.3.1.1 Chiết từ hoa khô 14

1.3.1.2 Chiết từ hoa tươi 16

1.3.2 Phương pháp xử lý hoa cúc vạn thọ bằng enzyme 17

1.3.2.1 Sự cần thiết phải xử lý hoa bằng enzyme trước khi chiết 17

1.3.2.2 Phương pháp chiết lutein ester từ hoa cúc vạn thọ đã xử lý enzyme 18

1.4 Tình hình nghiên cứu chiết xuất lutein ester từ cánh hoa cúc vạn thọ 19

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Đối tượng nghiên cứu 23

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 23

2.1.2 Dụng cụ, thiết bị và hoá chất nghiên cứu 23

2.1.2.1 Dụng cụ và thiết bị 23

2.1.2.2 Hoá chất 24

2.2 Phương pháp nghiên cứu 24

2.2.1 Chuẩn bị nguyên liệu 24

2.2.2 Xác định thành phần khối lượng của cánh hoa cúc vạn thọ 24

2.2.3 Phương pháp phân tích 25

2.2.3.1 Xác định hàm lượng lutein tổng số trong cánh hoa cúc vạn thọ 25

2.2.3.2 Xác định trọng lượng khô (%TL khô) của cánh hoa cúc vạn thọ 25

2.2.3.3 Phương pháp chiết lutein ester từ cánh hoa cúc vạn thọ 25

2.2.4 Đề xuất quy trình tách chiết lutein ester từ cánh hoa cúc vạn thọ 25

2.2.5 Bố trí thí nghiệm lựa chọn dung môi chiết 29

2.2.6 Phương pháp thiết kế thí nghiệm RSM-CCD tối ưu hóa điều kiện chiết 30 2.2.6.1 Thiết kế thí nghiệm RSM-CCD 30

2.2.6.2 Chọn phương án sản xuất tối ưu Kiểm tra bằng thực nghiệm 31

2.2.7 Xử lý số liệu 33

CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 Kết quả thí nghiệm xác định thành phần khối lượng của hoa cúc vạn thọ 34 3.2 Hàm lượng lutein tổng số và trọng lượng khô của nguyên liệu 34

3.3 Kết quả thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất chiết lutein ester 35

3.4 Kết quả thí nghiệm thiết kế tối ưu hóa điều kiện chiết lutein ester từ hoa CVT theo RSM-CCD 36

3.5 Chọn phương án sản xuất tối ưu 41

3.6 Hoàn thiện quy trình chiết lutein ester từ cánh hoa cúc vạn thọ đã được xử

lý bằng enzyme thương mại Viscozyme 44

3.7 Kết quả thử nghiệm quy trình-Đánh giá chất lượng sản phẩm 47

3.7.1 Kết quả thử nghiệm quy trình 47

3.7.2 Tinh chế sản phẩm lutein ester - Đánh giá chất lượng sản phẩm 48

3.8 Tính toán sơ bộ giá thành sản phẩm trong phòng thí nghiệm 51

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 PHỤ LỤC A

Phụ lục 1 Mục đích sử dụng và mức độ sử dụng của lutein trong thực phẩm A Phụ lục 2 Phương pháp xác định hàm lượng lutein tổng số C Phụ lục 3 Phương pháp xác định % trọng lượng khô D Phụ lục 4 Tối ưu hóa bằng phương pháp RSM-CCD và phần mềm Design-Expert® 8.0.7.1 E Phụ lục 5 Kết quả xác định lutein tổng số của cánh hoa CVT F Phụ lục 6 Kết quả xác định phần trăm trọng lượng khô của cánh hoa CVT G Phụ lục 7 Kết quả thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất chiết lutein ester G Phụ lục 8 Kết quả thử nghiệm quy trình chiết tối ưu H Phụ lục 9 Một số hình ảnh thí nghiệm I

UV-Vis Ultraviolet-Visible Tử ngoại-khả kiến

ADI Acceptable Daily Intake Liều lượng chấp nhận hàng

ngày FDA Food and Drug Administration Cục quản lý dược và Thực

phẩm

AMD Age-related Macular Degenerescence Thoái hoá điểm vàng lên

quan đến tuổi tác

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Các yếu tố ảnh hưởng khảo sát trong RSM-CCD 31

Bảng 2.2 Quy hoạch thí nghiệm tối ưu hóa điều kiện chiết theo thiết kế CCD 32

Bảng 3.1 Thành phần khối lượng của hoa cúc vạn thọ 34

Bảng 3.2 Trọng lượng khô và hàm lượng lutein tổng số của nguyên liệu 35

Bảng 3.3 Kết quả ma trận quy hoạch thực nghiệm theo RSM-CCD 37

Bảng 3.4 Phân tích ANOVA kết quả thí nghiệm tối ưu hóa RSM-CCD 38

Bảng 3.5 Các hệ số hồi quy sau phân tích ANOVA 39

Bảng 3.6 Các giải pháp tối ưu theo RSM-CCD 41

Bảng 3.7 Kết quả thử nghiệm quy trình 47

Bảng 3.8 Kết quả xác định hàm lượng lutein tổng số tính theo phần trăm của sản phẩm thử nghiệm 49

Bảng 3.9 Ước tính chi phí nguyên vật liệu để chiết lutein estertừ 1 kg cánh hoa cúc vạn thọ 51

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cấu tạo phân tử lutein (dạng đồng phân all-trans) 8

Hình 1.2 Cấu trúc của mắt 10

Hình 1.3 Cấu tạo phân tử của lutein ester (lutein dipalmitate, M=1044) 12

Hình 1.4 Nồng độ lutein và lutein ester trong huyết thanh 14

Hình 1.5 Thuỷ phân tế bào cánh hoa CVT của enzyme thương mại Viscozyme 18

Hình 2.1 Hoa cúc vạn thọ châu Phi 23

Hình 2.2 Sơ đồ quy trình dự kiến tách chiết lutein ester từ cánh hoa CVT đã được xử lý bằng Viscozyme 26

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn dung môi chiết 29

Hình 2.4 Các yếu tố đầu vào ảnh hưởng đến hiệu suất chiết lutein ester 30

Hình 3.1 Ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất chiết lutein ester 35

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa tốc độ lắc và nhiệt độ chiết 40

Hình 3.3 Đồ thị 3D biểu diễn sự tương tác giữa tốc độ lắc và nhiệt độ chiết đến hiệu suất chiết lutein ester 40

Hình 3.4 Sơ đồ quy trình tối ưu chiết lutein ester từ cánh hoa cúc vạn thọ đã được xử lý bằng Viscozyme 45

Hình 3.5 Phổ hấp phụ UV-Vis của sản phẩm lutein ester 49

Hình 3.6 Sản phẩm lutein ester tinh chế 50

Hình 3.7 So sánh sản phẩm lutein ester thu được từ 2 phương pháp chiết 50

MỞ ĐẦU

Khi xã hội ngày càng phát triển, đời sống ngày càng được nâng cao, con người không chỉ quan tâm đến những vấn đề ăn, mặc, ở như trước đây, mà còn có những yêu cầu cao hơn, cả về chất lượng cũng như hình thức, đặc biệt đối với những sản phẩm ảnh hưởng trực tiếp đến sức khoẻ Do đó, những thực phẩm, vật dụng có thành phần với nguồn gốc tổng hợp hoá học có thể gây hại cho sức khỏe dần bị loại bỏ và thay thế bằng các sản phẩm được sản xuất từ các thành phần chiết xuất thiên nhiên Với nhu cầu ngày càng cao của con người và sự phát triển vượt bậc của khoa học, các nhà khoa học đã nghiên cứu chiết xuất nhiều hợp chất thiên nhiên có lợi cho sức khỏe con người và ứng dụng chúng vào đời sống, trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau Trong đó, việc sử dụng các thành tựu khoa học vào ngành công nghiệp thực phẩm đóng vai trò quan trọng đặc biệt

Trong thực phẩm, màu sắc cũng đóng một vai trò rất quan trọng, giúp cho sản phẩm bắt mắt hơn, tạo ảnh hưởng tốt về chất lượng của sản phẩm Chất màu thực phẩm là hợp chất hoá học không độc và dễ tiêu hoá, tạo cho thực phẩm có màu đặc trưng, đẹp, hấp dẫn và có thể có tác dụng kích thích tiêu hoá Hiện nay, chất màu thực phẩm có nhiều loại Ví dụ như: chất màu tự nhiên có sẵn trong nguyên liệu thực phẩm; chất màu được tạo ra trong quá trình gia công kĩ thuật, nhất là khi gia nhiệt; chất màu bổ sung từ ngoài vào (chất màu thiên nhiên hoặc chất màu tổng hợp bằng các phương pháp hoá học) Phần lớn chất màu tổng hợp được sử dụng nhiều trong thực phẩm do rẻ tiền, dễ sử dụng và bền màu [39] Tuy nhiên, các chất màu tổng hợp thường có thể có tác dụng không tốt cho cơ thể con người, thậm chí

có khả năng gây ung thư [44] Trong khi đó, chất màu tự nhiên thường không độc hại do được chiết xuất từ các thành phần thiên nhiên Vì vậy, việc nghiên cứu tìm ra các phương pháp chiết tách chất màu tự nhiên và ứng dụng vào trong ngành công nghiệp thực phẩm và các ngành khác là điều rất cần thiết

Ở Việt Nam, việc lạm dụng chất màu tổng hợp trong chế biến thực phẩm là một vấn nạn trong quản lý an toàn thực phẩm hiện nay Chẳng hạn việc sử dụng

phẩm màu vàng Tartrazine (mã số E 102) hay chất màu Sudan có khả năng gây ung thư nhằm tạo ra màu vàng – vàng cam trong một số loại thực phẩm, mỹ phẩm,… đang tạo ra những mối lo ngại cho người tiêu dùng Do vậy, một trong những yêu cầu đặt ra trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm ở nước ta là tạo ra sản phẩm chất màu tự nhiên có màu vàng nhằm thay thế cho các chất màu tổng hợp nói trên Một trong những chất màu tự nhiên có màu vàng đã được FDA công nhận là an toàn có thể sử dụng trong công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm là lutein ester và lutein tự do Một trong những nguồn nguyên liệu giàu lutein nhất hiện nay là hoa

cúc vạn thọ châu Phi (Tagetes erecta L.): hàm lượng carotenoid tổng số đến 1,0–

1,6% (tính theo trọng lượng khô), trong đó, khoảng 90% lượng carotenoid này là lutein và 5% là zeaxanthin [14] Đây là một loài hoa rất phổ biến và rất dễ trồng trong điều kiện khí hậu các nước nhiệt đới như Việt Nam Chính vì vậy, khoa học trong nước và trên thế giới quan tâm

Ở Việt Nam, đã có công trình nghiên cứu của tác giả Hoàng Thị Huệ An (2009), trong đó lutein ester được chiết từ nguyên liệu tươi bằng acetone sau đó chiết sang eter dầu hoả [37] Quy trình này còn một số hạn chế: mất nhiều thời gian (chiết qua 2 giai đoạn, chiết 3 lần), tốn nhiều dung môi và hiệu suất thu nhận lutein còn thấp Vì vậy, đã có một số nghiên cứu cải tiến quy trình này bằng cách xử lý hoa cúc vạn thọ bằng Viscozyme nhằm phá vỡ tế bào nguyên liệu, sau đó chiết trực tiếp bằng hexane mà không qua giai đoạn chiết với acetone Kết quả cho thấy biện pháp này cho phép nâng cao đáng kể hiệu suất thu hồi lutein ester Tuy nhiên, hiệu quả thu nhận lutein từ quy trình cải tiến này không chỉ phụ thuộc vào điều kiện xử

lý enzyme mà còn phụ thuộc nhiều vào điều kiện chiết sắc tố Đó chính là lý do

thực hiện đề tài: “Tối ưu hóa quy trình chiết lutein ester từ hoa cúc vạn thọ

Tagetes erecta L đã được xử lý bằng Viscozyme”

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài:

Xác định các thông số tối ưu cho phép chiết lutein ester từ cánh hoa cúc vạn thọ đã được xử lý với Viscozyme với hiệu suất chiết cao nhất

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng công cụ tối ưu hóa là phần mềm Design-Expert® 8.0.7.1 với phương pháp bề mặt đáp ứng theo mô hình cấu trúc có tâm RSM-CCD

Nội dung nghiên cứu:

– Xác định các thông số tối ưu của quy trình chiết lutein ester từ hoa cúc vạn

thọ đã xử lý enzyme bằng phương pháp RSM-CCD;

– Thử nghiệm quy trình Đánh giá mức độ tương thích của giải pháp tối ưu xác định bằng lý thuyết và thực nghiệm;

– Tinh chế sản phẩm lutein ester Đánh giá chất lượng sản phẩm

Do kiến thức và kinh nghiệm nghiên cứu còn hạn chế cũng như do thời gian

và kinh phí hạn hẹp nên đề tài chắc chắn không thể tránh khỏi những thiếu sót Rất mong nhận được sự chỉ bảo từ quý thầy cô và các bạn sinh viên nhằm giúp đề tài có thể hoàn thiện hơn

CHƯƠNG I TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về cây cúc vạn thọ

Tên Việt Nam: cúc vạn thọ; vạn thọ;

Tên tiếng Anh: Marigold

Tên khoa học: Tagetes erecta;

Họ cúc Asteraceae [10, 42]

1.1.1 Nguồn gốc và đặc điểm của cây cúc vạn thọ

Cây hoa cúc vạn thọ (CVT) có nguồn gốc từ Mexico Cây được nhà thám hiểm Hernando Cortés đưa về Châu Âu vào thế kỷ 14 và được trưng bày trên các bàn thờ, nên được gọi là ‘Mary’s gold’ (nén vàng của Mẹ Maria) Sau đó, cây được trồng khắp nơi quanh Địa Trung Hải, rồi mọi nơi trên thế giới Cây này có loài chỉ cao chừng 20 cm, có loài cao hơn 70–80 cm Có hai dạng hoa CVT: hoa kép và hoa đơn Hoa có nhiều màu: vàng kem, vàng tươi, vàng chanh, vàng cam, đỏ cam

1.1.2 Phân loại

Cây hoa CVT chia làm ba loài nguyên và loài lai [41, 42]:

Cúc vạn thọ Châu Phi (African Marigold, tên khoa học Tagetes erecta L.)

Đây thường là giống hoa CVT cây cao nhất và hoa cũng to nhất Đáng kể nhất hiện nay là loài hoa kép, to, nở tròn xoe không cồi gọi là ánh Nguyệt (Moonlight), cây cao chừng 40 cm và mọc dày khít nhau Gold-n Vanilla cũng có hoa kép to và cây còn cao hơn nữa, khoảng 50–70 cm, hạt đem gieo thường cho nhiều hoa màu sắc khác nhau, lẫn lộn từ cam đến vàng, vàng kim, vàng chanh, vàng

bơ Các loài khác của giống này đáng kể ra là Tuổi Vàng (Golden Age), cây cao hơn 75 cm và có thể có cây cao đến 1,50 m và hoa rất to, đường kính 12,5 cm

Cúc vạn thọ Pháp (French Marigold; tên khoa học Tagetes patula L.)

Đối với giống Oai Vệ (Majestic), cây lùn, cao độ 30 cm, hoa vàng đơn, cánh sọc nâu hay sọc màu gõ đỏ, cồi vàng Cũng như mọi loài hoa CVT Pháp khác, ở nơi luôn luôn nóng như đồng bằng nước ta, cây có thể cao hơn 60 cm Giống Kỳ Hoa

Sọc Đỏ (Striped Marvel) thân cao đến 75 cm Janie là loài ra hoa sớm nhất và hoa nhiều nhất trong nhóm hoa CVT Pháp Cây mọc khít, thân lùn, chỉ cao chừng 20

cm, hoa 4–5 cm, nhưng đầy đặn, ít cồi và gieo hạt sau 6 tuần là đã trổ hoa Có ba màu được ưa thích là vàng, đỏ lửa và vàng kim, nhưng cũng còn có màu gõ đỏ, màu cam đậm, màu quýt tiều đỏ son, hay lẫn lộn nhiều màu Loài lùn Naughty Marietta, chỉ cao 25 cm, hoa đơn, cánh bên trong điểm vết nâu Loài Mắt Cọp (Tiger eyes), cao 30–35 cm là một loài hoa CVT lạ vì lẽ cánh đơn đỏ huyết ở viền bìa ngoài hoa, còn bên trong nở như là cúc vàng cam Loài Loạt Nữ Hoàng (Queen series) hoa nở tựa hoa trà mi, hải đường, cây lùn 25–30 cm,

Cúc vạn thọ nhỏ (Tên khoa học Tagetes tenuifolia, Tagetes signata)

Hoa đơn cánh, có cồi và nhỏ 1–2 cm Loài hay trồng ở Âu Mỹ là Stafire Mix,

có đặc điểm là lá thơm mùi chanh bưởi, nhất là khi trời nóng nực

Cúc vạn thọ lai

Loài lai Antigua Yellow có lẽ là loài hoa CVT vàng tươi, hoa kép to 7–8 cm,

có được trồng ở Làng Hoa Gò Vấp nước ta Sau 60 ngày gieo hạt là đã ra hoa, và hoa nở liên tiếp nhiều tháng, lâu nhất trong các loài hoa CVT Cây mọc khít và cao 30–50 cm Có khi gọi là Inca lùn Loài lai Inca Hybrid hoa kép và rất to, 10–13 cm Cây cao 50–70 cm, cũng ra hoa sớm và vụ hoa kéo dài, vẫn còn hoa khi các hoa CVT khác đã tàn Chịu nhiệt độ đến 39–40oC Giống tam nhiễm lai triploid, thuộc nhóm Solar series F1 là giống phối hợp cây lùn của vạn thọ Pháp và hoa kép to của hoa CVT châu Phi, vừa chịu lạnh vừa chịu nóng

1.2.3 Ứng dụng

Về tinh thần

Người phương Đông coi hoa CVT là hình ảnh trường sinh của cuộc sống và hạnh phúc vĩnh hằng của muôn người Ngoài sự hiện diện như một đặc trưng cho mùa xuân, hai chữ vạn thọ còn có ý nghĩa về mặt tâm linh Hoa CVT biểu trưng cho

sự tốt lành, cát tường, phúc lộc [41, 42]

Trong y học

Hoa CVT được cho là có tác dụng ‘tán Nhiệt’, ‘trục Hàn’ và ‘khử Đờm’ do đó được dùng để trị ho gà, ho do nhiễm lạnh, kinh phong nơi trẻ em, trị sưng mắt đỏ, quai bị và sưng vú Lá và hoa có nhiều dược tính, nhiều công dụng trong điều trị các bệnh về đường tiêu hóa, kích thích tuần hoàn máu Hoa CVT có chứa nhiều vitamin

C, resin, protein và flavonoid [17] Trong y học, chỉ có loài hoa CVT lớn được dùng làm thuốc Hoa CVT có vị đắng, mùi thơm, tính mát, tác dụng tiêu viêm, làm long đờm, trị ho Lá hoa CVT làm mát gan, phổi, giải nhiệt, chữa đau mắt, ho gà, viêm khí quản, viêm miệng, viêm hầu, đau răng dùng đắp ngoài để trị viêm tuyến mang tai, viêm vú, viêm da mủ Dược liệu chứa tinh dầu, tagetiin, helenien, flavoxanthin, caroten Thành phần của tinh dầu gồm piperiton, linalol, D-limonen, b-ocimen, caryophylen, tageton, a-pinen [41] Các nghiên cứu gần đây tập trung vào việc sử dụng các chất chiết xuất từ hoa CVT là bổ sung chất dinh dưỡng cho con người Các lợi ích tiềm năng bao gồm phòng chống ung thư và tăng cường chức năng miễn dịch, ức chế quá trình oxy hóa tự động tế bào chất béo, bảo vệ chống lại tổn thương

tế bào do oxy hoá, và phòng ngừa thoái hóa điểm vàng liên quan đến tuổi tác (AMD), nguyên nhân hàng đầu của vấn đề thị giác ở những người cao tuổi [14, 15]

Ngoài ra, hoa CVT còn có công dụng chống sưng-viêm Nghiên cứu tại

Yamagata Prefecrural Institute of Public Health, Nhật ghi nhận dịch chiết bằng

methanol từ hoa Tagetes patula có hoạt tính ức chế được các phản ứng sưng-viêm

cấp tính và kinh niên ở chuột nhắt và chuột nhà bị gây sưng phù bằng carrageenin Dịch chiết này không chỉ ức chế sự phù gây ra bởi histamin, serotonin, bradykinin và prostaglandins E1 mà còn làm giảm được sự gia tăng thẩm thấu nơi mạch máu gây ra do acid acetic Nghiên cứu tại Đại học London ghi nhận tác dụng trị chứng sưng khớp xương đầu ngón chân cái của chế phẩm từ hoa CVT Cho 121 bệnh nhân đắp một chế phẩm làm từ dịch chiết bằng alcohol từ hoa (50%) và từ lá (50%) cho kết quả là tất cả đều bớt đau và giảm sưng rõ rệt [41]

gamma-Tác dụng của rễ hoa CVT lùn đã được nghiên cứu tại Đại Học Hamdard, (Karachi, Pakistan) Dịch chiết bằng methanol từ rễ đã cho các chất citric, malic

acid gây hạ huyết áp và pyridine hydrochloride gây tăng huyết áp cùng một hợp chất mới 2-hydroxy, 5-hydroxymethylfuran Hai acid malic và citric gây tụt huyết

áp trung bình động mạch 43 và 71% nơi chuột ở liều 30 và 15 mg/kg, trong khi đó pyridinne hydrochloride gây tăng huyết áp 34% ở liều 30 mg/kg [41]

Trong chăn nuôi

Trong công nghiệp thực phẩm, chất chiết xuất từ hoa CVT đã được thương mại quốc tế và được sử dụng làm phụ gia thức ăn cho gia cầm, làm thực phẩm cho

gà đẻ trứng, tạo được loại trứng gà có vỏ màu vàng khá đẹp và lòng đỏ có màu vàng tươi, da và mô mỡ có màu sắc tươi sáng Sắc tố trích từ hoa CVT cũng được dùng trong nghề nuôi tôm, cá Nghiên cứu tại Đại học Universidad Autonoma Metropolitana-Iztapalapa (Mexico) đã so sánh tác dụng tạo màu của dịch chiết hoa CVT và astaxanthin tổng hợp pha trộn trong thực phẩm nuôi tôm trắng giống

Panaeus vannamei Sau 14 ngày cho ăn, tôm nuôi bằng dịch chiết hoa CVT có màu

vàng của thịt đẹp hơn astaxanthin từ 50–70% [14]

Trong thực phẩm

Tinh dầu chiết từ hoa có màu vàng đỏ, từ thân và lá có màu vàng lục, mùi thơm hắc bền, vị đắng cay, được dùng trong ngành hương liệu [41] Một số loài hoa

cúc vạn thọ (Tagetes) được dùng trong các phương thức nấu ăn tại châu Mỹ: Lá

Tagetes lucida, Tagetes lemmonii được dùng để thay thế lá tarragon trong một số

món ăn; lá khô Tagetes minuta dùng tạo mùi thơm cho súp, nước lèo, thịt và rau

Hoạt tính diệt ấu trùng muỗi Aedes aegypti

Theo nghiên cứu tại Đại học Bách khoa Brooklyn, NewYork (1991), tinh dầu được chưng cất từ hoa CVT có tác dụng diệt ấu trùng của muỗi Tinh dầu

Tagetes minuta có hoạt tính mạnh nhất ở nồng độ 10 ppm và hoạt tính này kéo dài

được ít nhất là 9 ngày sau khi dầu phân tán trên mặt nước Tinh dầu hoa CVT cũng

có khả năng ức chế một số loài nấm Nghiên cứu dược lý cho thấy, cao chiết của

hoa với nước và cồn có tác dụng ức chế các chủng vi sinh vật Bacillus subtilis,

Micrococcusluteus, Staphylococcus aureus [42]

1.2 Tổng quan về lutein và lutein ester

1.2.1 Tổng quan về lutein

1.2.1.1 Cấu tạo phân tử của lutein

Lutein là một sắc tố màu vàng thuộc nhóm sắc tố carotenoid, được coi là tiền thân của vitamin A, là dẫn xuất 3,3’-diol của , -caroten [25, 30, 37] Lutein thuộc

nhóm sắc tố xanthophyll hay còn gọi là oxycarotenoid (all-trans lutein; (3R, 3’R,

6’R)-beta, epsilon-carotene-3, 3’-diol ) Trong phân tử nó có chứa 2 vòng đầu mạch (một vòng - và một vòng α-ionone) và chuỗi C40 isoprenoid cơ bản chung cho tất

cả các carotenoid Mặc dù chuỗi liên kết đôi có mặt trong lutein có thể tồn tại trong

cấu hình cis hoặc trans, làm tăng lên số lượng mono-cis và poly-cis, phần lớn lutein tồn tại ở cấu hình trans như trong hình 1.1

8

9 10

11 12

13 14

15 15'

14' 13' 12' 11'

20'

10' 9' 8' 7' 6'

19' 3

HO

1

1 2

16 17

5

OH2'

3'

4' 5'

16' 17' 18'

Hình 1.1 Cấu tạo phân tử lutein (dạng đồng phân all-trans)

(Công thức phân tử: C40H56O2; Trọng lượng phân tử: 568,88)

1.2.1.2 Tính chất lý-hoá của lutein

Tính chất vật lý của lutein

Tính tan: Lutein không tan trong nước nhưng lại tan trong cồn, eter, chất béo,

các dung môi chứa clor và các dung môi không phân cực khác

Lutein kết tinh dạng tinh thể, hình kim, khối lăng trụ, đa diện, dạng lá hình thoi, với điểm nóng chảy 190–193°C Tinh thể lutein bảo quản tốt nhất ở –18°C

Tính hấp thụ ánh sáng: Chuỗi polyene liên hợp đặc trưng cho màu thấy được

của carotenoid Dựa vào quang phổ hấp thụ của nó, người ta thấy khả năng hấp thụ ánh sáng phụ thuộc vào nối đôi liên hợp, phụ thuộc vào nhóm C9 mạch thẳng hay mạch vòng Ngoài ra, trong mỗi dung môi hoà tan khác nhau, khả năng hấp thụ ánh

sáng tối đa cũng khác nhau Khả năng hấp thụ ánh sáng mạnh nên chỉ cần 1 ppm lutein trong dung dịch cũng có thể thấy bằng mắt thường Độ hấp thụ lutein cực đại

ở bước sóng 445 nm [25]

Tính chất hoá học của lutein

Lutein rất nhạy cảm đối với acid và chất chống oxy hoá, các tác nhân ánh sáng, nhiệt, bền vững với kiềm Hệ thống nối đôi liên hợp (polyen) là nguyên nhân chính làm cho các phân tử lutein ở dạng tự do trong dung dịch rất dễ bị oxy hoá mất màu hoặc đồng phân hoá, hydro hoá tạo màu khác Các tác nhân ảnh hưởng đến độ bền màu của lutein: nhiệt độ, ánh sáng, phản ứng oxy hoá trực tiếp, tác dụng của ion kim loại, enzyme, nước Tuy nhiên, lutein trong các mô động thực vật có khả năng liên kết với các acid béo, lipid, lipoprotein tạo thành các cấu trúc bền vững hơn,… [5]

Lutein dễ bị oxy hoá trong không khí (ít nhạy cảm với sự oxy hoá hơn so với các carotenoid khác) nên cần bảo quản trong môi trường khí trơ, chân không Ở nhiệt độ thấp, bao kín lutein tránh ánh sáng mặt trời Lutein khi bị oxy hoá tạo hợp chất có mùi thơm như aldehyde không no hoặc ketone, tạo hương thơm cho trà [12]

1.2.1.3 Ứng dụng của lutein

Trong lĩnh vực chăn nuôi

Lutein được cho phép sử dụng làm chất phụ gia trong thức ăn chăn nuôi gia cầm, để thúc đẩy màu sắc của da gà và lòng đỏ trứng theo nhu cầu của người tiêu dùng Nhờ có màu vàng cam khá đẹp, lutein được bổ sung vào thức ăn chăn nuôi giúp gia tăng giá trị dinh dưỡng và tính thẩm mỹ [14, 37, 45]

Trong y học

Ngoài tác dụng tạo màu, lutein còn là một hoạt chất chống oxy hóa khá mạnh, có khả năng bảo vệ tế bào khỏi tác hại của tia tử ngoại, ngăn ngừa thoái hóa võng mạc ở người già, bệnh tim mạch, ung thư cột sống,… [9, 15, 32, 43]

Hoạt động chống oxy hoá của lutein có thể do cấu trúc của nó Lutein có hai nhóm hydroxyl làm cho tính chống oxy hoá của nó trở nên mạnh mẽ hơn các carotenoid khác [12]

Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh tác dụng có lợi của lutein Lutein có thể làm giảm nguy cơ bệnh xơ vữa động mạch Lượng lutein trong động mạch càng cao, sự dày lên của thành động mạch càng thấp Lutein cũng làm giảm quá trình oxy hóa cholesterol LDL (Low Density Lipoprotein, những hạt chất béo

có tỷ trọng thấp), do đó, làm giảm nguy cơ tắc nghẽn, xơ vữa động mạch, là chất ức chế ung thư như ung thư cột sống và chất ức chế khối u [14, 15]

Hình 1.2 Cấu trúc của mắt [15]

Lutein là chất ức chế các bệnh về mắt giúp chống lại các bệnh về mắt khi về già như thoái hoá điểm vàng liên quan đến tuổi (AMD), ngăn ngừa bệnh đục thủy tinh thể, thoái hóa võng mạc ở người già,… [14, 16, 32] Lutein hoạt động như một chất chống oxy hoá, và ngăn chặn các bức xạ cực tím có hại Bằng chứng cho thấy rằng, những người bị AMD có nồng độ lutein và zeaxanthin tại điểm vàng thấp

hơn so với những người không bị AMD Điều này được chứng minh bởi việc tìm thấy lutein và đồng phân zeaxanthin trong macula, một khu vực của võng mạc chịu trách nhiệm cho tầm nhìn sắc sảo (hình 1.2) Mức tiêu thụ lutein từ thực phẩm hoặc lutein ester có thể làm tăng lutein trong huyết thanh và mật độ sắc tố điểm vàng tăng giúp cho tầm nhìn được cải thiện ở những bệnh nhân AMD, các bệnh mắt khác [15, 27] Chính vì thế, chế độ ăn uống bao gồm trứng, bông cải xanh và cải bina sẽ giúp giảm nguy cơ đục thuỷ tinh thể (lên đến 20%) và thoái hoá điểm vàng (lên đến 40%) [5]

Trong lĩnh vực mỹ phẩm

Lợi ích của lutein không chỉ dừng ở sức khoẻ của mắt, chống ung thư, ngăn ngừa bệnh tim mạch,… mà lutein cũng có thể phục vụ để bảo vệ làn da khỏi tác dụng có hại của tia cực tím Hoạt tính sinh học của lutein thể hiện qua tính chống oxy hoá và bắt giữ các gốc tự do trong tế bào, góp phần ức chế ung thư da và chăm sóc da Nó được sử dụng làm chất chống nắng, chống lão hóa tế bào Dưới ảnh hưởng của ánh sáng mặt trời, các gốc tự do được hình thành bên trong da Những gốc tự do có thể gây hại cho DNA của các tế bào Lutein có thể bảo vệ chống lại các tác hại của bức xạ UV-A, UV-B Nghiên cứu hiện đại được thiết kế để nghiên cứu

kem chống nắng có công thức thảo dược chứa lutein ester chiết xuất từ Tagetes

erecta L Hòa tan lutein, lutein ester cùng với dầu của các thảo dược khác và các

hợp chất không bão hòa có thể dễ dàng thâm nhập vào da cho thấy hiệu quả chống nắng tốt [27]

Việc sản xuất lutein từ nguồn có sẵn trong tự nhiên được cho là an toàn hơn

vì ít tạo ra các dạng đồng phân cấu trúc có khả năng ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người so với từ con đường tổng hợp hóa học Ngoài ra, các yếu tố kinh tế khác như rẻ tiền, năng suất cao cũng làm cho việc sản xuất lutein từ các nguồn tự nhiên

ngày càng được ưu tiên [37]

Trong lĩnh vực thực phẩm

Lutein được các tổ chức FDA ở Mỹ, Canada, EU cho phép sử dụng làm chất màu trong chế biến thực phẩm Ngoài ra, năm 2006 lutein đã được đánh giá bởi

FAO/WHO, Uỷ ban chuyên gia về Phụ gia Thực phẩm, kết luận rằng, xanthophyll chiết từ nguyên liệu tự nhiên bởi quá trình vật lý có thể sử dụng trong thực phẩm Hội đồng khoa học về phụ gia thực phẩm và các nguồn dinh dưỡng (ANS) đã thêm lutein (E 161b) là một loại thuốc nhuộm carotenoid tự nhiên vào thực phẩm, sau khi

đã cung cấp quan điểm khoa học đánh giá lại sự an toàn của lutein khi được sử dụng như là một màu thực phẩm [29] Có thể nói, lutein là chất tạo màu mang đặc tính sinh học cao, không gây hại cho cơ thể Do đó, nó được dùng cho các dầu trộn salad, kem, các sản phẩm sữa, bánh kẹo, nước sốt, các loại thực phẩm cho trẻ sơ sinh và trẻ mới biết đi,…(bảng PL1.1) [25]

1.2.2 Tổng quan về lutein ester

1.2.2.1 Cấu tạo phân tử của lutein ester

Lutein ester được tìm thấy trong tự nhiên như là dạng diester hóa của lutein với hai nhóm acid béo gắn vào hai bên nhóm hydroxyl thường được tìm thấy trong lutein (hình 1.3)

Hình 1.3 Cấu tạo phân tử của lutein ester (lutein dipalmitate, M=1044)

Lutein ester có trong hoa CVT chủ yếu là dưới dạng lutein dipalmitate Ngoài ra, còn có lutein dimyristate, lutein myristate-palmitate, lutein palmitate- stearate, lutein distearate và vết của các ester myristate và stearate Phần còn lại là

– Lutein ester không tan trong nước Do lutein ester có chứa các chất béo trung

tính nên nó tan trong chất béo như dầu thực vật Ngoài ra, lutein ester tan trong glycerol, rượu, acetone [22], các dung môi clo hóa (chloroform, diclometylen) và các dung môi không phân cực khác (hexane, eter dầu hoả), Lutein ester tinh khiết hòa tan được trong CO2 siêu tới hạn với độ tan tương đương như trong hexane [7];

– Hấp thụ ánh sáng mạnh nhất ở bước sóng 445 nm [20]

Tính chất hóa học

Tính chất hóa học của lutein ester tương tự đối với lutein tự do tuy nhiên, lutein ester bền hơn, ít bị oxy hoá hơn lutein [15, 23, 45] Mặt khác, do có hệ thống nối đôi liên hợp nên lutein ester dễ bị oxy hóa mất màu hoặc đồng phân hoá, hydro hóa tạo màu khác, nên cần bảo quản trong khí trơ, chân không; ở nhiệt độ thấp nên bao kín, tránh ánh sáng mặt trời Lutein ester có thể bị xà phòng hóa với KOH Khi xảy ra phản ứng thủy phân lutein ester, những axit béo được phân cắt,

thu được lutein tự do Lutein ester ở dạng đồng phân trans có độ tinh khiết cao và

giữ được màu sắc tự nhiên được sử dụng cho nhiều mục đích của con người bởi vì nó có

tính chất ổn định [19]

1.2.2.3 Hoạt tính sinh học của lutein ester

Lutein ester cũng có những hoạt tính sinh học tương tự như của lutein tự do [23].Tuy nhiên, khả năng hấp thụ lutein và lutein ester trong cơ thể là không tương đương Nghiên cứu của Oryza (Oil & Fat Chemical Co., Ltd) cho thấy chỉ có lutein

tự do được tìm thấy trong huyết thanh người bất kể chế độ ăn uống, thức ăn như thế nào [32] Lutein ester bị thủy phân thành lutein tự do, sau đó mới được hấp thu vào huyết thanh [15] Một số enzyme được gọi là esterase và lipase thực hiện thủy phân của lutein ester trong tiêu hóa Trong cơ thể sự thủy phân lutein ester thành lutein tự

do xảy ra với hiệu suất ít hơn 5% [2] Do đó, hoạt tính sinh học của lutein và lutein ester trong cơ thể thực tế là không tương đương Mặt khác, những enzyme esterase

và lipase trong cơ thể được sản xuất trong tuyến tụy bởi một cơ chế được quy định bởi sự hiện diện của chất béo trong dạ dày và tá tràng Vì thế, hoạt tính sinh học của

lutein ester cũng được cải thiện khi được cung cấp cùng với chất béo trong thực phẩm

Ngoài ra, lutein ester bền hơn lutein tự do [45] Lutein ester hấp thu được vào vào máu của con người và có tác dụng hạn chế sự tăng trưởng khối u và sự gia tăng tế bào lympho [6]

Lượng khuyến cáo sử dụng hàng ngày:

Khối lượng phân tử của lutein ester gần như gấp đôi lutein Vì vậy, 2 mg lutein ester sẽ gần như tương đương với 1,0 mg lutein Lượng lutein khuyến cáo hàng ngày để phòng ngừa AMD được báo cáo là 6 mg/ngày (lutein tự do) Như vậy,

để có được liều lượng cần thiết của 6–10 mg/ngày của lutein, nên tiêu thụ 12–20 mg lutein ester

Hình 1.4 Nồng độ lutein và lutein ester trong huyết thanh [15]

1.3 Các phương pháp chiết lutein ester

1.3.1 Các phương pháp chiết lutein ester từ hoa cúc vạn thọ không xử lý enzyme

1.3.1.1 Chiết từ hoa khô

Ngâm chiết

Ngâm chiết là quá trình chuyển chất cần chiết rút trong nguyên liệu vào dung môi và được thực hiện bằng khuếch tán phân tử và khuếch tán đối lưu Theo phương pháp này, người ta ngâm nguyên liệu vào dung môi, sau một khoảng thời gian nhất định giữa nguyên liệu và dung môi đạt một nồng độ chất cần thiết ở mức cân bằng, tiến hành đổ dịch chiết ra thay dung môi mới vào, cứ thế cho tới khi chiết sạch

– Ưu điểm: đơn giản, dễ thực hiện;

– Nhược điểm: Phương pháp này tốn công, tốn thời gian, tốn dung môi nên

không phù hợp với quy mô sản xuất lớn

Chiết bằng Soxhlet

Nguyên liệu được sử dụng ở dạng bột, nghiền nhỏ, rồi gói lại bằng giấy lọc, rồi chiết bằng thiết bị Soxhlet với dung môi thích hợp

– Ưu điểm: Thiết bị này có ưu điểm là cho phép thực hiện quá trình chiết một

cách tự động, đồng thời liên tục cô đặc dịch chiết và làm mới dung môi nên hiệu suất chiết rất cao, tiết kiệm dung môi;

– Nhược điểm: tốn thời gian [18, 27]

Chiết dung môi tăng tốc (ASE: Accelerated Solvent Extraction) hay chiết dưới áp suất cao (PFE: Pressurized Fluid Extraction)

Đây cũng là một phương pháp chiết mới, cho phép chiết rất nhanh, tự đồng hóa, hiệu quả và tiết kiệm dung môi Nguyên tắc của nó tương tự như phương pháp Soxhlet cổ điển, ngoại trừ việc quá trình chiết được thực hiện ở nhiệt độ và áp suất cao (nhưng vẫn dưới điểm tới hạn của dung môi sử dụng)

Nguyên liệu cần chiết được xay nhỏ, làm khô (thường là đông khô), rồi nhồi vào một ống chiết (extraction cell) Ống chiết này được đặt trong lò duy trì ở nhiệt

độ thích hợp (có thể điều chỉnh từ 40–200oC) Dung môi được bơm vào ống chiết

và giữ ở áp suất 10–20 MPa trong vài phút, sau đó, dịch chiết được đẩy vào một bình hứng bằng một thể tích dung môi mới (flush volume) Quá trình được lặp lại

vài lần Cuối cùng, toàn bộ dịch chiết được đẩy ra bằng một dòng khí trơ, có thể là

N2 [34]

– Ưu điểm: Hiệu quả cao, tiết kiệm dung môi;

– Nhược điểm: Thực hiện ở áp suất cao

1.3.1.2 Chiết từ hoa tươi

Chiết bằng phương pháp đồng hóa trong dung môi

Theo phương pháp này, nguyên liệu được khuấy trộn trong dung môi với tốc

độ cao (dùng máy đồng hóa, máy xay điện) Khi trạng thái cân bằng được thiết lập giữa nồng độ chất cần chiết giữa dung môi và nguyên liệu, đổ dung môi cũ ra, thay dung môi mới vào Cứ như thế cho đến khi chiết hết chất cần chiết [11]

– Ưu điểm: đơn giản, dễ thực hiện;

– Nhược điểm: Yêu cầu cao về thiết bị, quy trình tương đối phức tạp, tốn công,

tốn thời gian cũng như thất thoát dung môi chiết nên không có tính kinh tế, không phù hợp với quy mô sản xuất lớn

Chiết nhờ siêu âm (Ultrasound-assisted extraction)

Nguyên liệu được trộn với dung môi thích hợp rồi chiết nhờ tác dụng của siêu âm Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng, siêu âm có khả năng phá vỡ màng tế bào của nguyên liệu, do đó, giúp cho xâm nhập của dung môi vào bên trong tế bào dễ hơn Ngoài ra, siêu âm còn có tác dụng khuấy trộn mạnh dung môi, làm gia tăng sự tiếp xúc của dung môi với chất cần thiết và cải thiện đáng kể hiệu suất chiết [18]

– Ưu điểm: đơn giản, dễ thực hiện;

– Nhược điểm: Chiết nhờ siêu âm thì dung môi bị bay hơi khi nhiệt độ siêu âm

tăng

Chiết bằng phương pháp siêu tới hạn (SFE: Supercritical Fluid Extraction)

Đây là phương pháp chiết được quan tâm nhiều nhất hiện nay trong lĩnh vực chiết các hợp chất có hoạt tính sinh học từ nguyên liệu tự nhiên nhằm ứng dụng trong công nghiệp dược phẩm và thực phẩm Phương pháp này cho phép tự động hóa quá trình chiết và hạn chế việc sử dụng các dung môi hữu cơ độc hại Dung môi chiết là một chất lỏng ở trạng thái siêu tới hạn, ở trạng thái này, chất lỏng có những

tính chất đặc biệt như có tính chịu nén cao, khuếch tán nhanh, độ nhớt và sức căng

bề mặt thấp,… Trong phương pháp này, dùng CO2 ở trạng thái siêu tới hạn làm dung môi chiết (có thể thêm vài % dung môi phân cực nào đó như etanol, metanol, 2-propanol để làm tăng khả năng hòa tan carotenoid của CO2) do nó cho phép chiết nhanh, chọn lọc, không làm oxy hóa carotenoid và an toàn trong vận hành

Bằng cách sử dụng CO2 với nhiệt độ tăng từ 40–80oC, ở áp lực liên tục

300 bar, sản lượng lutein ester thu được tối đa không thay đổi nhiều Từ kết quả khai thác cho thấy, số lượng CO2 sử dụng trong quá trình chiết tốn một lượng rất

lớn [3, 8]

– Ưu điểm: Dung môi CO2 siêu tới hạn, khả năng khuếch tán mạnh vào nền nguyên liệu tốt hơn nhiều so với các dung môi thông thường, vì thế làm tăng hiệu suất chiết lên nhiều lần;

– Nhược điểm: chi phí đầu tư thiết bị và dung môi tương đối lớn.

1.3.2 Phương pháp xử lý hoa cúc vạn thọ bằng enzyme

1.3.2.1 Sự cần thiết phải xử lý hoa bằng enzyme trước khi chiết

Việc chiết lutein ester từ cánh hoa CVT theo phương pháp truyền thống trong đó hoa cúc vạn thọ sau khi ủ xi-lô sẽ được sấy khô, xay thành bột rồi chiết lutein ester bằng hexane Quá trình này mất nhiều thời gian, hao tốn năng lượng và tổn thất đáng kể hàm lượng lutein, hiệu suất thu hồi lutein kém

Để tăng hiệu quả chiết lutein ester, cần phá vỡ cấu trúc tế bào hoa CVT bằng cách sử dụng các tác nhân để phân giải thành tế bào như kiềm, acid hoặc enzyme Đối với thực phẩm, sử dụng enzyme thủy phân sẽ cho chất lượng sản phẩm tốt nhất [11] Xử lý bằng enzyme cũng đã được đề xuất như là một giai đoạn thay thế cho quá trình tách chiết dầu từ các nguyên liệu thực vật bằng dung môi để cải thiện năng suất và chất lượng của một số sản phẩm Đối với quá trình chiết lutein từ hoa cúc vạn thọ, một số nghiên cứu đã cho thấy việc xử lý nguyên liệu bằng enzyme trước khi chiết đã cải thiện đáng kể hiệu suất chiết Trong trường hợp xử lý bằng enzyme trước khi chiết, các enzyme thủy phân đã được sử dụng như tác nhân tương tác lên

các thành tế bào, phá vỡ tính toàn vẹn cấu trúc dẫn đến các vật liệu bên trong tế bào tiếp xúc nhiều hơn với dung môi khi chiết làm cho năng suất chiết tăng Vì vậy, có tác dụng cải thiện hiệu quả chiết carotenoid, đặc biệt là lutein ester trong cánh hoa CVT [9, 20]

1.3.2.2 Phương pháp chiết lutein ester từ hoa cúc vạn thọ đã xử lý enzyme

Hiện nay, có nhiều loại enzyme được sử dụng để xử lý nguồn nguyên liệu hoa CVT tươi trước khi tiến hành chiết lutein ester

Nhiều nghiên cứu gần đây có sử dụng enzyme thương mại đã tiết kiệm thời gian, công sức và sự lựa chọn enzyme thương mại cũng rất phong phú [4, 6, 20]

Hình 1.5 Thuỷ phân tế bào cánh hoa CVT của enzyme thương mại

Viscozyme [11]

Chiết xuất lutein từ cánh hoa CVT được xử lý bằng enzyme thương mại bao gồm năm giai đoạn: lên men, ép, sấy khô, chiết lutein ester bằng hexan và xà phòng hóa để thu lutein tự do Hiệu quả của ủ lên men đã được xác định là yếu tố chính ảnh hưởng đến việc thu hồi xanthophyll thông qua chiết bằng dung môi Trong giai đoạn này, các vi sinh vật kết hợp với hoa cúc vạn thọ, làm phân hủy cellulose và hemicellulose có trong thành tế bào của các cánh hoa Sự suy thoái này làm tăng sự

thẩm thấu của dung môi vào các tế bào sắc tố trong nguyên liệu trong quá trình chiết Nói chung, trong quá trình lên men, hai loại vi sinh vật được sử dụng

là vi sinh vật nội sinh có sẵn trong nguyên liệu và vi sinh vật thương mại được phân lập từ các nguồn tự nhiên Trong cả hai trường hợp, các vi sinh vật có thể được sử dụng một mình hoặc như một phần của môi trường nuôi cấy trong chuẩn bị khởi đầu cho quá trình lên men [33]

1.4 Tình hình nghiên cứu chiết xuất lutein ester từ cánh hoa cúc vạn thọ

Trên thế giới, đã có nhiều công trình nghiên cứu tách chiết, tinh chế lutein ester từ cánh hoa CVT bằng các phương pháp khác nhau

Ausich, R L., và Sanders, D.J năm 1997, đã đưa ra quy trình chiết lutein

ester từ bột hoa CVT khô bằng hexane, sau đó cô đuổi dung môi dưới áp suất thấp

để thu được oleoresin chứa ít hơn 1% hexane Oleoresin được trộn với propylen glycol ở 50–60oC, sau đó thêm từ từ dung dịch KOH 45% rồi xà phòng hóa ở 65–

80oC trong 3–10 giờ Sau khi phản ứng kết thúc, thêm nước vào (tỷ lệ oleresin:propylen glycol:dung dịch KOH:nước là 4:4:1:1, w/w/w/w) Lutein tự do tinh thể sẽ kết tinh ngay trong môi trường phản ứng Lọc lấy lutein tinh thể rồi rửa bằng nước khử ion ở 70–90oC để loại bỏ tạp chất tan trong nước rồi làm khô bằng cách sấy lạnh, cô chân không hoặc dùng dòng khí N2 nóng Quy trình này khá đơn giản, ít tốn thời gian, hạn chế được việc sử dụng các dung môi hữu cơ dùng trong giai đoạn kết tinh lại Sản phẩm thu được chứa 0,5–5% nước, 70–85% carotenoid

tổng số (trong đó 85–95% trans-lutein, 0,2–1,5% các dạng đồng phân hình học của

lutein, 2,5–8% zeaxanthin) và một số tạp chất là các muối xà phòng hóa của acid béo [1]

Levy, L W thu sản phẩm oleoresin có tỷ lệ trans-lutein ester cao bằng cách

bằng cách ngâm bột hoa CVT khô trong hexane (8 l/kg) ở nhiệt độ phòng Tách lấy dịch chiết, cô đuổi dung môi để thu lutein ester thô Sau đó, thêm isopropanol vào

lutein ester thô ở nhiệt độ phòng để hòa tan cis-lutein ester và các tạp chất không

thuộc nhóm xanthophyll Sản phẩm sau đó được cô chân không để loại bỏ

isopropanol Kết quả thu được sản phẩm chứa 69% lutein ester trong đó tỷ lệ đồng

phân trans:cis là 90:10 [21]

Trong nghiên cứu của Kumar, S.T.K ; P Abdulkadir và ctv (2004) hexane

được sử dụng làm dung môi để chiết lutein ester từ bột hoa CVT khô (đã được cố định và làm giàu carotenoid bằng cách ủ xi-lô trong 2–3 tuần ở pH thích hợp trong điều kiện kỵ khí có kiểm soát và có mặt chất chống oxy hóa) Lutein ester sau đó được xà phòng hóa bằng KOH trong isopropanol ở 65–80oC trong 3 giờ, với tỷ lệ oleoresin:dung dịch KOH:isopropanol là 1:0,25:3 (w/w/v) Dịch xà phòng hóa được

xử lý bay hơi chân không để thu hồi isopropanol Chiết xanthophyll từ cặn thu được bằng acetat etyl Dịch chiết được cô chân không và kết tinh lại bằng cách khuấy trong hỗn hợp hexane-axetone (80:20, v/v) ở nhiệt độ phòng trong 30 phút rồi lọc Rửa tinh thể lutein thu được bằng metanol rồi cô chân không ở nhiệt độ phòng trong 72 giờ Kết quả, thu được tinh thể chứa 86,23% xanthophyll tổng số (w/w),

trong đó, trans-lutein chiếm 91,43% Sản phẩm có thể dùng làm dược phẩm ngăn

ngừa các bệnh thoái hóa võng mạc, ung thư phổi Nhược điểm của quy trình này là các bước xà phòng hóa và cô đuổi isopropanol đều phải thực hiện ở nhiệt độ khá cao (70–80oC) nên có khả năng dẫn đến sự chuyển hóa trans-lutein thành dạng đồng phân cis- hay phân hủy lutein thành các carotenoid khác, làm giảm hoạt tính

sinh học của sản phẩm Ngoài ra, sản phẩm có thể chứa dư lượng dung môi hữu cơ

sử dụng trong quá trình tách chiết, tinh chế [19]

Philip, T đã nghiên cứu chiết xuất lutein ester từ bột hoa cúc vạn thọ sấy khô bằng ete dầu hoả ở nhiệt độ phòng với tỷ lệ 1:3 (w/v) Dịch chiết được cô đuổi dung môi dưới áp suất thấp ở 50oC để thu lutein oleoresin (tức “chất dầu nhựa lutein”), sau đó, đem hòa tan trong isopropanol nóng ở 75oC rồi lọc bỏ tạp chất không tan Dịch lọc được làm lạnh xuống 15oC hay thấp hơn Lutein ester tách ra được lọc và làm khô dưới áp suất thấp ở 30oC để thu lutein ester tinh thể Ông đã thu được 51% lutein tổng số [22]

Bên cạnh đó, cũng xuất hiện nhiều hướng nghiên cứu hạn chế sự phân hủy lutein ester trong công đoạn chiết bằng cách dùng các kỹ thuật hiện đại như chiết với sự hỗ trợ của siêu âm, chiết bằng CO2 siêu tới hạn [24, 36] hay chiết dưới áp suất cao Mặc dù, các kỹ thuật chiết hiện đại đã được áp dụng ở khá phổ biến trong quy mô phòng thí nghiệm tại các nước tiên tiến trên thế giới, tuy nhiên, việc áp dụng rộng rãi trong thực tế sản xuất còn hạn chế do chi phí đầu tư thiết bị cao, không kinh tế Vì vậy, việc nghiên cứu cải tiến quy trình công nghệ nhằm nâng cao hiệu suất thu hồi lutein vẫn đang là bài toán đặt ra cho các nhà khoa học trên thế giới

Trong nghiên cứu của Sunita Tekwani và ctv (2010) về tác dụng của cellulase và các pectinase trong chiết xuất lutein từ những cánh hoa CVT khô, cho thấy hiệu suất chiết lutein với phương pháp có và không có xử dụng enzyme tương ứng là 9,2% w/w và 5,6 w/w Điều đó đã chứng minh được việc xử lý hoa CVT bằng enzyme pectinase và cellulase cho hiệu suất tăng một cách đáng kể [31]

Có thể nói, xử lý bằng enzyme đã được đề xuất như một giai đoạn thay thế cho các quy trình tách chiết bằng dung môi để cải thiện năng suất và chất lượng của một số sản phẩm oleoresin Cũng như đối với một số đối tượng đã nghiên cứu, việc xử lý hoa CVT bằng enzyme đã cải thiện được hiệu suất chiết [14]

Nghiên cứu Barzana và ctv (2002) là nghiên cứu điển hình về việc xử lý cánh hoa CVT bằng enzyme trước khi chiết Xử lý bằng Viscozyme hiệu suất tăng lên hơn 45% so với khi không sử dụng enzyme [6, 30] Điểm hạn chế của nghiên cứu này ở chỗ: Viscozyme là một loại enzyme thương mại đắt tiền (100 ml enzyme Viscozyme có giá 11.50 bảng Anh), nên ít được dùng trong nghiên cứu và sản xuất rộng rãi Do đó, chưa thật sự đánh giá được hiệu suất chiết lutein ester từ cách hoa CVT đã được xử lý với Viscozyme Chính vì vậy, việc lựa chọn phương pháp chiết, nhằm đạt hiệu quả cao, thân thiện với môi trường, phù hợp với điều kiện thực tế

cũng là yêu cầu đặt ra cho đề tài Trong đồ án tốt nghiệp này sẽ nghiên cứu “Tối ưu

hóa quy trình chiết lutein ester từ hoa cúc vạn thọ Tagetes erecta L đã được xử

lý bằng Viscozyme” nhằm đạt được hiệu suất chiết lutein ester là cao nhất

Để thực hiện được mục tiêu trên cần thực hiện những nội dung nghiên cứu sau:

– Nghiên cứu xác định điều kiện tối ưu cho việc chiết xuất lutein ester sử dụng

phương pháp RSM-CCD;

– Phân tích, giá mức độ tương thích của giải pháp tối ưu bằng thực nghiệm; – Nghiên cứu chiết xuất lutein ester từ hoa CVT với các điều kiện tối ưu trên; – Thử nghiệm tinh chế lutein ester

CHƯƠNG II

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu

Nguyên liệu sử dụng chiết tách lutein ester trong nghiên cứu này là cánh hoa

CVT châu Phi (Tagetes erecta L.) có màu vàng cam được trồng tại huyện Diên

– Cân phân tích  0,1 mg (Satorius, Nhật)

– Cân kỹ thuật  1 g (Việt Nam)

– Tủ sấy  10C UNB 400 (Memmert , Đức)

– Tủ lạnh trữ mẫu

– Máy lắc ổn nhiệt (Model: KS 4000 I control, IKA, Đức)

– Bể siêu âm Elmasonic S300H (Elma, Đức) với tần số siêu âm 35kHz

– Quang kế UV-Vis Genesys 20 (Thermo, USA)

– Quang phổ kế UV-VIS Cary 50 (Hache, Đức)

– Na2SO4 khan (độ tinh khiết ≥ 99,0 %, China);

– Etanol 99,5% (độ tinh khiết ≥ 99,7%, China);

– Acetone (độ tinh khiết ≥ 99,5%, China);

– Hexane độ (độ tinh khiết ≥ 97,0%, China);

– Dung dịch KOH 0,1 N và 0,5 N;

– Ete dầu hoả (độ tinh khiết ≥ 97,0%, China);

– BHT (độ tinh khiết ≥ 99%, China);

– Na2SO4 (độ tinh khiết ≥ 99%, China);

– Isopropanol (độ tinh khiết ≥ 99,7%, China);

– Viscozyme (Novozyme, Đan Mạch)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Chuẩn bị nguyên liệu

Hoa tươi sau khi thu hoạch được chuyển ngay về phòng thí nghiệm Cánh hoa CVT được tách ra, trộn đều để đồng nhất mẫu, cân thành những lượng xác định, rồi cho vào các túi polyetylen, hạn chế không khí tới mức tối đa, rồi đem cột kín và bảo quản ở –20oC đến khi nghiên cứu

2.2.2 Xác định thành phần khối lượng của hoa cúc vạn thọ

Thành phần khối lượng của hoa CVT được xác định như sau:

– Cân hoa được khối lượng là mH;

– Cắt lấy phần cánh hoa màu vàng của hoa, đem cân phần này ta được khối lượng mC;

– Phần bỏ đi là cuống hoa, cánh hoa bị úa có khối lượng là mB

Thành phần khối lượng của hoa được tính như sau:

2.2.3.1 Xác định hàm lượng lutein tổng số trong cánh hoa cúc vạn thọ

Chiết lutein tổng số trong cánh hoa CVT bằng acetone và đo độ hấp thụ của dung dịch lutein tổng số ở bước sóng 445 nm, dùng hexane làm dung dịch so sánh (phụ lục 2) Đo độ hấp thụ của lutein tổng số ở 445 nm là do ở bước sóng này độ hấp thụ của lutein là cực đại [20]

2.2.3.2 Xác định trọng lượng khô (%TL khô) của cánh hoa cúc vạn thọ

Hoa tươi được sấy ở 105–110oC đến khối lượng không đổi (phụ lục 3)

2.2.3.3 Phương pháp chiết lutein ester từ cánh hoa cúc vạn thọ

Lutein ester trong cánh hoa CVT được chiết xuất từ nguyên liệu tươi Xác định điều kiện chiết thích hợp bằng cách khảo sát sự phụ thuộc của hiệu suất vào các yếu tố: dung môi chiết (acetone, etanol, ete dầu hoả, hexane); tỷ lệ dung môi:nguyên liệu; thời gian chiết; số lần chiết; tốc độ lắc và nhiệt độ chiết

Dịch lutein ester được chiết sang hexane rồixácđịnh lượng lutein chiết được bằng phương pháp đo quang tương tự như khi định lượng lutein tổng số

Hiệu suất chiết lutein ester được tính theo công thức:

Hiệu suất chiết (%)= lượng lutein chiết được

lutein tổng số trong nguyên liệu *100%

2.2.4 Đề xuất quy trình tách chiết lutein ester từ cánh hoa cúc vạn thọ

Trên cơ sở kết quả của một số nghiên cứu liên quan, chúng tôi đề xuất quy trình dự kiến tách chiết lutein ester từ cánh hoa CVT thọ đã được xử lý bằng enzyme thương mại Viscozyme như sau:

Hình 2.2 Sơ đồ quy trình dự kiến tách chiết lutein ester từ cánh hoa CVT đã

Cô đuổi dung môi (áp suất thấp; < 400C)

Chất màu lutein ester

Sấy chân không Tinh chế

Na 2 SO 4 khan

Do đó, cần nghiên cứu xác định loại dung môi chiết, tỷ lệ dung môi:nguyên liệu, nhiệt độ chiết, tốc độ lắc, thời gian chiết, số lần chiết thích hợp đảm bảo hiệu suất thu lutein ester cao nhất

Nguyên liệu

Nguyên liệu dùng để chiết lutein ester trong thí nghiệm này là cánh hoa CVT tươi đã được loại bỏ phần hư hỏng, chất bẩn

Xử lý

Cánh hoa (cân khối lượng xác định) cho vào thiết bị chiết Sau đó, tiến hành

ủ nguyên liệu ở điều kiện sau: nồng độ Viscozyme 1% (v/v); tỷ lệ dung dịch Viscozyme:nguyên liệu 1:1 (v/w), pH xử lý = 5,5; ủ ở 40oC, lắc với tốc độ 250 rpm trong thời gian 5 giờ1

Cô đuổi dung môi

Dịch chiết sau đó được đem cô đuổi dung môi bằng thiết bị cô chân không dưới áp suất thấp (nhiệt độ không quá 40oC) để tránh sự phân hủy lutein trong điều kiện nhiệt độ và oxy không khí

Thực hiện cô đuổi nhằm mục đích thu được dịch sản phẩm thô chứa lutein ester cô đặc đồng thời thu hồi dung môi tái sử dụng

phễu lọc hút chân không để lọc bỏ những tạp chất không tan (sáp, cặn bả) Dịch lọc sau đó được để nguội ở 15oC qua đêm (trong tủ mát) để tạo điều kiện kết tinh lutein ester Lọc hút chân không một lần nữa để thu sản phẩm lutein ester tinh sạch hơn

Sấy chân không

Sấy khô chân không sản phẩm kết tinh ở 30oC để loại bỏ lượng dung môi và nước còn sót lại nhằm thu sản phẩm lutein ester ở dạng tinh thể khô Lượng dịch lọc còn lại đem gia nhiệt thu hồi isopropanol để sử dụng tiếp cho mẻ sau

Tất cả các thao tác trên nên thực hiện nhanh, tránh ánh sáng

Chú ý công đoạn lọc nên tiến hành nhanh đến mức có thể để rút ngắn thời gian lọc vì đây là giai đoạn lutein ester tiếp xúc với không khí nhiều nhất nên dễ bị oxy hóa, đồng thời bị tổn thất nhiều lượng dung môi bay hơi dẫn đến không những hiệu suất thu hồi dung môi kém mà hiệu suất thu hồi lutein ester cô đặc cũng không chính xác

Tất cả các dung môi đã thu hồi sẽ được lọc qua Na2SO4 dạng rắn để làm khan nước trong dung dịch thu hồi và tiếp tục sử dụng chúng cho các mẻ tiếp theo sau

Qua tham khảo một số kết quả nghiên cứu liên quan, chúng tôi chọn các yếu

tố có thể ảnh hưởng nhiều đến hiệu suất thu hồi lutein ester và khoảng giá trị khảo sát như sau:

– Dung môi chiết: acetone, etanol, hexane, ete dầu hoả;

– Tỷ lệ dung môi:nguyên liệu: X 1 = 2,0 – 6,0 (v/w);

– Thời gian chiết: X 2 = 6–24 (h);

2.2.5 Bố trí thí nghiệm lựa chọn dung môi chiết

Để xác định được loại dung môi chiết, tiến hành thí nghiệm sau:

Lấy 5 gam cánh hoa CVT tươi cho vào bình tam giác sau đó cho vào 5 ml enzyme thương mại Viscozyme 1% (v/v), tiến hành ủ ở 400C trong 5 giờ (lắc với tốc độ 250 rpm) Sau khi ủ xong, mẫu được hút nước ra và cho dung môi vào với tỷ

lệ dung môi:nguyên liệu là 4:1 (v/w) rồi chiết lutein ester bằng cách lắc với tốc độ

200 rpm, 15 giờ ở 40oC (dùng máy lắc ổn nhiệt), trong đó dung môi thay đổi lần lượt là: hexane, acetone, ete dầu hoả, etanol Dịch chiết được lọc qua Na2SO4 khan Pha loãng dịch chiết theo tỷ lệ thích hợp (D) rồi đo độ hấp thụ ở 445 nm trên quang

kế UV-Vis Từ đó, dựa vào kết quả đã chọn được dung môi chiết thích hợp

Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của dung môi chiết đến hiệu suất chiết lutein ester được trình bày ở hình 2.3

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn dung môi chiết

Chiết (Dung môi:nguyên liệu = 4:1 v/w; 15 giờ; 40oC; 200 rpm)

acetone hexane ete dầu hoả

2.2.6 Phương pháp thiết kế thí nghiệm RSM-CCD tối ưu hóa điều kiện chiết 2.2.6.1 Thiết kế thí nghiệm RSM-CCD

Để xác định chính xác giá trị tối ưu của các thông số X1; X2; X3; X4 ảnh hưởng đến hiệu suất chiết lutein ester, tiến hành tối ưu hóa quá trình tách chiết bằng phương pháp thực nghiệm yếu tố toàn phần theo mô hình Box-Wilson, trong đó sử dụng phương án trực giao 4 yếu tố với 3 thí nghiệm lặp lại ở tâm phương án (k = 4,

n0= 3) Riêng yếu tố X6 (số lần chiết) sẽ xác định sau khi có kết quả tối ưu hóa

Hình 2.4 Các yếu tố đầu vào ảnh hưởng đến hiệu suất chiết lutein ester

Như vậy, phương án thực nghiệm bao gồm 27 thí nghiệm (16 thí nghiệm ở biên, 3 thí nghiệm ở tâm và 8 thí nghiệm ở các cánh tay đòn)

Hàm mục tiêu là hiệu suất lutein ester chiết được (Y)

Phương trình hồi quy tuyến tính có dạng bậc 2 được xác định bằng phần mềm Design Expert:

2 4 44 2 3 33 4

4 3 3 2 2 1 1

X1: Tỉ lệ dung môi:nguyên liệu

X2: Thời gian chiết

X3: Nhiệt độ chiết

X4: Tốc độ lắc

Công đoạn chiết

Hiệu suất thu lutein ester

Hàm mục tiêu (Y) Các yếu tố khảo sát:

Các yếu tố thí nghiệm và chỉ tiêu theo dõi trong quy hoạch thực nghiệm RSM-CCD được trình bày ở bảng 2.1

Bảng 2.1 Các yếu tố ảnh hưởng khảo sát trong RSM-CCD

Mức Yếu

Đơn

vị

Phạm vi nghiên

2.2.6.2 Chọn phương án sản xuất tối ưu Kiểm tra bằng thực nghiệm

Kết quả thí nghiệm theo thiết kế RSM-CCD thu được sẽ được nhập vào chương trình Design-Expert 8.0.7.1 và tiến hành phân tích

Sau khi xử lý số liệu, phần mềm Design Expert sẽ đưa ra các thông số cho từng yếu tố để hàm đạt giá trị cực đại, sau đó sẽ phân tích đưa ra các phương án sản xuất tối ưu để người sử dụng lựa chọn

Sau khi đã chọn được phương án sản xuất tối ưu, áp dụng các mẫu lớn hơn (50 gam mẫu; lặp lại 3 lần) nhằm kiểm tra sự tương thích giữa lý thuyết với thực nghiệm Tính hiệu suất thu hồi lutein ester theo công thức: