2.1.2.1. Dụng cụ và thiết bị
Dụng cụ
- Phễu lọc thủy tinh, bông y tế, giấy bạc, bình định mức (25 ml, 50 ml), cốc thuỷ tinh (50 ml, 100 ml), micropipet, pipet, bình tam giác (250 ml), bình hút ẩm.
Thiết bị
– Cân phân tích 0,1 mg (Satorius, Nhật).
– Cân kỹ thuật 1 g (Việt Nam).
– Tủ sấy 10C UNB 400 (Memmert , Đức).
– Máy lắc ổn nhiệt (Model: KS 4000 I control, IKA, Đức).
– Bể siêu âm Elmasonic S300H (Elma, Đức) với tần số siêu âm 35kHz.
– Quang kế UV-Vis Genesys 20 (Thermo, USA).
– Quang phổ kế UV-VIS Cary 50 (Hache, Đức).
– Tủ HOTTE.
– Thiết bị cô chân không RV 10 Control V (IKA, Đức).
2.1.2.2. Hoá chất
Tất cả các hóa chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết phân tích (PA), bao gồm:
– Nước cất 1 lần;
– Na2SO4 khan (độ tinh khiết ≥ 99,0 %, China);
– Etanol 99,5% (độ tinh khiết ≥ 99,7%, China);
– Acetone (độ tinh khiết ≥ 99,5%, China);
– Hexane độ (độ tinh khiết ≥ 97,0%, China);
– Dung dịch KOH 0,1 N và 0,5 N;
– Ete dầu hoả (độ tinh khiết ≥ 97,0%, China);
– BHT (độ tinh khiết ≥ 99%, China);
– Na2SO4 (độ tinh khiết ≥ 99%, China);
– Isopropanol (độ tinh khiết ≥ 99,7%, China);
– Viscozyme (Novozyme, Đan Mạch).
2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Chuẩn bị nguyên liệu 2.2.1. Chuẩn bị nguyên liệu
Hoa tươi sau khi thu hoạch được chuyển ngay về phòng thí nghiệm. Cánh hoa CVT được tách ra, trộn đều để đồng nhất mẫu, cân thành những lượng xác định, rồi cho vào các túi polyetylen, hạn chế không khí tới mức tối đa, rồi đem cột kín và bảo quản ở –20oC đến khi nghiên cứu.
2.2.2. Xác định thành phần khối lượng của hoa cúc vạn thọ
Thành phần khối lượng của hoa CVT được xác định như sau: – Cân hoa được khối lượng là mH;
– Cắt lấy phần cánh hoa màu vàng của hoa, đem cân phần này ta được khối lượng mC;
– Phần bỏ đi là cuống hoa, cánh hoa bị úa có khối lượng là mB. Thành phần khối lượng của hoa được tính như sau:
%phần cánh hoa = *100% H C m m ; % phần bỏ đi = *100% H B m m ; 2.2.3. Phương pháp phân tích
2.2.3.1. Xác định hàm lượng lutein tổng số trong cánh hoa cúc vạn thọ
Chiết lutein tổng số trong cánh hoa CVT bằng acetone và đo độ hấp thụ của dung dịch lutein tổng số ở bước sóng 445 nm, dùng hexane làm dung dịch so sánh (phụ lục 2). Đo độ hấp thụ của lutein tổng số ở 445 nm là do ở bước sóng này độ hấp thụ của lutein là cực đại [20].
2.2.3.2. Xác định trọng lượng khô (%TL khô) của cánh hoa cúc vạn thọ
Hoa tươi được sấy ở 105–110oC đến khối lượng không đổi (phụ lục 3).
2.2.3.3. Phương pháp chiết lutein ester từ cánh hoa cúc vạn thọ
Lutein ester trong cánh hoa CVT được chiết xuất từ nguyên liệu tươi. Xác định điều kiện chiết thích hợp bằng cách khảo sát sự phụ thuộc của hiệu suất vào các yếu tố: dung môi chiết (acetone, etanol, ete dầu hoả, hexane); tỷ lệ dung môi:nguyên liệu; thời gian chiết; số lần chiết; tốc độ lắc và nhiệt độ chiết.
Dịch lutein ester được chiết sang hexane rồixácđịnh lượng lutein chiết được bằng phương pháp đo quang tương tự như khi định lượng lutein tổng số.
Hiệu suất chiết lutein ester được tính theo công thức:
Hiệu suất chiết (%)= lượng lutein chiết được
lutein tổng số trong nguyên liệu*100%
2.2.4. Đề xuất quy trình tách chiết lutein ester từ cánh hoa cúc vạn thọ
Trên cơ sở kết quả của một số nghiên cứu liên quan, chúng tôi đề xuất quy trình dự kiến tách chiết lutein ester từ cánh hoa CVT thọ đã được xử lý bằng enzyme thương mại Viscozyme như sau:
Hình 2.2. Sơ đồ quy trình dự kiến tách chiết lutein ester từ cánh hoa CVT đã
được xử lý bằng Viscozyme
Thuyết minh quy trình:
Mục tiêu:
Mục tiêu của bố trí thí nghiệm này là tìm ra chế độ chiết lutein ester từ cánh hoa CVT đã xử lý Viscozyme một cách hiệu quả nhất.
Hiệu quả chiết ngoài phụ thuộc vào mức độ tác động của các yếu tố ảnh hưởng đến việc xử lý hoa còn phụ thuộc vào điều kiện chiết lutein ester.
Điều kiện chiết thích hợp:
- Dung môi?
- Tỷ lệ dung môi:nguyên liệu? - Nhiệt độ chiết?
- Tốc độ lắc? - Thời gian chiết? - Số lần chiết? Xử lý thích hợp
Lọc
Chiết
Cánh hoa CVT tươi
Cô đuổi dung môi (áp suất thấp; < 400C)
Chất màu lutein ester Sấy chân không
Tinh chế Na2SO4 khan
Do đó, cần nghiên cứu xác định loại dung môi chiết, tỷ lệ dung môi:nguyên liệu, nhiệt độ chiết, tốc độ lắc, thời gian chiết, số lần chiết thích hợp đảm bảo hiệu suất thu lutein ester cao nhất.
Nguyên liệu
Nguyên liệu dùng để chiết lutein ester trong thí nghiệm này là cánh hoa CVT tươi đã được loại bỏ phần hư hỏng, chất bẩn.
Xử lý
Cánh hoa (cân khối lượng xác định) cho vào thiết bị chiết. Sau đó, tiến hành ủ nguyên liệu ở điều kiện sau: nồng độ Viscozyme 1% (v/v); tỷ lệ dung dịch Viscozyme:nguyên liệu 1:1 (v/w), pH xử lý = 5,5; ủ ở 40oC, lắc với tốc độ 250 rpm trong thời gian 5 giờ1.
Chiết
Sau khi ủ xong, lutein ester trong hoa CVT được chiết bằng dung môi và phương pháp chiết thích hợp đã xác định (tỷ lệ dung môi:nguyên liệu, nhiệt độ, tốc độ lắc, thời gian chiết, số lần chiết) sao cho đạt hiệu suất chiết cao và hợp lý nhất.
Lọc lấy dịch chiết
Dịch sau khi chiết xong được lọc qua Na2SO4 khan. Dịch thu được là dịch màu hỗn hợp lutein ester.
Cô đuổi dung môi
Dịch chiết sau đó được đem cô đuổi dung môi bằng thiết bị cô chân không dưới áp suất thấp (nhiệt độ không quá 40oC) để tránh sự phân hủy lutein trong điều kiện nhiệt độ và oxy không khí.
Thực hiện cô đuổi nhằm mục đích thu được dịch sản phẩm thô chứa lutein ester cô đặc đồng thời thu hồi dung môi tái sử dụng.
Tinh chế
Dịch chiết lutein ester cô đặc được tinh chế theo phương pháp của Phillip T. (1997) [22] bằng cách hòa tan dịch chiết trong dung dịch isopropanol ở nhiệt độ 75oC nhằm mục đích hòa tan lutein ester. Tiếp đó, lọc lấy hỗn hợp dung dịch qua
1
phễu lọc hút chân không để lọc bỏ những tạp chất không tan (sáp, cặn bả). Dịch lọc sau đó được để nguội ở 15oC qua đêm (trong tủ mát) để tạo điều kiện kết tinh lutein ester. Lọc hút chân không một lần nữa để thu sản phẩm lutein ester tinh sạch hơn.
Sấy chân không
Sấy khô chân không sản phẩm kết tinh ở 30oC để loại bỏ lượng dung môi và nước còn sót lại nhằm thu sản phẩm lutein ester ở dạng tinh thể khô. Lượng dịch lọc còn lại đem gia nhiệt thu hồi isopropanol để sử dụng tiếp cho mẻ sau.
Tất cả các thao tác trên nên thực hiện nhanh, tránh ánh sáng.
Chú ý công đoạn lọc nên tiến hành nhanh đến mức có thể để rút ngắn thời gian lọc vì đây là giai đoạn lutein ester tiếp xúc với không khí nhiều nhất nên dễ bị oxy hóa, đồng thời bị tổn thất nhiều lượng dung môi bay hơi dẫn đến không những hiệu suất thu hồi dung môi kém mà hiệu suất thu hồi lutein ester cô đặc cũng không chính xác.
Tất cả các dung môi đã thu hồi sẽ được lọc qua Na2SO4 dạng rắn để làm khan nước trong dung dịch thu hồi và tiếp tục sử dụng chúng cho các mẻ tiếp theo sau.
Qua tham khảo một số kết quả nghiên cứu liên quan, chúng tôi chọn các yếu tố có thể ảnh hưởng nhiều đến hiệu suất thu hồi lutein ester và khoảng giá trị khảo sát như sau:
– Dung môi chiết: acetone, etanol, hexane, ete dầu hoả; – Tỷ lệ dung môi:nguyên liệu: X1 = 2,0 – 6,0 (v/w);
– Thời gian chiết: X2 = 6–24 (h); – Nhiệt độ chiết: X3 = 30–50 (oC); – Tốc độ lắc: X4 = 100–300 (rpm);
– Số lần chiết: 1–3 (lần).
Để xác định điều kiện chiết tối ưu, trong nghiên cứu này chúng tôi dùng phương pháp thực nghiệm cổ điển kết hợp với phương pháp quy hoạch thực nghiệm yếu tố toàn phần mô hình cấu trúc có tâm RSM-CCD để xác định giá trị tối ưu của các thông số trên.
2.2.5. Bố trí thí nghiệm lựa chọn dung môi chiết
Để xác định được loại dung môi chiết, tiến hành thí nghiệm sau:
Lấy 5 gam cánh hoa CVT tươi cho vào bình tam giác sau đó cho vào 5 ml enzyme thương mại Viscozyme 1% (v/v), tiến hành ủ ở 400C trong 5 giờ (lắc với tốc độ 250 rpm). Sau khi ủ xong, mẫu được hút nước ra và cho dung môi vào với tỷ lệ dung môi:nguyên liệu là 4:1 (v/w) rồi chiết lutein ester bằng cách lắc với tốc độ 200 rpm, 15 giờ ở 40oC (dùng máy lắc ổn nhiệt), trong đó dung môi thay đổi lần lượt là: hexane, acetone, ete dầu hoả, etanol. Dịch chiết được lọc qua Na2SO4 khan. Pha loãng dịch chiết theo tỷ lệ thích hợp (D) rồi đo độ hấp thụ ở 445 nm trên quang kế UV-Vis. Từ đó, dựa vào kết quả đã chọn được dung môi chiết thích hợp.
Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của dung môi chiết đến hiệu suất chiết lutein ester được trình bày ở hình 2.3.
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn dung môi chiết Chiết (Dung môi:nguyên liệu = 4:1 v/w; 15 giờ; 40oC; 200 rpm)
acetone hexane ete dầu hoả
Cánh hoa CVT tươi
Xủ lý
Dịch màu
Đo quang
Dung môi chiết thích hợp Lọc
Na2SO4 khan
2.2.6. Phương pháp thiết kế thí nghiệm RSM-CCD tối ưu hóa điều kiện chiết 2.2.6.1. Thiết kế thí nghiệm RSM-CCD 2.2.6.1. Thiết kế thí nghiệm RSM-CCD
Để xác định chính xác giá trị tối ưu của các thông số X1; X2; X3; X4 ảnh hưởng đến hiệu suất chiết lutein ester, tiến hành tối ưu hóa quá trình tách chiết bằng phương pháp thực nghiệm yếu tố toàn phần theo mô hình Box-Wilson, trong đó sử dụng phương án trực giao 4 yếu tố với 3 thí nghiệm lặp lại ở tâm phương án (k = 4, n0= 3). Riêng yếu tố X6 (số lần chiết) sẽ xác định sau khi có kết quả tối ưu hóa.
Hình 2.4. Các yếu tố đầu vào ảnh hưởng đến hiệu suất chiết lutein ester
Như vậy, phương án thực nghiệm bao gồm 27 thí nghiệm (16 thí nghiệm ở biên, 3 thí nghiệm ở tâm và 8 thí nghiệm ở các cánh tay đòn).
Hàm mục tiêu là hiệu suất lutein ester chiết được (Y).
Phương trình hồi quy tuyến tính có dạng bậc 2 được xác định bằng phần mềm Design Expert: 2 4 44 2 3 33 4 4 3 3 2 2 1 1 0 b X b X b X b X ... b X b X b Y
Thí nghiệm được bố trí theo thiết kế CCD (bảng 2.2, trang 32), trong đó dung môi chiết thích hợp nhất (đã được chọn trong thí nghiệm ở mục 2.2.5) được dùng cho tất cả các thí nghiệm.
X1: Tỉ lệ dung môi:nguyên liệu
X2: Thời gian chiết
X3: Nhiệt độ chiết
X4: Tốc độ lắc
Công đoạn chiết
Hiệu suất thu lutein ester
Hàm mục tiêu (Y) Các yếu tố khảo sát:
Các yếu tố thí nghiệm và chỉ tiêu theo dõi trong quy hoạch thực nghiệm RSM-CCD được trình bày ở bảng 2.1.
Bảng 2.1. Các yếu tố ảnh hưởng khảo sát trong RSM-CCD
Mức Yếu tố Tên Đơn vị Phạm vi nghiên cứu – –1 0 +1 + X1 Tỷ lệ dung môi:nguyên liệu v/w 2 – 6 1,17 2 4 6 6,83 X2 Thời gian chiết h 6 - 24 2,27 6 15 24 27,73 X3 Nhiệt độ chiết o C 30 - 50 25,86 30 40 50 54,14 X4 Tốc độ lắc rpm 100 - 300 58,58 100 200 300 341,42
Khoảng biến thiên của các thông số trên được chọn sao cho các giá trị cánh tay đòn (–α) là dương (> 0).
Sơ đồ thí nghiệm tối ưu hóa điều kiện chiết lutein ester bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm được trình bày trên bảng 2.2 (trang 32).
2.2.6.2. Chọn phương án sản xuất tối ưu. Kiểm tra bằng thực nghiệm
Kết quả thí nghiệm theo thiết kế RSM-CCD thu được sẽ được nhập vào chương trình Design-Expert 8.0.7.1 và tiến hành phân tích.
Sau khi xử lý số liệu, phần mềm Design Expert sẽ đưa ra các thông số cho từng yếu tố để hàm đạt giá trị cực đại, sau đó sẽ phân tích đưa ra các phương án sản xuất tối ưu để người sử dụng lựa chọn.
Sau khi đã chọn được phương án sản xuất tối ưu, áp dụng các mẫu lớn hơn (50 gam mẫu; lặp lại 3 lần) nhằm kiểm tra sự tương thích giữa lý thuyết với thực nghiệm. Tính hiệu suất thu hồi lutein ester theo công thức:
Hiệu suất chiết (%)= lutein tlượng lutein chiết đượcổng số trong nguyên liệu*100%
2.2.7. Xử lý số liệu
Các kết quả nghiên cứu đều là trung bình cộng của 3 lần xác định song song. Xử lý số liệu bằng phần mềm MS Excel 2003.
Vẽ đồ thị hai chiều bằng phần mềm Excel 2003 và đồ thị ba chiều bằng phần mềm Design-Expert® 8.0.7.1.
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO
LUẬN
3.1. Kết quả thí nghiệm xác định thành phần khối lượng của hoa cúc vạn thọ
Kết quả thí nghiệm xác định thành phần khối lượng của hoa CVT được trình bày trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Thành phần khối lượng của hoa cúc vạn thọ Cánh hoa
(phần sử dụng, chứa lutein ester) Cùi (phần không sử dụng)
Nguyên liệu hoa CVT,
kg Khối lượng, kg Tỷ lệ, % Khối lượng, kg Tỷ lệ, %
2,58 1,32 51,16 1,26 48,84
Kết quả được trình bày trong bảng trên cho ta thấy:
– Phần cánh hoa chiếm khoảng 51,16% trọng lượng tươi của hoa. Đây chính là phần sử dụng được dùng chiết lutein ester.
– Phần không sử dụng (cùi hoa, cánh hoa bị úa, hư hỏng,…) chiếm khoảng 48,84% trọng lượng tươi của hoa CVT. Phần cùi hoa (có màu xanh của diệp lục tố và tinh dầu) có thể tận dụng để chiết xuất chất màu chlorophyll, tinh dầu kháng nấm, diệt côn trùng gây hại.
3.2. Hàm lượng lutein tổng số và trọng lượng khô của nguyên liệu
Kết quả xác định hàm lượng lutein tổng số và trọng lượng khô của nguyên liệu cánh hoa CVT được trình bày trong bảng 3.2 (trang 35).
Kết quả cho thấy:
Hàm lượng lutein tổng số trong cánh hoa CVT khá cao (khoảng 11260 mg/kg khô), lớn hơn rất nhiều so với các loại rau quả. Như vậy, việc chiết lutein ester từ cánh hoa CVT sẽ cho hiệu quả kinh tế cao hơn đi từ các nguồn nguyên liệu thực vật nói trên (bảng PL 1.2).
Hàm lượng nước trong cánh hoa khá cao chiếm khoảng 89,41%. Đây là môi trường thuận lợi cho vi sinh vật, nấm mốc phát triển là nguyên liệu dễ bị hư hỏng. Vì thế, cánh hoa CVT sau khi đã được tách ra khỏi cùi hoa nên tiến hành chiết lutein ester ngay để tránh ảnh hưởng đến hiệu suất, chất lượng lutein ester thu được [37]. Nếu không, cần bảo quản ở nhiệt độ thấp (–200C) đến khi sử dụng.
Bảng 3.2. Trọng lượng khô và hàm lượng lutein tổng số của nguyên liệu
% Trọng lượng khô Lutein tổng số, mg/kg tươi
Lutein tổng số, mg/kg khô
10,59 1193 11260
3.3. Kết quả thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất chiết lutein ester chiết lutein ester
Kết quả thu được khi tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng của dung môi chiết đến hiệu suất chiết lutein ester từ cánh hoa CVT được trình bày trong bảng PL 1.5, biểu diễn cụ thể trên hình 3.1.
Hiệu suất, % 90,88 78,84 64,96 24,36 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Hexane Ete dầu hoả Acetone Etanol
Dung m ôi H iệ u s u ấ t % Hiệu suất, %
Dựa vào kết quả được trình bày trong bảng PL 1.5, hình 3.1 cho thấy:
Bản chất của dung môi ảnh hưởng nhiều đến hiệu suất chiết lutein ester. Dung môi có bản chất khác nhau thì hiệu suất chiết lutein ester cũng khác nhau. Quy tắc chung là: Các dung môi phân cực hoà tan các hợp chất phân cực tốt nhất và các dung môi không phân cực hòa tan các hợp chất không phân cực tốt nhất.
Acetone và etanol là hai dung môi phân cực hơn hexane và eter dầu hoả nên cho hiệu suất chiết thấp hơn. Etanol có độ phân cực lớn nhất nên hiệu quả chiết thấp nhất (14,72%). Hiệu suất chiết của acetone là 64,96%. Hexane và ete dầu hoả là 2 dung môi không phân cực nên có thể hoà tan tốt hơn lutein ester. Do hiệu suất chiết của ete dầu hoả (78,84%) thấp hơn so với hexane (90,88%). Nên hexane là dung môi chiết thích hợp nhất trong 4 dung môi đã khảo sát.
Mặt khác, qua kết quả xác định trọng lượng khô của cánh hoa CVT ở mục 3.2, cánh hoa CVT tươi có chứa hàm lượng nước cao khoảng 89,41%. Mặt khác,