Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Xây dựng quy trình phát hiện các đột biến gen liên quan đến bệnh khiếm thính di truyền bằng kỹ thuật giải trình tự DNA thế hệ mới

NHIỆM VỤ VÀ NOI DUNG:Xây dựng quy trình phát hiện các đột biến gen liên quan đến bệnh khiếm thính di truyềnbăng kỹ thuật giải trình tự DNA thế hệ mới với các nội dung chính sau: 1.. Nhăm

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP.HCM

NGUYÊN THỊ DIỆU ÁI

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số: 60 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Tp Hỗ Chí Minh, tháng 1 năm 2019

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BACH KHOA —DHQG - TP HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học : PGS.TS Hỗ Huỳnh Thùy Dương

Cán bộ chấm nhận xét Ï : - it te S333 ESESEEESESEEEESESEEEESEEEEeESEEeEerrersrrres

TS Nguyễn Hoàng Chương

Cán bộ chấm nhận xét 2 : G tt Sa SE S33 E858 E8E9EE8E8E5E5EEE5EE8 E555 555515 cEe

TS Hoàng Anh Hoàng

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Dai học Bách Khoa, DHQG Tp HCMngày 11 tháng 01 năm 2019

Thanh phan Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:1 CHU TỊCH: PGS.TS NGUYEN TIEN THANG2 PHAN BIEN 1: TS NGUYEN HOANG CHUONG3 PHAN BIEN 2: TS HOANG ANH HOANG

4 UY VIEN: PGS TS LE PHINGA5 THU KY: TS PHAN THI HUYENXác nhận của Chu tịch Hội đồng đánh giá LV va Trưởng Khoa quản ly chuyên

ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nêu có).

CHỦ TỊCH HỘI ĐÔNG TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

PGS TS NGUYÊN TIỀN THÁNG GS.TS Phan Thanh Sơn Nam

DAI HOC QUOC GIA TP.HCM CONG HOA XA HOI CHU NGHIA VIET NAMTRUONG ĐẠI HOC BACH KHOA Độc lập - Tự do - Hanh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Nguyễn Thị Diệu Ái MSHV: 1670542

Ngày, tháng, năm sinh: 16/08/1993 Nơi sinh: Cà Mau

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60420201I TEN DE TÀI: Xây dựng quy trình phát hiện các đột biến gen liên quan đến bệnhkhiếm thính di truyền bang kỹ thuật giải trình tự DNA thế hệ mới

Il NHIỆM VỤ VÀ NOI DUNG:Xây dựng quy trình phát hiện các đột biến gen liên quan đến bệnh khiếm thính di truyềnbăng kỹ thuật giải trình tự DNA thế hệ mới với các nội dung chính sau:

1 Thiết lập quy trình giải trình tự DNA thế hệ mới phát hiện đột biến gây bệnhkhiếm thính trên 7 gen GJB2, GJB3, GJB6, KCNO4, MYO7A, MYOISA và SLC26A4

2 Xác định các thông số kỹ thuật đánh giá chất lượng dữ liệu giải trình tự3 Phân tích kết quả quy trình phát hiện biến thể trên mẫu chuẩn dương, mẫuchuẩn âm và mẫu âm tính với bệnh khiếm thính

IH NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 13/08/2018IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIEM VU: 02/12/2018V CAN BO HUONG DAN: PGS TS Hồ Huỳnh Thùy Duong

Tp HCM, ngay thang năm 20

CAN BO HUONG DAN CHU NHIEM BO MON DAO TAO

PGS TS Hồ Huỳnh Thùy Dương PGS TS Lê Thị Thủy Tiên

TRUONG KHOA KY THUẬT HOA HỌC

GS.TS Phan Thanh Son Nam

LOI CAM ON

Đề thực hiện va hoàn thành dé tai luận van nay, tôi xin gửi lời cám ơn chânthành đến:

Ban Giám hiệu trường Đại học Bách Khoa, Ban chủ nhiệm Khoa Kỹ Thuật

Hóa Học, Bộ môn Công nghệ Sinh học cùng tất cả thay cô đã giảng day những kiếnthức quý báu cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường

Ban Giám Đốc Công ty TNHH Công nghệ Sinh học Khoa Thương đã đồng ýcho tôi thực hiện đề tài tại công ty

PGS.TS Hồ Huỳnh Thủy Dương, Bộ môn Di truyền — Đại học Khoa Học TựNhiên TP HCM người hướng dẫn khoa học cho tôi trong quá trình hoàn thành luậnvăn.

Các anh, chị phòng nghiên cứu và các đồng nghiệp tại công ty TNHH CNSHKhoa Thương đã tạo điều kiện và hỗ trợ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Tp Hồ Chí Minh, ngày 01 tháng 12 năm 2018

TÓM TẮT

Khiếm thính là khuyết tật giác quan phố biến nhất ở người với tỷ lệ từ một đếnbón trên 1000 trẻ sinh ra Khoảng 50 — 70% trường hợp khiếm thính bam sinh là dođột biễn gen Nhăm phát hiện đột biến gây bệnh và cung cấp thông tin đánh giá lâmsàng cho người bị nghe khó và mất thính, chúng tôi xây dựng quy trình giải trình tựDNA thế hệ mới phát hiện các đột bién trên 7 gen phd biến gây bệnh khiếm thính.Đề tài đã nhân bản thành công các exon mã hóa và vùng intron +/- 15 bp kế cận của7 gen GJB2, GJB3, GJB6, KCNO4, MYO7A, MYOI5A và SLC26A4 bang long-range PCR Kết quả giải trình tự NGS thành công với mật độ cluster 219 k/mm2,

Q30 đạt 89.9%, passing filter đạt 89% va thu được chất lượng dữ liệu tốt

Đề tài thực hiện quy trình trên các mẫu chuẩn dương, mẫu chuẩn âm và mẫumáu người không mắc bệnh khiếm thính Kết quả cho thấy quy trình đã phát hiệnđược đột biến gây bệnh c.35delG và c.101T>C trên gen GJB2, đúng với đột biếnton tại trên mẫu chuẩn dương và không tìm thấy đột bién gây bệnh trên mẫu chuẩnâm và mẫu bình thường Đồng thời chúng tôi cũng giải được trình tự các gen mụctiêu với độ phủ cao trên 100X và độ chính xác 99.9% Kết quả này cho phép pháthiện đúng trình tự gen quy định chức năng nghe từ đó phát hiện được các biến thểgây bệnh Nghiên cứu này là tiền đề cho sự phát triển quy trình xét nghiệm di truyềnphát hiện đột biến gây bệnh khiếm thính

Hearing loss is the most common sensory impairment in humans, with aprevalence of one to four in 1,000 newborns Approximately 50% to 70% ofcongenital hearing loss cases are attributable to genetic causes Establishing agenetic diagnosis of hereditary hearing loss is a critical component of the clinicalevaluation of deaf and hard-of-hearing persons and their families In this study, atargeted DNA next-generation sequencing (NGS) gene panel for hearing loss wasdeveloped including 7 genes which have a well-established causal role in hearingloss Targeted regions including coding exon and +/- 15 base pairs of adjacentintronic sequence from GJB2, GJB3, GJB6, KCNQ4, MYO7A, MYOIS5A andSLC26A4 genes were successfully amplified by long-range PCR The sequencing

run clustered at 219 k/mm? and resulted in 89.9% of reads exceeded Q30, 89% of

the original reads passing filter and generated high-quality DNA sequence data.

The developed testing procedures were performed on four samples normal forhearing loss and two reference samples including one positive and one negative formutation The two mutations c.35delG and c.101T>C on GJB2 gene were identifiedwhich were exactly two previously identified mutations Good quality sequencedata with 99.9% accuracy and min coverage on target region greater than 100Xwere also obtained These results indicated that generated data were reliable forvariant calling This study established an initial step for developing a moleculardiagnostic for hereditary hearing loss.

LOI CAM DOAN

Tôi xin cam đoan day là công trình nghiên cứu cua riêng tôi, các sô liệu và kếtquả nghiên cứu trong luận văn là trung thực, nêu có gì sai sót tôi xin hoàn toàn chịutrách nhiệm.

Tp Hỗ Chí Minh, ngày 25 tháng 11 năm 2018

Nguyễn Thị Diệu Ái

2 Mục tiêu nghiÊn CỨU E22 2102222622111 1 111111111 1111111118815 5 5111k khe 2

CHƯƠNG 1 TONG QUAN TÀI LIEU 5-5-5 E268 EEeEeEeEeEeEsEeesererered 31.1 Khiếm thính di truyền va các gen liên quan - - - + +s+x+E+EeEsEersrrerees 31.2 Chương trình tầm soát và xét nghiệm chân đoán khiếm thính 71.3 Giải trình tự thé hệ mới trong xét nghiệm di truyén - - - sex: 91.4 Giá trị và hạn chế của xét nghiệm di truyền khiếm thính 14

1.5 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài NUGC << << << << sseesss 17

CHƯƠNG 2 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 192.1 Địa điểm va thời gian nghiên cứu - - %6 xxx #EeEeEeEeEsrerererees 192.2 Vật liệu — hóa chất ¿ - + 2k SE 5 EEE9 E1 1515111115151 111111.11 1111 cXe6 192.2.1 Mau thực nghiệm + EES1 St 11931 911cc 1n ru 192.2.2 Hóa chất-vật tư tiêu hao - ¿6 S223 SE 1513111151511 115 111111 x00 192.2.3 Thiết bị - dụng CỤ - s11 1H11 1111111111 rreg 202.3 Sơ đồ nghiên cứu tổng quất «+ sex E1EEEEEE9EEEEEEEExrkrers 212.4 BO 606i 0n “n áỶÝỶÝ 222.4.1 Thiết lập quy trình giải trình tự ÌNGS - c6 sxekeeeeresree 222.4.2 Xác định các thông số kỹ thuật đánh giá chất lượng dữ liệu giải trình tự 2.4.3 Phân tích kết quả quy trình phát hiện biến thể trên mẫu chuẩn và mẫu âm

2.5 Phương pháp nghién CUU ccccssccccccecccccesesseesssssscceeeeeecceeesesesesseessstsaaeeeees 27

2.5.1 Thiết kế hệ mỗi dùng cho phản ứng long-range PCR - s: 272.5.2 Tach chiết gDÌNA - s11 E111 9151 111111 1 1c greg 27

2.5.3 Long-range PCR 0 Ả 30

2.5.4 Chuẩn bị thư viện cho giải trình tự thế hệ mớii - 2 - s+s+s+sscsz 312.5.5 Giải trình tự DNA thế hệ mới - ¿2+ 2 2+E+E+E2£E£EeErErEeErkrree, 34

2.5.6 Phân tích dit liệu - ¿5-6 SE+ESEE£EEEEEEEEEEEEE1E11111115211511 1.11 xe, 35

2.5.8 Xử lý SỐ liệU tt H TT TT HT H11 TT T1 TT net 36CHƯƠNG 3 KET QUA - BIEN LUẬN - - - - set EEEEeEeEeEsrsesererrred 373.1 Kết quả thiết lập quy trình giải trình tự NGS ¿6 56x sxeeseeescee 373.1.1 Kết quả thiết kế hệ mỗi long-range - ¿c6 xxx +k+k+k+xeeeeeesree 373.1.2 Kết quả tối ưu các phản ứng long-range PCR -5-ss+s+ssesescse 393.1.3 Chuẩn bị thư viện giải trình tự DNA ¿c6 6xx ekeeeereeree 463.1.4 Giải trình tự DNA thé hệ mớii -¿- - 2 2E E2 +E£E+EE£E+EeErErrerereee 483.2 Kết quả xác định các thông số kỹ thuật đánh giá chất lượng dữ liệu giải trình

DANH SÁCH CÁC TỪ VIET TAT

LINE: Long interspersed nuclear element

NCBI: National Center for Biotechnology Information

PCR: Polymerase Chain ReactionSINE: Short interspersed nuclear element

TE: Dung dịch gồm Tris va EDTA

Bảng 2.1 Thông số đánh giá hiệu quả chuẩn bị thư viện - - 5c sccecee: 24

Bảng 2.2 Thông số đánh giá kết quả chất lượng chạy máy giải trình tự 24

Bảng 2.3 Thông số đánh giá chất lượng giải trình tự - + c+esesesrererees 25Bảng 2.4 Điểm chất lượng và độ chính xác của base đọc được 26

Bảng 2.5 Thành phan phan ứng long-range PCR 5-5 c+s+E+EeEsEsEsrererees 30Bảng 3.1 Các thông số kỹ thuật của 25 cặp môi thiết kế - 5 sex: 37Bảng 3.2 Thông tin kỹ thuật 28 cặp primer lựa chọn cho xét nghiệm KT di truyềnự - ÔÔ 44

Bảng 3.3 Nông độ và kích thước trung bình của thư viện trước khi biến tính 48

Bảng 3.4 Thông số kỹ thuật giải trình tự DNA trên hệ thông MiniSed 49

Bang 3.5 Các thông số thống kê chất lượng dữ liệu giải trình tự 50

Bảng 3.6 Thông số kiểm soát chất lượng cho quy trình phát hiện đột biến gây bệnhKT bang giải trình tự ÌNGS - - - E111 E9 5E ST TH HH g1 rrvo 54Bang 3.7 Kết quả tim biến thé của mẫu chuẩn dương — NA23853 56

Bảng 3.8 Kết quả tìm biến thé của mẫu chuẩn âm — NÑA12878 - 5s: 57Bảng 3.9 Kết quả tim biến thé của mẫu âm — HLOOL wc ccceeeeseeeeseseesesseeeeeeee 58Bang 3.10 Thông số kỹ thuật kiểm soát quy trình của mẫu âm tính 59Bảng 3.11 Kết quả tìm biến thé của mẫu âm — HL002 - 2 2 + +£sEexezxe: 60Bảng 3.12 Kết quả tìm biến thé của mẫu âm — HL003 - 2 2 + + £+£s£exezxe: 60Bảng 3.13 Kết quả tìm biến thé của mẫu âm — HL004 - - 2 + s£+Es£erezxe: 61

DANH MUC CAC HINH

Hình 1.1.Tan suất các nguyên nhân gây bệnh khiếm thính - 2-2-5 25s: 5Hình 1.2 Hướng dẫn chan đoán nguyên nhân và đánh giá lâm sàng khiếm thính của

Hình 3.3 Cac trình tự lặp trên 3 vùng gen KCNO4, MYOIS5A, MYOZA 43

Hình 3.4 Kết quả điện di sản phẩm cắt - ¿2-2 +s+E+ESEEE+E£EeEeEEErkrkerererered 46Hình 3.5 Kết quả kiểm tra kích thước thư viện mẫu NA23853 băng BioAnalyzer

Hình 3.10 Kích thước đoạn Insert (Insert Size) << c5 se 53

MO DAU

1 Tinh cấp thiết của dé tàiKhiếm thính (KT) là một trong những khiếm khuyết phố biến trong quan théngười, ty lệ mắc bệnh vào khoảng 1 trên 1000 ca mới sinh và khoảng 50% ở ngườitrên 80 tuổi Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization -WHO), năm 2018 ước tính có 466 triệu người mất thính lực, chiếm trên 5% dân sốthế giới [1] Nguyên nhân gây ra bệnh KT khá phức tap bao gồm các yếu tố do gen,do môi trường như mắc bệnh truyền nhiễm, tiếp xúc với chất gây độc lên thính giác,tiếng ồn hoặc do tuôi tác Trong các yếu tổ trên, yếu tố di truyền đóng vai trò quan

trọng trong sự hình thành bệnh, chiếm khoảng 50 — 70% các trường hợp bị bệnh

bam sinh và được xem là có liên quan đến việc thúc day tiễn trình bệnh ở người caotuổi [2] Trong các trường hợp khiếm thính di truyền, tỷ lệ các ca khiếm thính

không hội chứng (nonsyndromic hearing loss-NSHL) là 70%, 30% còn lại là các ca

khiếm thính có hội chứng, thường gặp đi kèm với các hội chứng như Usher,Pendred, Jervell và Lange-Nielsen Hiện nay, đã có trên 150 gen được công bồ là cóliên quan đến bệnh KT di truyền Da số đột biến trên các gen liên quan quy địnhtính trạng dị hợp tử, do đơn gen quy định, tần suất khác nhau tùy theo quần thể KTgây ảnh hưởng lớn đến sức khỏe, tâm lý cũng như sự phát triển thể chất và hoạtđộng của người bệnh Do đó việc tầm soát sớm để có phương pháp điều trị thíchhợp và kiểm tra thân nhân nhằm theo dõi, phát hiện các trường hợp mắc bệnh tiếptheo là vấn đề cần thiết Đồng thời, dữ liệu thu nhận được từ người bệnh sẽ gópphan làm rõ các van dé dich té học phân tử cua bệnh KT ở Việt Nam

Những thông tin về gen và cơ chế phân tử của bệnh do di truyền đã có nhữngbước tiến vược bậc kế từ khi kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới (Next generationsequencing — NGS) được phat minh Với dữ liệu dau ra cao nhờ chiến lược làm giàubăng phương pháp capture (capture enrichment) và giải đồng thời và lượng lớn cácđoạn ngăn trình tự (massively parallel), NGS có thể giải 1 GB bp trong vòng 0,5ngày trong khi Sanger phải mất 500 ngày cho khối lượng tương tự Chi phí cũng

giảm xuống đáng kể, thấp hơn đến 100 lần Do vậy, NGS được đánh giá là kỹ thuậtcó thời gian xét nghiệm nhanh, có thé áp dung phân tích lượng lớn thông tin gen; làcông nghệ hữu dụng và thích hợp cho nghiên cứu, xét nghiệm chan đoán các bệnhdi truyền dị hợp và có nhiều gen liên quan như khiếm thính di truyền Xuất phát từnhững thực tế trên, đề tài “Xây dựng quy trình phát hiện các đột biến gen liên quanđến bệnh khiếm thính di truyền bằng kỹ thuật giải trình tự DNA thế hệ mới” đượcthực hiện nhằm bước đầu cung cấp những nên tang cơ bản cho việc xây dựng quytrình xét nghiệm chân đoán bệnh khiếm thính di truyền ở Việt Nam.

2 Mục tiêu nghiên cứu

Xây dựng thành công quy trình phát hiện các đột biến trên 7 gen GJB2, GJB3,GJB6, KCNO4, MYO7A, MYOI5A và SLC26A4 gây bệnh KT di truyền bang kỹthuật giải trình tự DNA thế hệ mới

CHƯƠNG 1 TONG QUAN TÀI LIEU

1.1 Khiếm thính di truyền và các gen liên quanKhiếm thính hay suy giảm thính lực (KT) là tình trạng bị suy giảm một phầnhoặc mất hăn toàn bộ khả năng nghe và là một trong bốn dạng khiếm khuyết phốbiến trong quan thé người được Tỷ lệ mắc bệnh ở trẻ sơ sinh vào khoảng 1 trên1000 ca và khoảng 50% ở người trên 80 tuổi Theo thong kê của tổ chức y tế thé

giới (World Health Organization - WHO), năm 2018 ước tính có 466 triệu người

mất thính lực, chiếm trên 5% dân số thế giới [1] Khiếm thính có thé do nguyênnhân di truyền hoặc do ảnh hưởng của các yếu tổ môi trường như biến chứng khisinh, mắc bệnh truyền nhiễm, phơi nhiễm với âm thanh tần số lớn, sử dụng sai liềulượng một số loại thuốc hoặc mẹ sử dụng thuốc có ảnh hưởng đến thính giác trongquá trình mang thai Trong các nguyên nhân trên, yếu tố di truyền hay đột biến genđóng vai trò quan trọng trong sự hình thành bệnh, chiếm khoảng 50 — 70% cáctrường hợp bị bệnh khiếm thính bam sinh và được báo cáo là có liên quan đến việcthúc đây tiến trình bệnh ở người cao tuổi [2]

Khiếm thính di truyền thường được phân loại như là KT có hội chứng hoặcKT không có hội chứng dựa trên sự hiện diện hoặc thiếu vắng các khiếm khuyết dikèm trên các hệ co quan khác Khiếm thính là một trong những rối loạn với nguyênnhân phức tạp nhất khi có đến trên 400 hội chứng liên quan [3] Khiếm thính có hộichứng thường chiếm dưới 30% các trường hợp khiếm thính di truyền với phô cáchội chứng thường gặp là Pendred (cống tiền đình mở rộng, các vẫn dé về tuyếngiáp), Usher (viêm võng mạc sắc tố), Waardenburg (bất thường sắc tố), vàBranchio-oto-renal (dị dạng tai và thận) Trong khi đó, khiếm thính không hộichứng chiếm khoảng 70% các trường hợp và thường là dạng khiếm thính thần kinhgiác quan (Sensoneural HL), dạng KT do khiếm khuyết ở tai trong, ton thương ở 6ctai hoặc ở đường dẫn truyền thần kinh lên hệ thống thần kinh trung ương Các dạngkhiếm thính dẫn truyền (Conductive HL) do khiếm khuyết ở tai ngoài hay tai giữangăn chặn sự dẫn truyền hợp lý của âm thanh và dạng khiếm thính hỗn hợp giữa hai

loại trên (Mixed HL), hoặc khiếm thính do thần kinh thính giác (Neural HL) có xảyra nhưng chiếm tỷ lệ thấp trong khiếm thính di truyền không hội chứng.

Đột biến gây khiếm thính di truyền gồm các dạng: đột biến lặn trên nhiễm sắcthé thuong chiém gan 80%, đột bién trội trên nhiễm sắc thé thường chiếm gân 20%,các dạng đột biến di truyén liên kết trên NST giới tính X và đột biến trên gen ty thélà các đột biến hiếm chiếm tỷ lệ < 1% (Hình 1.1) Hiện nay đã có trên 150 gen đượccông bố có liên quan đến bệnh KT di truyền Các gen này mã hóa nhiều loại proteinliên quan đến sự phát triển và chức năng của hệ thống thính giác như nhân tố phiênmã, protein cau trúc, protein liên kết khe (gap-junction protein) và các kênh ion [4].Trong đó, đột biến trên gen G/B? có tần suất gây bệnh lớn nhất Tiếp theo đó là các

gen như SLC26A4, GJB6, MYO7A, MYO15A, CDH23, TMCI, KCNOQ4 Tuy nhiên

tan suất gây bệnh của các gen này rất khác nhau tùy theo sắc tộc Trong sắc tộcngười Hán, đột biến bi-allelic GJB2 được báo cáo trong 19,1% bệnh nhân bị bệnhđiếc không hội chứng, sau đó là đột biến bi-allelic trên gen SLC2644 với tỷ lệ12,1% [5] Một nghiên cứu sử dụng kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới (Next-

generation sequencing- NGS) trên 63 gen mục tiêu cho 1120 bệnh nhân người Nhật

cho kết quả đột biến có tần suất cao nhất là GJB2:c.235delC, được tìm thay trong166 allele từ 1120 bệnh nhân Đột biến SLC2644:c.2168A>G (p.H723R) là đột biếnpho biến thứ hai với 53 allele được tìm thấy [6] Gen KCNO4, quy định proteinkênh điện thế màng tế bao K+, giữ vai trò quan trong trong chu trình tái phục hồiion K+ ở tai trong và là gen pho biến nhất quy định khiếm thính di truyền dạng trộitrên NST thường Một nghiên cứu cho thấy đột biến trên gen nảy chiếm 6.6%(19/287 gia đình) các trường hợp khiếm thính [7]

1=%~1%, X-linked~ 25 % Môi trườn

, 2 => 1% đột biến trên gene ty thể

~ 25 % nguyên nhân không

rõ, có thể do di truyền

~ 30% có hội chứng

~ 15-20% đột biến trội trên

~ 50 % Di truyền NST thường 40-50%

~ 70% không hội chứng - đột biến

~ 80% đột biến lặntrên gene

NST thường GIB2

Hình 1.1.Tan suất các nguyên nhân gây bệnh khiếm thính

Phố các gen quy định khiếm thính di truyền rất đa dạng và đôi khi có sự trùnglặp giữa dạng có hội chứng với không hội chứng, giữa dạng di truyền trội với lặntrên NST thường Trên 50% trường hợp KT theo kiểu di truyền lặn trên NSTthường liên quan đến gen GJB2 (Gap junction protein beta 2 hay connexin 26) Tuynhiên, đột biến trên gen nay cũng gây các dạng khiếm thính di truyền theo kiểu trội[3] Gen GJB2 năm trên nhánh dai nhiễm sac thé 13 (13q12), có kích thước khoảng7 kb và gồm 2 exon Gen nay mã hóa cho protein connexin 26 (Cx26), có vai tròchủ chốt trong sự hình thành và hoạt động của ốc tai, một bộ phận quan trọng củatai Các đột biến trên gen GJB2 thường gây KT thần kinh giác quan bam sinh,không tiễn triển và quy định mức khiếm thính từ nhẹ đến nặng Tuy nhiên, dạng KTtiễn triển và có tuôi phát bệnh trễ cũng được mô tả ở các đột biến không thay đôikích thước protein [8] Do tần suất đột biến gây bệnh cao, GJB2 đã được dùng trongxét nghiệm chan đoán va là gen quan trọng đầu tiên cho chan đoán nguyên nhân gâykhiếm thính di truyền Xét nghiệm trên gen GJB2 có thể giải thích 50-80% cáctrường hợp điếc di truyền lặn và 10-37% các trường hợp điếc không rõ nguyên nhân

giữa các tế bào kế cận nhau [10] Đột biến trên gen G/JB3 thường quy định KT ditruyền lặn, liên quan đến độ tuổi, có khuynh hướng xuất hiện ở nam giới nhiều honnữ giới và gây bệnh điếc thần kinh giác quan [11] KT không hội chứng cũng xảy rakhi có dạng đột biến phức hợp giữa một đột biến trên gen GJB2 va một đột biénkhác trên GJB6 xảy ra ở nhiều quan thé nhưng nhiều nhất là ở Hoa Ky [12].

Một họ protein khác đóng góp vai trò quan trọng hệ thống thính giác là

myosin Myosin - la phân tử protein motor giữ vai trò quan trọng trong sự co cơ vàvận động, các protein này bám vào soi actin và sử dụng hoạt động của enzyme

ATPase để tạo năng lượng cần thiết cho vận động Myosin được mã hoá bởi nhiềugen khác nhau trong đó hai gen mã hoá protein myosin chính yếu trong hệ thôngthính giác là MYO7A và MYOI5A Gen MYO7A ở người gồm 49 exons va đượcbiểu hiện ở võng mạc, phối, tinh hoan, thận và lông ốc tai (tế bào lông giữ vai tròchuyền đôi tất cả rung động âm thanh từ tai giữa truyền vào thành các tín hiệu điệnđi dọc theo các dây thần kinh thính giác lên tới não để được xử lý) Đột biến trênMYO7A quy định các dạng khiếm thính bao gồm: KT không hội chứng di truyềnlặn hoặc trên NST thường va hội chứng Usher Đột biến trên MYO7A gây các dạngUsher type 1B và type 2 có thé dẫn đến khiếm thính dạng nặng va sâu Tuy hộichứng Usher gây khiếm thính nhưng hội chứng này thường biểu hiện trễ nên khónhận biết và khó phát hiện được bởi các phương pháp sàng lọc khiếm thính sơ sinhthông thường [13] Gen MYO/5A gồm 66 exon, mã hóa một dạng protein myosin.Đột biến trên gen nay liên quan đến bệnh khiếm thính thần kinh giác quan khônghội chứng, gây điếc bam sinh Sang lọc đột biến trên MYO/5A trong một thời giandài có bước tiến triển rất chậm mặc dù nó được dự đoán là nhân tố quan trọng gâyKT Nguyên nhân là do gen này có nhiều exon với chiều dài lên đến 71kb Các tiếnbộ gần đây của kỹ thuật NGS đã giúp phát hiện nhiều đột biến mới trên gen nàycũng như khăng định tính gây bệnh của nó Băng kỹ thuật NGS và kết hợp xác nhậnlại bang kỹ thuật giải trình tự Sanger, một nghiên cứu trên 1120 bệnh nhân ngườiNhật đã phát hiện các đột biến trên gen \⁄YO154 Các bệnh nhân có đột biến genMYOIS5A đã được phân tích chi tiết đặc điểm lâm sảng, cho kết luận đây là gen điển

hình gây bệnh KT không hội chứng, với tuổi phát bệnh từ 0 - 14 Bốn trẻ em bịkhiếm thính bâm sinh có đột biến dị hợp tử kép mang hai đột biến khác nhau đượccay Ốc tai điện tử đã cho kết quả khả quan, cải thiện được khả năng phân biệt ngônngữ Kết quả nghiên cứu cho thấy cây ốc tai điện tử là hữu ích cho bệnh nhân có độtbiến KT trên gen MYOISA [14].

Các kết quả nghiên cứu trên đã phát hiện các đột biến gây bệnh KT trên cácgen liên quan đến chức năng va cau tạo hệ thống thính lực có tần suất gây bệnh caovà khăng định tiềm năng của xét nghiệm di truyền (XNDT), đặc biệt là kỹ thuậtNGS trong việc xác định nguyên nhân gây bệnh khiếm thính di truyền

1.2 Chương trình tầm soát và xét nghiệm chan đoán khiếm thínhHiện nay, chương trình tầm soát khiếm thính cho trẻ sơ sinh đã trở thành tiêuchuẩn y tế và là chương trình quốc gia ở nhiều nước trên thế giới như Mỹ, NewZealand, Singapore, Trung Quốc Ở Việt Nam, năm 2007 chương trình tầm soátkhiếm thính tại Bệnh viện Phụ sản Quốc tế Sài gòn trên 1412 trẻ sơ sinh bang kythuật do âm ốc tai OAE và đo điện thính giác thân não ABR cho kết quả 0,21% trẻbị khiếm thính Điều tra tam soát ở bệnh viện Hùng Vương năm 2005 có tỷ lệ 0,2%trẻ khiếm thính và 0,4% trẻ có nguy cơ cao [15] Chương trình sàng lọc khiếm thínhcho trẻ sơ sinh chủ yếu dựa trên nghiệm pháp đo âm ốc tai (OAE) vì đây là phươngpháp có giá trị để đánh giá chức năng của ốc tai, dễ thực hiện, không tốn kém,không gây đau cho trẻ và cho kết quả trong thời gian ngắn Trẻ sau khi sinh đượckiểm tra âm 6c tai OAE hai lần nếu báo that bại thì tiếp tục theo dõi bang máy điện

thính giác thân não ABR (auditory brainstem response) Hai nghiệm pháp này là

tiêu chuẩn vàng xác định bệnh lý khiếm thính Tuy nhiên, phương pháp sảng lọcnày cũng bỏ sót một số trường hợp như trẻ bị khiếm thính thần kinh thính giác(neural HL) do ton thương sau ốc tai hoặc kết qua sai lệch do ảnh hưởng của tiếngđộng gây nhiễu, tai trẻ chưa làm sạch nước ối Đối với trẻ nhỏ, xét nghiệm khiếmthính có thể qua các xét nghiệm hành vi khi phản ứng lại với âm thanh và cácnghiệm pháp đo âm khách quan khác [16] Do khiếm thính có thé tiến triển theo

thời gian, các chương trình sàng lọc khiếm thính sơ sinh có thé bỏ qua các trẻ bịkhiếm thính tiến triển Vì vay, sang lọc lặp lại tại các giai đoạn hop lý được khuyến

cáo cho trẻ có nguy cơ.

Các liệu pháp điều trị khiếm thính hiện nay đều dựa trên nguyên nhân gâybệnh và dạng khiếm thính mắc phải vì một khi nguyên nhân gây khiếm thính đượcxác nhận, nó có thể đưa đến các quyết định điều trị và hướng dẫn phòng ngừa hoặctư van di truyền Các trường hợp khiếm thính do tổn thương ống tai hay mat chứcnăng tai giữa do các van dé khi sinh có thé điều trị bang phẫu thuật Các liệu phápthuốc kháng sinh có thể giúp ích trong các trường hợp khiếm thính do nhiễm trùng.Trong khi đó, bệnh nhân khiếm thính mang đột biến GJB2 có kha năng hồi phụcthính giác tốt sau khi được cấy điện cực ốc tai [17] Tuy nhiên các phương phápsàng lọc va chân đoán hiện nay lại bị hạn chế trong việc tìm kiếm căn nguyên gâybệnh Sự hiểu biết ngày càng cải thiện về cơ chế sinh lý bệnh học và phân tử củabệnh khiếm thính và những tiến bộ gần đây của XNDT sẽ thúc đây sự phát triển củacác phương pháp điều trị và chiến lược sang lọc mới [18] Bên cạnh các kỹ thuậtchân đoán khiếm thính như đo âm Ốc tai, điện áp thân não, chân đoán hình ảnh,Hiệp hội Di truyền học Y khoa Hoa Kỳ (American College of Medical Genetics andGenomies, ACMG) đã đưa ra hướng dẫn XNDT khiếm thính nhăm hỗ trợ xác định

nguyên nhân gây bệnh (Hình 1.2).

s _ Tiền sử sinhvà sử dụng thuốc¢ Đánh giảthínhlựce - Tiền sử bệnhcủagia đìnhtrong 3 đời

Ỷ

Nghi ngờ khiếm thính mắc pha? |

Xét nghiệm CMV, chẩn đoán hình änhvà các xét o_ Tư vấn di truyền tiền xét nghiệm và xét nghiệm di truyền dựa trên

nghiệm khác dựatrên nguyên nhân nghi ngờ dấu hiệu lâm sang:

(vd: rubella meningitis.v.v) s Nếu nghingờ HL có hội chứng, xemxét panel mục tiêu

¢ Nếu nghingờ HL không hội chứng, xem xét xét nghiệm đơn gene

| như G1B2 và G1B6, xét nghiệm theo panel gene hoặc NGS dựa

trên lịch sử và các dấu hiệu tìm được

Nguyên nhân gây HL mắc phải được xác nhận? | oO Chẩn đoản hình anh hoặc các xét nghiệm khác phù hợp với chẩn

ảnh dựatrên kết quatim được

vy

Dựa trên kết quaxét nghiệm tim được:* - Điều trinhư chỉ định âm sàng———| * Tư vấn định kỳ, bao gồmtư vấn ditruyền s.

* - Giới thiệutới cácchuyêngia

* Cham sóc, theo dõi định kỳ nếu bệnh nhân cần

Hình 1.2 Hướng dẫn chan đoán nguyên nhân và đánh giá lâm sàng khiếm thính của

ACMG1.3 Giải trình tự thế hệ mới trong xét nghiệm di truyền

Giải trình tự thế hệ mới (next-generation sequencing, NGS) là thuật ngữ môtả phương thức giải trình tự đồng thời và lượng lớn các đoạn ngăn nucleotide(massively parallel sequencing) Kỹ thuật NGS được giới thiệu lần đầu tiên vào

năm 2005, dựa trên phương pháp giải trình tự pyrosequencing bởi 454 Life Science

(Roche) [19] Đến nay NGS đã phát triển trên các nền tảng khác nhau như 454

sequencing, Illumina, SoliD, PacBio sử dụng các nguyên lý khác nhau với những

đặc điểm đặc trưng của quy trình chuẩn bị thư viện DNA, phương thức giải trình tựvà phân tích kết quả Nền tảng 454 sequencing dựa theo nguyên lý pyrosequencing,là kỹ thuật giải trình tự dựa vào quá trình tong hợp mach DNA, khi một nucleotideđược gan vào mạch đang phát triển thì một nhóm pyrophosphate được giải phóng,

nhóm pyrophosphate nay tham gia vào phản ứng hóa học để tạo ra tín hiệu ánh sángđèn flash và được đo bởi một detector quang học SoliD là một nền tảng phổ biếnkhác sử dụng nguyên lý nối ligase (sequencing by ligation) Nền tảng này sử dụngcác đoạn mẫu dò gồm 8 nucleotied trong đó có 2 nucleotide ở đầu 3’ được đánh dautheo kiểu bố sung với nhau dé khóa đuôi phát huỳnh quang phía 5’ Sau khi phảnứng nối diễn ra, đuôi phát huỳnh quang được giải phóng bởi phản ứng cắt 3nucleotide cuối tạo ra một màu nhận biết theo bảng mã màu được thiết lập từ đầu.

Phản ứng cứ thế lặp lại với các đoạn bắt cặp khác cho đến hết chiều dài của đoạn

DNA với môi đầu tiên chiều dài n Sau đó bat đầu chu trình mới lần lượt với cácmỗi trên nhưng có chiều dai là n-1, n-2, n-3, n-4 tức là toàn bộ quá trình giải trình tựta sử dụng tất cả là 5 môi: n, n-1, n-2, n-3, n-4 PacBio là nền tảng sử dụng công

nghệ giải trình tự DNA đơn phân tử theo thời gian thực (Single molecule real-time

sequencing, SMRT) SMRT “quan sát” quá trình tổng hợp một chuỗi DNA mới củaDNA polymerase, xác định chính xác nucleotide nào trong 4 loại nu dang được ganvào mạch, và như thế khi đoạn DNA được sao chép xong thì máy cũng xác định

xong trình tự đoạn DNA đó Đó là lý do tai sao nó có tên gọi giải trình tự DNA đơnphân tử theo thời gian thực Nanopore sequencing là phương thức giải trình tự mới

nhất hiện nay dựa trên sự dịch chuyển của DNA qua 16 sinh học (pore), một hệthống gdm a-hemolysin gắn với một exonuclease trên bề mặt ngoài và cảm biếncyclodextrin bên mặt trong, trình tự DNA được đọc dựa trên sự thay đôi dòng điệnhoặc tính hiệu quang học khi DNA dịch chuyển qua pore bị exonuclease cắt đứt

thành các nu riêng rẻ [20].

Mặc dù sự phát triển của kỹ thuật NGS đã mang đến những công nghệ mới,Illumina hiện vẫn dẫn đầu trong công nghệ NGS hiện nay do có kết qua đầu ra caonhất, chỉ phí trên mỗi base thấp nhất và tương thích với hầu hết mọi ứng dụng [21].Illumina giải trình tự dựa trên phương thức tổng hợp (sequencing by synthesis) Mỗithế hệ máy khác nhau sử dụng các chiến lược giải trình tự khác nhau Với hệ máyMiniSeq được sử dung trong đề tài, DNA sẽ được giải trình tự 2 mạch ngược vàxuôi (kỹ thuật paired-end) DNA sẽ phải trải qua quá trình chuẩn bị thư viện, đây là

quá trình xử lý và làm giàu DNA mục tiêu để chuẩn bị cho quá trình giải trình tựtrên may MiniSeq Ở quy trình này, DNA mục tiêu được cắt ngẫu nhiên thành cácđoạn dai ngắn khác nhau, sau đó đoạn DNA được xử lý dé gan adapter ở 2 đầu 5° va3° Sản phẩm sau đó được tỉnh sạch và làm giàu bang PCR, quá trình làm giàu sẽđồng thời gan barcode, trình tự primer P7 (i7) ở đầu 3' và trình tự primer P5 (i5) ởđầu 5° (Hình 1.3) Barcode (Index) là trình tự gồm 8 nucleotide dùng để phân biệt

các mâu khác nhau, primer 1Š và 17 sẽ dùng cho giải trình tự 2 mạch.

== DNA

aja Uracil

4 Barcode (BC)

=== P5 Primermam ~=P7 Primer

Q USER Enzyme

(== NEBNext“=~ Adaptor

Fragmented DNA input >| PCR Enrichment Bc P7

Hình 1.3 Quy trình chuẩn bị thư viện cho giải trình tự NGS

Ở giai đoạn giải trình tự, máy sẽ thực hiện tiễn trình tạo các cluster dựa trênnguyên lý của PCR Với tiến trình này, những chu kỳ lặp lại sẽ tạo ra hang triệucluster, mỗi cluster chứa hàng nghìn bản sao của một đoạn DNA trên một đơn vị cóđường kính 1 pm Tiến trình giải trình tự được bắt đầu sau đó dựa trên nguyên lýtong hợp 4 loại deoxyribonucleotide triphosphates (A, C, G, T) gắn màu huỳnhquang vào mạch khuôn nhờ enzyme xúc tác DNA polymerase Tại mỗi chu kỳ, tín

hiệu huỳnh quang phát ra khi có một nucleotide gắn vào đầu 3’OH của chuỗinucleotide dang được tong hop được máy chụp ảnh và ghi nhận lại kết quả (Hình1.4) Mỗi đoạn trình tự nucleotide được giải tạo ra một chuỗi ký tự 150 bp gọi là

một read Kỹ thuật giải trình tự pair-end sẽ đọc trình tự mạch xuôi trước tạo thành

các read đầu tiên, sau đó sẽ đọc trình tự mạch ngược để tạo read thứ hai Các read sẽđược sắp xếp gióng cột trên trình tự gen tham chiếu chuẩn để gọi biến thể nhờ vào

các công cụ tin sinh học.

apply to flowcellattach adapters to

create sequencing library |

cluster generation by

solid phase PCR

(bridge amplification)

LUB

sequencing by synthesis with reversible terminators

Hình 1.4 Tiến trình giải trình theo nguyên ly tổng hợp trên máy Illumina

Với dữ liệu đầu ra cao nhờ chiến lược giải đồng thời lượng lớn trình tu, giảitrình tự NGS có thể giải 1 GB bp trong vòng 0,5 ngày trong khi Sanger phải mất

500 ngày cho khối lượng tương tự Chi phí cũng giảm xuống đáng kể, thấp hơn đến100 lần Hơn nữa, do một nucleotide được đọc hơn 30 lần thậm chí hàng trăm lần vìvậy tăng độ chính xác lên rất nhiều lần [22].

Hiện nay có ba phương án tiếp cận chính trong nghiên cứu bệnh di truyền sửdụng kỹ thuật NGS gồm giải toàn bộ bộ gen (whole genome sequencing, WGS),

giải toàn bộ exon (whole-exome sequencing, WES), và giải các nhóm gen mục tiêu

(targeted sequencing) WGS đòi hỏi phân tích ~3.2x10” bp của hệ gen WES cũng

đòi hỏi phân tích 1% con số này Với các ứng dụng trong phân tích bệnh di truyền,chiến lược giải trình tự mục tiêu góp phần giảm được số lượng gen phân tích, giảmdung lượng, giá thành và nhanh chóng hơn so với chiến lược WGS hay WES màvan đảm bảo phát hiện các đột biến trên các gen liên quan đến bệnh Trong nghiêncứu XNDT bệnh khiếm thính, một số nhóm nghiên cứu đã thực hiện chiến lược giảigen mục tiêu với các phố gen khác nhau Để đánh giá hiệu quả của giải trình tựnhóm gen mục tiêu cho bệnh nhân mac KT không hội chứng 63 bệnh nhân khôngmang đột biến trên gen GJB2, MT-RNRI, và SLC26A4 được tuyén chon dé gialtrình tự 131 gen Kết qua đã phát hiện 14 đột biến gây bệnh trên gen STRC,

CATSPER2, USH2A, TRIOBP, MYO15A, GPR96, và TMPRSS3 ở 8 bệnh nhân Một

nghiên cứu giải trình tự NGS 49 gen quy định thính lực trên 1119 trường hợp mắcbệnh điếc, đã phát hiện các đột biến có tần suất cao nhất gây bệnh suy giảm thính

lực thuộc các gen GJB2, STRC, SLC26A4, TECTA, MYOI5A, MYO7A, USH2A,

CDH23, GPR96, TMC] Trong đó, đột biến trên gen GJB2 chiém tan s6 cao nhat,xuất hiện trên 95 bệnh nhân trên tong s6 440 bénh nhan mang dot bién, chiém ty lệ21,6% [23] Các nghiên cứu trên cho thay tiém năng của giải trình tự gen mục tiêutrong việc tìm đột bién gây bệnh KT di truyén

1.4 Giá trị và hạn chế của xét nghiệm di truyền khiếm thínhSuy giảm thính lực gây ảnh hưởng lớn đến sức khỏe, tâm lý cũng như sự pháttriển thé chất và hoạt động của người bệnh Trẻ khiếm thính thường chậm nói hoặckhông nói được, từ đó dẫn đến chậm phát triển ngôn ngữ va gây khó khăn cho việc

học tập Do đó việc tầm soát sớm bệnh để có phương pháp điều trị thích hợp vàkiểm tra thân nhân trong gia đình bệnh nhân nhằm theo dõi, phát hiện các trườnghợp tiếp theo là van dé cần thiết nhằm giảm ảnh hưởng của khiếm thính lên sự phát

triên của trẻ, cải thiện các kêt quả ngôn ngữ và giáo dục.

Phát hiện sớm khiếm thính và nguyên nhân gây bệnh có thé hỗ trợ đưa ra cácbiện pháp điều trị và quản lý bệnh như phẫu thuật các bộ phận bat thường, sử dụngthuốc kháng khuẩn đối với các trường hợp nhiễm trùng trước và sau sinh, sử dụngcác công cụ hỗ trợ nghe như máy trợ thính hay cấy ốc tai điện tử Đối với nhữngngười bị khiếm thính nặng hay điếc hoàn toàn, phát hiện sớm bệnh giúp họ có cơ

hội học ngôn ngữ ký hiệu và các phương tiện ho trợ giáo dục và xã hội khác.

Tổn thương thính giác có thé xay ra Ở tất cả các bộ phan cua tai; việc mat chứcnăng của tai ngoài hoặc tai giữa (conductive HL) nói chung có thé diéu trị bangthuốc hoặc phẫu thuật Tuy nhiên, 90% trường hợp khiếm thính gây ra bởi sự mấtchức năng hay ton thương tai trong Hiện tại, máy trợ thính hiện đại có thể bù dapcho hau hết các ton thương của tai trong Tuy nhiên, đối với trẻ khiếm thính sâu saukhi đeo máy trợ thính không hiệu quả thì sẽ tiếp tục được cây điện cực Ốc tai Việcchữa trị như vậy sẽ mat thời gian và tốn kém hơn Biết chính xác nguyên nhân gâykhiếm thính do sai hỏng gen đóng vai trò quan trọng trong việc lựa chọn phươngpháp điều trị phù hợp cho bệnh nhân

Các kết quả xét nghiệm di truyền hỗ trợ chân đoán nguyên nhân gây bệnhkhiếm thính bố sung cho các trường hợp bệnh nhân ma trước đây kỹ thuật như chânđoán hình ảnh hay dùng máy đo khả năng nhận biết âm thanh không phát hiệnđược Hơn nữa, việc biết được nguyên nhân chính xác gây khiếm thính còn cungcấp thông tin điều trị khiếm thính hiệu quả hơn Kết quả điều trị khiếm thính chobệnh nhân mang đột biến G782 cho thay khả năng hồi phục thính giác tốt sau khiđược cây điện cực ốc tai [17] Giai đoạn trẻ từ 1 — 3 tuôi là tốt nhất dé thực hiện câyđiện cực ốc tai, vì thời gian này trẻ phát triển tốt về ngôn ngữ Do đó, xác định độtbiến gen GJB2 ở bệnh nhân khiếm thính là một yếu tô dự báo hữu ích cung cấp

thông tin quan trọng cho việc tư vân di truyên và cây điện cực ôc tai Đôi với nhữngngười được chân đoán mac hội chứng Usher, các biện pháp như bảo vệ trước anhnăng mặt trời, bô sung vitamin có thê được thực hiện dé giảm toc độ tiên triên củaviêm võng mạc sac to.

Xét nghiệm di truyền khiếm thính không chỉ hữu ích cho bản thân người bệnhmà còn có giá trị cho các thành viên trong gia đình Khi nguyên nhân di truyền củabệnh khiếm thính được xác định, đây sẽ là thông tin hữu ích cho tư van viên ditruyền tiên lượng, đánh giá nguy co phát sinh bệnh cho các thành viên trong giađình, hỗ trợ rất nhiều cho việc quản lý bệnh, tư van tiền hôn nhân và tư vẫn tiền

sinh.

Xét nghiệm DNA cho bệnh khiếm thính di truyền có rất nhiều thách thức khisố lượng gen chịu trách nhiệm cho hệ thính giác rất lớn trong khi chỉ có một vàimanh mối chân đoán dựa trên kiểu hình Từ năm 1998 đến 2010, các phòng thínghiệm chan đoán ở các quốc gia khác nhau phân tích chỉ một vài gen điển hình chobệnh khiếm thính bao gồm gen có tan suất đột biến cao như GJB2 do hạn chế củacác kỹ thuật XNDT ở thời điểm hiện tại Kỹ thuật microarray có kha năng phát hiệnđược số lượng đột biến lớn nhưng phụ thuộc vào kiến thức về gen của các nghiêncứu trước Kỹ thuật Sanger chi cho phép giải vài trăm nucleotide trong mỗi lần chạydo đó chi phí cho việc giải trình tự gen có kích thước rất cao Sự phát triển của kỹthuật NGS đã giải quyết các vẫn đề trên nhờ khả năng cho dữ liệu đầu ra lớn, thờigian phân tích dữ liệu nhanh và chi phí thấp hơn so với các phương pháp thông

thường trên cùng một lượng dữ liệu.

Tuy nhiên, một trong những thách thức lớn nhất của XNDT nhiều gen băng kỹthuật NGS là diễn giải số lượng lớn các biến thể Biến thể phát hiện có thể không cókết quả rõ ràng là gây bệnh hay lành tính Vì vậy, các xét nghiệm nảy cần sự diễngiải rất cân thận kết quả xét nghiệm va cần có sự kết hợp liên ngành giữa cácchuyên gia bao gồm chuyên gia di truyền học, chuyên gia tin sinh học, bác sĩ cũngnhư các nhà tư vấn viên di truyền để bệnh nhân hiểu rõ hơn kết quả xét nghiệm của

mình [4].

1.5 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

Trong nghiên cứu XNDT bệnh khiếm thính, một số nhóm nghiên cứu đã thựchiện chiến lược giải gen mục tiêu voc các panel gen khác nhau Năm 2016, mộtnghiên cứu xem xét 160 gia đình dự đoán dựa trên sơ đồ phả hệ là mac bệnh khiếmthính di truyền theo đột biến lặn trên NST thường (ARNSD) nhưng không do độtbiến trên gen GJB2 quy định Kết quả cho thấy đột biến gây ARNSD trong 90(56%) gia đình, các đột biến xác định được nằm trên 31 genes trong đó các gen cótỷ lệ đột biến phát hiện được trong các gia đình nhiều nhất là ÄAZYO/5%⁄4 (13%),

MYO7A (11%), SLC2644 (10%), TMPRSS3 (9%), TMCT (8%), ILDRI (6%) và

CDH23 (4%) [24] Một nghiên cứu giải NGS số lượng gen lớn hon với 109 genmục tiêu trên 29 gia đình bị khiếm thính nặng đến sâu với thời điểm phát sinh bệnhlà bam sinh và trước tuổi biết nói, kết qua phát hiện 21/29 gia đình có đột biến gâybệnh Ba đột biến khác nhau trên gen GJB2 hiện diện trong 7 gia đình, chiễm ty lệ24.13% 14 gia đình còn lại có đột biến trên các gen quy định KT không hội chứngbao gồm MYO7A (4/29 gia đình, chiếm ty lệ 13,8%), TMC/ (2/29 gia đình, chiếm tylệ 6,9%) các gen còn lại gồm A⁄YO15A, MARVELD2, TMIE, DFNB31, LOXHDI,GPSM2, USHIG, CDH23 mỗi gen đều có đột bién phát hiện trong 1 gia đình,chiếm tỷ lệ 3,4% Nghiên cứu cũng phát hiện thêm 8 đột biến mới Kết qua đãkhăng định tính hữu ích của phương pháp giải trình tự gen mục tiêu cho bệnh KT

không hội chứng [25].

Tại Việt Nam, khiếm thính di truyền cũng đã được quan tâm nghiên cứu Mộtnghiên cứu giải trình tự Sanger gen GJB2, GJB6 và DNA ty thé 12S rRNA trên 76trẻ khiếm thính bam sinh, kết quả phát hiện đột biến gây bệnh c.235delC trên genGJB2 ở 3 bệnh nhân và không có đột biến gây bệnh nào được tìm thấy trên genGJB6 và 12S rRNA [26] Năm 2018, 250 trẻ khiếm thính và 250 trẻ bình thường

trong khu vực Hà Nội được nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật DNA microarray và giải

trình tự NGS trên kết quả phát hiện 16 trường hợp mang đột biến gen (tỉ lệ 6,4%)với 9 loại đột bién phố biến tại 4 gen GJB2, SLC26A4 và 12S rARN lần lượt với tỷlệ 4.4% (11/250), 1,2% (3/250), 0,8% (2/250) khi sàng lọc lần đầu tiên với kỹ thuật

microarray 30 trường hop được chon loc dé giải trình tự NGS trên 18 gen, kết quaphát hiện thêm 1 đột biến trên gen TMCI, 2 đột biến trên gen MT-TH và 2 đột biếntrên gen MT-TL] [26] Các nghiên cứu này cung cấp thông tin hữu ich trong nghiêncứu bệnh di truyền ở mức độ phân tử của trẻ khiếm thính tại Việt Nam.

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứuĐề tài được thực hiện tại Công ty TNHH Công nghệ Sinh học Khoa Thương.Thời gian thực hiện dé tài: 13/08/2018 — 02/12/2018

2.2 Vật liệu — hóa chất2.2.1 Mẫu thực nghiệm

Vật liệu sinh học được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm:

e DNA mẫu chuẩn âm (NA12878, Viện Coriell — Mỹ) và DNA mẫu chuẩn

dương (NA23835, Viện Coriell — Mỹ).

e Mẫu máu toản phần của người không mắc bệnh khiếm thính được lưu trữ

tại Công ty CNSH Khoa Thương.

2.2.2 Hóa chất-vật tư tiêu haoHóa chất tách chiết DNA

e Bộ kit thu DNA từ máu: QIAamp DNA Blood Mini Kit (Cat no 51104)(Qiagen, Duc)

Hoa chat tinh sach DNA

° GeneJet PCR Purification Kit (Thermo Scientific, Mỹ)

Hóa chat chuẩn bị thư viện

e Enzyme polymerase, dNTP và buffer: PrimeSTAR® GXL DNAPolymerase (Cat no R050A) (Takara, Nhật)

e Môi: Các môi thiết kế nhân ban các đoạn trong gen GJB2, GJB3, GJB6,

KCNO4, MYO7A, MYOIS5A va SLC26A4(IDT, Mỹ)

e AMPure XP-PCR Beads (Cat no 63880/63881) (Beckman Coulter, Mỹ)

e DNA 1000 kit (Agilent, Mỹ)

° Qiagen Buffer EB (Cat no 19086) (Qiagen, Đức)

e = Qubit Assay tube (Cat no Q32856) (Invitrogen, Mỹ)e =§=Qubit dsDNA HS Assay Kit (Cat no Q32851) (Invitrogen, Mỹ)e =§=Qubit dsDNA BR Assay Kit (Cat no Q32850) (Invitrogen, Mỹ)

e NEBNext® dsDNA Fragmentase® (Cat no M0348S) (NEB, Mỹ)

e NEBNext® UltraTM I DNA Library Prep Kit for Illumina® (Catno.7645 S/7645 SL) (NEB.,Mỹ)

e NEBNext® Multiplex Oligos for Illumina® (Index Primers Set 1) (Catno E7335S) (NEB, Mỹ)

e NEBNext® Multiplex Oligos for IHumina® (Index Primers Set 2) (Catno E7500S) (NEB, My)

e Ethyl alcohol, Pure (Cat no E7023-500ML) (Sigma-Merck, Mỹ)

° Water for Molecular Biology (Cat no 693520) (Merck, Mỹ)

Hoa chat giai trinh twe Hoa chat giai trinh tu: MiniSeq Mid Output Kit (FC-420-1004)

(lumina, Mỹ)

2.2.3 Thiết bị - dụng cu

e May luân nhiệt: VeritiTM 96-Well Thermal Cycler (Cat no 4375786)(Applied Biosystem, Mỹ)

e Máy luân nhiệt: SimpliAmpTM Thermal Cycler (Applied Biosystem, Mỹ)

e May Bloanalyzer 2100 (Cat no G2939BA) (Agilent, Mỹ)

° Qubit® 3.0 Fluorometer (Cat no Q33216) (Invitrogen, Mỹ)

° Magnetic stand-96 (Cat no AM10027) (ThermoFisher Scientific, Mỹ)

e May vortex chip (Cat no 3617036) UKA, Mỹ)

e MiniSeq System (Cat no SY-420-1001) (Illumina, Mỹ)

e Z 233 M-2 Microlitre Centrifuge (Hermle LaborTechnik GmbH, Đức)

e Vortex Shaker

e Dry heat block

2.3 So đồ nghiên cứu tong quátMục tiêu của dé tai là xây dựng quy trình phát hiện các đột biến trên 7 gen

GJB2, GJB3, GJB6, KCNQ4, MYO7A, MYOI5A và SLC26A4 gây bệnh KT di

truyén bang ky thuat giai trinh tr DNA thé hệ mới Để lựa chọn gen mục tiêu,chúng tôi đã thực hiện thống kê các gen năm trong các gói xét nghiệm của 13 trungtâm XNDT lớn trên thế giới và các gen được lựa chon là gen luôn được bao gồmtrong gói xét nghiệm của 13 trung tâm nảy Trong nghiên cứu nay, hệ môi dùng chophản ứng long-range PCR nhân bản các gen mục tiêu được thiết kế Sau đó, các mixphản ứng long-range PCR được thiết lập để tối ưu nhiệt độ lai cho tùng cặp mỗi sửdụng Các sản phẩm sau PCR được giải trình tự Sanger để xác nhận đã nhân bảnđúng trình tự mục tiêu Sau khi tối ưu thành công phản ứng, trộn các mix và tiếnhành quá trình chuẩn bị thư viện dùng cho giải trình tự Nhằm hướng tới việc pháttriển quy trình dùng cho xét nghiệm trong tương lai, các thông số kỹ thuật đánh giáchất lượng dữ liệu đầu ra của quy trình giải trình tự NGS được thiết lập Sau đó,chúng tôi phân tích kết quả quy trình phát hiện biến thể đã xây dựng để tìm các biếnthể trên mẫu DNA chuẩn dương, là mẫu bệnh nhân mang đột biến gây bệnh, mẫuchuẩn âm không mang đột bién gây bệnh và mẫu máu toàn phan của người bìnhthường âm tính với khiếm thính Công trình nghiên cứu được thể hiện qua sơ đồ

sau:

Thiết kế hệ mỗi nhân bản 7 gene mục tiêu

GIB2, GJB3, GJB6, KCNQ4, MYO7A,MYOIS5A va SLC26A4

— Tối wu các phan ứng long-range PCR:Thiet lập quy trình giải trình o Tối ưu nhiệt độ lai

tư NGS f o Giải trình tự Sanger xác nhận nhân

bản thành công sản phẩm mục tiêuChuẩn bị thư viện

Giải trình tự DNA thế hệ mới

= — — Tỷ lệ sắp xếp gióng cột

Xác định các thông số kỹ — Độ phủthuật đánh giá chất lượng dữ »— — — Điểm chat luong

liệu giải trình tự — Tỷ lệ duplicate

_ — Insert size

— Tìm biến thé bang phần mềmGenelous & phân loại biến thé

dựa trên cơ sở dữ liệu ClinVar,

Phân tích kết quả quy trình :

phat hién bién thé trén mau —- 1000 Genome, công cụ Varsome

Ậ Rk A , à phan mềm Alamutchuẩn và mẫu âm tính vap „

— Giải trình tự Sanger xác nhận các

đột biến gây bệnh tìm được nếu~ đột biến có độ phủ < 100X

2.4 Bồ trí thí nghiệmĐề xây dựng quy trình phát hiện các đột biến gây bệnh KT di truyền, đầu tiênchúng tôi tiến hành thiết lập quy trình giải trình tự NGS và sau đó xác định cácthông số kỹ thuật đánh giá chất lượng dữ liệu giải trình tự Quy trình giải trình tựNGS được thiết lập bao gồm các bước thiết kế hệ mỗi long-range nhân bản vùnggen mục tiêu, tối ưu phản ứng long-range PCR, chuẩn bị thư viện và giải trình tựDNA thế hệ mới Sau khi xác định các thông số kỹ thuật đánh giá chất lượng dữliệu giải trình tự, chúng tôi tiến hành phân tích kết quả quy trình phát hiện biến thể

trên mâu chuân dương, mâu chuân âm và mâu âm tính với bệnh khiêm thính.

2.4.1 Thiết lập quy trình giải trình tự NGS2.4.1.1 Thiết kế hệ môi long-range nhân ban vùng gen mục tiêuHệ mỗi dùng cho phản ứng nhân bản vùng gen mục tiêu được thiết kế bangcông cụ Primer Blast, NCBI Hệ môi thiết kế bao phủ tất cả các exon của gen, cach

vùng thượng nguôn va hạ nguồn của gen 100 bp để có thé hạn chế ảnh hưởng củachất lượng giải trình tự xấu ở các nucleotide đầu tiên của read [27] Các thông sốcủa môi phải đạt các tiêu chí cho bộ môi dùng trong phản ứng long-range PCR: Môiđặc hiệu cho vùng gen thiết kế, không năm trên vùng trình tự lặp và trên gen giả(pseudogene), môi thiết kế không chứa 4 nucleotide liên tiếp của cùng một loại base

và trình tự lặp 2 nucleotide (ví dụ, ACCCC hoặc ATATATAT), không chứa SNP ở

3 nucleotide đầu 3’, môi có kích thước từ 18-25 bp, phần tram GC 35 — 65%, Tm60-68°C Tm của mỗi ngược và mỗi xuôi không chênh lệch quá 2°C Delta G củacác thông số self-dimers, hairpins, và heterodimers bé hơn —9.0 kcal/mole [28] [29]

2.4.1.2 Tối ưu phản ứng long-range PCRKiểm tra thực nghiệm hiệu quả hoạt động của các cặp mỗi đã thiết kế Đầutiên mỗi được kiểm tra thử ở một nhiệt độ lai phù hợp nhất với Tm dự đoán của tấtcả cặp môi đã thiết kế, thí nghiệm thực hiện lặp lại 3 lần Các môi hoạt động ở nhiệtđộ lai này sẽ được sử dụng cho phản ứng long-range Các môi không hoạt động sẽđược tiếp tục khảo sát trên một dãy nhiệt độ lai cách Tm khoảng + 5 °C, mỗi đơn vịkhảo sát cách 2°C, từ đó chọn ra nhiệt độ lai tối ưu cho các cặp mỗi sao cho số nhiệtđộ lai dùng trong một lần long-range là thấp nhất

Do enzyme sử dụng là Takara GXL, một enzyme thương mại đã tối ưu trướcnông độ MgCh, dNTP, nồng độ môi, nông độ enzyme nên các thành phần trên sẽkhông được khảo sát trong quá trình tối ưu phản ứng long-range

Lựa chọn nhiệt độ lai tối ưu cho các cặp mỗi va chạy phản ứng long-range lặplại trên 3 mẫu khác nhau gồm mẫu chuẩn âm, mẫu chuẩn dương và mẫu của ngườikhông mắc bệnh khiếm thính Các mẫu sau khi chạy long-range PCR được dùng dé

tiên hành chuân bị thư viện.

2.4.1.3 Chuẩn bị thư việnSản phẩm long-range PCR của mỗi mẫu được trộn lại, mỗi mix lay thé tich 10ul, tinh sạch DNA va do OD Sản phẩm dat chất lượng là sản phẩm có nồng độ >16

ng va tỷ số đo OD 260/280 nm nam trong khoảng 1,6 - 2,2, [30] Mẫu sau tinh sạch

được sử dụng đê chuân bị thư viện.Thư viện dùng cho phan ứng giải trình tự vung gen mục tiêu (targeted-

sequencing) được xây dựng băng nhiều phương án khác nhau, tuy nhiên dựa trênđặc tính của dòng máy MiniSeq, thư viện thu được cuối cùng trước khi biến tínhphải thỏa các thông số theo Bảng 2.1

Bảng 2.1 Thông số đánh giá hiệu quả chuẩn bị thư viện

Thông số Khoảng chấp nhận PP đánh giáNông độ > 10 nM BioAnalyzer DNA 1000

Kích thước thư viện 300 — 600 bp BioAnalyzer DNA 1000

2.4.1.4 Giải trình tự DNA thé hệ mớiBiến tính thư viện và pha loãng về nông độ chạy máy giải trình tự Khi việcgiải trình tự hoàn tất, hệ máy giải trình tự sẽ tính toán và cho biết chất lượng củamỗi nucleotide được giải Máy giải trình tự thành công sẽ đạt các thông số theo

Bảng 2.2

Bang 2.2 Thông số đánh giá kết quả chất lượng chạy máy giải trình tự [31] [32]

Thông số Khoảng chấp nhận Công cụ xử lý

Mật độ cluster (k/mm? 160k-220 + 2 SAV

Passing filter > 80% SAVQ30 > 80% SAVWA~YT~%G~%C ~25% SAV

Phân tích các thông số chất lượng của file giải trình tự xuất ra Kết qua phântích các thông số chất lượng là cơ sở để đánh giá hiệu quả toàn bộ quy trình giảitrình tự và phát hiện biến thé

2.4.2 Xác định các thông số kỹ thuật đánh giá chất lượng dữ liệu giải

trình tựDữ liệu giải trình tự đầu ra dat chất lượng cho việc phân tích biến thé khi đạtcác thông số theo Bảng 2.3

Bang 2.3 Thông số đánh giá chất lượng giải trình tự [31] [32]

Thông SỐ Khoảng chấp nhận Công cụ xử lý% Ty lệ sắp xếp gióng cột > 85 Picard

% D6 phu ngang > 30X > 80 QualiMap

D6 phu doc toi thiéu từng virng mục tiêu > 30X GeneiousDiém chat luong > 20 FastQC

Ty lệ trình tự trùng lặp (3%) < 50 PicardInsert size (bp) > 150 Picard

Ty lệ sắp xếp gióng cột: Ty lệ phân trăm số read được map lên trình tự gentham chiếu (reference) trên tổng số read thu được Thông số này cho biết phan trămcác read giải được sắp xếp đúng trình tự mục tiêu Tỷ lệ sắp xếp gióng cột tối thiểucần đạt là trên 85%

Độ phủ (coverage): Tại mỗi vi trí nucleotide của các trình tự gen tham chiếu,sẽ có nhiều read được sắp xếp gióng cột tạo nên độ phủ doc (depth of coverage), độphủ 1X tương ứng với một read được sắp xếp gióng cột Độ phủ ngang (Breadth ofcoverage) mô tả số read trung bình được sắp xếp gióng cột vảo các vùng gen mụctiêu (Hình 2.1) Độ phủ 1a thông số quan trong đảm bảo độ chính xác của base đượcđọc Độ phủ càng cao, trình tự được đọc lặp lại càng nhiều lần Đối với quy trìnhphát hiện biến thể bằng NGS, phần trăm độ phủ ngang lớn hơn 30X phải đạt trên80% và độ phủ dọc tối thiểu từng vùng mục tiêu phải đạt trên 30X [33]

CS Ga Độ phủ dọc

Độ phủ ngang

Hình 2.1 Độ phú dọc và độ phủ ngangĐiểm chất lượng (Phred Quality Score): Điểm chất lượng cho biết độ chínhxác của trình tự đọc được bởi máy giải trình tự DNA thế hệ mới Tương quan giữađiểm chất lượng và sự chính xác của base đọc được được thể hiện trong Bảng 2.4.Điểm chất lượng đạt yêu cầu khi phan trăm nucleotide đạt Q30 lớn hơn 80%

Bảng 2.4 Điểm chất lượng và độ chính xác của base đọc được [34]

Điểm chat lượng (Phred Độ chính xác củaXác suât base doc saiQuality Score) base đọc được10 1 trên 10 90%20 1 trén 100 99%30 1 trén 1000 99,90%40 1 trên 10,000 99,99%50 1 trén 100,000 100,00%60 1 trén 1,000,000 100,00%

Insert Size: Insert Size là chiều dai đoạn trình tự giữa 2 adapter Thư viện cuốicùng nên có insert size trung bình ~250-300 dé phù hợp với đoạn read dai 2x150bpcủa giải trình tự paired end trên hệ thống MiniSeq [35]

Ty lệ trình tự trùng lặp (duplicate rate): Trong một thư viện đa dang, hầu hếtcác trình tự khác nhau chỉ xuất hiện một lần trong kết quả cuối cùng Ty lệ trình tựtrùng lặp thấp có thé thé hiện độ phủ cao của trình tự mục tiêu Tỷ lệ trình tự trùnglặp cao thé hiện khả năng trình tự gặp van dé không cân bằng của quá trình làm giàuthư viện, hoặc do lỗi của quá trình giải trình tự khi nhiều bản sao của cùng một readđược tạo ra và giải trình tự Ty lệ trình tự trùng lặp đạt yêu cầu khi thấp hơn 50%

[32].

2.4.3 Phân tích kết quả quy trình phát hiện biến thể trên mẫu chuẩn và

mầu âm tính

Sau khi xác định các thông số đánh giá chất lượng giải trình tự NGS, chúng tôitiến hành phân tích kết quả tìm biến thé gây bệnh khiếm thính Việc phân tích kếtqua được thực hiện trên các mẫu đã được dùng để xây dựng quy trình bao gồm 1mẫu mẫu âm tính với bệnh khiếm thính và 2 mẫu DNA chuẩn gồm một mẫu chuẩndương đã biết trước mang hai đột biến gây bệnh khiếm thính (NA23835, ViệnCoriell — Mỹ) và một mẫu chuẩn âm không chứa đột biến gây bệnh khiếm thính(NA12878, Viện Coriell — Mỹ) Quy trình giải trình tự NGS phát hiện biến thé sauđó được áp dụng thêm trên 3 mẫu âm tính với bệnh khiếm thính để kiểm tra tính

chính xác của quy trình.

Đọc kết quả chất lượng trên các thông số đã thiết lập Sắp xếp gióng cột trìnhtự giải được với trình tự tham chiếu và tìm các biến thể Quy trình đánh giá là thànhcông khi các thông số đạt tiêu chí đã đặt ra, phát hiện được biến thể gây bệnh trênmẫu chuẩn dương đồng thời không xuất hiện trường hợp dương tính giả trên cácmẫu chuẩn âm và mẫu người bình thường không mắc bệnh khiếm thính

2.5 Phương pháp nghiên cứu

2.5.1 Thiết kế hệ môi dùng cho phản ứng long-range PCRCác cặp mỗi được thiết kế sử dụng công cụ Primer Blast của Variation viewerphiên bản tham chiếu GRCh38.p7 được hién thị đầy đủ các tính năng dbSNP, STS

Nguyên tắc: Mẫu máu chứa tế bào bạch cầu được ly giải bằng dung dịchđệm ly giải có chứa các muối, hóa chất biến tính và chất tây để giải phóng DNA rakhỏi tế bao Sau đó dịch nồi sạch được trộn với dung dịch đệm gan cột dé tạo cácđiều kiện tối ưu cho sự liên kết của DNA và màng silica Tiếp đó dung dich chứaDNA được kéo qua cột bang lực li tâm, chỉ có DNA được giữ trên màng Màng tiếptục được rửa với các dung dịch đệm khác nhau để loại bỏ hết các tạp chất DNAđược tách khỏi màng và thu nhận trong các dung dịch có nồng độ muối thấp và sẵnsàng được sử dụng cho can phản ứng tiếp theo [36].

Quy trình tách chiết DNA bộ gen băng phương pháp cột silica:- Hút 20 wl QIAGEN Protease (hay proteinase K) cho xuống day của

eppendorf 1,5 ml

- Bồ sung 200 pl mau_ Bồ sung 200 pl Buffer AL Vortex 15 giây U ở 56°C, 10 phút_ Ly tâm nhẹ dé kéo toan bộ mẫu dính trên nắp xuống

- Bồ sung 200 ul ehtnaol (96-100%) Vortex 15 giây Ly tâm nhẹ để kéotoàn bộ mẫu dính trên nắp xuống

-_ Chuyến toàn bộ phan dịch lên cột Ly tâm vận tốc tối đa (200009), 1 phút.-_ Chuyến cột qua tube 2 ml mới để loại bỏ phan dịch

- Bồ sung 500 pl Buffer AWI lên cột._ Ly tâm 6000g, 1 phút Chuyến cột qua tube 2ml mới dé loại bỏ phần dich- Bồ sung 500 pl Buffer AW2 Ly tâm vận tốc tối đa (200009), 3 phút.- Chuyến cột qua 1 tube 2 ml mới

_ Ly tâm vận tốc tối đa (200009), 1 phút Chuyển cột qua eppendorf 1,5 ml._ Bồ sung 200 pl Buffer AE lên cột

- Ủở nhiệt độ phòng (15-25oC), 1 phút