Trong nghiên cứu này, nguyên liệu dùng để chiết lutein ester là cánh hoa cúc vạn thọ châu Phi (Tagetes erecta L.) được trồng tại huyện Diên Khánh, tỉnh Khánh Hòa. 2.1.1.2. Hóa chất: - Na2SO4 khan (PA,Trung Quốc); - PE (PA,Trung Quốc); - Hexane (PA,Trung Quốc); - Acetone (PA,Trung Quốc); - Nước cất 1 lần ;
- Enzyme Viscozyme (Novozyme ) ;
- BHT (PA, Merck, Đức).
Tất cả các hóa chất đều thuộc loại tinh khiết dùng trong phân tích.
2.1.2. Dụng cụ, thiết bị
2.1.2.1. Dụng cụ:
Phễu lọc thủy tinh, ống đong, bình định mức, pipet, bông y tế, giấy bạc, bình nón, phễu chiết.
2.1.2.2. Thiết bị
- Cân phân tích ± 1 mg (Shimadzu, Nhật);
- Cân phân tích ± 0,1 mg (Satorius, Nhật);
- Tủ sấy ±10C (Memert, Đức);
- Bể siêu âm Elmasonic S300H (Elma, Đức);
- Máy lắc ổn định nhiệt (IKA, Đức).
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp xử lý nguyên liệu
Tiến hành:
Hoa cúc vạn thọ tươi sau khi thu hoạch được chuyển ngay về phòng thí nghiệm. Cánh hoa được cắt tách ra (phần sử dụng), loại bỏ phần đài hoa (phần không sử dụng). Bảo quản cánh hoa tươi ở −200C cho đến khi nghiên cứu (trong thời gian không quá 2 tuần).
Để hiệu chỉnh ảnh hưởng của sự biến đổi hàm lượng carotenoid trong quá trình bảo quản, trước mỗi lô thí nghiệm, xác định lại hàm lượng carotenoid tổng số và hàm lượng nước trong nguyên liệu.
2.2.2. Xác định thành phần khối lượng của nguyên liệu
Các phần sử dụng được (cánh hoa) và phần không sử dụng được (đài hoa) sau khi tách riêng được đem cân.
Thành phần khối lượng của hoa cúc vạn thọ nguyên liệu được tính bằng công thức: Phần sử dụng (%) = *100% m m 0 1 Phần không sử dụng (%) = *100% m m 0 2 Trong đó:
m0: khối lượng nguyên liệu ban đầu; m1: khối lượng phần cánh hoa;
m2: tổng khối lượng phần cuống, cánh hoa.
2.2.3. Xác định một số thành phần của hoa 2.2.3.1. Xác định lutein tổng số: 2.2.3.1. Xác định lutein tổng số:
Nguyên tắc: Chiết hoàn toàn lutein từ mẫu phân tích bằng aceton. Lutein ester chiết được sang dung môi hexane rồi định lượng bằng phương pháp đo quang ở 445 nm (Phụ lục 1).
2.2.3.2. Xác định % TL khô của hoa
Nguyên tắc: Trọng lượng khô của hoa cúc vạn thọ được xác định sau khi sấyở 105–1100C đến khối lượng không đổi (Phụ lục 2).
2.2.4. Bố trí thí nghiệm
2.2.4.1. Quy trình chiết lutein ester từ cánh hoa cúc vạn thọ sau khi xử lý bằng Viscozyme xử lý bằng Viscozyme
Trên cơ sở kết quả của một số tài liệu [1], chúng tôi đề xuất quy trình dự kiến xử lý và chiết carotenoid từ hoa cúc vạn thọ bằng Viscozyme như sau:
Thuyết minh quy trình:
Chuần bị nguyên liệu: Cân chính xác G gam cánh hoa cúc vạn thọ tươi cho vào bình chứa đựng có nắp đậy kín.
Xử lý nguyên liệu: Thêm vào nguyên liệu đã chuẩn bị dung dịch Viscozyme có nồng độ, tỷ lệ enzyme: nguyên liệu, pH thích hợp. Sau đó, tiến hành ủ nguyên liệu trong điều kiện đã được kiểm soát ở tốc độ, nhiệt độ, thời gian thích hợp.
Chiết lutein ester: Cánh hoa cúc vạn thọ sau khi xử lý bằng Viscozyme được chiết bằng hexan với tỷ lệ 4:1 v/w bằng cách sử dụng máy lắc ổn nhiệt ở điều kiện sau: tốc độ lắc 150 rpm; nhiệt độ 300C; thời gian lắc: 18 giờ. Sau khi chiết, lọc lấy dịch chiết, làm khan bằng Na2SO4, pha loãng đến thể tích thích hợp rồi đo quang ở 445 nm để xác định hàm lượng lutein chiết được tương tự khi xác định lutein tổng số trong nguyên liệu.
Hiệu suất quả xử lý được đánh giá bằng hiệu suất chiết lutein ester và được tính theo công thức sau:
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình dự kiến chiết lutein ester từ hoa cúc vạn thọ
2.2.4.2. Xây dựng quy trình xử lý hoa cúc vạn thọ bằng Viscozyme
Để xây dựng được quy trình sử dụng Viscozyme xử lý hoa cúc vạn thọ tươi cho hiệu suất cao, với mục đích cải tiến quy trình chiết lutein ester bằng phương pháp chiết truyền thống, cần nghiên cứu sự phụ thuộc của hiệu suất chiết lutein ester vào các yếu tố sau: nồng độ dịch Viscozyme; tỉ lệ
- Nhiệt độ ủ ?
- Tốc độ lắc ?
- Thời gian ủ ?
- Dung môi: Hexan (4/1, v/w)
- Lắc (150 rpm; 300C; 18 h) - Nồng độ Viscozyme ? - pH = ?
- Tỷ lệ Viscozyme:nguyên liệu ?
Ủ (lắc)
Thêm dung dịch Viscozyme
Chiết carotenoid (1 lần)
Lọc-Làm khan
Định lượng carotenoid tổng số
Đánh giá hiệu quả xử lý
Dịch chiết carotenoid
enzyme:nguyên liệu; pH ủ; tốc độ lắc; nhiệt độ ủ; thời gian ủ; trong đó các thông số trên thay đổi như sau:
- Nồng độ Viscozyme: 0; 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 1; 1,2; 1,4; 1,6 % (v/v)
- Tỉ lệ Viscozyme:nguyên liệu: 0,1; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5% (v/w)
- pH xử lý: thay đổi từ 4; 5; 6; 7
- Tốc độ lắc: 0; 100; 150; 200; 250; 300 rpm
- Nhiệt độ ủ: 30; 35; 40; 45; 50 0C;
- Thời gian ủ: 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8 giờ
Việc xác định giá trị thông số thích hợp được thực hiện bằng phương pháp thực nghiệm cổ điển (thay đổi 1 thông số, cố định tất cả các thông số còn lại, từ đó chọn giá trị thích hợp của thông số đang khảo sát).
a) Bố trí thí nghiệm xác định nồng độ Viscozyme thích hợp
Lấy 6 bình nón nút mài. Cân chính xác khoảng G g cánh hoa cúc vạn thọ cho vào mỗi bình. Tiến hành ủ nguyên liệu với Viscozyme bằng cách cho lần lượt dung dịch enzyme vào các bình nón chứa nguyên liệu hoa, trong đó nồng độ dịch Viscozyme trong các bình lượt thay đổi như sau: 0%; 0,1%; 0,2%; 0,4%; 0,6%; 1%; 1,2%; 1,4%; 1,6% (v/v), còn tỷ lệ dịch enzyme:nguyên liệu là 2:1 pH của dịch Viscozyme được cố định là 5,6 (ứng với pH tự nhiên của dịch Viscozyme trong dịch bảo quản). Đậy kín các bình nón, đem ủ ở 300C, lắc với tốc độ 150 rpm 4 giờ. Sau khi ủ, tiến hành chiết carotenoid rồi so sánh hiệu quả xử lý của Viscozyme (xem mục 2.2.4.1). Từ đó, xác định được nồng độ Viscozyme thích hợp (Hình 2.2, trang 27).
b) Xác định tỉ lệ Viscozyme:nguyên liệu thích hợp
Tiến hành tương tự như đã mô tả ở mục 2.2.4.2 nhưng với nồng độ Viscozyme thích hợp đã xác định và tỉ lệ enzyme:nguyên liệu lần lượt thay đổi lần lượt là: 0,1:1; 0,5:1; 1,0:1; 1,5:1; 2,0:1; 2,5:1 (v/w). So sánh hiệu quả xử lý của Viscozyme trong các trường hợp. Từ đó, xác định tỉ lệ Viscozyme:nguyên liệu thích hợp (Hình 2.3, trang 28).
c) Xác định pH thích hợp
Tiến hành tương tự như đã mô tả ở mục 2.2.4.2 nhưng với nồng độ Viscozyme và tỉ lệ Viscozyme:nguyên liệu thích hợp đã xác định.Thay đổi pH môi trường ủ nguyên liệu bằng cách sử dụng các dung dịch đệm có pH thay đổi lần lượt là: 4,0; 5,0; 6,0; 7,0.
Đánh giá hiệu quá xử lý của Viscozyme trong các trường hợp. Từ đó, xác định tỉ lệ Viscozyme:nguyên liệu thích hợp (Hình 2.4, trang 29).
d) Xác định tốc độ lắc thích hợp
Tiến hành tương tự như đã mô tả ở mục 2.2.4.2 nhưng với nồng độ Viscozyme, tỉ lệ Viscozyme:nguyên liệu, pH thích hợp đã xác định. Lắc các mẫu thí nghiệm với tốc độ lắc thay đổi lần lượt như sau:
100; 150; 200; 250; 300 (rpm)
Sau khi ủ enzyme, tiến hành chiết carotenoid và đánh giá hiệu quả xử lý trong từng trường hợp. Từ đó, xác định tốc độ lắc thích hợp (Hình 2.5, trang 30).
e) Xác định nhiệt độ ủ thích hợp
Tiến hành tương tự như đã mô tả ở mục 2.2.4.2 nhưng với nồng độ Viscozyme, tỉ lệ Viscozyme:nguyên liệu, pH, tốc độ lắc thích hợp đã xác định. Thay đổi nhiệt độ ủ lần lượt là: 30, 35, 40, 45, 50 (0C).
Sau khi chiết carotenoid, so sánh hiệu quả xử lý nguyên liệu bởi enzyme ở các trường hợp để chọn nhiệt độ ủ enzyme thích hợp (Hình 2.6, trang 31 ).
f) Xác định thời gian ủ thích hợp
Tiến hành tương tự như đã mô tả ở mục 2.2.4.2 nhưng với nồng độ Viscozyme, tỉ lệ Viscozyme:nguyên liệu, pH, tốc độ lắc, nhiệt độ ủ enzyme thích hợp. Thay đổi thời gian ủ lần lượt là:
1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8 (giờ).
Sau khi chiết carotenoid, đánh giá hiệu quả xử lý hoa cúc vạn thọ bởi Viscozyme ứng với các mẫu nói trên. Từ đó, chọn thời gian ủ thích hợp (Hình 2.7, trang 32).
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ Viscozyme thích hợp
Nguyên liệu
Thêm dịch Viscozyme
Thay đổi nồng độ Viscozyme (v/v)
Lắc (150 rpm, 300C, 4 h) Thêm hexan (4/1, v/w) Lắc (150 rpm; 300C; 18 h) Lọc Dịch chiết Nồng độ Viscozyme thích hợp Định lượng carotenoid So sánh hiệu quả xử lý 0% 0,1% 0,2% 0,4% 0,6% 1% 1,2% 1,4% 1,6%
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỉ lệ Viscozyme:nguyên liệu
Thêm dịch Viscozyme (nồng độ thích hợp) Nguyên liệu
Tỉ lệ Viscozyme:nguyên liệu (v/w)
0,5:1 Thêm hexan (4/1, v/w) Lắc (150 rpm, 300C, 4 h) 0,1:1 1:1 1,5:1 2:1 2,5:1 Lắc (150 rpm; 300C; 18 h) Lọc Định lượng carotenoid Dịch chiết Tỉ lệ Viscozyme:nguyên liệu thích hợp So sánh hiệu quả xử lý
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỉ lệ pH thích hợp
Nguyên liệu
Thêm dịch Viscozyme (pha trong dung dịch đệm pH): nồng độ và tỷ lệ thích hợp Thay đổi pH 4 Lắc (150 rpm; 300C; 4 h) Thêm hexan (4/1, v/w) Lọc Lắc (150 rpm; 300C; 4 h) Dịch chiết Định lượng carotenoid So sánh hiệu quả xử lý pH thích hợp 5 6 7
Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tốc độ lắc thích hợp Nguyên liệu Thêm dịch Viscozyme (nồng độ, tỷ lệ, pH thích hợp) Lắc (300; 4 h) Thay đổi tốc độ lắc 100 rpm 150 rpm 200 rpm 250 rpm 300 rpm Thêm hexan (4/1, v/w) Lắc (150 rpm; 300C; 4 h) Định lượng carotenoid Dịch chiết So sánh hiệu quả xử lý Tốc độ lắc thích hợp
Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ lắc thích hợp
Nguyên liệu
Thêm dịch Viscozyme (nồng độ, tỷ lệ, pH thích hợp)
Thay đổi nhiệt độ ủ Lắc (Tốc độ thích hợp; 4h) 300C Thêm hexan (4/1, v/w) Lắc (150 rpm; 300C; 4 h) Dịch chiết Lọc Nhiệt độ ủ thích hợp So sánh hiệu quả xử lý Định lượng carotenoid 350C 400C 450C 500C
Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian ủ thích hợp
Nguyên liệu
Thêm dịch Viscozyme (nồng độ, tỷ lệ, pH thích hợp)
Lắc (Tốc độ lắc và nhiệt độ ủ thích hợp
Thay đổi thời gian ủ
1 h Thêm hexan (4/1, v/w) 2 h 3 h 4 h Lắc (150 rpm; 300C; 4 h) Lọc Định lượng carotenoid So sánh hiệu quả xử lý Thời gian ủ thích hợp 5 h 6 h 7 h 8 h Dịch chiết Nguyên liệu
2.2.5. Thử nghiệm chiết lutein ester từ hoa cúc vạn thọ đã được xử lý bởi Viscozyme. Đánh giá hiệu quả thu hồi lutein ester từ cánh hoa cúc vạn Viscozyme. Đánh giá hiệu quả thu hồi lutein ester từ cánh hoa cúc vạn thọ đã xử lý bằng enzyme so với phương pháp chiết truyền thống
Sau khi đã chọn được các thông số xử lý nguyên liệu cúc vạn thọ thích hợp, đề xuất quy trình chiết lutein ester từ cánh hoa cúc vạn thọ tươi đã được xử lý với Viscozyme.
Thử nghiệm quy trình này trên các mẫu lớn hơn. Tiến hành đồng thời mẫu đối chứng trong cùng điều kiện (chiết từ nguyên liệu tươi không xử lý Viscozyme). So sánh hiệu suất chiết trong 2 trường hợp. Từ đó, kết luận về hiệu quả của Viscozyme đối với việc nâng cao hiệu suất chiết lutein ester từ hoa cúc vạn thọ.
2.2.6. Phương pháp xử lý số liệu
- Các kết quả đều là trung bình cộng của 2 lần thí nghiệm song song.
PHẦN 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả một số thành phần chính của hoa cúc vạn thọ
Kết quả xác định thành phần khối lượng và hàm lượng lutein tổng số của nguyên liệu cánh hoa cúc vạn thọ tươi được trình bày trong lần lượt trong các bảng 3.1 và 3.2.
Bảng 3.1. Thành phần khối lượng của hoa cúc vạn thọ
Thành phần % Khối lượng Phần sử dụng 51,16 Phần không sử dụng được 48,84 Bảng 3.2. Một số thành phần chính của hoa cúc vạn thọ Thành phần Hàm lượng TL khô (%) 10,59 Lutein tổng số, g/kg TL khô 11,26
Kết quả phân tích thành phần khối lượng của nguyên liệu (Bảng 3.1) cho thấy: Phần sử dụng cho mục đích chiết lutein ester (cánh hoa) và phần không sử dụng được (cùi hoa) có tỉ lệ xấp xỉ nhau: 51,16 % và 48,84 %. Nghiên cứu của Pratheesh V.B. và các cộng sự (2009) cũng cho thấy phần cánh hoa chiếm 40−50 % của hoa. Mặc dù chỉ có phần cánh hoa là có thể dùng cho mục đích tách chiết lutein [21] nhưng phần cùi còn lại có thể được tận dụng cho các ứng dụng khác như tách chiết tinh dầu, chiết chlorophyll hay sử dụng như một vị thuốc đông y để chữa một số bệnh [22].
Dựa vào bảng 3.2 có thể thấy rằng hàm lượng lutein tổng số trong nguyên liệu hoa cúc vạn thọ sử dụng (11,26 g/kg TL khô) cao hơn rất nhiều so với nhiều loài thực vật khác (ví dụ: bông cải xanh 19 mg/kg; rau cải bina
102 mg/kg,.. [19]). Như vậy, cúc vạn thọ là nguồn nguyên liệu rất tốt cho việc chiết tách lutein.
3.2. Kết quả bố trí thí nghiệm
3.2.1. Kết quả xác định nồng độ enzyme Viscozyme thích hợp
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch Viscozyme đến hiệu quả xử lý hoa cúc vạn thọ (hình3.2) cho thấy:
Với nồng độ enzyme 0,1% thì cho hiệu suất chiết rất thấp, chỉ có 1,17% v/v. Khi nâng nồng độ enzyme lên 0,2; 0,4; 0,6 % v/v thì hiệu suất tăng nhanh và đạt hiệu suất chiết cao nhất ở nồng độ Viscozyme 1%. Tiếp tục tăng nồng độ Viscozyme lên 1,2; 1,4; 1,6 % thì hiệu suất chiết tăng nhưng không đáng kể. Có thể giải thích điều này như sau: Với nồng độ Viscozyme thấp ở mức 0,1% thì lượng enzyme quá ít, không đủ để phản ứng với cơ chất nên không gây hiệu quả đáng kể đến sự phá vỡ thành tế bào sắc tố, dẫn đến hiệu suất chiết lutein ester nhỏ. Nồng độ Viscozyme càng cao thì số lượng tế bào sắc tố tiếp xúc với phân tử enzyme càng nhiều nên lượng tế bào bị phá hủy càng nhiều, hiệu quả chiết càng cao. Khi nồng độ Viscozyme đã đủ lớn, các tế bào cánh hoa bị phá hủy gần như hoàn toàn. Khi đó, nếu tiếp tục tăng nồng độ enzyme thì lượng enzyme thừa này sẽ không thay đổi lượng tế bào bị phá hủy nên hiệu suất chiết thay đổi không đáng kể. Kết quả này hơi khác so với kết quả của Barzana và các cộng sự (2002) khi sử dụng hỗn hợp Viscozyme- Neutrase-Pectinex để xử lý hoa cúc vạn thọ: nếu chiết xanthophyll bằng hexane (4/1, v/w) thì hiệu suất chiết thay đổi không đáng kể khi thay đổi nồng độ hỗn hợp enzyme từ 0,1 đến 1% v/v nhưng nếu chiết với tỷ lệ hexane 3/1 v/w thì hiệu suất chiết tăng khá nhiều (từ 65% đến 90%) khi tăng nồng độ dịch enzyme từ 0,1 lên 1% v/v [5]. Sự khác biệt này có lẽ do hỗn hợp Viscozyme-Neutrase-Pectinex có tác dụng phá hủy thành tế bào hoa cúc vạn thọ mạnh hơn nên ở nồng độ thấp hơn đã đạt đến sự bão hòa về hiệu quả xử lý.
Từ khảo sát trên, có thể chọn giá trị nồng độ enzyme 1% v/v làm nồng độ thích hợp cho việc xử lý hoa cúc vạn thọ bằng Viscozyme.
Hình 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ Viscozyme đến hiệu suất chiết lutein ester
3.2.2. Kết quả xác định tỉ lệ Viscozyme:nguyên liệu thích hợp
Kết quả xác định tỷ lệ Viscozyme:nguyên liệu (hình 3.2) cho thấy: Với tỉ lệ trong khoảng từ 0,1:1 đến 0,5:1 (v/w) thì hiệu suất chiết tăng không đáng kể. Nguyên nhân có thể là ở trong khoảng 0,1:1 đến 0,5:1 (v/w), enzyme chưa thấm đều vào cánh hoa nên không thể phá vỡ hoàn toàn thành tế bào của cánh hoa. Khi tăng tỉ lệ này lên 1:1 (v/w) thì hiệu suất chiết tăng cao. Đối với tỉ lệ Viscozyme:nguyên liệu 1,5:1; 2:1; 2,5:1 (v/w) hiệu suất chiết tiếp tục tăng, nhưng không đáng kể. Do đó, để đạt hiệu quả kinh tế cao, tỉ lệ Viscozyme:nguyên liệu thích hợp là 1:1 (v/w).
Ảnh hưởng của nồng độ Viscozyme đến hiệu suất chiết 1,17 7,93 18,03 27,47 32,72 48,08 48,91 49,61 51,43 0 10 20 30 40 50 60 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 Nồng độ Viscozyme, v/v H iệ u s u ấ t ch iế t, %
Hình 3.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ Viscozyme:nguyên liệu đến hiệu suất chiết
lutein ester
3.2.3. Kết quả xác định pHtối ưu
Kết quả thí nghiệm xác định nồng độ đệm pH được trình bày ở hình 3.3