Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp bacteriocin và ứng dụng

Trong các hệ vi sinh vật có khả năng tong hợp bacteriocin thì nhómvi khuẩn lactie LAB có ưu thế hơn cả [23].Trong thực phẩm lên men, LAB hiển thị nhiều hoạt động kháng khuẩn.. Bacterioci

ĐẠI HOC QUOC GIA THÀNH PHO HO CHÍ MINH

TRUONG DAI HOC BACH KHOA

“2

NGUYEN THI NGUYET

NGHIEN CUU QUA TRINH SINH TONG HOP

BACTERIOCIN VA UNG DUNG

CHUYEN NGANH: CONG NGHE SINH HOCMA NGANH: 60.42.80

LUẬN VAN THAC SĨ

TP HO CHÍ MINH, tháng 08 năm 2014

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠITRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOAĐẠI HỌC QUOC GIA TP HO CHI MINH

Cán bộ hướng dẫn khoa hoc: TS Nguyễn Thi Bich HồngCán bộ chấm nhận xét 1: TS Nguyễn Hữu Phúc

Cán bộ chấm nhận xét 2: PGS TS Nguyễn Thúy Hương.Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Truong Dai hoc Bách Khoa, DHQG Tp HCMngày l5 thang 8 năm 2014

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ bao gồm:(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vi của Hội đồng cham bảo vệ luận văn thạc sĩ)1 PGS TS Nguyễn Tiến Thang

2 TS Nguyễn Hữu Phúc3 PGS TS Nguyễn Thúy Hương

4 TS Phan Ngọc Hòa5 TS Hoàng Anh HoàngXác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyênngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nêu có).

CHỦ TỊCH HỘI DONG TRƯỚNG KHOA KTHH

ĐẠI HỌC QUOC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAMTRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨHọ tên học viên: Nguyễn Thị Nguyệt MSHV: 12310742Ngày, tháng, năm sinh: 29/03/1985 Nơi sinh: Bình ThuậnChuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Mã số : 60.42.80I TÊN DE TÀI: Nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp bacteriocin và ứng dụngII NHIEM VU VÀ NOI DUNG

1 Khảo sát các nghiên cứu làm tiền dé thực hiện chế độ lên men fed-batch déthu bacteriocin có hoạt tính cao từ Lactococcus lactis.

2 Lên men fed-batch.3 Ứng dụng trong bảo quản nguyên liệu mật hoa dừaIl NGÀY GIAO NHIỆM VU : 01/2014

IV NGAY HOAN THANH NHIEM VU: 06/2014V CAN BO HUONG DAN: Ti ns Nguyễn Thị Bich Hong

Tp HCM, ngày thang năm 2014

CAN BO HUONG DAN CHU NHIEM BO MON DAO TAO

(Ho tén va chit ky) (Họ tên và chữ ky)

TRƯỞNG KHOA

(Họ tên và chữ ký)

LỜI CÁM ƠNTôi xin chân thành cảm ơn Cô Nguyễn Thị Bích Hồng đã quan tâm và chia sẻ với tôinhững khó khăn trong quá trình thực hiện luận văn Đặc biệt, tình cảm của Cô dành chotôi là động lực rất lớn để tôi hoàn thành tốt luận văn này.

Tôi xin chân thành cảm ơn Cô Nguyễn Thúy Hương, Cô Lê Thị Thủy Tiên, Cô

Huỳnh Ngọc Oanh đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong thời gian học tập tại trường,động viên an ủi, quan tâm chia sẻ khi tôi gặp trở ngại, tạo điều kiện về thiết bị dụng cụphòng thí nghiệm và những góp ý trong quá trình làm luận văn của tôi.

Cũng không thể quên gửi lời cảm ơn tới cô Võ Thị Ly Tao, chị Trần Trúc Thanh, bạnNguyễn Anh Tuần đã giúp đỡ về dụng cụ phòng thí nghiệm cho tôi

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các bạn học cùng khóa đã hỗ trợ nhiệt tình, trao đổi vàgiúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Và cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình tôi luôn hỗ trợ và động viênđể tôi toàn tâm trong quá trình học tập

TÓM TAT LUẬN VANĐề tài luận văn: “Nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp bacteriocin và ứngdụng”

Nội dung đề tài:

1 Khảo sát các nghiên cứu làm tiền dé thực hiện chế độ lên men fed-batch déthu bacteriocin có hoạt tính cao từ Lactococcus lactis.

Tối ưu một số điều kiện nuôi cây và dinh dưỡng thu bacteriocin trong lên menbatch Khảo sát mức độ tiêu thụ đường theo thời gian nuôi cấy của chủng giống.Khảo sát ngưỡng ức chế

2 Lên men fed-batch.3 Ứng dụng trong bảo quản nguyên liệu mật hoa dừa

Kết quả đê tài

- Tái định danh chủng giống băng bộ Kit API 50 CHL: độ tương đồngLactococcus lactis 92%

- Trong lên men batch: bacteriocin có thời gian nuôi cấy tối ưu là 16 giờ Điềukiện nuôi cấy tối ưu ở nhiệt độ 37 °C, pH 6, tỷ lệ cấy giống 10% Điều kiện dinhdưỡng thích hop: sucrose với nồng độ 20 g/l, ngưỡng ức chế 60 g/l Hoạt tínhbacteriocin trong lên men batch ở điều kiện tối ưu đạt 2180 AU/ml

- Trong lên men fed-batch: tiến hành nuôi cấy ching Lc lactis trong môitrường MRS chuẩn có bố sung sucrose để duy trì nồng độ là 20 g/l Chúng tôichon thời điểm bồ sung sucrose là 6 giờ giúp duy trì pha log nhanh, chu kỳ bổsung sucrose 2 giờ, đồng thời duy trì điều kiện nuôi cấy tối ưu Kết quả hoạt tínhbacteriocin dat 3210 AU/ml sau 12 giờ nuôi cấy Tại thời điểm 16 giờ, hoạt tínhbacteriocin đạt 3215 AU/ml, nâng cao năng suất tong hợp bacteriocin lên 147% sovới lên men batch.

- Ứng dung bao quản nguyên liệu mật hoa dừa: bố sung 0.3% dich bacteriocinvới hoạt tính 3210 AU/ml, thu nhận bởi quá trình lên men fed-batch, giúp kéo daithời gian bảo quản nguyên liệu mật hoa dừa 3 ngày so với mẫu đối chứng khôngsử dụng dung dich bacteriocin ở điều kiện nhiệt độ phòng

Optimize culture conditions and nutrition for collecting bacteriocin utilizingfed-batch fermentation mode.

Survey sugar consumption over time by culturing strains and inhibitionthreshold.

2 Fed-batch fermentation.3 Applications in material preservation of coconut nectarResults:

- Re-identification of Lactococcus lactis strains by using API 50 CHL Kit:Lactococcus lactis similarity reached 92%

- In fed-batch fermentation: bacteriocin has optimal incubation time in 16h;Optimal culture conditions at 37°C, pH 6, 10% inoculation rate Appropriatenutrient conditions: sucrose concentration 20¢/I, inhibition threshold of 60ø/I Thebacteriocin activity is 2180 AU/ml.

- In fed-batch fermentation: Lactococcus lactis cultured strains lactis in MRSmedium supplemented with sucrose standards to maintain concentration of 20 gi].The timing of additional sucrose at 6h helped to maintain rapid log phase,additional cycles of sucrose for 2 hours, maintaining optimal culture conditions.Results activated bacteriocin reached 3210 AU/ml after 12 h incubation At thetime of 16h, activated bacteriocin reached 3215 AU/ml, increasing biosynthesisproductivity of bacteriocin up 147% compared to batch fermentation.

- Addition of 0.3% liquid activated bacteriocin to 3210 AU/ml obtained by thefed-batch fermentation process helps prolong shelf materials of coconut nectar 3

MỤC LỤC

ÿI90097.0017 |CHƯƠNG 1 TONG QUAN TALI LIỆU - s5 66s 3E E9E2ESEEESEEESESEEEEeEeEcEEEsEsereseseree 3Bi na 3IS run e 61.2.1 Déic Aim, tinh nan 61.2.2 Phân loạI DACÍ€TIOCHHN - cu Kê 71.3 Hệ vi sinh vật và quá trình sinh tổng hop bacteriocin + 525552 5s+s+scscs+2 81.3.1 Hé vi sinh vat sinh tong hỢP DACTCTIOCII cccccccccccccccecceceececsecccccecececeseeeseseeeeeeeess ổ1.3.2 Các cụm gen sinh tong hợp baCt€FÌOCÌH -c-c-ccEESE‡E‡EeEsEeEerererrererered 101.3.3 Sinh tong hợp ĐqCI€FÌOCÌN «c1 1E TT cưyi 111.3.4 Cơ chế điều hòa quá trình tổng hợp DaCteriOCiNe.cseccccccscsesssesesesesesvscsesveenenees 1213.5 Cơ chế hoạt động CUA DACÍCTIOCHTN G9111 1991111111111 1 ng và 1331.3.6 Cơ chế tự miễn bacteriocin của tế bào Chit cecccccccccscsssesccsesseseseesesscsesscsesscsevscsesscseseeass 151.4 Ứng dụng baCf©riOCT - 56-65522132 3932123915 12111 211111111111 111.11 01111111 161.5 Các yêu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hop bacteriocin -5s+: 201.6 Nguyên liệumật hoa đừa - - << 00 221.7 Tinh hình nghiên Cứu trong Và ASOT HHỨC cece v1 1111111111111 xxx 26NĂNG 0106.180 8 na.ộằộằộằ 261.7.2 CAC 1ghi€n CUU OAL DUOC 7a ốnốốốốốốốỐốỐốẦốẦẮốeẮe ẢẢẢ ÔỎ 26CHUONG 2 VAT LIEU VA PHƯƠNG PHÁP - 6E EEsESESESEEEEeEseresereree 292.1 Giống vi sinh vật — Hóa chất — Môi trường o ceceeccccsesccscsessesesesecsesessesesesseseseseeseseeseees 29PIN Nc an na vn hố hố ä_ẽ 292.1.2 Hóa chất và môi IFưỜng NUOL CẤY -c- + + ttEEEkEEkSkSkSEEEEEEEEEEEEE ru 292.1.3 Thiết bị và //71/750678.17 087/77/7220 302.2 Nội dung nghiÊn CỨU G1 9.0000 312.3 Bồ trí thí nghi@Me.c ccc ccccscscscsesescscscsscsescscscsscscscscsssscscssscsesscscscsvssecscssscesssesens 322.3.1 Đặc điểm hình thải đại thé, vi thỂ c-csccctcectteExrttritrtrttrrrrrtrrrrrrrrirrrriio 32

2.3.2 Tái định danh giống thuần bằng bộ kit API 50 CHLL + scsrsreesrsrererees 322.3.3 y dựng đường CONG SIHÍ UU H@ ĂĂẰ Tà 332.3.4 Khảo sát điều kiện nuôi cấy và môi trường dinh dưỡng trong lên men

172, h.< 342.3.4.1 Khao sát pH tối ưu của quá trình nuôi cấy w.cceecesescssesessssessessseseseseseeseseseees 342.3.4.2 Khảo sát nhiệt độ nuôi cấy tối ưu - ¿S65 Sk SE Exrkrkrtrret, 342.3.4.3 Khảo sát tỷ lệ cây giống tối ưu ¿5-52 Set EExSkEEEkErrkerrrkreerrred 342.3.4.4.Khảo sát ảnh hưởng của nguồn cacbon +55 +52 S++s+S+£ezxvrsrereersred 342.3.4.5 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng cacbon - << sexy 352.3.2 Lên men Fed — (ÍCỈH «<< cọ vn 352.3.6 Khảo sát anh he ng nông độ dịch bacteriocin đến thời gian bảo quản

/J14/4/2(8112/8//408//2.8/).;000000n0n0n8080808808 352.3.7 Phuong PRGD Ph tach07866 eeheấM 1äă 372.3.7.1 Phương pháp Vi Sih - cờ 372.3.7.2 Phương pháp hóa sinh - - << + 1 990010 ngờ 39CHUONG 3 KET QUA VÀ BIEN LUẬN ¿-G- + + E2 ESE SE SE EeESEEEeEskEserksereree Al3.1 Tái định danh chủng ging c.ceccccscscssesessssesscsesesscsesesscsesecscsessscsssecsescsesscsssesscseseeseseseees 413.2 Xây dựng đường cong sinh trưởng chủng Le Íđ€fiS 5S Ă S231 kess 423.2.1 Xây dựng đường CHUGN tt kEEEEEEEEEEEEEEET TT TT E111 1111111111110 1x 423.2.2 Xây dựng đường CONG SIHÍ UU H@ ĂĂĂ SH kg và 443.3 Khảo sát điều kiện nuôi cấy và môi trường dinh dưỡng trong lên men batch 463.3.1 Khảo sát pH toi ưu của quá trình nuôi CẤY Set EkSkSkSEEEEEEESEsrsrererereeo 463.3.2 Khao sát nhiệt độ nuôi cấy 717777 493.3.3 Khảo sát tỷ lệ cấy giống tỐI 1fM -c- + ctttEEEESETTk ST E111 1111111 tk 523.3.4 Khảo sát ảnh hư ng của ngHÔn CaCĐOH - cv SE SESESE+EEEEEEESEsEsrsrererees 533.3.5 Khao sát anh hur ng của hàm WONG CACOH cece sees 11111 Ettsseessssss 563.4 Lên men fed-batch - 1131310100101 00000000 ke 593.4.1 Phân tích các khảo sát làm tiên dé cho lên men ƒed-batch -ccscscecee: 593.4.2 Khao sat quả trình lên men ÍG@-AfCÌH 111991111111 111111 ng v2 ó2

3.5 Kết quả khảo sát ảnh hưởng nông độ dich bacteriocin đến thời gian bảo quannguyên liệu mật hoa MWA - «G0 0 kh 65SSD CHỈ TIÊU VÌ SITLH, SG cG c0 ng cr ó63.2.2 Chi ti€u HÓA SIHH, S -cG c3 SE SH TK ng crg 70CHUONG 4 KET LUẬN VA KIEN NGHỊ uu cccccccscssccscececesseescecececesvevecscecsesevavacececeeaceceess 74AL K@tlUdin cc.ccccccceccccccsccecescssssscececessevevscscecsesevscscececsevevacacecesvavavacacecssevasaeesavacaceceseevevacees 744.2 Kiến nghi ccccccccccccccscsscsescscsssscscscscsssscscscscssscscscsvssesesesssvssescscscsssesscscsssssssssecsessavesesseass 74TAI LIEU THAM KHẢOO (tt E611 919191 1 9 969191 1 1E 1111012119 111018 ng gx 76

CÁC TỪ VIET TAT

LAB: vi khuẩn sinh lactic.Lc.lactis: Lactococcus lactis.TSVKHK: tổng số vi khuẩn hiéu khí.TSNM-NM: tong số nắm men — nam mốc.PDA: Potatose Dextrose A gar.

MRS: Man, Rogosa, Sharpe.

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Tổ chức cụm gen sinh tổng hop Nisin - ¿555552 55cc+cccscce2 IIHình 1.2 Quá trình sinh tổng hợp lantibiotic ¿5552 5s5c+cscecxceersceee 12Hình 1.3 Cơ chế hoạt động cua bacteriocin ở vi khuẩn lactic 5s: 15Hình 3.1 Đặc điểm đại thể, vi thé của chủng Le IACTIS -5- 2525555 55+c+cscscecs2 41Hình 3.2 Kết quả tái định danh từ bộ Kit API 50 CHL - 55+: 42

DANH MỤC BANGBảng 1.1 Thanh phan axit amin va vitamin trong mật hoa dừa - 23Bảng 3.1.Tuong quan giữa OD¢ionm và mật độ tế bàO Sc Sen SH ng, 43Bảng 3.2 Điều kiện nuôi cay trong lên men fed-batch -. - 525555: 60Bảng 3.3 Chế độ bố sung sucrose trong lên men fed-batch_ - 61Bảng 3.4 Kết qua OD và hoạt tinh bacteriocin trong lên men fed-batch 62

DANH MỤC ĐỎ THỊĐồ thị 3.1 Đường tương quan giữa OD¿¡o và mật độ tế bào - 5-5-5 tenes 43Đồ thị 3.2 Đường cong sinh trưởng của chủng Le ÏđcfiS -55c+c+cscccecs¿ 44

Đồ thị 3.3 Anh hưởng của pH đến sự phát triển sinh khối -. - 46

Đồ thị 3.4 Ảnh hưởng của pH đến khả năng tong hop bacteriocin 47

Đồ thị 3.5 Anh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển sinh khối - 49

Đồ thị 3.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng tong hop bacteriocin 50

Đồ thị 3.7 Anh hưởng của ty lệ giống đến sự phát triển sinh khối 52

Đồ thị 3.8 Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến sinh tổng hop bacteriocin 53

Đồ thị 3.9 Anh hưởng của các loại đường lên sự sinh trưởng của Le lacfis 34

Đồ thị 3.10 Ảnh hưởng nông độ đường đến sự sinh trưởng của Le lactis 57

D6 thị 3.11 Anh hưởng nồng độ đường đến sinh tổng hợp bacteriocin củay7 innớgớgớ ốốẶằẶẶc, 57

Đồ thị 3.12 Quá trình sinh trưởng của chủng Le lactis trong lên men fed-batch 63

Đồ thị 3.13 Quá trình sinh tổng hop bacteriocin của chủng Lc lactis trong lênMeN fed-batch T1 aa 64

Đồ thị 3.14 Sự phát triển TSVKHK theo thời gian bảo quản của các mẫu 66

Đồ thị 3.15:Tông số nắm men — nắm mốc theo thời gian bao quản của các mau 68

Đồ thị 3.16 Sự thay đổi pH ở các mẫu khảo sát theo thời gian 70

Đồ thị 3.17 Nồng độ đường tổng theo thời gian ở các mẫu bảo quản 71

MO DAUTrong những năm gan đây người tiêu dùng có ý thức vẻ sức khỏe đang timkiếm các loại thực phẩm tự nhiên mà không cần chất bảo quản hóa học Vì vậy,chất bảo quản sinh học có nguồn gốc từ vi sinh vật và các sản phẩm chuyển hóacủa chúng giúp kéo dài thời hạn sử dụng, tăng cường an toàn thực phẩm đượcquan tâm hơn Trong các hệ vi sinh vật có khả năng tong hợp bacteriocin thì nhómvi khuẩn lactie (LAB) có ưu thế hơn cả [23].

Trong thực phẩm lên men, LAB hiển thị nhiều hoạt động kháng khuẩn Điềunày chủ yếu là do việc sản xuất các axit hữu cơ và các hợp chất khác nhưbacteriocin, peptide kháng nam Một số bacteriocin với tiềm năng công nghiệp đãđược điều chế và tinh sạch [32] Nisin là một ví dụ điển hình về sự thành công

thương mại Bacteriocin được coi là chất phụ gia an toàn (GRAS), hữu ích để

kiểm soát sự phát triển thường xuyên của các mam bệnh và vi sinh vật làm hưhỏng trong thực phẩm Trước tình trạng lây lan của vi khuẩn kháng kháng sinh vànhu câu về các sản phẩm sử dụng ít hóa chất, nhiều chuyên gia đã tập trungnghiên cứu bacteriocin như một giải pháp thay thế hiệu quả dé hạn chế van đề trên

[46].Bacteriocin là peptide được tổng hop ở ribisome, tích điện dương, có khốilượng phân tử thấp, bên nhiệt, nhạy cảm với enzyme phân hủy protein và có khảnăng ức chế các chủng có quan hệ ho hang gan gũi với chủng sinh bacteriocin đó[33, 45] Chúng hoạt động chống lại sự hư hỏng thực phẩm và vi sinh vật gâybệnh truyền qua thực phẩm bao gồm cả vi khuẩn Bacillus cereus, Clostridiumperfringens, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes |49, 40].

Tuy bacteriocin có tiềm năng ứng dung rộng rãi, nhưng chi phi sản xuất, tinhsạch khá cao và pho kháng khuẩn của bacteriocin còn hep Do đó, đã có nhiềunghiên cứu về tối ưu môi trường, dé xuất kỹ thuật nuôi cấy nhằm giảm chi phí sảnxuât bacteriocin.

Từ những điều thực tiễn đó, nghiên cứu quá trình sinh tong hợp bacteriocin vàsử dụng trong bảo quản thực phẩm an toàn là điều cần thiết và có ý nghĩa quan

trọng.

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài gồm:- Khảo sát chế độ lên men fed-batch để cải thiện quá trình sinh tổng hợpbacteriocin.

- Bước dau ứng dụng bảo quản nguyên liệu mật hoa dừa.Nội dung đề tài:

1 Khảo sát các nghiên cứu làm tiền dé thực hiện chế độ lên men fed-batch déthu bacteriocin có hoạt tính cao từ Lactococcus lactis.

2 Lên men fed-batch.3 Ứng dụng trong bảo quản nguyên liệu mật hoa dừa

CHƯƠNG 1 TONG QUAN TÀI LIEU

1.1 Vi khuan lacticVi khuẩn lactic thuộc ho lactobacilliaceae, là các vi khuan Gram dương, chịuaxit, không hình thành bao tử, tuy nhiên hiện nay người ta tim thay một số giốngtrong họ vi khuẩn lactic có khả năng tạo thành bào tử Một số loài hiếu khí và cóthé sử dụng oxy thông qua enzyme flavoprotein oxidase, trong khi những giốngkhác ky khí nghiêm ngặt Vi khuẩn lactic không chứa cytochrom và enzymecatalase, có khả năng tổng hop peroxydase rất mạnh Chúng phân giải HạOs tạo ranước và O; dé phát triển Vi khuẩn lactic phát triển tối ưu ở pH 5,5 - 5.8

Theo khóa phân loại của Bergey, họ Lactobacteriaceae chia làm hai họ.Họ Streptococeae chia ra Streptococcus va Leuconostoc.

Ho Lactobacileae chỉ có một loài là Lactobacillus.Vi khuẩn lactic có nhiều trong thiên nhiên Chúng tổn tại nhiều ở cỏ, trongđường ruột, miệng người và động vật.

Vi khuẩn lactic là nhóm vi khuẩn lên men cacbohydrat khi có hoặc không cóoxy và tạo nên sản phẩm chính cudi cùng là axit lactic LAB có vai trò quan trọngtrong công nghiệp sữa, muối chua rau quả, cũng như trong nông nghiệp và dược

phẩm Đặc tính khác của vi khuẩn lactic được xem trọng là chúng có khả năng tạo

ra bacteriocin ức chế một số vi sinh vật gây bệnh, ngăn chặn sự phát triển của cácnguôn bệnh trong thực phẩm [5]

Trong quá trình trao đối chất, LAB sinh ra các sản phẩm va các hợp chatkháng khuẩn như diacetyl, hydrogen peroxide, acetone, các axit hữu cơ vàbacteriocin Bacteriocin sinh ra bởi LAB được ứng dụng là các chất bảo quản tựnhiên trong thực phẩm LAB là vi khuẩn an toàn cho con người do chúng và cácsản pham của chúng không gây ra tác dụng phụ khi sử dụng trong thực phẩm lênmen, mà còn tăng hương vi và làm chậm sự phát triển của vi sinh vật gây hư hỏngtrong thực phẩm [12]

Kha năng sinh bacteriocin của LAB được biết nhiều ở một số chủng thuộc chiLactococcus, Pediococcus, Enterococcus, Lactobacillus Nisin, bacteriocin do

Lactococcus lactis sinh tông hợp, được tô chức nông lương thé giới và tổ chức y

tế thế giới cho phép sử dụng như một chất phụ gia thực phẩm Nisin được biết đến

với khả năng ức chế sự sinh trưởng của một số chủng thuộc chi Lactobacillus,Streptococcus, Enterococcus, Staphylococcus aureus, Listeria monogenes, tễ baosinh dưỡng Bacillus sp., Clostrium sp., ức chế nảy chổi bao tử Bacillus vàClostrium.

Ngoài nisin, Lc./zcfs còn có khả năng sinh tong hợp những phân tửbacteriocin kích thước nhỏ và bền nhiệt như lactococin A, B, M Lactococin cóphổ kháng khuẩn hẹp hơn nisin, chỉ ức chế những chủng Lactococcus khác vớichung san xuat [2]

Đặc điểm tế bào vi khuẩn Lactococcus lactis:Trong môi trường dịch thể, tế bao thường ton tại ở dạng kết đôi hoặc chuỗingăn Tế bào Gram dương, không hình thành nội bào tử, không di động, không cóvO bọc, Vi hiéu khi , catalase am tinh, oxidase am tinh

Phương thức biến dưỡng là hóa dưỡng hữu co, lên men lactic đồng hình mộtsố nguồn cacbon tạo sản phẩm chủ yếu là L(+)- axit lactic, nhưng không sinh hơi.Lactococcus lactis có nhu cầu dinh dưỡng phức tap, chúng cần nhiều cơ chất khácnhau trong môi trường dé sinh trưởng [53]

Quá trình trao đối chatQuá trình trao đối chất và năng lượng của LAB thực hiện thông qua lên menlactic LAB được chia thành hai nhóm: nhóm lên men lactic đồng hình và nhómlên men lactic di hình.

Lên men lactic động hìnhLà quá trình lên men trong đó sản phẩm axit lactic tạo ra chiếm 90% tổng sốcác sản phâm lên men và một lượng nhỏ axit axetic, axeton, diaxetyl

Phương trình tổng quát quá trình lên men:

Trong quá trình lên men lactic đồng hình, glucose được chuyển hóa theo chutrình Embden-Mayerhof, vi khuẩn sử dung enzyme aldolase vàtriozophosphatizomerase cho quá trình này, còn hydro tách ra khi dehydro hóatriozophophat được chuyển đến pyruvat Trong vi khuẩn lên men lactic đồng hìnhkhông có enzyme cacboxylase nên axit pyruvit không phân hủy nữa mà tiếp tụckhử thành axit lactic.

Lên men lactic di hìnhLà quá trình lên men trong đó ngoài san phẩm chính axit lactic còn tạo ra mộtlượng đáng kế các sản phẩm phụ như axit axetic, etanol, axit sucxinic, CÓ

Phương trình tổng quát quá trình lên men

C¿H¡;O; —>CH;CHOHCOOH + HOOC(CH;);COOH + CH:COOH + C,HsOH +CO; + H;

Trong đó, axit lactic chiễm khoảng 40%, axit sucxinic khoảng 20%, rượuetylic và axit axetic 10%, các loại khí 20%, đôi khi không có các khí nay mà thayvào đó là sự tích lũy một lượng ít axit formic Như vậy, các sản phẩm phụ khácnhau đáng kế tạo thành trong quá trình lên men lactic dị hình chứng tỏ quá trìnhnày phức tạp hơn so với lên men lactic đồng hình

Vi khuẩn lactic không có các enzyme co bản của sơ đồ Embden-Meyerhorf làandolase và triozophosphatizomerase Nghĩa là, qua glucose-6 phosphat, 6-phosphoglucose va ribulose-5-phosphat Ribulose-5-phosphat dưới tac dung củaepimerase chuyén thành xilulose-5-phosphat Xilulose-5-phosphat dưới tác dụngcủa enzym pentose phosphoketolase bị phân hủy để tạo thành andehitphosphoglyxerinic va axetil phosphat Dưới tác dung của axetatkinase (cóphosphoril hóa ADP) sé tạo thành axetat (hoặc bị khử thành axetaldehit rồi thànhrượu etanol), còn andehit phosphoglyxerinic theo con đường thông thường của sơđồ Embden-Meyerhorf

Theo quan điểm tiễn hóa sinh lý trong vi sinh vật học người ta cho rằng lênmen lactic đồng hình là hướng tiễn hóa độc lập của lên men di hình [5]

1.2 Bacteriocin1.2.1 Đặc điểm, tính chất

Bacteriocin từ LAB có thể định nghĩa là phân tử protein nhỏ hoặc peptideđược tổng hợp bởi ribosome và tiết vào môi trường, có pho kháng khuẩn tươngđối hẹp Sinh tong hop bacteriocin được xem như cơ chế tự vệ và sinh tồn của tếbao, kháng lại các vi khuẩn khác Có một xu hướng tăng sử dụng các chất chuyểnhóa tự nhiên để ngăn chặn sự phát triển của các vi sinh vật không mong muốntrong thực phẩm Các chất chuyền hóa có thể thay thế việc sử dụng các hóa chấtphụ gia như axit sorbic, sulfur dioxide , nitrit, nitrat Trong số đó, bacteriocinsinh tong hợp bởi LAB đã thu hút sự chú ý, vì do ban chất protein nên việc sửdụng bacteriocin không gây ra độc tính Bacteriocin không gọi là thuốc khángsinh, chúng không gây ra tác dụng phụ, không gây ra các phản ứng dị ứng trongcơ thé con người và các van dé sức khỏe do bị phân cắt nhanh chóng bởi protease,lipase, trong đường tiêu hóa, dé dàng điều khiến bởi các enzyme phân hủyprotein [48].

Bacteriocin của vi khuẩn Gram dương có những đặc điểm khác biệt so với vikhuẩn Gram âm: phan lớn không có các receptor đặc hiệu, khối lượng phân tử nhỏhơn colicin, có phố kháng khuẩn rộng, có các trình tự leader trong suốt quá trìnhchưa trưởng thành và có nhiều hệ thong diéu hoa chuyên chở đặc hiệu [14] Trongcác bacteriocin của vi khuẩn Gram dương, bacteriocin từ LAB có nhiều đặc điểmthích hợp dé sử dụng làm chất bảo quản thực phẩm, chang hạn như:

¢ Ban chat protein, làm bat hoạt các enzyme phân giải protein của hệ tiêu hóa.- Không độc đối với vật thí nghiệm

¢ Hoạt tính không độc hai đối với các tế bào nhân chuẩn.¢ Có khả năng chịu nhiệt (có thể duy trì hoạt động kháng khuẩn sau khi thanhtrùng và tiệt trùng).

¢ Pho kháng khuẩn rộng, tiêu diệt hầu hết các vi khuẩn Gram dương, vi khuẩnGram âm, bao gồm các tác nhân gây bệnh như L.monocytogenes, Bacillus cereus,S.aureus và Salmonella.

¢ Yếu tố quyết định di truyền thường năm trong plasmid, tạo điều kiện biến đổigen để tăng sự đa dạng của các peptide tự nhiên với các đặc tính mong muốn

Vì những lí do trên, bacteriocin được sử dụng lam chất bảo quản sinh họctrong thực phẩm, điều này giúp phát hiện tiềm năng của các peptide tự nhiên [23]

1.2.2 Phân loại bacteriocinBacteriocin do LAB sản xuất được chia thành 4 lớpLớp I: (Lantibiotic) những phân tử peptide nhỏ (<5kDa), chịu nhiệt, hoạt độngtrên cau trúc màng Lantibiotic chứa những axit amin hiếm (lanthionine, 3-methyllanthionine) và một số axit khử nước Lantibiotic có thé được chia thànhhai phân lớp dựa vào những đặc điểm cau trúc và chức năng:

Lớp Ia: là những peptide tích điện dương, gồm từ 21 — 38 axit amin Nhữngpeptide này hoạt động chủ yếu do sự phá vỡ trạng thái nguyên vẹn của màng tếbào đích Có thể chia nhóm này thành hai phân nhóm dựa trên kích thước, điệntích và trình tự peptide leader.

Lớp Ib: là những phân tử peptide hình cau, có thé chứa đến 19 axit amin Hoạtđộng chủ yếu của chúng là phá vỡ chức năng của các enzyme như ức chế việc sinhtong hợp vách tế bào của tế bào đích

Lantibiotic được tạo thành ở trạng thái bất hoạt với trình tự leader ở đầu N,trình tự này sẽ bị cắt đi trong quá trình trưởng thành dé phóng thích peptide hoạthóa.

Lop H: là những phân tử bacteriocin nhỏ (<10kDa) gồm những phân tửpeptide hoạt động ở màng tế bào, không chứa lanthionine và bên nhiệt, gồm 30 —60 axit amin Bacteriocin lớp II có phố kháng khuẩn hẹp Lớp II có thể chia thành3 phân lớp:

Lớp Ia: rất đa dạng, điểm đặc trưng là trình tự bảo tồn ở đầu N và hoạt tínhkhang Listeria.

Lớp IIb: những bacteriocin lớp này cần có sự kết hợp của hai peptide tronghoạt động dé có hoạt tính kháng khuẩn hoàn chỉnh Trong hầu hết các trường hợp,các peptide rời cũng biểu hiện hoạt tinh bacteriocin nhưng hoạt tính sẽ cao hơnkhi có sự diện của peptide thứ hai.

Lop IIc: bacteriocin phụ thuộc nhân tố sec- Phân tử bacteriocin lớp IIc đượcđưa ra ngoài té bào xuyên qua màng tế bào chất bằng con đường tiết phụ thuộcnhân t6 sec-

Bacteriocin lớp Ila có tiềm năng ứng dụng trong quy mô công nghiệp nhờ khảnăng kháng Listeria mạnh, thậm chí chúng còn được quan tâm nhiều hơn cácbacteriocin lớp I (nisin) do chúng có phô kháng khuẩn không rộng Pediocin PA-1là một ví dụ điển hình và được nghiên cứu pho biến nhất trong số các bacteriocinlớp la.

Lop IH: là những phân tử protein lớn (>30kDa), bền nhiệt Lớp này gồmnhững enzyme ngoại bào (hemolysin và muramidase) có hoạt tính sinh lý củabacteriocin Bacteriocin thuộc lớp II] được thu nhận từ một SỐ giốngLactobacillus.

Lớp IV: là những bacteriocin phức hop, ngoài protein còn có thêm lipid vacacbohydrate Hiện nay vẫn còn nhiều điều chưa biết về cau trúc cũng như chứcnăng cua bacteriocin thuộc lớp này vì chưa có phan tử nao được tinh sạch.Bacteriocin lớp IV là kết quả của sự tương tác đặc tính ky nước và tích điệndương của bacteriocin với các phân tử khác trong dịch thô Lớp này bao gồm cảglycoprotein hoặc lipoprotein.Vi dụ như leuconocin S và lactocin 27 [24,55].1.3 Hệ vi sinh vật và quá trình sinh tong hợp bacteriocin

1.3.1 Hệ vi sinh vat sinh tổng hop bacteriocinMột số chủng vi khuẩn lactic có khả năng tổng hop bacteriocin

Bacteriocin Vị sinh vat | MW (Da) Đặc tính

lactis dài tai pH 2 De bị phân hủy bởi

chymotrypsin, có khả năng kháng

lại trypsin, elastase,carboxypeptidase A, pepsin [2].

Laticin3714

Lactococcus

lactis 2847

Bén nhiét 6 100°C trong 10

phút với pH 5 hay 90°C trong 10

phút với pH 7 Nhay cam vớitrypsin,a- chymotrypsin, proteaseK, pronase E, khang pepsin [54].

Plantaricin C Lactobacillus

plantarum 3500-4000

Ôn định ở nhiệt độ phòng vanhiệt độ thấp, bền nhiệt ở 100°C

trong 60 phút hay 121°C trong 10

phút Hầu hết 6n định ở pH axithay trung tính Nhạy cảm vớipronase, trypsin và a —chymotrypsin, khang lai pepsin,protease K, a -amylase va lipase[25].

BavaricinA

Lactobacilusbavaricus 3500-4000

Bén nhiét 6 100°C trong 60phút On định ở pH từ 2 đến 97.Nhạy cảm với pepsin, trypsin,pronase E, protease K_ vàchymotrypsin A, khang lại vớicatalase [29].

Piscicolin126

Carnobacteriocinpiscicola JG126 4416

On định ở pH băng 2 sau khilưu trữ hai tháng ở 4°C Bên nhiệt

ở 100°C trong 120 phút tại pH 2-3,

trở nên ít ôn định ki pH tăng Nhay

cảm với chymotrypsin, ptotease,trypsin, kháng catalase, lipase vàlyzozyme [50].

Bên ở pH 4-6 ở 80°C trong 60

phút hay 100°C trong 10 phút.

pH tăng thì độ bền giảm Dễ bịPediocin Pediococcus 9400 phan hủy bởi trysin,

PA-1 acidilactici chymotripsin, papapain, ficin,

protease Khang laiphotpholipase C, catalase,

lysozyme, lipase [37].On dinh 6 pH tir 2 dén 10,Micrococcus A iê ° 4

Variacin | 2658 bên nhiệt 115°C trong 20 phút,

varians nhạy cảm với pronase E, protease

K, ficin, khang catalase [16].

1.3.2 Các cum gen sinh tong hop bacteriocinBacteriocin được tong hop bởi các ribosome Gen mã hoá cho sự sinh tong hợpvà miễn dịch của bacteriocin thường được tô chức thành các operon cluster Nhómgen bacteriocin có thé duoc dinh vi trén nhiém sac thé (subtilin va mersacidin),cũng có thé được định vị trên plasmid (divergicin A và sakacin A), hay gen nhảy -transposon (nisin và lacticin 481).

Operon sinh tổng hop lantibiotic thường chứa gen mã hoá trên tiền peptide,enzyme chịu trách nhiệm cho các phan ứng biến đối, quá trình phân hủy protein,chịu trách nhiệm tách rời leader peptide, ABC (ATP-binding cassette), họ proteinvận chuyên bao gồm protein vận chuyền peptide, protein điều hoà và các proteintự bảo vệ tế bào sản xuất Leader peptide có một vai trò rất quan trọng, nó giữ chotiền peptide ở dạng bất hoạt trong tế bào, phát ra tín hiệu vận chuyền lantibiotic rakhỏi tế bào, chứa các trình tự đặc biệt chỉ đường cho enzyme sinh tong hợp đi tớinơi thích hợp để thực hiện sự biến đối các axit amin và 6n định hình dạng củadomain propeptide [43].

nisA nisB nisT nisC nisi nisP nisR nisK nọ nisE nisG

Hình 1.1 Tổ chức cum gen sinh tổng hop Nisin [55].Cụm gen tong hop nisin: Nis A có nhiệm vụ tong hợp prepeptide trong khi đóNis B, nis C tổng hợp enzyme biến đổi axit amin; Nis P tong hop protease cónhiệm vụ cat các peptide leader; Nis L, nis FEG tổng hop các protein điều hòa cơchế miễn dịch; Nis R, nis K đảm nhận nhiệm vụ điều hoà và biểu hiện [55]

1.3.3 Sinh tong hợp bacteriocinHau hết các bacteriocin được tổng hợp dưới dạng tiền peptide bất hoạt cómang một trình tự leader peptide ở đầu bám và trình tự ở đầu C của propeptide

Trong trường hợp lantibiotic, các phân tử serine, threonine va cysteine trongphân propeptide trải qua những biến đổi sau dịch mã để hình thành Lan/MeLan

Con đường sinh tổng hợp lantibiotic gsm những bước sau:Bước 1: Sinh tong hợp phân tử tiền bacteriocin

Bước 2: Phân tử tiền bacteriocin bị biến đối bởi Lan B, Lan C sau đó được vậnchuyển qua màng bởi hệ thống vận chuyển ABC Lan T, đồng thời được biến đổibởi LanC để phóng thích phân tử bacteriocin trưởng thành Tuy nhiên, quá trìnhcắt trình tự leader peptide có thể xảy ra trước, trong hoặc sau bước xuất bào

Bước 3: Histidine protein kinase (HPK) cảm ứng sự hiện diện cua bacteriocinva tu phosphoryl hóa.

Bước 4: Nhóm phosphoryl hóa (P) được chuyển qua nhân to đáp ứng điều hòa(response regulator — RR).

Bước 5: Nhân t6 RR hoạt hóa sự phiên mã của các gen được điều hòa.Bước 6: Sự hiện diện cua bacteriocin cảm ứng hoạt động tự miễn của tế bàosản xuất Sự tự miễn được điều khiến bởi các protein miễn dịch, Lan I, protein vậnchuyển ABC và Lan FEG

Bước 3: Histidine protein kinase (HPK) cảm ứng sự hiện diện cua IF và tựphosphoryl hóa.

Bước 4: Nhóm phosphoryl hóa (P) được chuyển qua nhân to đáp ứng điều hòa(response regulator — RR).

Bước 5: Nhân t6 RR hoạt hóa sự phiên mã của các gen được điều hòa.Bước 6: Sự hiện diện cua bacteriocin cảm ứng hoạt động của các protein cóchức năng tự miễn của té bào chủ [43]

1.3.4 Coch điều hòa quá trình tong hợp bacteriocinQuá trình sinh tong hop bacteriocin duoc điều hòa nhờ hệ thống điều hòa haithành phân Hệ thống điều hòa này chứa hai protein phát tín hiệu: histidine proteinkinase (HPK) liên kết màng và nhân tố điều hòa đáp ứng trong tế bào chất

(reponse regulator — RR) Trong quá trình truyền tai tín hiệu, HPK tự phosphorylphân tử histidine khi nó cảm ứng được sự hiện diện cua bacteriocin ở nồng độ tớihạn trong môi trường Sau đó nhóm phosphoryl được chuyển đến phân tử axitaspartic ở vung RR tạo ra sự thay đối nội phân tử, tác động đến nhân tố điều hòađáp ứng làm hoạt hóa quá trình phiên mã của các gen được điều hòa Các gen điềuhòa gồm: gen cau trúc, gen xuất bào, gen miễn dich.

Trong trường hợp nisin và subtilin, phân tử bactreiocin đóng vai trò như mộttín hiệu ngoại bào để tự điều hòa quá trình sinh tổng hợp của chúng theo conđường truyền tải tín hiệu Ngược lại, hầu hết bacteriocin lớp II sản xuất mộtpeptide giống bacteriocin nhưng không có hoạt tính kháng khuẩn va sử dụng nónhư một nhân tố cảm ứng (IF) để hoạt hóa quá trình phiên mã của các gen đượcđiều hòa IF là một peptide nhỏ, bền nhiệt, tích điện dương va ki nước, được tonghợp dưới dạng một tiền peptide với một trình tự leader glycine kép Hệ thống vậnchuyển sẽ cắt bỏ peptide leader của IF cùng lúc với quá trình xuất bào của peptidetrưởng thành IF được tiết ra đóng vai trò như một tín hiệu ngoại bào và tác độngđến quá trình phiên mã của các gen liên quan đến việc sản xuất bacteriocin [56,57].

1.3.5 Coch hoạt động cua bacteriocinDo có sự khác nhau về cau trúc hóa hoc mà các bacteriocin sẽ có cách thức tácđộng khác nhau với các tế bào sống Các bacteriocin có thé tác động lên sự saochép, phiên mã, dịch mã, tổng hợp thành tế bào Tuy nhiên, hầu hết cácbacteriocin hoạt động băng cách tạo kênh hay lỗ trên màng làm phá hủy nănglượng hữu ích của tế bào sống

Cơ chế tác động của nisin được nghiên cứu kỹ nhất Nisin thuộc nhóm Ia, tíchđiện dương, liên kết tĩnh điện với mang phospholipid tích điện âm Kết quả taophan tương tác ki nước giữa bacteriocin với màng tế bào của tế bào đích Lysinelà axit amin tích điện âm có liên quan tới sự tương tác tĩnh điện này Sự tương tác

giữa phần kị nước của nisin và màng tế bào đích tạo những kênh ion không đặchiệu Việc tạo các lỗ làm giảm sự hiện diện của các ion dương hóa tri IT như Me,Ca** Bởi vi chúng trung hòa điện tích âm của phospholipid, làm giảm sự linhđộng của màng Các lỗ trên màng tạo bởi nisin làm cho các ion K*, MgTM, axitamin, axit glutamic, lysine va ATP thoát ra ngoài nhưng các protein lớn trong tếbào chất không qua được, vì vậy tạo thế màng, làm mất động lực proton nên sẽgây chết tế bào.

Lipid II cũng tham gia trong việc tạo thành các lỗ, lipid II đóng vai trò như

những phân tử cắt cụt cho các liên kết đặc hiệu với màng tế bào vi khuẩn.Ở bacteriocin như mersacidin và actagardin thì cơ chế hoạt động của chúng làtác động lên sự tổng hợp của thành tế bao, các bacteriocin nay ngăn cản việc gắncác phân tử glucose và D-alanine vào thành tế bào, sự tổng hợp DNA, RNA vàprotein xảy ra một cách tự do Cả hai bacteriocin nay đều ức chế sự sinh tổng hoppetidoglycan băng cách tạo phức hợp với tiền chất lipid II của peptidoglycan gắntrên màng.

Nhìn chung, cơ chế hoạt động của bacteriocin lớp Ila cũng giống như nisin.Đặc tinh bacteriocin nhóm này là kháng Listeria do sự hiện diện của trình tựYGNGV ở vùng dau N Giả thiết hiện nay dé lý giải cơ chế hoạt động của nhómnày là liên kết tĩnh điện của bacteriocin với màng tế bảo đích qua trung gian phântử receptor liên kết trên màng Giả thiết về receptor đáp ứng cho sự nhận diện kiểukháng Listeria YGNGV ở những peptide này Người ta cho rang bacteriocin nhómIla có thé tự tạo lỗ xuyên qua màng tế bào vì chúng là những bacteriocin cực nhỏvà lưỡng cực Cac bacteriocin lớp phụ Hc theo sự phân loại của Klaenhammer(1988) được chia thành hai nhóm khác nhau dựa vào việc có hay không có sự hiệndiện liên kết disulfit bên trong phân tử Do đó, hoạt động của hai nhóm này hoàntoàn khác nhau.

Các nghiên cứu trên màng được tiễn hành với lactococcin — bacteriocin thiếuphan L-cysteine và thấy rang đây là protein hoạt động trên màng Cơ chế hoạtđộng chính là sự tạo thành các lỗ trên màng tế bào Phố kháng khuẩn rộng củanhững hợp chất này chứng to có sự hiện diện cua receptor bacteriocin liên kết đặchiệu trên màng Các axit amin tích điện dương và tryptophan trong vùng ưa nướccó thể thuận lợi cho các tương tác không đặc hiệu với lớp phospholipid tích điệnâm của màng tế bào đích làm cho các lỗ xuyên màng 6n định hơn [24].

Class ll Ctass I Bacteriolysins

Pamidoghcar se ined 5, =

Hình 1.3 Co ch hoạt động của bacteriocin ở vi khuẩn lactic [23].1.3.6 Co ch tự miễn bacteriocin của t bào chủ

Đề đảm bảo sự tổn tại của vi sinh vật có kha năng sinh bacteriocin là sự tựmiễn đặc biệt, tức là tế bào chủ bảo vệ chính mình khỏi sự ảnh hưởng củabactericin sinh ra trong quá trình trao đối chat

Có hai hệ thống tự miễn lantiobiotic của tế bào chủ đã được nhận định, đó làcác protein miễn dịch Lan I và Lan FEG Hai hệ thống tự miễn này hoạt động hỗtrợ lẫn nhau bảo vệ tế bào chủ khỏi bacteriocin do chúng sinh ra

Lan I bám trên mặt ngoài của mang tế bào, ngăn chặn sự tạo lỗ của bacteriocindé bảo vệ tế bào Lan FEG vận chuyển các phân tử bacteriocin đã chèn vào mangra môi trường ngoại bào, vì vậy Lan FEG giúp giữ nông độ bacteriocin bên trongtế bào luôn ở mức thấp.

Gen tự miễn của bacteriocin lớp II thường mã hóa cho một loại protein liên kếtvới té bào chất Quadri và cộng sự (1995) xác định đa phan protein miễn dichCbiB2 của carnobacteriocin B2 tìm thấy bên trong tế bào chất và một lượng ít kếthợp với màng Theo Abdel-Dayem và cộng sự (1996), phan lớn protein tự miễnMesl của mesentericin Y tổn tại trong tế bào chat và chỉ một lượng nhỏ trên mangté bào

Protein tự miễn là những phân tử tích điện dương, khoảng 51-254 axit amin,

thể hiện khả năng tự miễn với bacteriocin Sự tương tác của protein tự miễn vớimàng tế bào giúp bảo vệ tế bào chủ không bị ảnh hưởng của bacteriocin do chúngsinh ra [14].

1.4 Ứng dung bacteriocinỨng dụng trong bảo vệ sức khỏe con ngườiGidi hạn của việc sử dụng kháng sinh để tiêu diệt các vi khuẩn gây bệnh làchúng có phô ức chế rộng Điều này sẽ giết không đặc hiệu bất kỳ loại vi khuẩnnào không kháng thuốc Do đó, kháng sinh tiêu diệt luôn các vi khuẩn có lợi chosức khỏe con người Người ta sử dung bacteriocin như là một giải pháp thay thé.Chúng có phố ức chế hẹp nên có thể xem như “thuốc độ thiết kế”, nó có tác dụngđặc hiệu với các vi khuẩn gây bệnh [46]

Chế phẩm sinh học có chứa các vi khuẩn sinh axit lactic dạng vi nangLactomin gồm Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium longum, Streptococcusfaecalis Những chủng vi khuẩn nay ức chế những vi khuẩn có hại dé tái lập cân

băng hệ thống vi sinh ở ruột [52].Mutacin sinh ra từ Streptococcus mutans biên doi di truyền được sử dụngtrong sản phâm chăm sóc sức khỏe răng miệng như kem đánh răng, nước súc

miệng để ức chế sâu răng va cao răng Bacteriocin có trong xà phòng, mỹ phẩmgiúp loại trừ mụn [41].

Ứng dung bacteriocin trong thủy sảnPhương pháp tri liệu sinh học sử dụng vi sinh vật có lợi trở thành công cuphòng ngừa, điều trị nhiều bệnh hiệu quả trong nuôi trông thủy sản thông qua khảnăng cải thiện môi trường nước và ức chế vi sinh gây bệnh Đặc biệt là các vi sinhvật này có khả năng tiết ra các sản phẩm làm giảm độc và đồng thời ức chế sựphát triển của các vi khuẩn có hại Trong đó, Lactobacillus sp có những đặc tínhtốt dé sản xuất probiotic và bacteriocin trong phòng và trị bệnh cho cá tra, có tínhđối kháng với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri (nguyên nhân gây bệnh gan thận mủtrên cá da trơn, đặc biệt là cá tra nuôi) đang là một giải pháp có triển vọng trongviệc phòng trừ bệnh gan thận mủ trên cá tra hiện nay [6].

Nisin cũng có khả năng bảo quản tốt các loại thủy sản như tôm, cá Bố sung5.10’ AU nisin vào 100 kg tôm hoặc cá sẽ kéo dài thời gian bảo quản từ 20 ngàylên 26 ngày [4].

L nh vực thực phẩmƯu điểm của bacteriocin trong bảo quản thực phẩm là làm tăng thời hạn sửdụng, hạn chế sự truyền mam bệnh, giảm thiệt hại kinh tế do thực phẩm hư hỏng,hạn chế sử dụng chất bảo quản hóa học cũng như xử lý nhiệt Bacteriocin giúpduy trì giá trị dinh dưỡng và vitamin của sản phẩm, cung cấp những thực phẩmmới (ít axit, hàm lượng muối thấp và hàm lượng nước cao) thỏa mãn nhu cầu củangười tiêu dùng [35] Xu hướng trong công nghiệp chế biến thực phẩm là hạn chếsử dụng chất phụ gia, chất hóa học nhân tạo, hạn chế quá trình chế biến nhưngphải đảm bảo an toàn, giữ nguyên chất lượng Những yêu cau này có thé đượcđáp ứng nhờ sử dụng bacteriocin [57, 26].

Một số bacteriocin phát huy được hiệu quả tốt hơn hắn khi sử dụng phối hợpvới các yếu tô kháng khuẩn khác như hop chất phenolic tự nhiên cũng như nhữngprotein kháng khuẩn khác Ngoài ra, sự kết hợp bacteriocin với xử lý vật lý như ápsuất cao hay xung điện giúp bảo quản thực phẩm hiệu qua hon, nhất là đối với

những vi khuẩn có khả năng sống sót cao như bào tử Hiệu quả bảo quản thựcphẩm của bacteriocin thường bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường như pH,nhiệt do, thành phan thực phẩm va cau trúc, cũng như hệ vi khuẩn có trong thực

phẩm Do đó, cần xác định hiệu quả cua bacteriocin cho mỗi loại thực phẩm [26]

Chủ yếu sử dụng bacteriocin cho xúc xích lên men, rau lên men, ô liu và các sảnphẩm sữa [32]

Các bacteriocin được sử dụng trong bảo quản sinh học thực phẩm dưới badạng chính

- U thực phẩm với giống vi sinh vật bảo vệ (thường là LAB) để taobacteriocin Trong trường hợp này, kha năng LAB sinh trưởng va tạo bacteriocintrong sản phẩm sẽ quyết định khả năng kéo dài thời gian bảo quản thực phẩm

- Bổ sung bacteriocin tinh khiết hay bán tinh khiết như là các chất bảo quảnthực phẩm

- Sử dụng sản phẩm lên men từ chủng sinh bacteriocin làm thành phan chếbiến thực phẩm [15]

Bảo quản các sản phẩm từ sữaNisin được cho phép sử dụng trong các loại thực phẩm khác nhau trên toàn thếgiới Bố sung 2000 IU/g nisin trong phô mai, kết quả là giảm 1000 lầnL.monocytogenes sau khi lưu trữ 7 ngày ở 20°C, so với mẫu đối chứng 10” CFU/g

L.monocytogenes.

Sự phát triển của L.monocytogenes từ 10° -10° CFU/ml trong phô mai Ricotta

được ức chế lên đến 55 ngày ở 6-8°C khi thêm vào 2,5 mg/l nisin [51].Bảo quản các sản phẩm thịt

Nitrit được su dụng pho bién trong khi udp thit để ôn định mau đỏ của thịt,kìm hãm sự thối thực phẩm và vi sinh vật gây độc như C botulinum Tuy nhiên,nitrit có thể phản ứng lại với amin bậc hai trong thịt gây ung thư cho người sửdụng Raymon và cộng sự (1981) báo cáo rằng kết hợp 3000 IU/g nisin và nitrit

với nông độ 40 ppm hầu như kìm hãm hoàn toàn sự phát triển của bào tử

Clostridium sporogenes trong thịt ở 37°C trong 56 ngày.

Pediocin AcH (PA-1) kiểm soát thành công sự phát triển của L.monocytogenestrong thịt gà sống Việc sử dụng 2400 AU/g pediocin làm giảm 2,8log CFU/g

L.monocytogenes sau 28 ngày bao quản ở 5°C [51].

Bảo quản rau quảBồ sung 6,3-6,5.10° AU nisin dé bảo quản 100 lít thịt quả nhuyễn của na, 6i,dứa, cà chua, nước 6i, nước dứa, bánh phở đã kéo dài thời gian bảo quản của cácloại thực phẩm này từ 45 ngày lên 60 ngày Bồ sung 5.10’ AU nisin trong 1 tanbánh phở cũng kéo dai được thời gian bao quản bánh phở từ 1 ngày (khi không bồsung nisin) đến 2 ngày (có bồ sung nisin) [4]

Rượu vang là loại thức uống có lợi cho sức khỏe Trong quy trình sản xuấtrượu vang, để kiểm soát sự phát triển của vi sinh vật làm hỏng rượu, người ta sửdụng SO, hoặc lysozyme SO, thường được sử dụng vì nó có pho tre ché rong vaduy tri tac dụng trong thời gian dai, SO vừa là chất khử trùng, vừa là chất chốngoxi hóa Tuy nhiên SO; lại ảnh hưởng đến sức khỏe con người, nên người ta tìm ranhững chất thay thế nhăm giảm lượng SO; trong rượu Lysozyme chống lại vikhuẩn Gram dương, không ảnh hưởng đến nấm men, nhưng giá thành cao vàkhông bên trong môi trường lên men rượu Ung dung bacteriocin trong sản xuấtrượu vang là một giải pháp Thế nhưng phải chọn lọc giống vi khuẩn sinhbacteriocin dé chúng thích nghỉ tốt trong môi trường rượu Những giống này pháttriển tốt trong quá trình lên men rượu và sinh một lượng lớn bacteriocin đủ để ứcchế các vi khuẩn làm hư rượu Những bacteriocin được dùng trong lên men rượunhư nisin, pediocin PA-1, pediocin N5p và plantaricin 423 Bacteriocin còn đượcdung dé tang chat lượng rượu va cải thiện mui vi rượu [12]

Bacteriocin trong màng bao thực phẩmSự kết hợp của bacteriocin trong màng bao gói dé hạn chế sự hư thối và vi sinhvật gây bệnh được nghiên cứu trong vài thập niên qua Màng bao gói kháng khuẩnngăn ngừa sự phát trién của vi sinh vật trên bê mặt thực phầm bang cách tiêp xúc

trực tiếp màng bao với bề mặt thực phẩm như thịt và phomat, bacteriocin có thểkhuếch tán dan dan từ mang bao gói đến bé mặt thực phẩm [15].

Bước dau sử dụng màng mỏng cellulose vi khuẩn (BC) hap phụ bacteriocin đểbảo quản thịt tươi sơ chế tối thiểu: có thể bảo quản thịt tươi đến 3 ngày bằng màngBC hấp phụ dịch bacteriocin 200 AU/m vẫn đảm bảo chất lượng thịt, theo TCVN7046:2002 [3] Hai phương pháp phố biến được sử dụng để chuẩn bị màng baogói với bacteriocin.

Phương pháp thứ nhất: kết hợp bacteriocin trực tiếp vào trong polymer Chănghạn như sự kết hợp của nisin vào protein màng sinh học dễ phân hủy làm từprotein đậu nành và cazein bắp Sự kết hợp của EDTA vào trong màng bao góilàm tăng hiệu quả kìm hãm của nisin chống lại E.coli

Phương pháp thứ hai: sự kết hợp của bacteriocin vào trong màng bao thựcphẩm để bao hay hấp phụ lên bề mặt polymer Chang hạn bao nisin và methylcellulose vào trong mang polyethylene, ethylen vinyl acetate, polypropylene,polyamide, polyester, acrylic, polyvinyl chloride [15].

1.5 Các y u to ảnh hưởng d n quá trình sinh tổng hop bacteriocinĐiều kiện môi trường, điều kiện nuôi cấy như thời gian, pH, nhiệt độ có ảnhhưởng đến năng suất của bacteriocin có hoạt tính Nhìn chung, sự sinh tổng hợpbacteriocin tốt hơn ở điều kiện tối ưu của chủng mục tiêu phát triển [42]

Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cayNhiệt độ: mỗi vi sinh vật phát triển ở một giới hạn nhiệt độ nhất định trongmôi trường nuôi cấy cụ thé Nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển sinh khối nêngián tiếp ảnh hưởng đến sinh tổng hợp bacteriocin Trong khoảng giới hạn nhiệtđộ thuận lợi, khi nhiệt độ tăng thì quá trình trao đổi chất tăng và sinh tong hop cacchat trong tế bao cũng tăng lên, trong đó có bacteriocin O một số ching LAB,nhiệt độ tối ưu cho quá trình sinh trưởng trùng với nhiệt độ tối ưu quá trình sinhtong hop bacteriocin Nhiệt độ tối ưu thu bacteriocin thường từ 30 — 37C [59,20].

Tuy nhiên, có trường hợp ngoại lệ, Todorov và cộng sự (2000) chứng minhnhiệt độ tối ưu cho sự tong hop bacteriocin ở một SỐ chung LAB thap hon so voinhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng [59].

pH: Theo Poolman và Konings (1988) pH là một trong những yếu tố quyếtđịnh tốc độ vận chuyển axit amin hoặc peptide, hoạt tính các enzyme Quá trìnhsinh tong hợp bacteriocin đạt tối ưu khi môi trường nuôi cay được điều chỉnh pHphù hợp (Vignolo va cs, 1995) Gia trị pH tối ưu phụ thuộc vào dong LAB và môitrường nuôi cấy pH tối ưu thường gặp cho quá trình sinh tổng hop bacteriocinkhoảng 6-7, pH axit hoặc kiềm thường ức chế sự phát triển LAB Trong một sốtrường hợp, giá trị pH tối ưu quá trình sinh tổng hợp bacteriocin thấp hơn pH tốiưu cho sự sinh trưởng [59, 20].

Thời gian nuôi cấy: Thời gian nuôi cay phù hợp giúp thu được bacteriocin cóhoạt tính cao nhất, kinh tế nhất, tránh các quá trình phân giải bacteriocin khi nuôicay trong thời gian dài Thời gian nuôi cấy phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy, môitrường và chung LAB [20].

Sản lượng bacteriocin tối đa có thé thu được ở nhiều pha khác nhau trong chukỳ sinh trưởng, do đó thời điểm bacteriocin sinh tổng hợp cao nhất không theomột quy luật cụ thé

Bacteriocin sinh ra trong giai đoạn sớm của pha log và tăng lên tuyến tínhcùng sự phát triển của sinh khối Có trường hợp hoạt tính bacteriocin cao nhất vàocuối pha log và sự giảm hoạt tính diễn ra trong pha cần bằng, hoặc hoạt tínhbacteriocin tăng trong giai đoạn pha cân bằng và đạt cực đại tại một thời điểmtrong giai đoạn cân bằng sớm [34, 38, 11] Có sự khác biệt này là do các nhân tốcảm ứng chuyên biệt của môi trường nuôi cấy, cũng như sự khác nhau trong quátrình điều hòa biểu hiện của các loại bacteriocin Thời gian nuôi cay càng dài thìlượng bacteriocin sinh ra càng giảm, nguyên nhân do sự thủy phân của cácenzyme thủy phân protein được tạo ra nhiều trong pha cân bằng Có trường hợpsinh tong hợp bacteriocin ôn định trong suốt pha cân băng [11]

Ảnh hưởng của môi trường nuôi câyThành phần môi trường ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp bacteriocin Sinhtong hop bacteriocin bởi các chủng S mutans sẽ gia tăng khi thêm 2% cao nammen vào mỗi trường cơ bản trypticase Tương tự, sự hình thành butyricin 7423trong môi trường phụ thuộc lượng casein hydrolysate thêm vào cho đến tối đa 5%.Quá trình sinh bacteriocin của chung Corynebacteria va Staphylococcus phụthuộc vào ham lượng axit amin trong môi trường nuôi cấy Theo De Carvalho(2009) S bovis HC5 sinh tong hop bovicin, phát triển nhanh chóng trong môitrường cơ bản chứa mono hoặc disaccharide, sinh khối tế bào và hoạt tính bovicintăng tuyến tính cùng với tăng nồng độ đường đến ngưỡng 16¢/l Theo De Vuystvà Vandamme (1992) nguồn cacbon tham gia điều hòa quá trình sinh tổng hợpbacteriocin bằng việc kích thích hình thành các enzyme liên quan đến quá trìnhbiến đổi và trưởng thành của bacteriocin sau phiên mã, hay những enzyme liênquan đến việc tạo ra những protein có vai trò trong tính kháng bacteriocin củachủng sản xuất, hoặc nó cũng có thể góp phần hình thành các tính hiệu khởi độngquá trình dịch mã [13].

1.6 Nguyên liệu mật hoa dừa

Mật hoa dừa là sản phẩm tỉnh túy của cây dừa thu được từ bắp hoa dừa cònnon, chứa rất nhiều dinh dưỡng dé hình thành và nuôi nắng cho tat cả các bộ phậncủa quả dừa sau này Trong mật hoa dừa có chứa một hàm lượng lớn cacbohydratlà đường sucrose từ 11,5-16,5% Trong đó, hàm lượng đường khử là <0,3%,protein <0,4% và khoáng từ 0,3-0,4% Ngoài thành phần chính là đường sucrosethì mật hoa dừa còn chứa 14 loại axit amin (trong đó có 8 loại axit amin khôngthay thế) và 12 loại vitamin khác nhau Trong đó, nhiều nhất là axit glutamic là34,20 mg/100g va inositol 127/70 mg/dl, axit glutamic là axit amin cần thiết chocơ thé trong việc vận chuyên thông tin của hệ thân kinh và có vai trò quan trongtrong việc tái sản sinh ở tuyến sinh dục nam Inositol là vitamin có nhiều tác dụngtrong việc bảo vệ sức khỏe con người.

Bảng 1.1 Thành phần axit amin và vitamin trong mật hoa dừaAxit amin (mg/100g) Vitamin (mg/dl)

Tryptophan | ,27 Thiamine (Vit B1) 77,0Lysine 0,32 Riboflavin (Vit B2) 12,20Histidine 1,19 Pyridoxine (Vit B6) 38,40Arginine 0,35 Para-aminobenzoic axit 47,10Aspartic axit 11,22 Pyridoxal 38,40

Threonline 15,36 Pantothenic axit (Vit.B5) 5,20Serine 8,24 Nicotinic axit (Vit.B3) 40,60Glutamic axit 34,20 Biotin (Vit H) 0,17

Proline 3,52 Folic axit (Vit.B9) 0,24Alanine 2,56 Inositol 127,70

Valine 2,11 Choline 9,0Isoleucine 0,38 Vitamin B12 vét

Leucine 0.48Phenylalanine 0,78

[1].Hon nữa, chi số Glyceric index (GI) của đường dừa là 35, so với đường mía là

64 và mật ong là 62, tức là thực phẩm có chỉ số GI thấp, rất có lợi cho sức khỏe vì

giảm lượng cholesterol GI < 55: thấp, GI 56 — 69: trung bình, GI > 70: cao.Ngày nay nhiều nước như Philippines, Malaysia, Sri Lanka, Thailand và Indiasử dụng nguyên liệu mật hoa dừa để sản xuất một số thực phẩm nhiều dinh dưỡngnhư:

- Thức uống nhẹ (sap drink): mật hoa dừa đun nóng 60°C, đóng chai.- Syrup: cô đặc mật hoa dừa ở 110°C đến khi tạo thành dạng sệt, để nguội,đóng chai.

- Đường (Coco Sugar): cô đặc mật hoa dừa ở 115°C cho đến khi thành đường,màu hơi nâu, để nguội cho vào các khuôn

- Giảm: mật hoa dừa lên men hiếu khí, sau 5 — 10 ngày tạo thành giấm Sau khilên men cần phải khử trùng ở 60 — 65°C trong 5 — 10 phút nhằm đảm bảo chấtlượng giấm ở nông độ axit 4%, để nguội, đóng chai.

- Rượu vang mật hoa dừa: mật hoa dừa được lọc thô để loại bỏ tạp chất có kíchthước lớn Điều chỉnh dịch mật sao cho hàm lượng đường đạt 200 g/l, pH 4,0 vabồ sung đạm (NH„)zSOx5 g/l Bồ sung giống nắm men Saccharomyces cerevisiae10% vào mật hoa dừa, tiễn hành lên men trong điều kiện ky khí 120 giờ ở nhiệt độ

28-30°C Rượu thu được có độ rượu thấp, chưng cất phân đoạn để thu được nông

độ rượu cao hơn.Các sản pham từ mật hoa dừa được đánh giá là các sản phẩm mang tinh cộng

đồng cao vì: đơn giản, dễ thực hiện; gia tăng thu nhập; chi phí đầu tư thấp; các sản

phẩm tự nhiên giàu dinh dưỡng; giảm được lao động nông nhan [1].Phương pháp thu nguyên liệu mật hoa dừa

Chọn cây để thu mật hoa: mật hoa dừa chỉ có thể thu tốt nhất ở những câydừa đã cho quả 6n định từ 6 năm trở lên, ở những cây mới thu mật thì thời gian từkhi xử lý phát hoa đến thời gian bắt đầu chảy mật lâu hơn và hàm lượng mật íthơn ở những cây đã thu mật nhiều lần Thông thường người ta chỉ thu mật trênnhững cây dừa lấy dầu hay dừa lai

Chọn phát hoa để xử lý thu mật: trên mỗi tán dừa thường có khoảng 3 pháthoa chưa nở, khi quan sát thấy phát hoa thứ 4 (từ trên xuống) vừa mới bắt đầu mởbung ra là có thé tiễn hành xử lý dé thu mật ở phát hoa thứ 3 Và tuần tự tiếp tục ởnhững phát hoa tiếp theo sau khoảng 20 ngày, tùy vào khoảng thời gian cho ra hoamới của từng giống dừa ở từng điều kiện canh tác cụ thể, có nghĩa là khoảng cáchthời gian xử lý giữa phát hoa trước và phát hoa sau tùy thuộc vào khoảng cách rahoa giữa 2 phát hoa kế tiếp nhau

Xử lý phát hoa để lay mật: dùng biện pháp cơ học tác động dé kích thíchmạch dẫn nhựa tiết mật ra ngoài băng cách dùng một cái chày gỗ đập chung quanhphát hoa khoảng 5cm về phía đỉnh Sau đó mỗi ngày 2 lần sáng và chiều tiếp tụcdùng chảy gõ nhẹ kết hợp cat bỏ khoảng 3-5 mm/phát hoa đồng thời dùng dây

buộc kéo nhẹ phát hoa cúi xuống cho đến khi mật chảy ra.Kỹ thuật làm tôn thương phát hoa rất khó định lượng, người ta mô tả nó nhưmột môn “nghệ thuật”, có người làm được nhưng lại có người không do thao tácquen tay quá mạnh hoặc quá nhẹ ngay từ đầu Nếu tác động quá mạnh sẽ làm chocác gié bên trong phát hoa bị giập, phát hoa sẽ bị hư sẽ không cho ra mật Nhưngnếu đập quá nhẹ thì các gié hoa bên trong không bị ton thương, mật sẽ không tiếtra được Hơn nữa, kích thước các phát hoa của từng giống và từng cây cũng khácnhau, đòi hỏi người kỹ thuật viên phải rất có kinh nghiệm và quen tay để điềuchỉnh lực đập đối với những phát hoa khác nhau.

Thu mật hoa: phát hoa dừa sau khi xử lý khoảng 7 ngày thì bắt đầu tiết mật,người ta có thể dùng bình sứ, ống tre hay bình nhựa đặt trực tiếp vào phát hoađể hứng và thu mật hoa dừa mỗi ngày hai lần vào lúc sáng sớm hoặc chiều mát.Mỗi phát hoa dừa có thé thu mật trong khoảng thời gian 1 tháng với sản lượngbình quân 30 lit/phat hoa, lượng mật hoa dừa được tăng dan từ phát hoa thứ nhấtđến các phát hoa tiếp theo Sau khoảng 6 tháng thu mật, tức là ở phát hoa thứ 7,thứ 8 lượng mật bắt đầu giảm mạnh lúc này cần ngưng thu mật để cây dừa phụchồi trong khoảng 6 tháng tiếp theo Mỗi năm, tốt nhất thu hoạch trong vòng 6thang [1].

So ch mật hoa dừa: mật hoa dừa rất giàu dinh dưỡng, dé bị tap nhiễm trongquá trình thu hoạch nên chất lượng dịch mật sẽ biến đổi trong vòng một ngày saukhi thu hoạch, do bị lên men bởi nắm men Quá trình bảo quản và chế biến mậthoa dừa phải duy trì ham lượng đường, vitamin va các thành phan dinh dưỡng cólợi cho sức khỏe Do đó phải có các giải pháp nhăm kéo dài thời gian bảo quannguyên liệu mật hoa dừa cho các quá trình chế biến và lên men như:

Nguyên liệu mật hoa dừa ngay sau khi thu phải đun 100°C trong 30 phút nhămngăn cản quá trình lên men Thế nhưng các thành phan tinh hoa trong dịch mậtnhư vitamin sẽ bị biến đổi khi sử dụng nhiệt độ bảo quản mật hoa dừa

Sử dụng chất bảo quản hóa học như sorbate, benzoat để ức ché nim mốc,nâm men và vi khuân trong nguyên liệu mật hoa dừa Nhược điêm của các chât

bảo quản hóa học là ảnh hưởng đến chất lượng cảm quan, ức chế hệ vi sinh vậttrong mật hoa dừa không lên men được.

Yêu cầu đặt ra phải lựa chọn chất bảo quản không độc đối với cơ thể người,được công nhận là GRAS, không gây ra mùi vi lạ hay mắt mùi tự nhiên của mậthoa dừa Đông thời bảo toàn thành phan dinh dưỡng, tinh hoa của mật hoa dừa.Đặc điểm quan trọng là không ảnh hưởng đến hệ vi sinh vật trong quá trình lênmen Sử dụng bacteriocin bảo quản mật hoa dừa là một giải pháp đảm bảo các yêucầu trên

1.7 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước1.7.1 Các nghiên cứu trong nước

Nghiên cứu về bacteriocin do LAB sinh tổng hợp đã và đang được nhiều nhàkhoa học quan tâm, tuy nhiên nghiên cứu về ứng dụng của bacteriocin chưa đượcrộng rãi.

Hoa Thị Minh Tú và cộng sự (2007), điều khiển lên men dé tăng cường sinhtong hợp nisin ở vi khuẩn Lactococcus lactis, thiết lập mô hình lên men theo đópH được điều khiến cô định tại 6,5 và nguồn cacbon sucrose cung cấp liên tục đạtnông độ 40g/1 trong suốt quá trình lên men đã cải thiện đáng kế hoạt tính tong hopnisin của chủng, không chỉ nâng cao nâng suất lên 179% mà còn kéo dài thời giansinh tong hợp nisin [7]

Nguyễn Thị Da, Hoa Thi Minh Tú, Lê Thanh Binh (2008), nghiên cứu một SỐtinh chat của bacteriocin được tổng hợp bởi vi khuẩn lactic phân lập từ sữa bò tươi

[2I.Nguyễn Thúy Hương, Trần Thị Tưởng An (2008), nghiên cứu thu nhậnbacteriocin bằng phương pháp lên men bởi tế bao Lactococcus lactis cô định trênchất mang cellulose vi khuẩn (BC) và ứng dụng trong bảo quản thịt tươi sơ chế tốithiểu [3]

1.7.2 Các nghiên cứu ngoài nướcLemos miguel và cộng sự (2008) sàng lọc chung Enterococcus faecium E86 từ339 chủng LAB có nguồn gốc từ thực phẩm lên men Bacteriocin được tổng hop

từ chủng này bền với nhiệt độ (121°C trong vòng 15 phút), axit và kiềm, khángcác chung Enterococcus, Leuconostoc, Lactobacillus, Listeria, Corynebacteriumva Staphylococcus aureus, khang Listeria trong sữa [30].

Todorov và cộng sự (2004) nghiên cứu kha nang sinh tong hop bacteriocin cuaL plantarum Nghiên cứu đã đưa ra các loại môi trường có ảnh hưởng đến khảnăng sinh tong hợp bacteriocin và môi trường tối ưu trong tong hợp bacteriocin

[59].Wenhua Lv, Wei Cong, Zhaoling Cai (2005) nghiên cứu ảnh hưởng củasucrose đến tăng trưởng tế bào và sản xuất nisin bởi Lactococcus lactis trong lênmen batch và fed - batch Trong môi trường batch nisin đạt tối da 2658 IU/ml, ởnông độ sucrose ban dau là 30g/1.Với nồng độsucrose cao hơn 30g/1, tổng hợpnisin giảm trong khi sinh khối không bị ảnh hưởng đáng kế Điều khiến lên menfed — batch pH, còn sucrose được kiểm soát trong ba nông d6(sucrose duy trì ởmức 2, 16, 20 g/l) Duy trì nồng độ sucrose thấp tại 2 g/l hiệu suất sinh tổng hopnisin đạt tối đa là 4961 IU/ml, so với 33701U/ml (16 ø sucrose/lit) và 3498 IU/ml(20 g sucrose/lit) sau [0h nuôi cay [60]

Antonio Galvez và cộng sự (2007) nghiên cứu các chiến lược dung bacteriocintrong bảo quản thực phẩm Ngoài ra các chế phẩm thương mai có sẵn của nisin vàpediocin PA-1/AcH , bacteriocin khác( ví dụ như lacticin 3147 , enterocin AS- 48hoặc variacin ) cũng có nhiều hứa hen Bacteriocin phố rộng nhiều tiềm năng sửdụng, trong khi bacteriocin pho hep duoc su dung dé ức chế chọn lọc các vi khuẩncó nguy cơ cao nhất định trong thực phẩm như vi khuẩn Listeria monocytogenesma không ảnh hưởng hệ vi sinh vật vô hại Bacteriocin có thể ứng dụng cho sựphát triển của bao bì thực phẩm hoạt tính sinh học Sử dụng kết hợp bacteriocinkhác nhau, bacteriocin và các yếu tố khác cũng có thé là một phương pháp có triểnvọng để tránh sự phát triển của các chủng kháng thuốc [9]

Luc De Vuyst Frédéric Leroy (2007) nghiên cứu bacteriocin từ LAB : sinhtong hop, tinh sạch và ứng dụng trong thực phẩm [32]