Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Xây dựng phương pháp PCR Realtime Multiplex nhằm phát hiện DNA các loài heo, bò, gà trong mẫu bột cá dùng làm thức ăn cho thủy sản

Kết quả cho thấy thành phan các loài nayđược định tính một cách chính xác bằng phương pháp PCR realtime multiplex tốiưu với nồng độ MgCl, 3,5 mM, nồng độ mỗi CytbF/R 700nM, nhiệt độ lai

HUYNH DUONG THAO NGUYEN

XAY DUNG PHUONG PHAP PCR REALTIME MULTIPLEX NHAMPHAT HIEN DNA CAC LOAI HEO, BO, GA TRONG MAU BOT CA DUNG

LAM THUC AN CHO THUY SAN

MA SO CHUYEN NGANH: 604280

LUẬN VĂN THAC SĨNGƯỜI HƯỚNG DÂN KHOA HỌCPGS.TS HO HUYNH THUY DUONG

TP HO CHI MINH — 2014

HUYNH DUONG THAO NGUYEN

XAY DUNG PHUONG PHAP PCR REALTIME MULTIPLEX NHAM

LUẬN VĂN THAC SĨNGƯỜI HƯỚNG DÂN KHOA HỌCPGS.TS HO HUYNH THUY DUONG

TP HO CHI MINH — 2014

thành tốt luận văn.Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ThS Phùng Ngoc Thùy Linh, chi đã luôn tận tìnhchỉ dẫn, giúp đỡ và chia sẽ nhiều kinh nghiệm trong suốt quá trình thực hiện luận

van.

Em cũng xin gửi lời cam on đến các anh chị và các bạn thuộc công ty TNHH CNSHKhoa Thương đã luôn cô vũ và tạo điều kiện cho em về cơ sở vật chất, thiết bị kĩthuật dé em thực hiện luận văn

Cùng các thầy cô và bạn bè thuộc chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học- Đại họcBách Khoa Tp HCM đã luôn quan tâm và tận tình hướng dân cho em

Và cuối cùng, con xin cam ơn cha, me đã luôn là chô dựa tinh thân vững chac giúp

con vượt qua moi khó khăn dé hoàn thành luận văn nay

Huynh Duong Thao Nguyén

dụng để xác định loài heo, bò, gà trong hỗn hợp bột cá dùng làm nguyên liệu cho

thức ăn thủy sản Bột thịt, xương của các loài heo, bò, gà được pha trộn ở các tỉ lệ

0,01%, 0,1%, 1%, 10% và 25% (w/w) Kết quả cho thấy thành phan các loài nayđược định tính một cách chính xác bằng phương pháp PCR realtime multiplex tốiưu với nồng độ MgCl, 3,5 mM, nồng độ mỗi CytbF/R 700nM, nhiệt độ lai 64°C.Độ nhạy của quy trình đạt được khi tỉ lệ mẫu bột thịt, xương các loài heo, bò, gà lầnlượt là 0,1% khối lượng của từng loài trên tong khối lượng thức ăn Từ nghiên cứunày cho thay, sử dụng phương pháp PCR realtime muliplex dé xác định loài tronghỗn hợp bột cá thô cho kết quả nhanh và chính xác, đây cũng là một phương pháp

kiêm soát hiệu quả các mâu bột cá thô có mặt trên thị trường.

chicken species was used to detect material origin in producing food powder foraquiculture Meat and bone powders of pork, beef and chicken were mixed inproportions of 0.01%, 0.1%, 1%, 10% and 25% (w/w) The multiplex realtimePCR system was optimized with 3,5mM MgCl,, 700nM CytbF/R primers and 64oCoptimal annealing temperature The system could identify and quantify probablematerial sources of aquafood The diagnostic sensitivity was determined about 0.1%weight of material originated from pork, beef or chicken in total aquafood Themultiplex realtime PCR method using in this study showed accurately and quickly.Thus, it allows controlling efficiently the components of aquafood on the market.

MỤC LỤC

DANH MỤC CHU VIET TAT ĩc E195 9133k SE cv ske iDANH MỤC BANG BIÊUU -.- G - C11562 S1 123191 91 11111 H1 2 ng vn iiDANH MỤC HINH ẢNH - G6 1S S51 95 91 919151111 1T ng nh ng rệt iii00790880.i9557.100177 |1.1 Tinh cấp thiết của dé tài cà k1 1212121111121 1111 1111111010101 2

1.2 Mục tiêu nghiÊn CỨU GĂ c c c9 ng 3

PHAN 2: TONG QUAN TÀI LIEU 2G 26 E2 E983 E28 SE£Esvx sevei 42.1 Vai trị của thức ăn đối với thủy sản ¿+25 2e2ecececcererreeeee 52.1.1 Nguồn thức ăn cho thủy sản - +2 5222 5222 £££EeEeeeveeerrserrered 52.1.2 Thành phan dinh dưỡng trong thức ăn thủy sản - -5- 6

2.1.2.1 Vai trị của protein Va AXit ạmITI -s <5 <3 vke 62.1.2.2 Vai trị CỦa VIfamin vn nh 9

2.1.2.3 Vai trị của chất khống c.ccccccccsesescssscsesescesseseseseseesscsesesesess 10

2.1.2.4 Vai trị Của ÏIDIC c1 HH nh 12

2.1.2.5 Vai trị của tinh bột và chất XƠ ¿- 6s skx vs sEsekseeea 12

2.1.3 Hiện trạng chăn nuơi thủy sản ở nước fa - «<< s*s<*2 132.2 Các phương pháp phat hiện các lồi Heo, Bị, Ga << <2 152.2.1 Phuong pháp ELISAA - - -G ch g 152.2.2 Phương pháp PCR multiplex điện di -. - «<< << << <<<<<2 152.2.3 Phuong pháp PCR Realtime mulfIplex - - << «<< << << <<<<<2 18

PHAN 3: NGUYEN VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

3.I Nguyên lIỆU SH ng và 24

3.1.1 Hóa chất c1 1 S151 12111111 1111111 51111101110 1011111 re 243.1.2 Dụng cụ - Thiết bị - ccc S1 123 3 1E 111112111 111101011 11111 re 243.2 Các phương pháp tách chiết thu gDNA -¿ 2 2 5< c2ccccesee: 253.2.1 Tach chiết thu gDNA bang cột Solgent (theo protocol của Solgent) 253.2.2 Tach chiết thu gDNA bằng cột Khoa Thương (theo protocol của Khoa

3.2.3 Tach chiết tủa thu gDNA theo protocol Khoa Thuong 273.2.4 Tách chiết thu gDNA dùng proteinase K + tách chiết tủa (theo protocol

của Khoa Thương) - - - cv Họ ng 283.3 Phương pháp PCR Realtime multiplex 5s s3 30

3.3.1 Thiết kế primer/probe ¿ ¿5c S2 t3 3212121 1 2E Errrrerred 30Yêu cau việc thiết kế priimerr - +: + S252 2 E+E+E2E£E£EEEE SE E82 ErErvrrrrrrred 30

3.3.1.1 Yêu cầu việc thiết kế probe - ¿+ 2 2s cs£+£+x+Ezecsreeered 30PC ng ố ẻ -1I 313.3.2 Phương pháp chuẩn bị mẫu thức ăn thủy sản -. - 5-55: 313.3.4 Tối ưu phản ứng PCR Realtime multiplex - 2 2 555552 33

3.3.4.1 Khao sát phan ứng PCR Realtime monoplex 333.3.4.2 Khao sát phan ung PCR Realtime multiplex - 36

4.1.1 Độ đăc hiệu lý thuyết của primer và probe các loài Heo, Bò, Gà 39

4.1.2 Kiểm tra sản phẩm nhân bản của phản ứng PCR Realtime 44

4.1.3 Sản phẩm của phan ứng PCR đặc hid : 5-5 555 5< << 552 494.1.4 Khảo sát các phương pháp tách chiết gDNA - - 55c: 50AQ Tối ưu quy trình - ¿Sẻ E1 12t 5151 1 115 1 1111 1 11511111 tre 534.2.1 Cac điều kiện tối ưu của phan ứng PCR Realtime monoplex 53

4.2.1.1 Kết quả khảo sát nhiệt độ bắt cặp (Tạ) của primer/probe 53

4.2.1.2 Kết quả khảo sát nồng độ MgCl, của từng cặp primer/probe 55

4.3 Khảo sát các điều kiện tối ưu cho phan ứng multiplex 56

4.3.1 Kết quả khảo sát nhiệt độ bat cặp (T,) của primer/probe 57

4.3.2 Kết quả khảo sát nồng độ MgCl, của từng cặp primer/probe 57

4.3.3 Khảo sát nông độ của cặp primer CytbF/R: -5-5 555cc: 594.3.4 Khảo sát nông độ probe Bos ¿ ¿ cc c3 2x22 2x rrrrrrveg 6044 Danh giá phản ứng PCR Realtime mulfIpÏexX - 55555 <<<<<+ 6144.1 Độ nhạy cua phan ứng PCR Realtime multiplex 62

44.2 Độ đặc hiệu của phan ứngPCR Realtime multiplex 64

4.5 Đánh giá cả quy trÌnh: 2< 5 3 3330000000 0 ke 654.5.1 DO nhạy của quy trÌnh: - - + HH nh 654.5.2 Do đặc hiệu của quy trình: tương tự như ở mục 4.5.2 67

4.6 Kết quả khảo sát các mẫu bột cá trên thị trường: - s55: 67

5.2 Kiến nghị: 5 E21 121 1111 1110111 1 111101011 11111111 rrrệg 71TAI LIEU THAM KHẢO G2 62126821 98 5195 53 9193191 11 91912 g1 g1 se ro 72

PHAN 1:MO DAU

1.1 Tinh cấp thiết của dé tàiNgành chăn nuôi thủy sản là một trong những ngành kinh tế tiềm năng của nước ta,nhưng hiện nay chất lượng thức ăn của ngành nuôi thủy sản vẫn chưa được quan tâmđúng mức Bên cạnh đó, người tiêu dùng vẫn còn bị động trong các thông tin về thànhphân có trong thức ăn và phương pháp để xác định các thành phần đó Việc xác địnhthành công thành phan các loài có trong mẫu thức ăn thủy sản mang ý nghĩa nhất định

cho ngành thủy sản trong nước.

Việc xác định thành phan loài, nguồn gốc đạm trong hỗn hợp thức ăn thủy sản là mộtviệc làm rất can thiết và cấp bách vì những lý do sau [5]:

e Phòng chống các trường hợp lây nhiễm bệnh từ động vật sang người do sử dụngnguồn protein không rõ nguồn gốc Ủy ban cộng đồng Châu Au đã đưa ra quy định vềviệc ghi tên nhãn trên bao bì của thức ăn vật nuôi và yêu cầu cam sử dụng protein củamột số loài động vật như là một biện pháp ngăn ngừa bệnh bò điên (BSE), các bệnhtruyền nhiễm (TSEs) [26]

e Thành phan loài của các nguyên liệu cho thay nguồn gốc đạm trong hỗn hợp thức ănthủy sản, đây là yếu tố quyết định chất lượng thức ăn thủy sản, và do đó trực tiếp quyếtđịnh chất lượng, năng suất, hiệu quả kinh tế của quá trình chăn nuôi thủy sản Trongcác loại nguyền liệu thức ăn cung cấp đạm cho thủy sản, bột cá là nguồn đạm tốt nhấtcho thủy sản, vì ngoài việc cung cấp hàm lượng protein cao, bột cá còn chứa nhiễu loạiacid amin (lysine, methionin), vitamin A và D, khoáng, chất kích thích sinh trưởng tựnhiên cần thiết cho thủy sản Bên cạnh đó, thủy sản có mức hấp thu năng lượng tiêuhóa cao nhất đối với bột cá khiến cho lượng protein thừa trong môi trường nước làthấp nhất Vì vậy, có thể nói nguồn gốc đạm trong thức ăn thủy sản ảnh hưởng giántiếp đến chất lượng môi trường sống, sức chống bệnh của thủy sản Tuy nhiên, giáthành của nguyên liệu bột cá không rẻ, mà nguồn cung cấp cũng dễ biến động và cógiới hạn [5] Do đó, để giảm chi chí sản xuất nhưng van đảm bảo hiệu quả sử dụng

thức ăn cho thủy sản thì nhà sản xuất thường tiến hành phối trộn các nguyên liệu bộtcá, bột thịt, bột xương từ heo, gà, bò theo một tỉ lệ nhất định và được công bỗ thànhmột tiêu chuẩn đánh giá chất lượng sản phẩm Việc công bố đúng tỉ lệ, thành phầnnguồn gốc của các nguyên liệu thô dùng dé chế biến thức ăn thủy sản là một hành độngthé hiện trách nhiệm cao của nha sản xuất có uy tín kinh doanh vững bên, giúp chongười chăn nuôi có thé lựa chọn những sản phẩm thức ăn thủy sản phù hợp với yêu cầu

nuôi thủy sản của mình.Do những lý do trên, Công ty TNHH CNSH Khoa Thương đã thực hiện nghiên cứuxác định các loài Heo, Bò, Ga trong mâu bột cá tạp từ nguôn nguyên liệu dau vào.1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu của chúng tôi là xây dựng phương pháp PCR realtime multiplex nhằm phát

hiện DNA các loài heo, bò, gà trong mẫu bột cá dùng làm thức ăn cho thủy sản

PHAN 2:

TỎNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Vai trò của thức ăn đối với thủy san2.1.1 Nguồn thức ăn cho thủy sản

Thức ăn là vật chất dinh dưỡng mà động vật có thé ăn, tiêu hóa và hấp thu để duy trì sựsống và tích lũy trong các mô cơ thé [1]

Các loại thức ăn mà thủy sản có thể sử dụng:

— Thức ăn tự nhiên: như các loại rong tảo, sinh vật phù du, các loại động vật chưa

qua chế biến như tôm cá tạp, Ốc, cua.— Thức ăn tự chế: thức ăn do người nuôi tự phối trộn với nguồn nguyên liệu sẵn cóvới quy trình đơn giản Loại thức ăn này thường ở dạng 4m và sử dụng ngay sau khichế biến

— Thức ăn công nghiệp: thường ở dạng viên, được chia làm thức ăn viên chìm sửdụng chủ yêu nuôi giáp xác và thức ăn nôi sử dụng nuôi cá.

2.1.2 Thành phần dinh dưỡng trong thức ăn thủy sản

2.1.1.2 Vai trò cua protein và axit amin

Protein:

Nhu cầu protein cho tăng trưởng ở cá cao hơn động vật có vú 4 lần, gà 2 lần và phụ

thuộc vào [1]:

- _ Loài cá: ví dụ cá rô phi lớn nhanh hơn hai lần so với cá mè hoa

- Tinh biệt: ví dụ cá chép cái lớn nhanh hơn cá chép đực.

- Tudi và khối lượng cơ thể: nhu cầu protein tính cho một đơn vị khói lượng cơ thể ở

con vật non lớn hơn con vật trưởng thành Thí nghiệm cho thay ở giai đoạn ca bộtnhu cau protein là cao nhất khâu phan đạt 50%, sau đó giảm dan ở giai đoạn cá lúc6 — 8 tuân và cá thương phẩm

- - Mật độ dan: số lượng cá trên đơn vi diện tích mặt nước.Nhu cầu protein cho duy trì sự sống ở cá cao hơn động vật có vú Cá hồi vân(Oncorhynchus mykiss) nặng 100g có nhu cau protein duy trì hăng ngày là 52,1; 69,3

và 97,7 mg/ngày tương ứng với nhiệt độ môi trường là 10°C, 15°C và 20°C [6].

Nguồn cung cấp protein có ảnh hưởng rất lớn đến độ tiêu hóa protein của tôm cá Ví dụ

như ở cá rô phi, mức năng lượng tiêu hóa bột cá là 4,04 kcal/g, bột đậu nành là 3,34kcal/g, trong khi bột xương chỉ là 2,49 kcal/g [1].

Protein cơ thé luôn ở trong trạng thái cân bang và cá có thé thích nghi trong môi trườngnuôi khác nhau Do đó, nhu cầu protein thay đối đáng ké theo tuổi tác và các loài.Protein cũng được sử dụng như nguồn năng lượng cho sự trao đổi chất Cứ 1 gamprotein bên trong cơ thé cá bị oxy hóa thành 18,8 KJ năng lượng [29]

Mức protein cao được yêu cau trong giai đoạn đang phát triển của cá bột và cá giốngcao hơn so với cá nuôi thương phẩm [29]

Nhu cầu sử dụng protein của | số loài cá:Bang 2.1: Nhu cdu sir dung protein cua Ì số loài cá nuôi [29]

Loài g protein/kg trọng Nguôn tài liệu

Ca rô phi (Tilapia zillit) 350 Mazid va cong su (1979)

Luon Nhat Ban (Anguillo 445 Nose va Arai (1972)

japonica)Axit amin:

Trong tự nhiên có 23 loại axit amin, được chia lam 2 loại là axit amin thiết yếu Và aXIf

amin không thiệt yêu Đôi với tôm va cá có 10 loại axit amin được coi là axit amin

thiết yếu

Bang 2.2: Các axit amin thiết yéu cua tôm và cá[Š]Axit amin thiết yêu (Essential amino Axit amin không thiết yếu (Non-essential

Lysine (Lys)Methionine (Met)Phenyalanine (Phe)Threonine (Thr)Tryptophan(Try)Valine (Val)acids) amino acids)Arginine (Arg) Alanine (Ala)Histidine (His) Acid aspartic (Asp)Isoleucine (Iso) Acid glutamic (Glu)Leucine (Leu) Glycine (Gly)

Proline, Hydroxyproline (Pro)Cystine, Cysteine (Cys)Tyrosine (Tyr)

Serine (Ser)Ornitine (Orn)

Bang 2.3: Nhu cầu axit amin cua một số loài cá (% vật chất khô)”Axit amin Cá chép | Cá rô phi | Cá chình Nhật Ban | Cá da tron | Cá hoi

Arginine (Arg) 1,6 1,18 1,7 1,0 14Histidine (His) 0,8 0.48 0,8 0.4 0,64Isoleucine (Iso) 0,9 0,87 15 0,6 0.96Leucine (Leu) 13 0,95 2,0 0,8 1,76Lysine (Lys) 22 1.43 2.0 12 2,12

Methionine (Met) 1 2° 0/75 12 0.6 0.72!Phenyalanine (Phe) | 2.5 1,05° 22° 1,2° 1,24

Threonine (Thr) 15 1,05 15 0.5 136

Tryptophan(Try) 0,3 0,28 0.4 0,12 03

Valine (Val) 1,4 0,78 1,5 0,71 1,24

` a: không có cytine; b: không có tyrosine nêu có tyrosine chiếm 1% nhu câu

phenyalanine; c: có 0,15% cytine; d: có 0,5% tyrosine; e: có 0,3% tyrosine; f: cócystine

Nhóm tác gia Trần Thị Thanh Hiền và cộng sự đã nghiên cứu và xác định nhu cầu

methionine trong thức ăn cua cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) [5] Thí nghiệm

được tiễn hành với 6 nghiệm thức thức ăn có cùng mức protein (38%) va mức lipid(7%), hàm lượng methionine từ 4,5g đến 14,5g methionine/kg thức ăn (tức là 11,9 đến38,2 g/kg protein) Khi mức methionine tăng đến 27/7 g/kg protein thì hệ số thức ăn

(FCR) và hiệu quả sử dụng protein (PER) được cải thiện có ý nghĩa Hàm lượng mức

methionine toi ưu cho cá Tra giỗng là 10,1 g/kg thức ăn (tương ứng 26,7 g/kg protein)

Hàm lượng protein của cá chịu ảnh hưởng bởi mức methionine có trong thức ăn do đó

trong chế biến thức ăn thủy sản, bột cá tạp chứa hàm lượng methionine cao hơn bột thịtvà xương đo đó bột cá được xem là nguồn protein tốt nhất [5]

Cũng trên cá Tra (2009) giai đoạn cá giống tác giả đã nghiên cứu nhu câu sử dụng

lysinetrong thức ăn, thí nghiệm với 7 nghiệm thức thức ăn có cùng mức protein (38%)

và mức lipid (7%) Hàm lượng lysine từ 7,3g¢ đến 31,3g lysine/kg thức ăn (19,3 đến82.4 g/kg protein) với bước nhảy là 4 g/kg thức ăn Kết quả cho thấy tốc độ tăngtrưởng đặc biệt và hiệu quả sử dụng protein (PER) đạt cao nhất tại hàm lượng lysine là61.4 g/kg Dựa trên sự tương quan giữa tốc độ tăng trưởng đặc biệt với hàm lượnglysine trong thức ăn cho thay hàm lượng lysine tối ưu cho cá Tra giống là 20,3 g/kg

thức ăn (tương ứng 53,5 g/kg protein) [4].

2.1.2.2 Vai trò của vitamin

Trong điều kiện nuôi thâm canh băng thức ăn công nghiệp như hiện nay dẫn đến cácbệnh lý rối loạn do thiếu vitamin Do đó, việc bồ sung vitamin vào nguôn thức ăn là hếtsức cân thiết Hầu hết vitamin được bố sung vào thức ăn bằng con đường hóa học hoặcvi sinh vật hoặc kết hợp cả hai Các vitamin tong hợp được san xuất và bảo vệ chồnglại sự phân hủy trong quá trình chế biến và dự trữ

Có 2 nhóm vitamin chính là vitamin tan trong dầu (gồm vitamin A, D, E, K) và vitamintan trong nước (gồm vitamin BI, B2, B5, Bó, B12, PP, C, cholin, biotin )

Bang 2.4: Nhu cau vitamin cho sự tăng trưởng ở 1 số loài cá [14]

Vitamin mg/kg trọng lượng khô

Cá hôi Cá hồi Cachép | Cá datrơn | Cá trap

(trout) (salmon)

Bl 10-12 10-15 2-3 1-3 RB2 20-30 20-25 7-10 9 RB6 10-15 15-20 5-10 3 5-6B5 40-50 40-50 30-40 25-50 RB3 120-150 150-200 30-50 14 RAcid folic 6-10 6-10 N R RB12 R 0.015-0.02 N R R

myo-Inositol 200-300 300-400 200-300 R 300-900Choline 2000-4000 3000 1500-2000 R R

B8 1-1.2 1-1.5 1-1.5 R NC 100-150 100-150 30-50 60 RA 2000-2500 | 2000-2500 IU | 1000-2000 | 1000-2000 1000-

IU IU IU 2000 IUD 2400 IU 2400 IU N 500-1000 IU ?E 30 30 30-100 30 ?K 10 10 R R ?

R: cân thiết, nhưng mức độ không biết; N: không cân thiết; ?: không biếtVitamin C giúp cá hấp thu sắt tốt do đó ngăn ngừa được hiện tượng thiếu máu hay gặpở cá do thiếu vitamin C Thiếu vitamin C cá có các biểu hiện không đặc trưng nhưgiảm ăn, yếu ớt, kém linh hoạt Ngoài ra, vitamin C cùng với vitamin E tham gia vàoquá trình hạn chế sự hình thành peroxit ở lipid trong mô cá [6]

Vitamin D giúp thúc đây sự hấp thu Ca và P ở ruột để duy trì các chất khoáng bìnhthường cho xương Nếu thiếu vitamin Ds: cá sinh trưởng kém, gan nhiều mỡ, có biểu

hiện co cứng cơ xương [1].

2.1.2.3 Vai trò của chất khoángTrong tự nhiên có ít nhất 22 chất khoáng mà cơ thé động vat can Chat khoáng đượcchia làm 2 nhóm căn cứ vào nhu cầu sử dụng của động vật: nhóm khoáng đa lượng và

nhóm khoáng vi lượng.

Bang 2.5 Hàm lượng một số nguyên tổ khoáng trong cơ thé động vật

Khoáng đa lượng | g/kg thé trọng Khoáng vi lượng Mg/kg thê trọng

Ca 15 Fe 20-80P 10 Zn 10-50

2 Cu 1-5Na 1,6 Mo 1-4Cl 1,1 Se 1-2

S 1,5 | 0,3-0,6Mg 0,4 Mn 0.2-0.5

Trong môi trường nước thi nồng độ Ca là 200mg/1 là đáp ứng đủ nhu cầu Ca cho cáhoi Nếu lượng Ca trong nước thấp thì phải b6 sung Ca cho cá trong khẩu phan ăn.Đối với P thì cá hấp thu từ môi trường nước kém hơn Ca (chỉ băng 1/400 so với Ca).Hap thu P từ nước cũng phụ thuộc vào nhiệt độ nước và hàm lượng Ca trong nước.Hap thu P tăng khi nhiệt độ nước tăng va hàm lượng Ca trong nước giảm Do đó, bổsung nguồn P vào khẩu phan thức ăn cho cá quan trọng hơn là từ nguồn nước [1].Tác giả Cowey và cộng sự (1977) nghiên cứu trên cá hồi nặng 30g thay răng tính hamăn, tăng trọng và FCR (hệ số chuyển đổi thức ăn) tốt khi khâu phan thức ăn chứa Mgvới tỉ lệ 1000mg/kg so với khẩu phan 26-63mg/kg Thí nghiệm ở cá hồi con thay 200-300mg/kg thì đủ cho sinh trưởng nếu nước chứa 1,7mg/l Trong một thí nghiệm ngườita cho thay mức Mg là 52mg/kg khẩu phan thức ăn đã làm cho tỉ lệ tử vong tăng, từ đóngười ta cho thay nhu cầu tối thiểu Mg phải là 400-700mg/kg thức ăn

2.1.2.4 Vai trò cúa lipid

Lipid có vai trò cung cấp và dự trữ năng lượng, là nguồn năng lượng chính của độngvật, |g lipid cho 9,1 Kcal GE hoặc 8 Kcal DE [6] Nếu thiếu các loại axit béo quantrọng có thé gây thối loét vảy, vây, tăng tỉ lệ tử vong, viêm co tim, giảm khả năng sinhsản (ở cá chép, cá hồi, cá tráp), giảm sinh trưởng, giảm tiêu thụ thức ăn Như vậy, khixây dựng khẩu phần ăn cho thủy sản ngoài việc đảm bảo cân đối tỉ lệ P/E(Protein/Năng lượng) mà cần phải có | tỉ lệ lipid nhất định ( đối với 1 vài loài cá thi tỉ

lệ này từ 20% trở lên).

Tac giả Steffens và cộng sự (1989) đã khảo sát ảnh hưởng của việc bồ sung thêm dầuvào khẩu phân ăn của cá hoi vân cho thay sự sinh trưởng và chuyền hóa thức ăn của cátăng lên khi khẩu phan lipid tăng từ 4/7% lên 9%, các loại dầu khác cũng cho kết quả

khác nhau [34].

Thanh phan axit béo trong khẩu phan ăn cũng ảnh hưởng đến kha năng miễn dịch củacá Nghiên cứu của tác giả K.D.Thompson và cộng sự (1996) trên cá hồi Đại TâyDương trong hai thí nghiệm cho thấy rằng khẩu phần ăn đầy đủ các axit béo (n-3)(omega-3) (axit béo có vi tri nối đôi là thứ 3 tinh từ nhóm CH; ở đầu chudi) nhưng tỉ lệ(n-3)/(n-6) thấp thì sức đề kháng với vi khuẩn Aeromonas salmonicida và Vibrio

anguillarum kém hơn khẩu phân có tỷ lệ (n-3)/(n-6) cao [19] Ngoài ra, cá thường có

nhu câu cao sử dụng các loại axit béo không no (n-3) Các loại mỡ động vật như lợn,bò, cừu chứa nhiều axit béo (n-6) (omega-6), chi có dầu mỡ cá biến là nguồn thức ănchứa nhiều axit béo (n-3) (ome ga-3)

Mức lipid tối đa trong thức ăn cua cá nước ngọt thường thấp hơn cá nước mặn, mứclipid tối đa trong thức ăn của cá chép là 12-15%, cá rô phi <10%, cá trê và cá da trơn 7-10%, cá hồi 18-20%, cá ch€m 13-18%, cá mú 13-14%, cá vền biên 12-15%

2.1.2.5 Vai trò của tỉnh bột và chất xơ

Tinh bột:

Tinh bột là nguồn năng lượng rẻ tiễn và được các nhà sản xuất đưa vào thức ăn vớinhững tỉ lệ khác nhau Việc b6 sung tinh bột vào thứ ăn giúp cá bon va cá chép tăngtốc độ sinh trưởng Tỉ lệ tiêu hóa tinh bột của cá chép trong khoảng 40-80% phụ thuộcvào nguon tinh bột Dé tăng hiệu qua su dung tinh bột trong thức ăn thủy sản ta nên hồtinh bột bằng biện pháp nấu chín.

Bang 2.6 Tỉ lệ tiêu hóa carbohydrate khác nhau của cá chép 2 năm tuoi (Scerbina,

1973)Loại thức ăn Hàm lượng carbohydrate (%) | Ti lệ tiệu

hóaĐại mạch (barley) 55,0 74

Yến mach (oats) 37,3 75

Mach den (rye) 46,8 84Lúa my (wheat) 43,6 58

Dau peas 34,1 45

Dau lupins 22,8 56Khô lạc ( groundnut meal) 15,0 65Khô đậu tương (soyabean meal) 254 51

Thức ăn hỗn hợp 14,8-30,5 46-75

b.Chat xo:Do hoạt tinh enzyme cellulose trong đường tiêu hóa của cá rất yếu,nên tỉ lệ chat xơtrong khẩu phan của cá thường được khuyến cáo từ 8-10% Ta sử dụng chất xơ nhự độpha loãng dé điều chỉnh tỉ lệ P/E khi phối trộn khâu phan

2.1.3 Hiện trang chăn nuôi thủy san 6 nước taNgành thủy san Việt Nam thu hút hơn 4 triệu lao động, giá tri sản lượng hang năm đạt

120.000 tỷ đồng Sản phẩm từ ngành nuôi trồng thủy sản xuất khẩu qua 130 quốc giatrên thế giới, theo Tổng Cục Thủy Sản GDP năm 2008 đạt 4,5 ty USD trong đó khu

vực Đồng Băng Sông Cửu Long đạt 1,453 ty USD (chiếm 32,2% tong giá trị xuất khâu

của toàn ngành) [39].

Nhưng thực tế chi phí thức ăn cho thủy sản trong giá thành sản phâm nuôi trồng thủysản chiếm hơn 50% Do vậy, giá thức ăn cao trong nước và trong khu vực đã tác độngbat lợi cho việc phát triển nghề nuôi trồng thủy sản ở nước ta trong những năm qua.Bên cạnh đó, nguồn nguyên liệu cá tạp luôn biến động theo mùa, chất lượng thức ăn docác nhà máy chế biến rất khác nhau, nhiều sản phẩm thức ăn chưa kiểm soát được.Theo thông kê của Tổng Cục Thủy Sản, những năm gần đây số lượng nhà máy sảnxuất thức ăn thủy sản đã tăng đáng kế với khoảng 130 nhà máy va 110 cơ sở sản xuấtthức ăn bổ sung, chưa kế một lượng lớn cơ sở nhỏ lẻ Khảo sát của Trung tâm Kiểmđịnh, khảo nghiệm, kiểm nghiệm (Tổng Cục Thủy Sản) trên 39 mẫu thức ăn thủy sảnđã phát hiện 6 mẫu không đạt chất lượng (chiếm 15%) |40] Ở khu vực Đồng Bằng

Sông Cửu Long, theo tính toán của Hiệp hội Thủy sản các tỉnh, năm 2007 sản lượng cá

tra toàn vùng đạt hơn Ï triệu tan, tiêu thụ gần 2 triệu tân thức ăn công nghiệp Chỉ cầnIkg thức ăn bị gian lận từ 2-5 độ đạm thì người nuôi cá đã thiệt hại từ 800-2000 tỉ đồng(lay chuân một độ đạm khoảng 200 đồng) [41]

Các lỗi vi phạm chủ yếu là không đạt tiêu chuẩn protein, lipid, chất xơ theo tiêu chuẩncông bố, trong đó lỗi vi phạm phổ biến nhất là không đạt tiêu chuẩn protein Dé giảmchi phí sản xuất bột thức ăn thì các cơ sở xay nghiên thường phối trộn các nguyên liệubột cá, bột thịt, bột xương từ heo, bò, gà mà theo tỉ lệ không công bố đúng với thực tế.Mà hậu quả là khiến cho thủy sản chậm lớn, thời gian nuôi kéo dài, hệ số tiêu tốn thứcăn cao dẫn đến giá thành sản xuất tăng theo

Do đó, việc sử dụng nguồn thức ăn có uy tín, thành phần thức ăn được công bố đúng tỉlệ không những giúp ích cho người dân mà còn có ảnh hưởng tích cực đến việc xuấtkhâu

2.2 Các phương pháp định danh thành phan loài Heo, Bò, Ga trong thức ăn

thúy sản2.2.1 Phương pháp ELISA

Nguyên lý: phương pháp ELISA có rất nhiều dạng mà đặc điểm chung là đều dựa trênsự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng nguyên (proteinmục tiêu) được cố định trên giếng plastic, kháng thé thi được gắn với 1 enzyme Khikháng thể được cho vào thì nó sẽ liên kết với kháng nguyên (protein mục tiêu) băngliên kết đồng hóa trị, kháng thé không gắn với kháng nguyên sé bị rửa trôi đi Khi chothêm cơ chất thích hợp vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân co chất thành | chất cómàu Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thé với khángnguyên mà thông qua cường độ màu ta biết được néng độ kháng nguyên hay kháng thécần phát hiện

Phương pháp này được thiết kế cho việc phát hiện và định lượng vật chất như peptides,

protein, atibodies, hormone.

Kỹ thuật này bao gồm 2 bước:- Phản ứng miễn dịch học: là sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể

- Phan ứng hóa học: thông qua hoạt tính xúc tác của enzym làm giải phóng oxy

nguyên tử [O] từ H,0, để oxy hóa cơ chất chỉ thị màu, do đó làm thay đổi màu

của hỗn hợp trong dung dịch thí nghiệm

2.2.2 Phuong pháp PCR multiplex điện diNguyên lý:

Phương pháp PCR là một phương pháp tạo d ng in vitro nhằm thu nhận một số lượng

lớn bản sao của một trình tự DNA/cDNA xác định.

Các DNA polymerase có khả năng tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn nhờsự hiện diện của những cặp primer chuyên biệt Mỗi là những oligonucleotide, có kha

năng bat cặp bô sung với một dau của mạch khuôn và DNA polymerase sẽ nôi dài

primer để hình thành mạch mới Nếu cung cấp hai primer chuyên biệt bat cặp bố sungvới hai đầu của một trình tự DNA thì sẽ tong hợp được một đoạn DNA đích nam giữamôi ngược (antisense primer) và mỗi xuôi (sense primer) [22].

Do các sản phẩm được tổng hợp ở chu kỳ trước có thé được sử dụng là khuôn trongchu kỳ tiếp theo, cho nên số bản sao DNA đích tăng lên gần gấp đôi sau mỗi chu kỳ.Do vậy, 20 chu ky PCR thu được hon một triệu (2°) và sau 30 chu ky thu được hơn

một tỷ (2) thể nhân bản

PDNA mur tiêu

Sự khuyếch đại theo ham mũ

trọng nhất là độ nhạy phát hiện từng tác nhân đích không bị giảm mà vẫn tương đươngnhư độ nhạy của PCR đơn mồi

Phản ứng PCR gồm 3 bước:‹_ Biến tính: bước biến tính đầu tiên kéo dài khoảng 15 phút ở nhiệt độ 94°C — 95°C,

mục tiêu là hoạt hóa h-Taq polymerase, đồng thời giúp DNA biết tính tách mạch

hoàn toàn trong khoảng | — | phút 30 giây.

e Lai: Cac primer bat cặp với mach khuôn, nhiệt độ lai khoảng 60°C — 70°C, tùy thuộc

vào nhiệt độ nóng chảy của prImer.

¢ Tổng hợp hay kéo dài: DNA polymerase tổng hợp mạch mới, nhiệt độ khoảng 72°Cgiúp cho DNA polymerase hoạt động tốt nhất

Kết thúc: Thông thường các phản ứng PCR multiplex đều thực hiện giai đoạn cuối.Giai đoạn kéo dài khoảng 7 phút ở 72°C dé cho primer tong hợp triệt để các sản phẩmPCR multiplex đã được tổng hợp

Hình 2.3: Biểu do thé hiện chu kỳ nhiệt cua một phan ứng PCR [38]

2.2.3 Phương pháp PCR realtime multiplex

2.2.3.1 Nguyên lý

Phản ứng PCR realtime được sử dụng dé theo dõi quá trình phản ứng PCR xác địnhchính xác hàm lượng sản phẩm PCR trong từng thời điểm cu thé Đồng thời, có thé xácđịnh được hàm lượng sản phẩm PCR từ một lượng mẫu DNA (cDNA hoặc RNA) rất

nhỏ Phan ứng PCR realtime dựa trên cơ sở phát hiện và định lượng các chất huỳnh

quang được phát ra sau mỗi chu ki phản ứng Cứ sau mỗi chu kì, số lượng sản phanPCR lại tăng lên gấp đôi Phương pháp PCR realtime giúp chúng ta có thé giám sáttrực tiếp các phản ứng khi tiến hành, giúp tiết kiệm nguôn lực và thời gian Kỹ thuậtnảy tương đối dé thực hiện có độ nhạy, đặc hiệu cao và hoàn toàn tự động [30]

Hệ thống PCR realtime bao gồm máy chu trình nhiệt được nối với máy phát hiệnquang pho huỳnh quang và máy vi tính Nguyên lý chủ yếu của PCR realtime là dựa

trên cơ sở phát hiện và định lượng các tín hiệu huynh quang (fluorescent signals) sau

mỗi phản ứng [22] Hàm lượng sản phẩm PCR bat dau tăng lên cao từ chu kì ngưỡng(Ct) Chu kì ngưỡng là chu ki nhiệt mà tại thời điểm này thiết bị PCR realtime ghi nhậnđược tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng bắt đầu vượt cường độ huỳnh

quang nền.

Để có thể xác định cường độ huỳnh quang nên, thiết bị realtime thường ghi nhậncường độ tín hiệu huỳnh quang xuất hiện trong ống phản ứng trong một số chu kì đầu,chúng ta gọi là các chu kì nên, lay trung bình cộng của các cường độ huỳnh quang nàylàm cường độ huỳnh quang nên

Tuy nhiên hệ thông PCR đơn loài mat nhiều thời gian, tốn kém Dé tiết kiệm chi phí,nâng cao hiệu suất của phương pháp PCR, hệ thông PCR realtime multiplex được pháttriển [31]

2.2.3.2 Các thành phan quan trong trong một phan ứng PCR:

Primer:

Trong phản ứng PCR realtime primer đóng vai tr quan trọng, việc thiết kế primer chủyếu dựa vào kinh nghiệm Nếu primer quá dài sẽ làm tăng tính đặc hiệu và làm giảmđộ nhạy của phản ứng Tuy nhiên nếu primer quá ngăn sẽ làm tăng độ nhạy nhưng sé

làm giảm độ đặc hiệu của phản ứng.

Trong phản ứng PCR realtime multiplex sử dụng nhiều cặp primer ( hoặc nhiều probetrong một phản ứng, nên các cặp primer (probe) sẽ cạnh tranh ức chế lẫn nhau Việc tốiưu hóa phản ứng phụ thuộc vào việc tính toán nông độ và tỉ lệ các cặp primer (probe)

sao cho phù hợp.dNTP:

dNTP có vai tr quan quan trọng trong quá trình tong hợp của phan ứng PCR Can chúý nông độ mỗi loại dNTP ( dATP, dCTP, dGTP, dTTP) phải như nhau Chi cần mộtloại dNTP nào đó chênh lệch về nồng độ, có thé gia tăng mức độ gan nhầm nucleotide

vào sản phâm PCR, dân đên kết quả là sản phâm biêu hiện sai khác với trình tự đích.

Phản ứng PCR realtime multiplex sử dụng nhiều cặp primer (probe) hơn, tạo ra nhiềusản phẩm hon phản ứng PCR realtime monoplex nên lượng dNTP sẽ được sử dungnhiều hơn Nếu cung cấp quá nhiều dNTP, nó sẽ chiếm giữ Mg””, khiến Tagpolymerase hoạt động không tốt Nếu cung cấp quá ít dNTP, sản phẩm tạo ra sẽ biểu

hiện yêu.Polymerase:Trong phan ứng PCR multiplex va PCR realtime multiplex người ta thường sử dụng h-

Taq polymerase Loại enzyme nay hoạt động khi đã được hoạt hóa ở 95°C điều nàygiúp làm tăng tính đặc hiệu của phan ứng PCR realtime multiplex Đồng thời, h-7Tøg

polymerase giúp ngăn ngừa việc hình thành các san phâm bên cũng như các primer bidimer hóa, giúp làm tăng hiệu quả phản ứng PCR realtime multiplex.

MgCl,

Nong độ MgCl, ảnh hưởng tới kha nang bắt cặp cua primer, nhiệt độ nóng chảy cua sợi

khuôn, sản phẩm và liên kết méi-khu6n; tính đặc hiệu của sản phẩm; hoạt tính củaenzyme Nong độ MgCl, là biến số chính ảnh hưởng tới sự bắt cặp giữa primer vớikhuôn DNA bang cách bên hóa mối tương tac môi-khuôn Vì vay, nó cũng tăng sự bắtcặp không đặc hiệu, đồng thời ảnh hưởng tới hoạt tính của Tag polymerase

Do ion Mg” tạo ra các phức hợp với dNTP, liên kết mỗi-khuôn, cho nên nồng độ tối

thích của MgCl, được tính toán cho từng thí nghiệm Trong phan ứng PCR realtime

multiplex, quá ít ion Mg” cho hiệu xuất sản phẩm PCR thấp, quá nhiều ion MgTM làmtăng hiệu suất thu các sản phẩm không đặc hiệu (sản phẩm kí sinh), tăng gan nhằm Vivậy việc tôi ưu hóa nồng độ MgCl, đóng vai tr quan trong trong quá trình tối ưu hóa

phản ứng PCR realtime multiplex.

2.3 Các nghiên cứu trong và ngoài nước

Các công trình nghiên cứu sử dụng các phương pháp ELISA, PCR điện di multiplex,

PCR realtime multiplex để xác định thành phân loài:

Năm 2000, nhóm tác giả Fun-Chi Chen và cộng sự sử dụng phương pháp ELISA trực

tiếp để phát hiện mô cơ xương của heo trong các mẫu thực phẩm bán trên thị trường.Kháng thể MAb 5H9 (Bio-Rad) được cô định trên trên giếng ELISA và bắt đặc hiệu

với protein cơ xương của lợn không cho phản ứng chéo với các loại protein khác có

mặt trong thực phẩm Độ nhạy của phản ứng là 0,5% (w/w) mẫu thực phẩm Tác giảthực hiện thí nghiệm với 45 mẫu thực phẩm có mặt trên thi trường phát hiện 18 mẫu cóchứa mô cơ xương Heo, 27 mẫu không chứ chứa mô cơ xương của Heo và kết quả này

hoàn toàn chính xác khi sử dụng bộ Kit Pab-Test [13].

Tiếp sau đó năm 2006, nhóm tác giả Lihua Liu và cộng sự tìm ra phương pháp ELISASandwich nhằm phát hiện mô cơ xương của Heo trong mẫu thịt say khô và thực phẩmtrên thị trường Tác giả cô định kháng thé đơn d ng MAbs 8F10 vào giếng bắt đặc hiệuvới protein của động vật có vú, sau đó gắn tiếp MAbs 5H9-biotin bắt đặc hiệu với

protein của Heo Kết quả thí nghiệm cho độ nhạy như sau: phát hiện 0,5% (w/w) thịt

Heo trong mẫu thịt Gà, 0,1% (w/w) thịt Heo trong hỗn hợp thịt Bò; 0,05% (w/w) thịt

Heo trong bột đậu nành và 1% trong thịt thương mại và bột Cá [20].

Tác giả Nguyễn Văn Ba và cộng sự (2010) tại phòng thí nghiệm Trọng điểm Côngnghệ Tế bào Động vật đã xác định các loài Bò, Lợn, Gà trong hỗn hợp bột thịt xươngbăng phương pháp PCR multiplex điện di với các cặp primer đặc trưng cho loài Bò,Lon va Ga, sản phẩm PCR thu được có các băng tương ứng là 271, 212 và 95 bp tươngứng với các loài Tỷ lệ thấp nhất có thể phát hiện được loài trong hỗn hợp là 0,5% [2].Bước đầu cho thấy đây là phương pháp kiểm soát hữu hiệu các sản phẩm bột thịt

xương động vật trên thị trường.

Tiến si Marco Tartaglia (1998) đã phát hiện DNA của B_ được phân lập từ nguồn thứcăn cho động vật băng phương pháp PCR nhằm ngăn chặn sự lây lan của bệnhB_ điên(TSE) có thé ấn chứa trong các sản phẩm chứa máu, gelatin, sữa và các sản phẩm đượclàm từ sữa, các sản phẩm chứa protein, thịt có nguồn gốc từ Bò Phương pháp này chophép phát hiện DNA của Bò trong thức ăn với tỉ lệ thấp nhất là 0,125% thịt Bò và

xương B_ trong hỗn hợp Cặp primer đặc hiệu được sử dụng trong phản ứng trên chi

phát hiện DNA của Bò mà không phá hiện vật liệu của các Loài Cừu, Lợn, Ngựa và gia

cầm (Gà Tây, Gà) [23]

Tác giả E Sakalar và cộng sự (2011) cũng đã xác định các loài : động vật nhai lại, gia

cầm, Cá và Heo băng phương pháp PCR multiplex, các cặp primer đặc hiệu cho cácloài được thiết kế dựa trên vùng gen bảo tồn 16S rRNA trong cơ sở dữ liệu củaGenBank Sản phầm DNA tạo thành có các kích thước 183, 224, 290 và 374 bp tươngứng cho các loài gia cầm, cá, thịt Lợn và động vật nhai lại Phương pháp này đã được

sử dụng kiểm định trên 93 sản phẩm thịt thương mại và trong những mẫu này phát hiệncó sự hiện diện của thịt gia cầm mà không được ghi trên bao bi [12].

Nhiều loại sản phẩm thịt có sự pha trộn của 2 hay nhiều loài động vật, để xác địnhchính xác tỉ lệ pha trộn các loài Bò, Heo, Gà và Gà Tây trong sản phầm phương phápPCR multiplex định lượng đã được phát triển [32] Sau đó 1 năm tác giả Rene Koppel

và cộng sự (2009) đã nâng phương pháp phát hiện cùng một lúc các loài Heo, Bò, Gà,Ga Tây, Ngựa, Dê, Cừu trong cùng một phản ứng PCR multiplex định lượng [31].Chun-Lai Zhang va cộng sự (2007) sử dụng phương pháp PCR realtime xác định va

định lượng DNA của Bò trong các mẫu thịt, sữa và pho-mát Nguồn DNA phân lập từ

thịt tươi và pho-mát theo protocol cua CTAB, sử dụng bộ Kit Promega Wizard

Magnetic dé thu DNA từ sữa DNA phan lập từ thit b tươi được su dụng để xây dựngđường cong tiêu chuẩn trong các thí nghiệm Cap primer đặc hiệu cho Bo được thiết kếtheo vùng gen ti thể Cyth, mẫu d được đánh dấu bang màu FAM Độ nhạy của thínghiệm có thé phát hiện là 35 pg DNA Bò và không cho phản ứng chéo với các loàiđộng vật khác Hệ thông đã được sử dụng thành công để đo chất lượng của thịt Bò tươicũng như các sản phẩm chế biến như sữa, pho-mat [11]

Tác gia Nicolette Pegels và cộng sự (2011) đã xây dung phương pháp PCR realtime

multiple Thiết kế các primer và probe dự trên trình tự vùng gen 18S rRNA nhăm pháthiện các loài động vật nhai lại, Cừu và Dê, để giúp việc phát hiện thành phan các loài

này trong thức ăn cho động vật [25].

Từ những nghiên cứu trên cho chúng ta thấy việc xác định thành phần loài trong thựcphẩm là van dé cần thiết và dang được các nhà khoa học nghiên cứu, áp dụng trên thếgiới Tham khảo những công trình nhiên cứu trên, chúng tôi tiễn hành việc xác địnhthành phan loai trên đối tượng là thức ăn cho thủy sản bằng phương pháp PCR realtime

multiplex.

PHAN 3: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1.Nguyên liệu

3.1.1 Hóa chấtHóa chất tách chiết cột Solgent: SGD1, Proteinase K (10 mg/ml), SGD2, Superbinder,

WB (Ethanol 80%), DNA hydration solution.

Hóa chất tách chiết cột Khoa Thương: SDS 1% (Merk), Proteinase K (10mg/ml), TE

1X, LB (Guadinium hydrochloride), DS (2-propanol), WBI (Guadiniumhydrochloride), WB2 (Ethanol), DEPC.

Hóa chất tách chiết tủa Khoa Thương: KTL1 (Phenol pH8 + glycerol), KTL2

(Chloroform), KTL3 (2-propanol), KTL4 (Ethanol 70%), KTL5 (DEPC).

Hóa chat tách chiết dùng proteinase K + Tach chiết tủa Khoa Thuong: SDS 10%,

proteinase K (10mg/ml) (Merk), KTL1 (Phenol pH8 + glycerol), KTL2 (Chloroform),KTL3 (2-propanol), KTL4 (Ethanol 70%), KTL5 (DEPC).

Hóa chat phan ứng PCR Realtime:

- h-Taq Buffer 10X (Biorad)- MgCl,

- dNTP- h-Taq DNA polymerase 2.5u/y1 (Biorad)- — Nước xử lý DEPC (Biorad)

3.1.2 Dụng cụ - Thiết bị- — Tủ cấy vô trùng

- May luân nhiệt (Techne)- May ly tam Mikro 22 (Hettich)

- _ Bồn ủ nhiệt khô

- Tủ lạnh -20°C (Sanaky)

- Bộ pippetman có đầu hút 10001, 20- 200/1, và 0,5- 101- Pau tip 1000, 200, 10

- Eppendorf 2,0 ; 1,5 va 0,2

- _ Cân điện tir 4 sé

- May PCR Bio_Rad CFX- May vortex

3.2 Cac phương pháp tách chiết thu gDNA3.2.1 Tach chiết thu gDNA băng cột Solgent (theo protocol của Solgent)

- Cho hoảng 10mg-80mgmud chun snvoepp15 Thmvo350 1

SGD1, ng pipet h t nha nhỉ u lần sau đó vortex mạnh trong 1 ph t

- Thmvo8 lProteinase K 10mg ml),h tnhadu ng pipet Dom m u đi ủở 65°C trong 10 ph t Ly tâm 13000 v ng trong 5 ph t ở nhiệt độ ph ng, thu

chn ichuyénv oepp15 he

- Cho v 0 400 1S D2v vortex trong 1 ph t, sau đó dem ly tâm 13000 v ngtrong 5 ph t ở nhiệt độ ph ng Ð tcộtv oepp 2 0

- - Cho 100 | ` chm uv o cột, ly tâm 12000 v ng rong 30 giây Loại epp có

chứa ch, chuyển cột v o epp 2 0 của Solgent Ly tâm 12000 v ng trong 1 ph t

ở nhiệt độ ph ng Loại cepp có chứa chl c, đ tcộtv o epp mới- Cho 500 1 (80% Ethanol) v o cột, sau đó ly tâm 12000 v ng trong 30 giây

ở nhiệt độ ph ng eppv chlc

- Cho tiếp 500 1 (80% Ethanol) v o cột, ly tam 12000 v ng trong 30 giây ở

nhiệt độ ph ng ch 1 c trong epp, d t cột v o epp, ly tam 13000 v ng trong

2 ph tở nhiệt độ thư ng để loại tất cả Ethanol có trong cột epp, đ t cột

v oepp 15

- Chovo50 | ung ch ảo quảnDN đi qua cột, ly tâm 13000 v ng trong 2

ph t, loai cộtv ảo quản ch chứa DN ở 4C ( Đông ở -2ŒC ho 80°C).

c-3.2.2 Tach chiết thu gDNA bằng cột Khoa Thương (theo protocol của Khoa

Thương)

Nguyên tac: DNA có khả năng li n ét với pha ran (silica hay những chat ran khác)phụ thuộc vào pH và nông độ muối của dung dch đệm Có a giai đoạn trong quátrình: (1) M u được thêm vào cộtv ưới đi u kiện dung d ch đệm có pH va nông độmudi cao, DNA sẽ gắn ch t vào pha ran (2) Sau đó cột sẽ được rửa b ng dung d ch80% Ethanol (3) Cuối cùng cột được rửa giải với nước hay đệm để giải phóng DNAkh ¡ pha rắn

Các nhân tổ gây biến tính như ua inium hy rochlori el nhân tố gây biến tính cấutrúc phân tử, đ c biệt là những cấu tr c được hình thành bởi những liên kết không phảilà liên kết cộng hóa tr như lin ết hy ro, tương t c Van cr waals v hiệu ứng knước Các nhân tố gây biến tính điển hình là sodium iodine, sodium perchlorate,

guanidinium thiocyanate hay guanidinium hydrochloride Dưới sự hiện diện của

chúng, DNA gắn vào silica, hạt thủy tinh hay diatoms Nguyên tac n y được ng để

tinh sạch acid nucleic sử dụng bột thủy tinh hay hạt silica ưới đi u kiện ki m Việc sửdụng những hat silica trong tinh sạch DN_ sau đó được thay b ng những cột nh có

chứa một lớp màng m ng bản chất là hợp chất của silica

Quy trình:ul mu: Cho 50 mg mu mô v o epp, sung 1% SDS + 10 | proteinase K

(10mg ml), vortex mạnh sau đó đem ủ ở ôn ủ nhiệt với nhiệt độ 65°C t 20 ph t- I

gi Chomu lygiảiho ntonthnh ch

- P tmột ống nước cất ho c TEV o ê ủ nhiệt 70°C

- — Trong epp I Š5 chov o I0 1 proteinase K

- Cho tiếp v 010 Ichứng nội

- Ht200 lmuvoepp.thm200 | ˆ L, sau đó vortex 5giây lŠ ph tở

- = Đ tcộtv oepp 2 0 moi, th mv 0 600 | 2 Ly tam 8000 v ng trong 1

ph t chl e Ð t cột v o epp 2 0 mới, ly tâm 13000 v ng trong 3 ph t déloại hét tat cac c đấu vết cồn

trong 20 ph t Ly tâm 13000 v ng trong 3 ph t dé thu DN ao quan DN tai

-4°C, -20°C hay -70°C tu theo mục đích sử ung

3.2.3 Tach chiết tủa thu gDNA theo protocol Khoa ThươngNguyên tac: 1 phuong ph p t ch chiết DNA kh i các thành phần khác duc trên sựphân tách các pha b ng li tâm Một dung d ch ly giải gồm phenol pH 8 và muốiGuanidine thyocyanate sẽ phá vỡ tế bào, giải phóng nucleic acid, protein và các thànhphan khác bao gồm DNA và RNA Dưới tác dụng của lực li tâm lớn sẽ làm phân táchthành 3 pha: pha trong suốt ở trên (DNA), pha giữa (màng tế bào, protein biến tính) và

pha Phenol-Chloroform 6 ưới (RNA).Quy trình:

Xử lý mu: cân 50 mg m u vào epp,b sung 60 | SDS 10% + 140 IP S1

Vortex mạnh sau đó đem ủở 6n ủ nhiệt với nhiệt độ 65°C t 20 ph t—1gi Cho

mu lygiảiho nto nth nh_ ch

- Cho 900 pl dung d ch 1 vào m i epp của loạt epp thứ nhất và 600 ul dung d ch 3vào m i epp của loạt epp thứ hai (cần trộn đ u dung d ch trước khi sử dụng).- Cho 150 hl dchm ud xử lý vào m iepp tương ứng của loạt epp thứ nhất Lac

mạnh (vortex) epp trong ít nhất 15 giây cho tan hoàn toàn protein biến tính Để

- Lam khô c n trong 10 phút ở 60°C trong bổn ủ nhiệt khô Hòa c n chứa DNA

trong 50 ul dung d ch 5 Bảo quản ở -20°C.

Chú thích:Dung d ch | (phenol, guanidine isothyocianate, glycerol, sodium acetate)Dung d ch 2 (chloroform)

Dung d ch 3 (isopropanol, chat tao mau tủa)

Dung d ch 4 (ethanol 70%)Dung d ch 5 (nước DEPC)

3.2.4 Tach chiết thu gDNA dùng proteinase K + tách chiết tủa (theo protocol của

Khoa Thương)

Proteinesae K b sung trước sẽ góp phần phá hủy màng tế bào và màng nhân giúp choviệc tách chiết tủa tốt hơn

Nguyên tắc: giỗng mục 3.2.3.

Quy trình:Xử lý mu: cho 50 mg m uv o0 epp, sung 20 ISDS 10% + 20 l proteinase K

(10mg ml), vortex mạnh sau đó đem ủở ôn ủ nhiệt với nhiệt độ 65°C t 20 ph t-1

gi Chomu lygiảiho nto nthnh ch

- Cho 900 pl dung d ch 1 vào m i epp của loạt epp thứ nhất và 600 ul dung d ch 3vào m i epp của loạt epp thứ hai (cần trộn đ u dung d ch trước khi sử dụng).- Cho 150 hl dchm ud xử lý vào m iepp tương ứng của loạt epp thứ nhất Lac

mạnh (vortex) epp trong ít nhất 15 giây cho tan hoàn toàn protein biến tính Để

- Lam khô c n trong 10 phút ở 60°C trong bổn ủ nhiệt khô Hòa c n chứa DNA

trong 50 wl dung d ch 5 Bảo quản ở -20°C.

Chú thích:Dung d ch | (phenol, guanidine isothyocianate, glycerol, sodium acetate)Dung d ch 2 (chloroform)

Dung d ch 3 (isopropanol, chat tao mau tủa)

Dung d ch 5 (nước DEPC)3.3 Phương pháp PCR realtime multiplexChúng tôi ch n phương ph p PCR realtime multiplex trong nghiên cứu n y vi đây |

phương ph p đnh lượng chính x c, độ nhạy cao, độ đ c hiệu cao Có thé đ nh lượng

nhị u hơn một trình tự đích cùng một lúc Toàn bộ quy trình nhân bản và phát hiện

diễn ra trong một epp kín và rút ngắn th i gian.3.3.1 Thiết kế primer/probe

Yêu câu việc thiết kế primerKhuếch đại hông đ c hiệu là một trong những thách thức lớn nhất trong việc xâydựng phản ứng PCR realtime Chi u dài primer n m trong khoảng 15-30 bp [10], nếuchi u dai của môi quá ngăn, rất khó thiết kế và tối ưu nhiệt độ lai, néu primer quá dàikhông can thiết | m tăng chi phí t ng hợp Ngo i ra, c e đoạn primer dài nhi u khảnăng hình th nh cấu trúc thứ cấp giảm hiệu qua PCR [22]; Nhiệt độ bắt c p của primert 55-60°Cnh m1 m tăng tính đ c hiệu của phản ứng: h m lượng GC của primer trongkhoảng 35-60% [22]; Các primer phải bắt c p đ c hiệu với DNA mục tiêu

3.3.1.1 Yêu cau việc thiết kế probe

Nhiệt độ nóng chảy của po en n cao hon primer xuôi v primer ngược khoảng 10°C

[10] Không nên thiết kế trình tự G ở cuối trình tự 5’ của probe (làm giảm tín hiệuhu nh quang), thành phan GC t 35-65% Probe phải được thiết kế ch t chẽ, khônghình thành cấu trúc thứ cấp gây giảm hiệu quả lai và d n đến giảm độ nhạy [22]

Các tín hiệu m u được thiết kế như sau:

FAM là tính hiệu của bộ primer/probe HeoTEX là tính hiệu cua bộ primer/probe BòHEX là tính hiệu của bộ primer/probe Gà