Trên thế giới, đã có nhiều công trình nghiên cứu tách chiết, tinh chế lutein ester từ cánh hoa CVT bằng các phương pháp khác nhau.
Ausich, R. L., và Sanders, D.J. năm 1997, đã đưa ra quy trình chiết lutein ester từ bột hoa CVT khô bằng hexane, sau đó cô đuổi dung môi dưới áp suất thấp để thu được oleoresin chứa ít hơn 1% hexane. Oleoresin được trộn với propylen glycol ở 50–60oC, sau đó thêm từ từ dung dịch KOH 45% rồi xà phòng hóa ở 65– 80oC trong 3–10 giờ. Sau khi phản ứng kết thúc, thêm nước vào (tỷ lệ oleresin:propylen glycol:dung dịch KOH:nước là 4:4:1:1, w/w/w/w). Lutein tự do tinh thể sẽ kết tinh ngay trong môi trường phản ứng. Lọc lấy lutein tinh thể rồi rửa bằng nước khử ion ở 70–90oC để loại bỏ tạp chất tan trong nước rồi làm khô bằng cách sấy lạnh, cô chân không hoặc dùng dòng khí N2 nóng. Quy trình này khá đơn giản, ít tốn thời gian, hạn chế được việc sử dụng các dung môi hữu cơ dùng trong giai đoạn kết tinh lại. Sản phẩm thu được chứa 0,5–5% nước, 70–85% carotenoid tổng số (trong đó 85–95% trans-lutein, 0,2–1,5% các dạng đồng phân hình học của lutein, 2,5–8% zeaxanthin) và một số tạp chất là các muối xà phòng hóa của acid béo [1].
Levy, L. W. thu sản phẩm oleoresin có tỷ lệ trans-lutein ester cao bằng cách bằng cách ngâm bột hoa CVT khô trong hexane (8 l/kg) ở nhiệt độ phòng. Tách lấy dịch chiết, cô đuổi dung môi để thu lutein ester thô. Sau đó, thêm isopropanol vào lutein ester thô ở nhiệt độ phòng để hòa tan cis-lutein ester và các tạp chất không thuộc nhóm xanthophyll. Sản phẩm sau đó được cô chân không để loại bỏ
isopropanol. Kết quả thu được sản phẩm chứa 69% lutein ester trong đó tỷ lệ đồng phân trans:cis là 90:10 [21].
Trong nghiên cứu của Kumar, S.T.K ; P. Abdulkadir và ctv(2004) hexane được sử dụng làm dung môi để chiết lutein ester từ bột hoa CVT khô (đã được cố định và làm giàu carotenoid bằng cách ủ xi-lô trong 2–3 tuần ở pH thích hợp trong điều kiện kỵ khí có kiểm soát và có mặt chất chống oxy hóa). Lutein ester sau đó được xà phòng hóa bằng KOH trong isopropanol ở 65–80oC trong 3 giờ, với tỷ lệ oleoresin:dung dịch KOH:isopropanol là 1:0,25:3 (w/w/v). Dịch xà phòng hóa được xử lý bay hơi chân không để thu hồi isopropanol. Chiết xanthophyll từ cặn thu được bằng acetat etyl. Dịch chiết được cô chân không và kết tinh lại bằng cách khuấy trong hỗn hợp hexane-axetone (80:20, v/v) ở nhiệt độ phòng trong 30 phút rồi lọc. Rửa tinh thể lutein thu được bằng metanol rồi cô chân không ở nhiệt độ phòng trong 72 giờ. Kết quả, thu được tinh thể chứa 86,23% xanthophyll tổng số (w/w), trong đó, trans-lutein chiếm 91,43%. Sản phẩm có thể dùng làm dược phẩm ngăn ngừa các bệnh thoái hóa võng mạc, ung thư phổi. Nhược điểm của quy trình này là các bước xà phòng hóa và cô đuổi isopropanol đều phải thực hiện ở nhiệt độ khá cao (70–80oC) nên có khả năng dẫn đến sự chuyển hóa trans-lutein thành dạng đồng phân cis-hay phân hủy lutein thành các carotenoid khác, làm giảm hoạt tính sinh học của sản phẩm. Ngoài ra, sản phẩm có thể chứa dư lượng dung môi hữu cơ sử dụng trong quá trình tách chiết, tinh chế [19].
Philip, T. đã nghiên cứu chiết xuất lutein ester từ bột hoa cúc vạn thọ sấy khô bằng ete dầu hoả ở nhiệt độ phòng với tỷ lệ 1:3 (w/v). Dịch chiết được cô đuổi dung môi dưới áp suất thấp ở 50oC để thu lutein oleoresin (tức “chất dầu nhựa lutein”), sau đó, đem hòa tan trong isopropanol nóng ở 75oC rồi lọc bỏ tạp chất không tan. Dịch lọc được làm lạnh xuống 15oC hay thấp hơn. Lutein ester tách ra được lọc và làm khô dưới áp suất thấp ở 30oC để thu lutein ester tinh thể. Ông đã thu được 51% lutein tổng số [22].
Bên cạnh đó, cũng xuất hiện nhiều hướng nghiên cứu hạn chế sự phân hủy lutein ester trong công đoạn chiết bằng cách dùng các kỹ thuật hiện đại như chiết với sự hỗ trợ của siêu âm, chiết bằng CO2 siêu tới hạn [24, 36] hay chiết dưới áp suất cao. Mặc dù, các kỹ thuật chiết hiện đại đã được áp dụng ở khá phổ biến trong quy mô phòng thí nghiệm tại các nước tiên tiến trên thế giới, tuy nhiên, việc áp dụng rộng rãi trong thực tế sản xuất còn hạn chế do chi phí đầu tư thiết bị cao, không kinh tế. Vì vậy, việc nghiên cứu cải tiến quy trình công nghệ nhằm nâng cao hiệu suất thu hồi lutein vẫn đang là bài toán đặt ra cho các nhà khoa học trên thế giới.
Trong nghiên cứu của Sunita Tekwani và ctv (2010) về tác dụng của cellulase và các pectinase trong chiết xuất lutein từ những cánh hoa CVT khô, cho thấy hiệu suất chiết lutein với phương pháp có và không có xử dụng enzyme tương ứng là 9,2% w/w và 5,6 w/w. Điều đó đã chứng minh được việc xử lý hoa CVT bằng enzyme pectinase và cellulase cho hiệu suất tăng một cách đáng kể [31].
Có thể nói, xử lý bằng enzyme đã được đề xuất như một giai đoạn thay thế cho các quy trình tách chiết bằng dung môi để cải thiện năng suất và chất lượng của một số sản phẩm oleoresin. Cũng như đối với một số đối tượng đã nghiên cứu, việc xử lý hoa CVT bằng enzyme đã cải thiện được hiệu suất chiết [14].
Nghiên cứu Barzana và ctv (2002) là nghiên cứu điển hình về việc xử lý cánh hoa CVT bằng enzyme trước khi chiết. Xử lý bằng Viscozyme hiệu suất tăng lên hơn 45% so với khi không sử dụng enzyme [6, 30]. Điểm hạn chế của nghiên cứu này ở chỗ: Viscozyme là một loại enzyme thương mại đắt tiền (100 ml enzyme Viscozyme có giá 11.50 bảng Anh), nên ít được dùng trong nghiên cứu và sản xuất rộng rãi. Do đó, chưa thật sự đánh giá được hiệu suất chiết lutein ester từ cách hoa CVT đã được xử lý với Viscozyme. Chính vì vậy, việc lựa chọn phương pháp chiết, nhằm đạt hiệu quả cao, thân thiện với môi trường, phù hợp với điều kiện thực tế cũng là yêu cầu đặt ra cho đề tài. Trong đồ án tốt nghiệp này sẽ nghiên cứu “Tối ưu
hóa quy trình chiết lutein ester từ hoa cúc vạn thọ Tagetes erecta L. đã được xử lý bằng Viscozyme” nhằm đạt được hiệu suất chiết lutein ester là cao nhất.
Để thực hiện được mục tiêu trên cần thực hiện những nội dung nghiên cứu sau:
– Nghiên cứu xác định điều kiện tối ưu cho việc chiết xuất lutein ester sử dụng phương pháp RSM-CCD;
– Phân tích, giá mức độ tương thích của giải pháp tối ưu bằng thực nghiệm;
– Nghiên cứu chiết xuất lutein ester từ hoa CVT với các điều kiện tối ưu trên;
CHƯƠNG II.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu
Nguyên liệu sử dụng chiết tách lutein ester trong nghiên cứu này là cánh hoa CVT châu Phi (Tagetes erecta L.) có màu vàng cam được trồng tại huyện Diên Khánh (Khánh Hòa).
Hình 2.1. Hoa cúc vạn thọ châu Phi
2.1.2. Dụng cụ, thiết bị và hoá chất nghiên cứu 2.1.2.1. Dụng cụ và thiết bị 2.1.2.1. Dụng cụ và thiết bị
Dụng cụ
- Phễu lọc thủy tinh, bông y tế, giấy bạc, bình định mức (25 ml, 50 ml), cốc thuỷ tinh (50 ml, 100 ml), micropipet, pipet, bình tam giác (250 ml), bình hút ẩm.
Thiết bị
– Cân phân tích 0,1 mg (Satorius, Nhật).
– Cân kỹ thuật 1 g (Việt Nam).
– Tủ sấy 10C UNB 400 (Memmert , Đức).
– Máy lắc ổn nhiệt (Model: KS 4000 I control, IKA, Đức).
– Bể siêu âm Elmasonic S300H (Elma, Đức) với tần số siêu âm 35kHz.
– Quang kế UV-Vis Genesys 20 (Thermo, USA).
– Quang phổ kế UV-VIS Cary 50 (Hache, Đức).
– Tủ HOTTE.
– Thiết bị cô chân không RV 10 Control V (IKA, Đức).
2.1.2.2. Hoá chất
Tất cả các hóa chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết phân tích (PA), bao gồm:
– Nước cất 1 lần;
– Na2SO4 khan (độ tinh khiết ≥ 99,0 %, China);
– Etanol 99,5% (độ tinh khiết ≥ 99,7%, China);
– Acetone (độ tinh khiết ≥ 99,5%, China);
– Hexane độ (độ tinh khiết ≥ 97,0%, China);
– Dung dịch KOH 0,1 N và 0,5 N;
– Ete dầu hoả (độ tinh khiết ≥ 97,0%, China);
– BHT (độ tinh khiết ≥ 99%, China);
– Na2SO4 (độ tinh khiết ≥ 99%, China);
– Isopropanol (độ tinh khiết ≥ 99,7%, China);
– Viscozyme (Novozyme, Đan Mạch).
2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Chuẩn bị nguyên liệu 2.2.1. Chuẩn bị nguyên liệu
Hoa tươi sau khi thu hoạch được chuyển ngay về phòng thí nghiệm. Cánh hoa CVT được tách ra, trộn đều để đồng nhất mẫu, cân thành những lượng xác định, rồi cho vào các túi polyetylen, hạn chế không khí tới mức tối đa, rồi đem cột kín và bảo quản ở –20oC đến khi nghiên cứu.
2.2.2. Xác định thành phần khối lượng của hoa cúc vạn thọ
Thành phần khối lượng của hoa CVT được xác định như sau: – Cân hoa được khối lượng là mH;
– Cắt lấy phần cánh hoa màu vàng của hoa, đem cân phần này ta được khối lượng mC;
– Phần bỏ đi là cuống hoa, cánh hoa bị úa có khối lượng là mB. Thành phần khối lượng của hoa được tính như sau:
%phần cánh hoa = *100% H C m m ; % phần bỏ đi = *100% H B m m ; 2.2.3. Phương pháp phân tích
2.2.3.1. Xác định hàm lượng lutein tổng số trong cánh hoa cúc vạn thọ
Chiết lutein tổng số trong cánh hoa CVT bằng acetone và đo độ hấp thụ của dung dịch lutein tổng số ở bước sóng 445 nm, dùng hexane làm dung dịch so sánh (phụ lục 2). Đo độ hấp thụ của lutein tổng số ở 445 nm là do ở bước sóng này độ hấp thụ của lutein là cực đại [20].
2.2.3.2. Xác định trọng lượng khô (%TL khô) của cánh hoa cúc vạn thọ
Hoa tươi được sấy ở 105–110oC đến khối lượng không đổi (phụ lục 3).
2.2.3.3. Phương pháp chiết lutein ester từ cánh hoa cúc vạn thọ
Lutein ester trong cánh hoa CVT được chiết xuất từ nguyên liệu tươi. Xác định điều kiện chiết thích hợp bằng cách khảo sát sự phụ thuộc của hiệu suất vào các yếu tố: dung môi chiết (acetone, etanol, ete dầu hoả, hexane); tỷ lệ dung môi:nguyên liệu; thời gian chiết; số lần chiết; tốc độ lắc và nhiệt độ chiết.
Dịch lutein ester được chiết sang hexane rồixácđịnh lượng lutein chiết được bằng phương pháp đo quang tương tự như khi định lượng lutein tổng số.
Hiệu suất chiết lutein ester được tính theo công thức:
Hiệu suất chiết (%)= lượng lutein chiết được
lutein tổng số trong nguyên liệu*100%
2.2.4. Đề xuất quy trình tách chiết lutein ester từ cánh hoa cúc vạn thọ
Trên cơ sở kết quả của một số nghiên cứu liên quan, chúng tôi đề xuất quy trình dự kiến tách chiết lutein ester từ cánh hoa CVT thọ đã được xử lý bằng enzyme thương mại Viscozyme như sau:
Hình 2.2. Sơ đồ quy trình dự kiến tách chiết lutein ester từ cánh hoa CVT đã
được xử lý bằng Viscozyme
Thuyết minh quy trình:
Mục tiêu:
Mục tiêu của bố trí thí nghiệm này là tìm ra chế độ chiết lutein ester từ cánh hoa CVT đã xử lý Viscozyme một cách hiệu quả nhất.
Hiệu quả chiết ngoài phụ thuộc vào mức độ tác động của các yếu tố ảnh hưởng đến việc xử lý hoa còn phụ thuộc vào điều kiện chiết lutein ester.
Điều kiện chiết thích hợp:
- Dung môi?
- Tỷ lệ dung môi:nguyên liệu? - Nhiệt độ chiết?
- Tốc độ lắc? - Thời gian chiết? - Số lần chiết? Xử lý thích hợp
Lọc
Chiết
Cánh hoa CVT tươi
Cô đuổi dung môi (áp suất thấp; < 400C)
Chất màu lutein ester Sấy chân không
Tinh chế Na2SO4 khan
Do đó, cần nghiên cứu xác định loại dung môi chiết, tỷ lệ dung môi:nguyên liệu, nhiệt độ chiết, tốc độ lắc, thời gian chiết, số lần chiết thích hợp đảm bảo hiệu suất thu lutein ester cao nhất.
Nguyên liệu
Nguyên liệu dùng để chiết lutein ester trong thí nghiệm này là cánh hoa CVT tươi đã được loại bỏ phần hư hỏng, chất bẩn.
Xử lý
Cánh hoa (cân khối lượng xác định) cho vào thiết bị chiết. Sau đó, tiến hành ủ nguyên liệu ở điều kiện sau: nồng độ Viscozyme 1% (v/v); tỷ lệ dung dịch Viscozyme:nguyên liệu 1:1 (v/w), pH xử lý = 5,5; ủ ở 40oC, lắc với tốc độ 250 rpm trong thời gian 5 giờ1.
Chiết
Sau khi ủ xong, lutein ester trong hoa CVT được chiết bằng dung môi và phương pháp chiết thích hợp đã xác định (tỷ lệ dung môi:nguyên liệu, nhiệt độ, tốc độ lắc, thời gian chiết, số lần chiết) sao cho đạt hiệu suất chiết cao và hợp lý nhất.
Lọc lấy dịch chiết
Dịch sau khi chiết xong được lọc qua Na2SO4 khan. Dịch thu được là dịch màu hỗn hợp lutein ester.
Cô đuổi dung môi
Dịch chiết sau đó được đem cô đuổi dung môi bằng thiết bị cô chân không dưới áp suất thấp (nhiệt độ không quá 40oC) để tránh sự phân hủy lutein trong điều kiện nhiệt độ và oxy không khí.
Thực hiện cô đuổi nhằm mục đích thu được dịch sản phẩm thô chứa lutein ester cô đặc đồng thời thu hồi dung môi tái sử dụng.
Tinh chế
Dịch chiết lutein ester cô đặc được tinh chế theo phương pháp của Phillip T. (1997) [22] bằng cách hòa tan dịch chiết trong dung dịch isopropanol ở nhiệt độ 75oC nhằm mục đích hòa tan lutein ester. Tiếp đó, lọc lấy hỗn hợp dung dịch qua
1
phễu lọc hút chân không để lọc bỏ những tạp chất không tan (sáp, cặn bả). Dịch lọc sau đó được để nguội ở 15oC qua đêm (trong tủ mát) để tạo điều kiện kết tinh lutein ester. Lọc hút chân không một lần nữa để thu sản phẩm lutein ester tinh sạch hơn.
Sấy chân không
Sấy khô chân không sản phẩm kết tinh ở 30oC để loại bỏ lượng dung môi và nước còn sót lại nhằm thu sản phẩm lutein ester ở dạng tinh thể khô. Lượng dịch lọc còn lại đem gia nhiệt thu hồi isopropanol để sử dụng tiếp cho mẻ sau.
Tất cả các thao tác trên nên thực hiện nhanh, tránh ánh sáng.
Chú ý công đoạn lọc nên tiến hành nhanh đến mức có thể để rút ngắn thời gian lọc vì đây là giai đoạn lutein ester tiếp xúc với không khí nhiều nhất nên dễ bị oxy hóa, đồng thời bị tổn thất nhiều lượng dung môi bay hơi dẫn đến không những hiệu suất thu hồi dung môi kém mà hiệu suất thu hồi lutein ester cô đặc cũng không chính xác.
Tất cả các dung môi đã thu hồi sẽ được lọc qua Na2SO4 dạng rắn để làm khan nước trong dung dịch thu hồi và tiếp tục sử dụng chúng cho các mẻ tiếp theo sau.
Qua tham khảo một số kết quả nghiên cứu liên quan, chúng tôi chọn các yếu tố có thể ảnh hưởng nhiều đến hiệu suất thu hồi lutein ester và khoảng giá trị khảo sát như sau:
– Dung môi chiết: acetone, etanol, hexane, ete dầu hoả; – Tỷ lệ dung môi:nguyên liệu: X1 = 2,0 – 6,0 (v/w);
– Thời gian chiết: X2 = 6–24 (h); – Nhiệt độ chiết: X3 = 30–50 (oC); – Tốc độ lắc: X4 = 100–300 (rpm);
– Số lần chiết: 1–3 (lần).
Để xác định điều kiện chiết tối ưu, trong nghiên cứu này chúng tôi dùng phương pháp thực nghiệm cổ điển kết hợp với phương pháp quy hoạch thực nghiệm yếu tố toàn phần mô hình cấu trúc có tâm RSM-CCD để xác định giá trị tối ưu của các thông số trên.
2.2.5. Bố trí thí nghiệm lựa chọn dung môi chiết
Để xác định được loại dung môi chiết, tiến hành thí nghiệm sau:
Lấy 5 gam cánh hoa CVT tươi cho vào bình tam giác sau đó cho vào 5 ml enzyme thương mại Viscozyme 1% (v/v), tiến hành ủ ở 400C trong 5 giờ (lắc với tốc độ 250 rpm). Sau khi ủ xong, mẫu được hút nước ra và cho dung môi vào với tỷ lệ dung môi:nguyên liệu là 4:1 (v/w) rồi chiết lutein ester bằng cách lắc với tốc độ 200 rpm, 15 giờ ở 40oC (dùng máy lắc ổn nhiệt), trong đó dung môi thay đổi lần lượt là: hexane, acetone, ete dầu hoả, etanol. Dịch chiết được lọc qua Na2SO4 khan. Pha loãng dịch chiết theo tỷ lệ thích hợp (D) rồi đo độ hấp thụ ở 445 nm trên quang kế UV-Vis. Từ đó, dựa vào kết quả đã chọn được dung môi chiết thích hợp.
Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của dung môi chiết đến hiệu suất chiết lutein ester được trình bày ở hình 2.3.
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn dung môi chiết Chiết (Dung môi:nguyên liệu = 4:1 v/w; 15 giờ; 40oC; 200 rpm)
acetone hexane ete dầu hoả
Cánh hoa CVT tươi