Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Khảo sát quá trình lên men thu nhận và tạo chế phẩm Bacterial Cellulose từ những nguồn nguyên liệu khác nhau

Việc ứng dụng nguồn vi sinh vật trong tự nhiên vào sản xuất sản phẩm BC sẽ mang lại hiệu quả kinh tế cao, tiết kiệm về thời gian do vi khuẩn thích nghi và tăng trưởng nhanh, tiết kiệm di

VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP

VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

Vi khuẩn A xylinum BC16 dùng để lên men thu nhận BC, được cung cấp từ bộ môn Công nghệ Sinh học, trường Đại học Bách Khoa TP.HCM

3.1.2.1 Nhóm môi trường sàng lọc và kiểm tra các đặc điểm sinh học của giống

MT1: Môi trường sàng lọc

MT2: Môi trường dịch thể, không chứa agar

MT3: Môi trường kiểm tra khả năng oxy hóa ethanol

Nước cất đủ 100ml Trước khi cấy vi khuẩn bổ sung ethanol 15%

K2HPO4 : 0,09% Nước cất cho đủ

MT5: Môi trường kiểm tra sự chuyển hóa Glucose thành acid

Glucose : 1% Nước cất cho đủ CaCO3 : 3%

MT6: Môi trường kiểm tra chuyển hóa Glycerol thành dihydroxyaceton

Glycerol : 3% Nước cất cho đủ

MT7: Môi trường kiểm tra sự sinh sắc tố nâu

Glucose : 2% Nước cất cho đủ

3.1.2.2 Nhóm môi trường mật rỉ đường

MT8: Môi trường sàng lọc

Cao nấm men: 0,5% (NH4)2HPO4 : 0,2%

Agar : 2% Nước cất cho đủ

MT9: Môi trường nhân giống

Cao nấm men: 0,5% (NH4)2HPO4 : 0,2%

Acid acetic : 0,5% Nước cất cho đủ

MT10: Môi trường lên men

(NH 4 ) 2 SO 4 : 0,8% Nước cất cho đủ 3.1.2.3 Nhóm môi trường nước dừa già

MT12: Môi trường nhân giống

MT13: Môi trường lên men

Nước dừa già : 100ml 3.1.2.4 Nhóm môi trường nước mía

MT14: Môi trường sàng lọc giống

Cao nấm men: 0,5% (NH4) 2 HPO 4 : 0,5%

Agar : 2% Nước cất cho đủ

MT15: Môi trường nhân giống

Cao nấm men: 1% (NH4) 2 HPO 4 : 0,5%

KH2PO4 : 0,05% Nước cất cho đủ

MT16: Môi trường lên men

Acid acetic : 0,5% Nước cất : đủ 3.1.2.5 Nhóm môi trường phụ phẩm thơm

MT17: Môi trường sàng lọc giống

Nước ép mắt dứa: 10% (NH4) 2 SO 4 : 0,8%

Cao nấm men: 0,5% (NH4)2HPO4 : 0,2%

MT18: Môi trường nhân giống

Nước ép mắt dứa: 10% (NH4) 2 SO 4 : 0,8%

Cao nấm men: 0,5% (NH4)2HPO4 : 0,5%

MT19: Môi trường lên men

Nước ép mắt dứa: 10% (NH4) 2 SO 4 : 0,8%

Cao nấm men: 1% (NH4) 2 HPO 4 : 0,5%

3.1.2.6 Nhóm môi trường Whey protein

MT20: Môi trường nhân giống

Acid acetic : 0,5% Dịch chiết 50% khoai tây cho đủ 100ml

MT21: Môi trường lên men

(NH4)2SO4 : 0,8% Dịch chiết 50% khoai tây cho đủ 100ml [7]

- Vật liệu: các nguồn nguyên liệu phổ biến, rẻ tiền, là phụ phế phẩm của quá trình sản xuất khác như: nước dừa già, rỉ đường, nước mía, thơm, Whey protein, khoai tây…

- Hóa chất: thuốc nhuộm Gram, NaOH, HCl, acid acetic, (NH4) 2 HPO 4 , (NH 4 ) 2 SO 4 , thuốc nhuộm xanh methylene, thuốc thử Folin, dầu khoáng…

3.1.4 Thiết bị và dụng cụ

- Thiết bị nuôi cấy: tủ cấy, tủ ủ, tủ sấy, nồi hấp, máy lắc ủ nhiệt, tủ lạnh, lò viba

- Thiết bị phân tích: kính hiển vi, cân kỹ thuật, cân phân tích, pH kế, máy siêu ly tâm, máy ly tâm lạnh, máy đo quang phổ, máy vortex…

- Dụng cụ: erlen, becher, đĩa Petri, ống nghiệm, bình định mức, pipette, phễu lọc, khay hộp

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Hình 3.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu đề tài

- Hình thái, sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn

Khảo sát đặc điểm hóa sinh:

Oxy hóa ethanol Phản ứng Catalase Sinh trưởng trên môi trường Hoyer Chuyển hóa Glucose

Chuyển hóa Glycerol Sinh sắc tố

Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy :

pH Nhiệt độ Thời gian

Tối ưu hóa điều kiện dinh dưỡng:

Tối ưu hóa: tốc độ lắc Đánh giá chỉ tiêu chất lượng sản phẩm S-BC:

Cảm quan Độ hút nước Độ chịu lực Độ kéo đứt Hàm lượng tro

Khảo sát điều kiện nuôi cấy phòng thí nghiệm

Khảo sát điều kiện lên men

Xử lý Khảo sát quá trình lên men thu nhận BC trên 05 loại môi trường nguyên liệu nghiên cứu

Quy trình lên men thu nhận S-BC và A-BC

Bước đầu tạo sản phẩm S-BC

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tất cả các thí nghiệm trong đề tài sẽ được thực hiện lập lại 3 lần và số liệu thu được sẽ là số liệu trung bình của các lần lập lại

3.3.1 Khảo sát các đặc điểm sinh học của vi khuẩn A xylinum BC 16 3.3.1.1 Kiểm tra đặc điểm, hình thái giống

Tiến hành quan sát đại thể, vi thể

- Cấy vi khuẩn vào môi trường MT2, ủ 48 giờ để quan sát khả năng tăng trưởng của vi khuẩn.- Kiểm tra môi trường để xem vi khuẩn có làm đục môi trường hoặc tạo màng sinh khối trên bề mặt hay không.- Lấy mẫu nhuộm Gram để quan sát vi thể tế bào dưới kính hiển vi, xác định đặc điểm hình thái của vi khuẩn và cách thức sắp xếp của chúng.

Cấy vi khuẩn trên môi trường chọn lọc có Agar (MT1), ủ 72 giờ Quan sát mô tả hình dáng, màu sắc, kích thước của khuẩn lạc

3.3.1.2 Khảo sát các đặc điểm sinh hóa đặc trưng

Khả năng oxy hóa ethanol thành acid acetic

Thêm 1ml dung dịch Bromocresol vào môi trường kiểm tra (MT3) Trước khi cấy vi khuẩn cho thêm 1ml ethanol 15% vào môi trường Kết quả dương tính khi môi trường chuyển thành màu vàng sau đó trở thành màu lam lục

Lấy 1ml H2O 2 nhỏ trực tiếp vào ống thạch nghiêng đã cấy vi khuẩn, sau 2 giờ nuôi cấy nếu có bọt khí xuất hiện là phản ứng dương tính.

Khả năng sinh trưởng trên môi trường Hoyer

Cấy vi khuẩn trên môi trường (MT4), kiểm tra sự phát triển của vi khuẩn

Khả năng chuyển hóa glucose thành acid

Quan sát sự xuất hiện vòng sáng quanh khuẩn lạc khi nuôi cấy trên môi trường kiểm tra (MT5)

Khả năng chuyển hóa Glycerol thành Dihydroxyacetone

Cấy vi khuẩn trên môi trường (MT6), nhỏ dung dịch Fehling lên mặt thạch để kiểm tra sự tạo thành Dihydroxyaceton Dấu hiệu nhận biết có sự xuất hiện vòng CuO xung quanh khuẩn lạc tạo màu đỏ

Khả năng sinh sắc tố nâu trên khuẩn lạc

Cấy vi khuẩn trên môi trường (MT7) và kiểm tra sự xuất hiện sắc tố nâu trên khuẩn lạc

Khả năng sinh tổng hợp Cellulose

Nhỏ dung dịch Lugol và H2SO4 60% lên mặt thạch sẽ xuất hiện màu lam

3.3.2 Tối ưu điều kiện nuôi cấy phòng thí nghiệm: pH, nhiệt độ, thời gian

- Để xác định điều kiện tối ưu cho quá trình nuôi cấy, chúng tôi tiến hành thí nghiệm theo phương pháp leo dốc ứng với ba yếu tố ảnh hưởng được khảo sát là pH

(x 1 ), nhiệt độ (x2) và thời gian (x3) Hàm mục tiêu (y) là mật độ quang (OD) của dịch nuôi cấy ứng với sinh khối vi khuẩn A xylinumBC16 Phương trình hồi quy có dạng : y = b 0 + b 1 x 1 + b 2 x 2 + b 3 x 3 + b 12 x 1 x 2 + b 13 x 1 x 3 + b 23 x 2 x 3 + b 123 x 1 x 2 x 3 (3.1) Với: b0, b 1 , b 2 , b 3 , b 12, b 13 , b 23 – lần lượt là các hệ số của phương trình hồi quy

Giống được tiến hành kiểm tra cấy trên môi trường sàng lọc, sau đó được nhân giống cấp 1 và nhân giống cấp 2 với cùng tỷ lệ 10% giống trong cùng điều kiện nhiệt độ phòng thí nghiệm Sau đó đưa vào môi trường để nuôi cấy

- Lập ma trận quy hoạch thực nghiệm và xác định các hệ số của phương trình hồi quy:

Để xác định số lượng thí nghiệm cần thiết theo phương pháp nhân tố toàn phần, công thức được sử dụng là N = n k, trong đó n là số lượng các mức và k là số yếu tố Khi cần khảo sát đồng thời ba yếu tố ảnh hưởng (pH, nhiệt độ, thời gian nuôi cấy), số thí nghiệm cần tiến hành là N = 2 3 = 8.

Các mức của thí nghiệm và khoảng biến thiên được xác định theo bảng 3.1

Bảng 3.1 Các mức và khoảng biến thiên của nhóm thí nghiệm 1

Các mức của thí nghiệm Yếu tố ảnh hưởng Mức dưới

Khoảng biến thiên pH môi trường (x1) 4,5 5,0 5,5 0,5

Nhiệt độ - x2 ( o C) 28 o C 30 o C 32 o C 2,0 o C Thời gian - x3 (giờ) 48 giờ 96 giờ 144 giờ 48 giờ Hệ số tương tác bi ,b ij được tính theo công thức:

(với N = 8) Từ đó xác định được phương trình hồi quy mô tả thực nghiệm

3.3.3 Tối ưu thành phần peptone và glucose trong lên men tĩnh tạo S-BC

- Để xác định điều kiện dinh dưỡng tối ưu với hai yếu tố ảnh hưởng là thành phần peptone-x 1 (g/100ml) và glucose-x 2 (g/100ml) cho quá trình lên men tĩnh, nuôi cấy ở khay nhỏ Chúng tôi tiến hành thí nghiệm theo phương pháp leo dốc ứng với điều kiện: pH , nhiệt độ, thời gian được xác định từ các thí nghiệm ở trên Hàm mục tiêu được chọn là năng suất S-BC (g/l), phương trình hồi quy có dạng như sau: y = b0 + b1x1 + b2x2 + b12x1x2 (3.3)

Với: b0, b 1 , b 2 , b 12, - lần lượt là các hệ số của phương trình hồi quy

Giống được tiến hành kiểm tra, nhân giống trong điều kiện như thí nghiệm trên, sau đó đưa vào môi trường lên men với cùng tỷ lệ 10% giống (10ml giống : 90ml môi trường), trộn đều, cho vào khay để lên men ở các điều kiện đã xác định

- Lập ma trận quy hoạch thực nghiệm và xác định các hệ số của phương trình hồi quy:

Với mục tiêu khảo sát hai yếu tố ảnh hưởng là tỷ lệ Peptone (whey) và tỷ lệ Glucose trong môi trường dịch thể thì số thí nghiệm cần tiến hành là (N = 2 2 = 4) [2]

Các mức của thí nghiệm và khoảng biến thiên tính theo bảng 3.2

Bảng 3.2 Các mức và khoảng biến thiên của nhóm thí nghiệm 2

Các mức của thí nghiệm Yếu tố ảnh hưởng Mức dưới

Hệ số tương tác bi ,b ij được tính theo công thức

(với N = 4) Từ đó xác định được phương trình hồi quy mô tả thực nghiệm

3.3.4 Kiểm định sự có nghĩa của các hệ số hồi quy theo tiêu chuẩn Student Để kiểm định sự có ý nghĩa của các hệ số phương trình hồi quy theo tiêu chuẩn Student, chúng tôi làm thêm 3 thí nghiệm ở tâm của từng phần thực nghiệm, kết quả thực nghiệm và tính các giá trị theo các công thức và thể hiện ở bảng 3.3

Bảng 3.3 Giá trị thực nghiệm tại tâm phương án

Sai số tính cho bi:

N S b S th i  (3.6) y 0 u: giá trị y thu được tại tâm thực nghiệm; y  0 : giá trị trung bình của các lần đo giá trị y 0 u; m là số thí nghiệm làm tại tâm thực nghiệm, ở đây m=3

Các giá trị tính toán theo số liệu thực nghiệm của phân bố Student được tính theo công thức: b j j j S t  b (3.7)

Tra bảng xác định giá trị của tiêu chuẩn Student đối với mức ý nghĩa p = 0,05; bậc tự do là f = m-1= 2 So sánh các giá trị Nếu:

- Nếu tj>tb(p;f) thì hệ số bj khác đáng kể với 0, ảnh hưởng của xj có ý nghĩa đến việc làm thay đổi thông số tối ưu hóa y, hệ số bj được chọn

- Ngược lại nếu tjF, phương trình phù hợp với các số liệu thực nghiệm Vậy phương trình hồi qui là:

- Phương trình hồi quy cho thấy pH và nhiệt độ có ảnh hưởng thuận lợi đến sự phát triển của vi khuẩn A xylinum, trong khi thời gian nuôi cấy có ảnh hưởng nghịch.- Nhiệt độ tác động đến phản ứng sinh hóa và hoạt động enzyme, ảnh hưởng đến đời sống của vi khuẩn.- A xylinum phát triển mạnh trong khoảng nhiệt độ hẹp (28-32 độ C).- pH ảnh hưởng đến tổng hợp enzyme, phân chia tế bào và tính thẩm thấu qua màng tế bào.- pH và nhiệt độ tối ưu tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn phát triển và sản xuất chất trao đổi chất.- Thời gian nuôi cấy đủ dài cho vi khuẩn thích nghi và phát triển, nhưng quá dài sẽ dẫn đến suy giảm do thiếu chất dinh dưỡng và sản phẩm phụ tích tụ.

Vậy trong thí nghiệm này các điều kiện tối ưu được dự đoán: pH môi trường sẽ lớn hơn 5, nhiệt độ ủ trên 30 o C và thời gian nuôi cấy sẽ ngắn hơn 96 giờ

4.2.1.2 Tối ưu hoá thực nghiệm theo đường dốc nhất Để xác định điều kiện tối ưu, chúng tôi tiến hành thí nghiệm leo dốc theo hướng gradient và thu được các giá trị sinh khối tế bào (OD của dịch nuôi cấy) Kết quả thể hiện ở bảng 4.6

Bảng 4.6 Thí nghiệm theo hướng gradient của mật độ quang của dịch nuôi cấy

Bước nhảy δ 0,200 0,241 -3,352 Bước làm tròn 0,200 0,300 -4,000 Thí nghiệm 12 5,000 30,000 96,000 0,158

Thí nghiệm 14 5,400 30,600 88,000 0,154 Thí nghiệm 15 5,600 30,900 84,000 0,147 Thí nghiệm 16 5,800 31,200 80,000 0,143 Thí nghiệm 17 6,000 31,500 76,000 0,131

Kết quả trên cho thấy sinh khối tế bào của dịch nuôi cấy thu được cao nhất ở thí nghiệm thứ 13 và giảm dần ở các thí nghiệm tiếp theo, vì vậy thí nghiệm thứ 13 cho kết quả tốt nhất theo hướng gradient đã chọn (OD đạt 0,184)

Như vậy, khi tiến hành nuôi cấy ở điều kiện pH (pH = 5,2), nhiệt độ ủ (T 30,3 o C), thời gian (t = 92 giờ), là điều kiện tối ưu cho sự phát triển của vi khuẩn nên chúng tăng về số lượng lẫn chất lượng và các quá trình trao đổi chất, chuyển hóa và tổng hợp các chất tạo sản phẩm BC tăng dần và đạt cực đại Sau thời gian này vi khuẩn bắt đầu suy yếu dần do môi trường suy giảm chất dinh dưỡng, đồng thời các sản phẩm phụ tích lũy nhiều dẫn đến gây ức chế, gây hại cho vi khuẩn và hiệu suất thu nhận sản phẩm giảm

Qua khảo sát quá trình nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường nước dừa già:

- Xác định được phương trình hồi quy :

- Trường hợp này cho thấy pH và nhiệt độ môi trường ảnh hưởng tỷ lệ thuận trong khi thời gian nuôi cấy ảnh hưởng tỷ lệ nghịch đến quá trình nuôi cấy

- Gía trị phù hợp nhất cho quá trình nuôi cấy vi khuẩn ứng với sinh khối tế bào đạt cực đại (OD= 0,184) là pH: 5,2; nhiệt độ: 30,3 o C; thời gian: 92 giờ

4.2.2 Trên môi trường dịch rỉ đường 4.2.2.1 Phương trình hồi qui

Kết quả thực nghiệm Y(OD) của dịch nuôi cấy được bố trí trên bảng ma trận mở rộng sau khi đưa thêm cột biến ảo z0= +1 (bảng 4.7)

Bảng 4.7 Kết quả (OD) thực nghiệm nuôi cấy trên môi trường rỉ đường

STT x 1 -pH x 2 -Nhiệt độ x 3 -Thời gian z 1 z 2 z 3 Y(OD)

Các hệ số hồi quy đối với hàm mục tiêu y được xác định: b0= 0,137; b 1 = −0,008; b2= 0,003; b3= 0,009; b12 = −0,0002; b13 = −0,005; b23 = −0,006; b123= 0,003.

Thay giá trị các hệ số hồi quy thu được phương trình hồi qui của hàm mục tiêu:

Y = 0,137−0,008x1+0,003x 2 +0,009x 3 −0,0002x1x 2 −0,005x1x 3 −0,006x2x 3 +0,003x 1 x 2 x 3 Giá trị các hệ số Sbj, tj được tính theo công thức và thể hiện ở bảng dưới:

Bảng 4.8 Giá trị phương sai và phân bố theo tiêu chuẩn Student

BSHQ HSHQ S bj t j t 0,05(2) Kết luận x0 0,137 88,573 Nhận x1 −0,008 5,191 Nhận x 2 0,003 2,109 Loại x3 0,009 6,002 Nhận x 1 x 2 −0,0002 0,162 Loại x 1 x 3 −0,005 3,082 Loại x 2 x 3 −0,006 3,569 Loại x1x2x3 0,003

Chọn tiêu chuẩn Student với mức ý nghĩa p = 0,05; bậc tự do là f = 2 Tra bảng ta có t b(p;f) = t (0,05; 2) = 4,3 Đối chiếu với các trị số Student tính ta thấy t2; t12; t13; t23; t123 < t(0,05; 2)= 4,3 nên các hệ số b2; b 12 ; b 13 ; b 23 ; b 123 không có ý nghĩa Phương trình hồi qui của hàm ylà:

Kiểm tra tính tương thích của phương trình hồi quy theo tiêu chuẩn Fisher

Phương sai dư tính theo công thức có giá trị bằng:

So sánh giá trị F với ( 1 )( , )

Tra bảng ta có Fb= 19,30, suy ra F b >F, phương trình phù hợp với các số liệu thực nghiệm Vậy phương trình hồi qui là:

Từ phương trình hồi quy trên cho thấy pH môi trường ảnh hưởng tỷ lệ nghịch với sự phát triển tế bào vi khuẩn trong khi thời gian nuôi cấy ảnh hưởng tỷ lệ thuận Ta thấy pH môi trường quá thấp sẽ làm chậm quá trình phát triển của vi khuẩn nhưng khi tăng quá cao sẽ gây tác dụng ức chế, kìm hãm Do vậy, khi pH và nhiệt độ đạt tối ưu sẽ giúp cho hiệu suất quá trình lên men sẽ đạt tối đa vì tế bào vi khuẩn trong điều kiện thuận lợi nhất sẽ tăng trưởng mạnh mẽ và sản phẩm trao đổi chất tăng cao Trong khi thời gian nuôi cấy phù hợp thì khối lượng sản phẩm lên men thu được tăng cao, tuy nhiên thời gian quá dài khi môi trường dinh dưỡng cạn dần thì hiệu suất thu hồi không cao

Vậy trong thí nghiệm này các điều kiện tối ưu được dự đoán: pH môi trường sẽ nhỏ hơn 5, nhiệt độ ủ ở 30 o C và thời gian ủ sẽ dài hơn 96 giờ

4.2.2.2 Tối ưu hoá thực nghiệm

Tiến hành thí nghiệm theo hướng gradient chúng tôi thu được các giá trị sinh khối của dịch nuôi cấy thể hiện ở bảng 4.9

Bảng 4.9 Thí nghiệm theo hướng gradient của mật độ quang của dịch nuôi cấy

Tên x 1 -pH x 3 -thời gian (giờ) Y(OD)

Kết quả trên cho thấy sinh khối tế bào thu được cao nhất ở thí nghiệm thứ 13 và giảm dần ở các thí nghiệm kế tiếp, vì vậy thí nghiệm thứ 13 cho kết quả tốt nhất theo hướng gradient đã chọn (OD đạt 0,175)

Như vậy, khi tiến hành nuôi cấy trong điều kiện pH (pH= 4,9), nhiệt độ (T= 30 o C),thời gian nuôi cấy (t= 107 giờ), tương ứng với điều kiện nuôi cấy tối ưu, thích hợp nhất cho sự phát triển của vi khuẩn nên vi khuẩn tăng sinh nhanh chóng về số lượng và chất lượng, đồng thời các quá trình trao đổi chất, chuyển hóa và tổng hợp các chất tạo sản phẩm BC tăng dần và đạt cực đại Sau thời gian này vi khuẩn bắt đầu suy yếu dần, do đó hiệu suất quá trình lên men sẽ giảm

Qua khảo sát quá trình nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường rỉ đường : - Xác định được phương trình hồi quy:

Y = 0,137 − 0,008 x 1 + 0,009 x 3 với các hệ số hệ số : b 1 =−0,008 < 0; b 3 = 0,009 > 0

- Trường hợp này cho thấy pH môi trường ảnh hưởng tỷ lệ nghịch và thời gian nuôi cấy ảnh hưởng tỷ lệ thuận đến quá trình nuôi cấy

- Gíá trị phù hợp nhất cho quá trình nuôi cấy ứng với sinh khối tế bào lớn nhất (OD dịch nuôi cấy = 0,175) là pH: 4,9; nhiệt độ: 30 o C ; thời gian nuôi cấy: 107 giờ

4.2.3.Trên môi trường nước mía 4.2.3.1 Phương trình hồi qui

Kết quả thực nghiệm Y(OD) nhận được bố trí trên bảng ma trận mở rộng sau khi đưa thêm cột biến ảo z0= +1 (bảng 4.10)

Bảng 4.10 Kết quả (OD) thực nghiệm nuôi cấy trên môi trường nước mía

STT x 1 -pH x 2 -Nhiệt độ x 3 -Thời gian z 1 z 2 z 3 Y(OD)

Các hệ số hồi quy của hàm mục tiêu: b0= 0,160; b 1 = 0,009; b 2 = 0,006; b 3 = 0,003; b12= −0,001; b13= −0,001; b23= −0,002; b123= 0,001 Phương trình hồi quy là: y = 0,160+0,090x 1 +0,006x 2 +0,003x 3 −0,001x1x 2 −0,001x1x 3 −0,002x2x 3 +0,001x 1 x 2 x 3 Giá trị các hệ số Sbj, t j được tính theo công thức và thể hiện ở bảng 4.11

Bảng 4.11 Giá trị phương sai và phân bố theo tiêu chuẩn Student

BSHQ HSHQ S bj t j t 0.05(2) Kết luận x 0 0,160 296,031 Nhận x 1 0,009 15,970 Nhận x 2 0,006 10,878 Nhận x3 0.003 4,861 Nhận x1x2 −0,001 2,546 Loại x 1 x 3 −0,001 1,157 Loại x 2 x 3 −0,002 4,298 Loại x 1 x 2 x 3 0,001

Loại Chọn tiêu chuẩn Student với mức ý nghĩa p = 0,05; bậc tự do f = 2 Tra bảng phân vị ta có tb(p;f) = t (0,05;2) = 4,3. Đối chiếu với các trị số Student tính ta thấy t12;t 13; t 23; t 123 < t (0,05;2) = 4,3 nên hệ số b 12 ; b 13 ; b 23 ; b 123 không có ý nghĩa Phương trình hồi qui của hàm Y xác định là:

Kiểm tra tính tương thích của phương trình hồi quy theo tiêu chuẩn Fisher

Phương sai dư theo công thức có giá trị bằng:

S 2 dư = 0,0000262 Tiêu chuẩn Fisher: F = 11,2142857 So sánh giá trị F với F b  F ( 1  p )( f 2 , f 1 ) trong đó chọn p= 0,5; f1= 8−4 = 4; f 2 = m−1 = 2.

Tra bảng ta có Fb= 19,30, suy ra Fb>F, phương trình phù hợp với các số liệu thực nghiệm Vậy phương trình hồi qui là:

TỐI ƯU HÓA THÀNH PHẦN PEPTON VÀ GLUCOSE TRONG QUÁ TRÌNH LEN MEN TĨNH TAO S-BC

4.3.1 Trên môi trường nước dừa

Kết quả thực nghiệm thể hiện trên bảng ma trận mở rộng sau khi đưa thêm cột biến ảo z0= +1 (bảng 4.19)

Bảng 4.19 Kết quả thực nghiệm trên môi trường nước dừa

Các hệ số hồi quy đối với hàm mục tiêu y: b0 = 50,115; b1 = 3,355; b2= - 3,375; b 12 = 2,015 Thay giá trị các hệ số thì được phương trình hồi qui của các hàm mục tiêu:

Y = 50,115 + 3,355x 1 - 3,375x 2 + 2,015x 12 Giá trị các hệ số Sbj, tj được tính theo công thức và thể hiện ở bảng 4.20

Bảng 4.20 Giá trị phương sai và phân bố theo tiêu cuẩn Student

BSHQ HSHQ S bj t j t 0,05(2) Kết luận x0 50,1150000 96,009 Nhận x1 3,3550000 6,427 Nhận x2 -3,3750000 6,466 Nhận x 1 x 2 2,0150000

Giá trị bảng của tiêu chuẩn Student đối với mức ý nghĩa p = 0,05; bậc tự do f = 2

Dựa vào bảng phân vị, ta có trung bình (p;f) = t (0,05; 2) = 4,3 Sau khi đối chiếu với các trị số Student được tính toán, ta thấy t12 < t (0,05; 2) = 4,3 Do đó, hệ số b12 không có ý nghĩa thống kê Sau khi loại bỏ hệ số này, phương trình hồi quy của hàm Y trở thành:

Kiểm tra tính tương thích của phương trình hồi quy theo tiêu chuẩn Fisher

Phương sai dư theo công thức có giá trị bằng:

So sánh giá trị F với ( 1 )( , )

Tra bảng ta có Fb= 18,50, suy ra Fb>F, phương trình phù hợp với các số liệu thực nghiệm Vậy phương trình hồi qui là:

Từ phương trình hồi quy trên cho thấy: Tỷ lệ peptone (x1) ảnh hưởng tỷ lệ thuận và tỷ lệ glucose (x2) ảnh hưởng tỷ lệ nghịch đến quá trình lên men Thành phần dinh dưỡng và tỷ lệ của nó có ý nghĩa quyết định đối với sự sinh trưởng và phát triển của A. xylinum Mỗi loài vi khuẩn có khả năng hấp thụ ở một ngưỡng hấp thụ thích hợp đối với các chất dinh dưỡng khác nhau Nếu tỷ lệ quá thấp sẽ không đủ dinh dưỡng cho vi khuẩn phát triển và tổng hợp các chất, ngược lại khi tỷ lệ quá cao vi khuẩn không hấp thụ hết sẽ lãng phí đồng thời gây hại cho vi khuẩn, gây ức chế, kìm hãm quá trình lên

Vậy trong thí nghiệm này các điều kiện tối ưu được dự đoán: thành phần peptone (x 1 ) sẽ lớn hơn 1,25%, glucose (x 2 ) sẽ nhỏ hơn 4%

4.3.1.2 Tối ưu hóa thực nghiệm

Tiến hành thí nghiệm theo hướng gradient thu được các giá trị năng suất S-BC được thể hiện ở bảng 4.21

Bảng 4.21 Thí nghiệm theo hướng gradient của mật độ quang của dịch nuôi cấy

Thí nghiệm thứ 8 đạt năng suất S-BC cao nhất (605 g/l) theo hướng gradien đã chọn Tuy nhiên, năng suất S-BC giảm dần ở các thí nghiệm leo dốc kế tiếp, cho thấy thí nghiệm thứ 8 là thí nghiệm cho kết quả tốt nhất trong số các thí nghiệm đã thực hiện.

Như vậy ứng với thành phần peptone (x1= 1,50%), glucose (x 2 = 3,325%) là điều kiện dinh dưỡng tối ưu cho quá trình phát triển nên vi khuẩn tăng sinh nhanh, đồng thời các quá trình trao đổi chất, chuyển hóa và tổng hợp các chất tạo sản phẩm S-BC tăng cao, hiệu suất quá trình lên men cực đại

Qua khảo sát quá trình lên men thu nhận S-BC trên môi trường nước dừa già:

- Xác định được phương trình hồi quy :

- Điều này có nghĩa thành phần peptone ảnh hưởng tỷ lệ thuận và thành phần glucose ảnh hưởng tỷ lệ nghịch đến quá trình lên men

- Gía trị phù hợp nhất cho quá trình lên men tạo năng suất S-BC cực đại: tỷ lệ peptone= 1,5%, Glucose= 3,325%, thời gian lên men là 92 giờ, pH: 5,2; nhiệt độ ủ:

4.3.2 Trên môi trường dịch rỉ đường

Kết quả thực nghiệm được bố trí trên bảng ma trận mở rộng (bảng 4.22)

Bảng 4.22 Kết quả thực nghiệm nuôi cấy trên môi trường rỉ đường

Các hệ số hồi quy đối với hàm mục tiêu y: b0 = 18,905; b1 = -7,180; b2= -13,115; b 12 = 2,890 Thay giá trị các hệ số hồi quy ta được phương trình hồi qui :

Y = 18,905 - 7,180x 1 - 13,115x 2 + 2,890x 1 x 2 Giá trị các hệ số Sbj, tj được tính theo công thức và thể hiện ở bảng 4.23:

Bảng 4.23 Giá trị phương sai và phân bố theo tiêu chuẩn Student

BSHQ HSHQ S bj t j t 0,05(2) Kết luận x0 18,905 16,9260 Nhận x1 -7,180 6,4284 Nhận x 2 -13,115 11,7421 Nhận x 1 x 2 2,890

Giá trị bảng của tiêu chuẩn Student đối với mức ý nghĩa p = 0,05; bậc tự do f = 2

Tra bảng ta có tb(p;f)= t(0,05;2)= 4,3. Đối chiếu với các trị số Student tính ta thấy t12< t (0,05;2) = 4,3 nên hệ số b12không có ý nghĩa và sau khi loại bỏ các hệ số này, phương trình hồi qui của hàm Ylà:

Kiểm tra tính tương thích của phương trình hồi quy theo tiêu chuẩn Fisher

Phương sai dư theo công thức có giá trị bằng:

S 2 dư = 33,4084000 Tiêu chuẩn Fisher: F = 3,3474903 So sánh giá trị F với F b  F ( 1  p )( f 2 , f 1 ) trong đó chọn p= 0,5; f1= 4-3= 1; f 2 = m-1 = 2.

Tra bảng ta có Fb= 18,50, suy ra F b >F, phương trình phù hợp với các số liệu thực nghiệm Vậy phương trình hồi qui là:

Từ phương trình hồi quy trên cho thấy: thành phần peptone (x1) và Glucose (x 2 ) đều ảnh hưởng tỷ lệ nghịch đến quá trình lên men Thành phần dinh dưỡng có ý nghĩa quyết định đối với sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Nếu tỷ lệ quá thấp sẽ không đủ dinh dưỡng cho vi khuẩn phát triển và tổng hợp các chất, ngược lại khi tỷ lệ quá cao vi khuẩn không hấp thụ hết sẽ lãng phí đồng thời gây hại cho vi khuẩn và gây ức chế, kìm hãm quá trình lên men

Vậy trong thí nghiệm này các điều kiện tối ưu được dự đoán: tỷ lệ peptone (x 1 ) sẽ lớn hơn 1,25%, glucose (x 2 ) sẽ nhỏ hơn 4%

4.3.2.2 Tối ưu hóa thực nghiệm

Tiến hành thí nghiệm theo hướng gradient thu được các giá trị năng suất S-BC của dịch nuôi cấy thể hiện ở bảng 4.24

Bảng 4.24 Thí nghiệm theo hướng gradient của năng suất S-BC

Kết quả trên bảng cho thấy năng suất S-BC thu được cao nhất ở thí nghiệm thứ 9

Khi tiếp tục thí nghiệm leo dốc thì năng suất S-BC giảm, vì vậy thí nghiệm thứ 9 cho kết quả tốt nhất theo hướng gradient đã chọn với năng suất S-BC đạt (mC3,40g/l)

Điều kiện dinh dưỡng tối ưu cho quá trình phát triển của vi khuẩn là peptone (1,0%) và glucose (2,78%) Trong điều kiện này, vi khuẩn tăng trưởng nhanh chóng về số lượng và chất lượng, đồng thời quá trình trao đổi chất, chuyển hóa và tổng hợp các chất tạo sản phẩm S-BC diễn ra mạnh mẽ, giúp hiệu suất lên men đạt cực đại.

Qua khảo sát quá trình lên men tạo S-BC trong môi trường rỉ đường:

- Xác định được phương trình hồi quy :

- Điều này có nghĩa tỷ lệ peptone và tỷ lệ glucose đều ảnh hưởng tỷ lệ nghịch đến quá trình lên men

- Giá trị phù hợp nhất trong quá trình lên men tạo năng suất S-BC cực đại là: peptone= 1,0%, Glucose= 2,78%, pH môi trường : 4,9; nhiệt độ ủ: 30 o C ; thời gian nuôi cấy: 107 giờ

4.3.3 Trên môi trường nước mía

Kết quả thực nghiệm được bố trí trên bảng ma trận mở rộng sau khi đưa thêm cột biến ảo z0= +1 (bảng 4.25)

Bảng 4.25 Kết quả thực nghiệm nuôi cấy trên môi trường nước mía

Các hệ số hồi quy đối với hàm mục tiêu Y: b0 = 30,787; b1= -21,163; b2= - 8,548; b 12 = 4,172 Thay giá trị các hệ số hồi quy vào ta được phương trình hồi qui:

Giá trị các hệ số Sbj, t j được tính theo công thức và thể hiện ở bảng 4.26:

Bảng 4.26 Giá trị phương sai và phân bố theo tiêu chuẩn Student

BSHQ HSHQ S bj t j t 0,05(2) Kết luận x0 30,787 31,3996 Nhận x1 -21,163 21,5841 Nhận x2 -8,548 8,7181 Nhận x 1 x 2 4,172

Giá trị bảng của tiêu chuẩn Student đối với mức ý nghĩa p = 0,05; bậc tự do f = 2

Tra cứu bảng phân vị cho thấy t(0,05;2) = 4,3 So sánh với giá trị Student tính toán được, t12 < t(0,05;2) nên hệ số b12 không có ý nghĩa thống kê Sau khi loại bỏ hệ số này, phương trình hồi quy của hàm y trở thành: y = 30,787 – 21,163x1 – 8,548x2.

Kiểm tra tính tương thích của phương trình hồi quy theo tiêu chuẩn Fisher.

Phương sai dư tính theo công thức có giá trị bằng:

S 2 dư = 69,6223360 Tiêu chuẩn Fisher: F = 9,0525505 So sánh giá trị F với F b  F ( 1  p )( f 2 , f 1 ) trong đó chọn p= 0,5; f1= 4-3= 1; f 2 = m-1 = 2.

Tra bảng ta có Fb= 18,50, suy ra Fb>F, phương trình phù hợp với các số liệu thực nghiệm Vậy phương trình hồi qui là:

Y = 30,787 – 21,163x 1 – 8,548x 2 Từ phương trình hồi quy trên cho thấy: thành phần peptone (x1) và thành phần glucose (x 2 ) đều ảnh hưởng tỷ lệ nghịch đến quá trình lên men Trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn nếu tỷ lệ dinh dưỡng quá thấp sẽ không đủ dinh dưỡng cho vi khuẩn phát triển và tổng hợp các chất, ngược lại khi tỷ lệ quá cao vi khuẩn không hấp thụ hết sẽ lãng phí đồng thời gây hại cho vi khuẩn và gây ức chế, kìm hãm quá trình lên men

Vậy trong thí nghiệm này các điều kiện dinh dưỡng tối ưu được dự đoán: thành phần peptone (x 1 ) sẽ nhỏ hơn 1,25%, thành phần glucose (x 2 ) sẽ nhỏ hơn 4%

4.3.3.2 Tối ưu hóa thực nghiệm

Tiến hành thí nghiệm theo hướng gradient thu được các giá trị năng suất S-BC của dịch nuôi cấy thể hiện ở bảng 4.27

Bảng 4.27 Thí nghiệm theo hướng gradient của năng suất S-BC

Kết quả trên cho thấy năng suất S-BC thu được cao nhất ở thí nghiệm thứ 8 và giảm dần ở các thí nghiệm kế tiếp, vì vậy thí nghiệm thứ 8 cho kết quả tốt nhất theo hướng gradient đã chọn với năng suất S-BC đạt (mT1,10 g)

Như vậy ứng với thành phần peptone (x1= 0,93%), glucose (x 2 = 3,65%) là điều kiện dinh dưỡng tối ưu cho quá trình phát triển của vi khuẩn nên vi khuẩn tăng sinh nhanh chóng về số lượng và chất lượng, đồng thời các quá trình trao đổi chất, chuyển hóa và tổng hợp sản phẩm BC tăng cao, hiệu suất lên men đạt cực đại

Qua khảo sát quá trình lên men trong môi trường nước mía để tạo sản phẩm S-BC đã xác định được:

- Điều này có nghĩa thành phần peptone và glucose đều ảnh hưởng tỷ lệ nghịch đến quá trình lên men

- Giá trị phù hợp nhất trong quá trình lên men tạo S-BC cực đại ứng với điều kiện: peptone= 0,93%, glucose= 3,65%, pH môi trường: 5,2; nhiệt độ ủ: 30,5 o C; thời gian nuôi cấy: 102 giờ

4.3.4 Trên môi trường dịch thơm

Kết quả thực nghiệm và được bố trí trên bảng ma trận mở rộng sau khi đưa thêm cột biến ảo z0= +1 (bảng 4.28 )

Bảng 4.28 Kết quả thực nghiệm nuôi cấy trên môi trường dịch thơm

Các hệ số hồi quy đối với hàm mục tiêu y: b0 = 43,195; b 1 = -15,850; b 2 = - 6,350; b12 = 4,172 Thay giá trị các hệ số hồi quy thu được phương trình hồi qui :

Y = 43,195 – 15,850x 1 – 6,350x 2 + 4,172x 12 Giá trị các hệ số Sbj, t j được tính theo công thức và thể hiện ở bảng 4.29

Bảng 4.29 Giá trị phương sai và phân bố theo tiêu chuẩn Student

BSHQ HSHQ S bj t j t 0,05(2) Kết luận x 0 43,195 49,9601 Nhận x1 -15,850 18,3324 Nhận x 2 -6,350 7,3445 Nhận x1x2 4,172

Loại Giá trị tiêu chuẩn Student với mức ý nghĩa p = 0,05; bậc tự do là f = 2 Tra bảng ta có t b(p;f) = t (0,05;2) = 4,3. Đối chiếu với các trị số Student tính ta thấy t12< t (0,05; 2) = 4,3 nên hệ số b12không có ý nghĩa và sau khi loại bỏ các hệ số này, phương trình hồi qui của hàm Ylà:

Kiểm tra tính tương thích của phương trình hồi quy theo tiêu chuẩn Fisher.

Phương sai dư theo công thức có giá trị bằng:

S 2 dư = 15,288100 Tiêu chuẩn Fisher: F = 2,5564815 So sánh giá trị F với F b  F ( 1  p )( f 2 , f 1 ) trong đó chọn p= 0,5; f1= 4-3 = 1; f 2 = m-1= 2.

Tra bảng ta có Fb= 18,50, suy ra Fb>F, phương trình phù hợp với các số liệu thực nghiệm Vậy phương trình hồi qui là:

Từ phương trình hồi quy trên cho thấy: thành phần peptone (x1) và glucose (x 2 ) đều ảnh hưởng tỷ lệ nghịch đến quá trình lên men Trường hợp này tương tự như thí nghiệm trên môi trường nước mía

Vậy trong thí nghiệm này các điều kiện tối ưu được dự đoán: thành phần peptone (x 1 ) sẽ nhỏ hơn 1,25%, thành phần glucose (x 2 ) sẽ nhỏ hơn 4%

4.3.4.2 Tối ưu hóa thực nghiệm

Tiến hành thí nghiệm theo hướng gradient thu được các giá trị mật độ quang của dịch nuôi cấy thể hiện ở bảng 4.30

Bảng 4.30 Thí nghiệm theo hướng gradient của năng suất S-BC

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA TỐC ĐỘ LẮC TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN LẮC TAO A-BC

Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành khảo sát quá trình lên men chìm trong bình tam giác thể tích 250 ml, trên máy lắc vòng với tỷ lệ giữa giống và môi trường là 10 ml: 90 ml, được nuôi cấy trong điều kiện tối ưu (điều kiện nuôi cấy và điều kiện dinh dưỡng đã xác định ở các thí nghiệm trước đó).

Chỉ tiêu theo dõi là năng suất A-BC tươi (g/l) Thí nghiệm qua 2 giai đoạn:

- Giai đoạn 1: Tiến hành các ở các mức tốc độ lắc: 150; 175; 200; 225; 250; 275;

300 (vòng/ phút) Năng suất A-BC thu được cao nhất ở khoảng (200 ÷ 250) vòng/phút

- Giai đoạn 2: Tiến hành thêm hai thí nghiệm xen giữa với vận tốc lắc: 215; 235 (vòng/ phút) Năng suất A-BC đạt cực đại ở vận tốc lắc 215 (vòng/phút) trên các môi trường nghiên cứu Kết quả thực nghiệm được thể hiện ở bảng 4.34

Bảng 4.34 Kết quả thực nghiệm xác định tốc độ lắc tối ưu

Sản lượng A-BC tươi (g/l) Tên

300 (v/p) Nước dừa già 103,8 210,6 317,4 443,5 378,9 322,3 296,7 211,6 76,00 Rỉ đường 114,5 178,1 281,2 342,3 315,4 284,4 254,5 179,8 80,70 Nước mía 110,6 198,1 234,0 372,2 312,3 267,8 211,2 146,5 71,20 Dịch thơm 96,4 257,0 347,7 367,7 211,6 203,3 165,5 134,7 64,90 Whey protein 111,6 180,5 332,4 362,2 341,8 328,0 302,5 268,3 102,6 Từ kết quả trên cho thấy :

Trong quá trình lên men chìm tạo A-BC, tốc độ lắc tối ưu trên các môi trường nghiên cứu là 215 vòng/phút Tốc độ này thấp hơn so với nghiên cứu của Phạm Thành Hổ (2007) (250 vòng/phút) và cao hơn so với Tantratian và cộng sự (2007) (100 vòng/phút) Khi lựa chọn tốc độ lắc, nên chọn trong khoảng từ 200 đến 250 vòng/phút để tiết kiệm năng lượng và đảm bảo an toàn khi vận hành thiết bị.

- Năng suất A-BC đạt cao nhất ở môi trường nước dừa già (443,5 g/l) và thấp nhất ở môi trường rỉ đường (342,3 g/l), các môi trường còn lại tương tự nhau

- Năng suất A-BC thu được thấp hơn so với lên men tĩnh S-BC (= 74,36%) kết quả phù hợp với nghiên cứu của Zhou (2007) và Kongruang (2008) [37, 58]

1- Nước dừa ; 2- Rỉ đường ; 3- Nước mía ; 4- Dịch thơm ; 5- Whey protein

Hình 4.5 Đồ thị so sánh năng suất A-BC tươi trên các môi trường nguyên liệu.

SO SÁNH, ĐÁNH GIÁ, ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH LÊN MEN THU NHẬN

4.5.1 Tổng hợp điều kiện tối ưu nuôi cấy phòng thí nghiệm

Bảng 4.35 Tóm tắt các điều kiện nuôi cấy tối ưu

STT Tên môi trường pH Nhiệt độ Thời gian OD dịch nuôi cấy

1 Nước dừa già 5,2 30,3 o C 92 giờ 0,184 2 Mật rỉ đường 4,9 30 o C 107 giờ 0,175 3 Nước mía 5,2 30,5 o C 102 giờ 0,180 4 Nước thơm 5,3 30,6 o C 105 giờ 0,145

- Giá trị trung bình : pH : (5,1 ± 0,2)

Thời gian lên men : (101 ± 9) giờ ( tương đương 4 ngày)

- Từ kết quả trên cho thấy:

Vi khuẩn A xylinum BC16 sinh trưởng được trên cả năm loại môi trường, trong đó môi trường nước dừa già vi khuẩn phát triển tốt nhất vì đây là môi trường phổ biến có thành phần dinh dưỡng thích hợp với loại vi khuẩn này, điều này phù hợp với nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thúy Hương và Phạm Thành Hổ (2005) [5] , của Kongruang S (2008) [37] Đối với môi trường whey protein là môi trường mà vi khuẩn phát triển chậm với thời gian dài nhất, có lẽ do vi khuẩn thích nghi chậm với loại môi trường này Trên môi trường mật rỉ đường vi khuẩn phát triển kém nhất do chất lượng thành phần dinh dưỡng hạn chế hoặc có nhiều tạp chất

Nhiệt độ trên các môi trường nuôi cấy không khác biệt nhiều dao động trong hẹp (30÷ 30,6 o C), phù hợp và gần với nhiệt độ môi trường tự nhiên, giúp tiết kiệm chi phí năng lượng, thuận lợi cho việc lên men quy mô công nghiệp

Vi khuẩn thích hợp với pH trong khoảng (4,9 ÷ 5,3) đây là khoảng pH acid yếu thuận lợi cho việc hạn chế sự phát triển của các vi khuẩn hoại sinh giúp vi khuẩn sinh trưởng tốt hơn, thích hợp cho việc lên men trong trong thực tiễn Trên các môi trường nguyên liệu khác nhau không có khác biệt nhiều về pH Các giá trị này phù hợp với nghiên cứu của Đinh thị Kim Nhung và cộng sự [8] ,của Chawla P.R và cộng sự [20] , của Tantratian S và cộng sự [52]

Thời gian tối ưu trong khoảng (92 ÷ 110) giờ, phù hợp với giai đoạn tăng sinh trên đường cong tăng trưởng của vi khuẩn, phù hợp với nghiên cứu của Nguyễn thúy Hương, của Phạm Thành Hổ (khoảng 4 ngày) [5, 6, 7] Qua đó cho thấy có thể ứng dụng lên men tạo chế phẩm BC trong thực tiễn với thời gian không quá dài, tiết kiệm giá thành sản phẩm, hạn chế sự tạp nhiễm Đây là các điều kiện nuôi cấy gần với điều kiện tự nhiên, dễ dàng áp dụng vào sản xuất quy mô lớn

4.5.2 Tỷ lệ pepton và glucose tối ưu trong lên men bề mặt tạo S-BC

Bảng 4.36 Tóm tắt tỷ lệ thành phần pepton và glucose tối ưu

STT TÊN MÔI TRƯỜNG Pepton (%) Glucose (%) Năng suất S-BC (g/l)

- Giá trị trung bình : Pepton : (1,135 ± 0,365) %

- Từ kết quả trên cho thấy:

Tỷ lệ sử dụng glucose cao do đây là nguồn năng lượng quan trọng cho sự tăng trưởng của vi khuẩn và quá trình sinh tổng hợp BC Trong mật rỉ đường, hàm lượng đường cao khiến tỷ lệ sử dụng glucose thấp nhất Tuy nhiên, so với các nghiên cứu trước đó của Nguyễn Thúy Hương, Chawla và cộng sự, Tantratian và cộng sự, tỷ lệ sử dụng glucose trong nghiên cứu này vẫn thấp hơn.

Tỷ lệ pepton cần cho quá trình không cao vì vi khuẩn có thể sử dụng các nguồn amôn để cung cấp Nitơ, chỉ dao động trong khoảng 1% và nhu cầu thấp nhất ở môi trường dịch thơm (0,77%) do thơm chứa nhiều khoáng chất, chất tăng trưởng và một phần protein thực vật đáng kể hỗ trợ cho quá trình lên men (phụ lục I)

Năng suất S-BC cao hơn so với A-BC (= 74,36%), phù hợp với nghiên cứu của

Trong nghiên cứu của Zhou LL và cộng sự, tốc độ lắc nhanh hơn dẫn đến sự hình thành của axit gluconic từ một phần glucose, do đó làm giảm tổng hợp sản phẩm A-BC, theo nghiên cứu của Tantratian S và cộng sự.

1- Nước dừa ; 2- Rỉ đường ; 3- Nước mía ; 4- Dịch thơm ; 5- Whey protein

Hình 4.6 Đồ thị so sánh năng suất S-BC và A-BC trên cùng môi trường

4.5.3 Đề xuất quy trình lên men tĩnh tạo màng S-BC

Từ những kết quả nghiên cứu đạt được ở trên chúng tôi đề xuất quy trình lên men tĩnh (lên men bề mặt) để thu nhận sản phẩm màng S-BC như sau :

Bảng 4.37 Tóm tắt quy trình lên men tĩnh tạo S-BC trên các môi trường

Nguyên liệu Tỷ lệ giống Điều kiện lên men Thành phần môi trường

1/Nước dừa già 10 % pH : 5,2 Nhiệt độ : 30,3 o C Thời gian : 92 giờ

Nước dừa già 100 ml ; (NH4) 2 SO 4 0,8%

2/Rỉ đường 10 % pH : 4,9 Nhiệt độ : 30 o C Thời gian : 107 giờ

Nước cất cho đủ 100 ml Môi trường (len men tĩnh và len men chìm)

3/Nước mía 10 % pH : 5,2 Nhiệt độ : 30,5 o C Thời gian : 102 giờ

Nước cất cho đủ 100 ml

4/Dịch thơm 10 % pH : 5,3 Nhiệt độ : 30,6 o C Thời gian : 105 giờ

Nước cất cho đủ 100 ml

5/Whey protein 10 % pH : 5,2 Nhiệt độ : 30 o C Thời gian : 110 giờ

Dịch chiết khoai tây 50% cho đủ 100 ml

4.5.4 Đề xuất quy trình lên men chìm tạo A-BC

Tượng tự như quy trình lên men tĩnh, nhưng quy trình lên men chìm thực hiện ở chế độ lắc tối ưu (vlắc : 215 vòng/phút) để thu sản phẩm A-BC.

KHẢO SÁT CÁC ĐẶC TÍNH CỦA MÀNG BC

Nguyên liệu tự nhiên ban đầu (nước dừa già; rỉ đường; nước mía; nước thơm; dịch whey protein) qua lọc, ép để tách bã và tạp chất, sau đó được bổ sung dinh dưỡng cơ bản theo công thức nghiên cứu ở trên, khuấy trộn nhiệt cho đều và được hấp thanh trùng ở điều kiện (121 o C,1 atm, 15 phút) Để nguội ở nhiệt độ phòng

Giống được tiến hành kiểm tra và nhân giống theo điều kiện thí nghiệm trên Sau đó đưa vào môi trường lên men với cùng tỷ lệ 10% giống (10 ml giống : 90 ml môi trường), trộn đều rồi cho vào khay để ủ và tiến hành lên men tĩnh truyền thống ở điều kiện nuôi cấy tối ưu (pH, nhiệt độ, thời gian) và tỷ lệ dinh dưỡng tối ưu (tỷ lệ nitơ và carbon) đã được xác định ở các thí nghiệm trên Thu sản phẩm màng S-BC thô

Hình 4.7 Các sản phẩm S-BC chưa xử lý

Tiến hành xử lý: Màng BC rửa sạch với nước cất, ngâm trong dung dịch NaOH 3% trong 3 giờ Sau đó rửa trong nước cất và vắt ráo nước, trung hòa bằng dung dịch HCl 5% Sau đó vớt ra, ngâm trong nước cất sạch trong 2 giờ, rửa nhiều lần, vắt ráo nước và để khô Hấp khử trùng ở điều kiện (121 o C,1 atm, 20 phút) Sấy khô và bảo quản

Sản phẩm S-BC sau khi được xử lý cho thấy khá tương đồng

Hình 4.8 Các sản phẩm S-BC đã xử lý

4.6.1 Khảo sát độ hút ẩm của màng BC

Bảng 4.38 Khảo sát độ hút ẩm của màng BC

Năng suất BC tươi (g/l) Năng suất BC khô (g/l) Độ hút ẩm (%)

Qua khảo sát cho thấy:

- Độ hút ẩm tương đối cao, trung bình đạt : 98,76 % Theo Klemm D và cộng sự

[35], Schrecker S T và cộng sự [46] là 99%.

- Độ hút ẩm của màng S-BC tạo từ các môi trường nghiên cứu là như nhau, kết quả này tương tự với nghiên cứu của giả Nguyễn Thúy Hương [6]

- Tỷ lệ hút và giữ ẩm khá cao do cấu tạo đặc biệt của các dải siêu mịn và xốp của BC tạo thành cấu trúc mắt lưới dày đặc, được ổn định nhờ các liên kết hydro Đặc tính này có giá trị cho việc tạo các sản phẩm màng bảo quản thực phẩm và màng băng bó vết thương, màng trị phỏng trong y khoa

- Năng suất BC thu được trên các môi trường nghiên cứu có sự khác nhau, cao nhất ở môi trường nước dừa và thấp nhất trên môi trường rỉ đường phù hợp với nghiên cứu của Phạm Thành Hổ [7] , Chawla và cộng sự [20] , Sumate T và cộng sự [46] Năng suất BC trên môi trường nước dừa già và nước thơm có sự khác nhau rõ rệt, kết quả này khác biệt so với nghiên cứu của Trương Nguyễn Quỳnh Hương, khi cho rằng năng suất là tương đương ở môi trường nước cốt dừa và nước thơm

1- Nước dừa ; 2- Rỉ đường ; 3- Nước mía ; 4- Dịch thơm ; 5- Whey protein

Hình 4.9 Đồ thị so sánh năng suất S-BC khô trên các môi trường nguyên liệu Độ ẩm (%)

1- Nước dừa ; 2- Rỉ đường ; 3- Nước mía ; 4- Dịch thơm ; 5- Whey protein

Hình 4.10 Đồ thị độ hút ẩm của màng BC trên các các môi trường

4.6.2 Khảo sát độ chịu lực, độ kéo đứt, độ tro của màng BC

Bảng 4.39 Khảo sát tỷ lệ tro và độ bền của màng BC

STT Tên môi trường nguyên liệu Độ dày (mm) Độ chịu lực (kg/cm 3 ) Độ kéo đứt (kg/cm 3 )

Qua kết quả khảo sát cho thấy : - Độ dày của màng S-BC thu được từ các môi trường nguyên liệu nuôi cấy khác nhau khá đồng đều

- Độ chịu lực của các loại màng S-BC tương đối cao và khá giống nhau, trung bình đạt: (802,5 ± 7,5) kg/cm 3 tương đương với độ chịu lực của nhôm

- Hàm lượng tro của các loại màng tương tự nhau và chiếm hàm lượng rất nhỏ

4.6.3 Khảo sát độ cảm quan về màu sắc, mùi vị, độ trong của màng BC

Tiến hành khảo sát, so sánh độ cảm quan về màu sắc, mùi và độ trong suốt của màng BC trước và sau khi được xử lý Kết quả mô tả ở bảng 4.40

Bảng 4.40 Khảo sát độ cảm quan của màng BC

Trước xử lý Sau xử lý STT

Môi trường nguyên liệu Màu sắc, mùi Độ trong Màu sắc, mùi Độ trong

1 Màng BC/ nước dừa già

Vàng nhạt, mùi khét nhẹ Hơi đục Trắng, không mùi

2 Màng BC/ rỉ đường Vàng sậm, mùi khét nhẹ Hơi đục Trắng, không mùi

3 Màng BC/ nước mía Vàng nhạt, mùi khét nhẹ Hơi đục Trắng, không mùi

Vàng nhạt, mùi khét nhẹ Hơi đục Trắng, không mùi

Vàng nhạt, mùi khét nhẹ Hơi đục Trắng, không mùi

Như vậy qua khảo sát các đặc tính màng sau xử lý thu nhận từ quá trình lên men trên các môi trường nghiên cứu cho thấy khá giống nhau, độ cảm quan khá tốt , đẹp về màu sắc, độ mịn, độ sáng và không tạo mùi vị lạ Từ đó dễ dàng tạo sản phẩm thương mại thân thiện với môi trường dễ được xã hội chấp nhận

Sau quá trình nghiên cứu, chúng tôi thu được kết quả sau:

1 Có thể sử dụng vi khuẩn A xylinum BC16 để lên men thu nhận BC trên môi trường truyền thống nước dừa già và trên các môi trường không truyền thống: rỉ đường, nước mía, nước thơm, whey protein, có thể dùng làm môi trường thay thế

2 Xác định được điều kiện nuôi cấy tối ưu và tỷ lệ dinh dưỡng tối ưu (pepton hoặc whey và glucose) cho quá trình lên men, từ đó xây dựng quy trình lên men tĩnh thu nhận S-BC hiệu quả trên các loại môi trường nguyên liệu (Bảng tóm tắt)

3 Xác định được tốc độ lắc tối ưu trong quá trình lên men chìm thu nhận A- BC trên các loại môi trường nghiên cứu là 215 vòng/phút

4 Bước đầu khảo sát được một số đặc tính của màng S-BC như: độ hút ẩm, độ chịu lực, độ kéo đứt, độ tro và độ cảm quan về màu sắc, mùi vị, độ trong suốt

- Bảng tóm tắt quy trình lên men thu nhận BC :

Nguyên liệu Tỷ lệ giống Điều kiện lên men Thành phần môi trường

1/Nước dừa già 10 % pH : 5,2 Nhiệt độ : 30,3 o C Thời gian : 92 giờ

Nước dừa già 100 ml ; (NH4) 2 SO 4 0,8%

2/Rỉ đường 10 % pH : 4,9 Nhiệt độ : 30 o C Thời gian : 107 giờ

Nước cất cho đủ 100 ml

3/Nước mía 10 % pH : 5,2 Nhiệt độ : 30,5 o C Thời gian : 102 giờ

Nước cất cho đủ 100 ml

4/Dịch thơm 10 % pH : 5,3 Nhiệt độ : 30,6 o C Thời gian : 105 giờ

Nước cất cho đủ 100 ml

5/Whey protein 10 % pH : 5,2 Nhiệt độ : 30 o C Thời gian : 110 giờ whey protein 1,02%; (NH 4 ) 2 SO 4 0,8%

Dịch chiết khoai tây 50% cho đủ 100 ml

- Khảo sát thêm các nguồn phụ phế phẩm khác dùng cho lên men thu nhận BC

- Khảo sát thêm các yếu tố ảnh hưởng như: tốc độ thổi khí oxy, tốc độ khuấy, diện tích bề mặt lên men, độ sâu của dịch cấy

- Khảo sát ảnh hưởng của giống: loại giống, tỷ lệ giống, thời gian nhân giống

- Khảo sát các đặc tính của sản phẩm lên men chìm (A-BC)

- Lặp lại thí nghiệm và xử lý số liệu bằng chương trình phần mền máy tính

[1] Nguyễn Văn Cách.(2004) “Công nghệ lên men các chất kháng sinh”, NXB Đại học Khoa học và Kỹ thuật

[2] Nguyễn Cảnh.(2004) “Quy hoạch thực nghiệm”, NXB Đại học Quốc gia

[3] Nguyễn Lân Dũng và cộng sự.(1976) “Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học”,tập II và III Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật.

[4] Phạm Thành Hổ.(2002) “Sinh học đại cương”, tập 1,2 Nhà xuất bản Đại học quốc gia TP.HCM.

[5] Nguyễn Thúy Hương và Phạm Thành Hổ.(2005) “Chọn lọc dòng A xylinum thích hợp cho các loại môi trường dùng trong sản xuất Cellulose vi khuẩn với quy mô lớn”, ĐHQG Tp HCM.

[6] Nguyễn Thúy Hương.(2007) “Tuyển chọn và cải thiện các chủng Acetobacter xylinum tạo cellulose vi khuẩn để sản xuất và ứng dụng qui mô pilot”, Luận án Tiến sĩ Sinh học, ĐHQG Tp HCM.

[7] Phạm Thành Hổ và cộng sự.(2007) “Hoàn thiện quy trình sản xuất cellulose vi khuẩn ở quy mô pilot và bước đầu ứng dụng trong thực phẩm, y dược và vật liệu mới”, ĐHQG Tp HCM.

[8] Đinh Thị Kim Nhung và cộng sự.(2011).“Nghiên cứu vi khuẩn A.xylinum sinh tổng hợp màng cellulose ứng dụng trong điều trị bỏng” Đại học Sư phạm Hà Nội.

[9] Nguyễn Đức Lượng.(2002) Công nghệ vi sinh” – Tập 1,2,3 – Vi sinh vật công nghiệp Nhà xuất bản Đại hoc quốc gia TP.Hồ Chí Minh.

[10] Nguyễn Đức Lượng.(2004).“ Công nghệ enzyme”– Tập 1,2,3 NXB ĐHQG TP.HCM.

[12] Lương Đức Phẩm.(2010).“Công nghệ lên men” Nhà xuất bản Giáo dục Việt nam.

[13] Akira Seto., Kojima Y., Tonouchi N., Tsuchida T., Yoshinaga F.(1997) “A screening of bacteria cellulose - producing Acetobacter Strains Suitable for Sucrose as carbon source”.Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 61, no

[14] Bielecki S., Krystynowicz A., Turkiewicz M., Kalinowska H.(2005) “Bacterial Cellulose”,Technical University of Lódz Poland, 3, 37-46.

[15] Brown R M.(1998) “Microbial cellulose: a new resource for wood, paper, textiles, food and specialty products”.

[16] Brown R M.(1989)."Cellulose: Structural and functional aspects".Ed Kennedy, Phillips, & Williams Ellis Horwood Ltd pp 145-151

[17] Brown R.M.(1999) “Cellulose structure and biosynthesis”, Pure Appl Chem.,

[18] Buchannan R.E., Gibbon N.E., (1975) “Bergey’s manual of determinative bacteriology” 8 th ed., Waverly Press Inc Bhaltimore, MD 267-277.

[19] Chao Y., Sugano Y., Shoda M.(2001) “Bacterial cellulose production under oxygenenriched air at different fructose concentrations in a 50 liter, internal-loop airlift reactor”.Appl Microbiol Biotechnol, 55(6); 673-9.

[20] Chawla P.R., et al.(2009) “Fermentative Production of Microbial Cellulose”,Food Technol Biotechnol 47(2) 107–124

[22] Embuscado M.E., Marks J.S., BeMiller J.N.(1994) “Bacterial cellulose:

Factors affecting the production of cellulose by A xylinum”, Food Hydrocolloids, 8(5), 407-418.

[23] Fumihiro Yoshinaga, Naoto Tonouchi, Kunihiko Watanabe.(1997).

“Research progress in production of bacterial cellulose by aeration and agitation culture and its application as a new industrial material”,

[24] Garcia M.V., Bontoux L., “Food applications of the new polysaccharides technology”.

[25] Helenius G., et al.(2005) "In vivo biocompatibility of bacterial cellulose"

Journal of Biomedical Material Research: Part A, vol 76A, no 2, 431-438.

[26] Hai-Peng Cheng, Pei-Ming Wang, Jech-Wei Chen, Wen-Teng Wu.

(2002).“Cultivation of Acetobacter xylinum for bacterial cellulose production in a modified airlift reacter”, Biotechnol Appl Biochem 35, 125-132.

[27] Hestrin S., Ascher M., Mager J.(1947) “Syntheris of cellulose by resting cell ofAcetobacter xylinum”,Nature, 159, 64-65.

[28] Hirai A., Horii F.(1999) “Cellulose assemblies produced by Acetobacter xylinum”.ICR Annual Report, Vol 6, pp 28-30.

[29] Hirishi Ougiya., Watanabe K., Morinaga Y., Yoshinaga F.(1997).

“Emulsion- stabilizing effect of bacterial cellulose”, Bioci Biotechnol.

[30] Hong-joo Son., Moon-Su Heo., Young-Gyun Kim., Sang-Joon Lee.(2001).

“Optimization of fermentation conditions for the prodution of BC by a determinative bacteriology”,Williams & Wilkins, 71, 126.

[32] Ishikawa A., Tsuchida T., Yoshinaga F.(1998) “Ralationship between sulfaguanidine resistance and increased cellulose production in Acetobacter xylinum BPR3001E” Biosci Biotechnol Biochem., 62(6), pp 1234-1236.

[33] Johnson D C., Neogi A N., Leblanc H A.(Mar.10,1988) “Bacterial cellulose as surface treatment for fibrous web” U.S United States Patent 4861427.

[34] Klemm D., Heublein B., Fink H.B., Bohn A.(2005).“ Cellulose: Fascinating Biopolymer and Sustainable Raw Material”, Angewandte Chemie International Edition ,44(22), 3358- 3393.

[35] Klemm D., Schumann D., Udhardt U., Marsch S.(2001) “Bacterial synthesized cellulose - artificial blood vessels for microsurgery” Progress in Polymer Science, Vol 26, No 9, pp 1561-1603.

[36] Kojima Y., Tonouchi N., Tsuchida T.(1998) “The characterization of acetic acid bacteria efficiently producing bacterial cellulose from sucrose: the proposal of Acetobacter xylinum subsp nonacetoxidans subsp nov.”, Biosci Biotechnol Biochem, 62, 185-187.

[37] Kongruang S.(2008) “Bacterial cellulose production by Acetobacter xylinum strains from agricultural Waste products”, Appl Biochem.

[38] Krystynowicz A., Bielecki.(2000) “Biosynthesis of bacterial cellulose and its potential application in the different industries”, Technical UniversityLódz, Poland.

[40] Neill H.O., Evans B.R., Woodward J.(2002) “Bacterial cellulose in energy conversion applications”.

[41] Nishi Y, et al.(1990) “The structure and mechanical properties of sheets prepard from bacterial cellulose”Journal of Material Science, vol 25, no 6, pp.

[42] Owen M Astley et al.(2001) “Structure of Acetobacter cellulose composites in the hydrated state” International Journal of Biological Macromolecules,29,193–20

[43] Peng Xiangping., Lu Hongmei.(2010) “Comparision of different ways to raise bacterial cellulose yield”.Guizhou University,Guiyang 550003,China.

[44] Ramana K.V., Tomar A., Singh L.(2000) “Effect of various carbon and nitrogen sources on cellulose synthesis by Acetobacter xylinum”, World J.

[45] Sanchez P.C., Yoshida T., Pulido MA., Nakajima M.(1999) “Fermentation conditions for high-cellulose production of Philippine strains of Acetobacter xylinum” International Conference on Asian Network on Microbial Research chiang Mai, Thailand, pp.459-461.

[46] Schrecker S T., Gostomski P A (2005) “Determining the water holding capacity of microbial cellulose.” Biotechnology Letters, Vol 27, No 19, pp.

1435-1438, [47] Sheu M.J., Tai S.P “Textur al properties of bacterial cellulose produced from coconut wate fermentation by Acetobacter xylinum”.

[48] Son H.J., Heo M.S., Kim Y.G.,Lee S.J.(2001) “Optimization of fermentation conditions for the production of bacterial cellulose by a newly trends”,Microbiology today, Vol.29, 317-229.

[50] Takehiko Ishida, Makoto Mitarai, Yasushi Sugano, Makoto Shoda (2003).

“Role of water Soluble Polysaccharides in of bacterial cellulose production”,Biotechnology & Bioengineerin, Vol 83, No.4, 474-478.

[51] Takehiko Ishida, Yasushi Sugano, Tomonori Nakai, Makoto Shoda (2002).

“Effects of acetan on production of bacterial cellulose by Acetobacter xylinum”, Biotechno Appl Biochem, 66(8),pp.1677-1681.

[52] Tantratian S., Tammarate P., Krusong W., Bhattarakosol P., Phunsri A.(2005).

“Effect of Dissolved Oxygen on Cellulose Production byAcetobacter sp”.J.

Sci Res Chula Univ., Vol 30, No 2.

[53] Thompson D., Hamilton M., “Production of bacterial cellulose from alternate feedstocks”.

“Characterization of cellulose membranes produced by Acetobacter xylinum”.Songklanakarin J Sci Technol,24:855-862.

[55] Wang W., Wang P., Hu R.(2011).“A novel screening method of cellulase producing bacteria” Prikl Biokhim Mikrobiol 47(1):58-60 PubMed PMID:21438471.

[56] Watanabe K., Yamanaka S (1995) “Effect of oxygen tension in the gaseous phase on production and physical properties of bacterial cellulose formed under static culture conditions”,Biosci Biotechnol Biochem, 59, 65-68.

[57] Wei Sheng., Wu Xue Bao.(2007).“Influence of culture mode on bacterial cellulose production and its structure and property” Oct;47(5):914-7.

[59] Yukiko Kojima, Naoto Tonouchi, Takayasu Tsuchida, Fumihiro Yoshinaga.

(1998) “The chararecterization of Acetic acid bacteria efficiently producing bacterial cellulose from sucrose: the proposal of Acetobacter xylinum subsp.

Nonacetoxidans subsp”.Biosci.Biotechnol.Biochem., 62 (1),185-187.

[60] Zhou Ling-li., Sun Dong-ping., Wu Qing-hang., Yang Jia-zhi., Yang Shu-lin.

(2007) “Influence of culture mode on bacterial cellulose production and its structure and property”, ActaMicrobiologica Sinica, 5.

[60] http://samson.net.vn/uploaded/image/matriduong2.jpg&imgrefurl [61] http://www.vtnews.edu/articles/2008/11/2008-693.html

[62] http://community.h2vn.com[63] http://vietsciences.org và http://vietsciences.free.fr[64] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/

Thành phần Hàm lượng 3/ Thành phần acid amin Hàm lượng

1/ Thành phần hóa học (%) Arginine 0,014 Đường 2,56 Histidine 0,01

Tỷ lệ tro 0,46 Prolin 0,06 pH 5,6 Glutamine 0,12

2/ Thành phần vitamin (à/ml) Asparagine 0,012 Acid nicotinic 0,64 4/ Thành phần vi lượng (à/100ml)

Củ cải Đường mía Đường tổng (%) 48-52 48-56

Quy trình xử lý mật rỉ đường [7] pha loãng rỉ đường: Nước = 10g:8 ml

Khuấy trộn 30 phút Thêm acid H2SO4 tỉ lệ = 6ml acid: 1000g rỉ

Khuấy trộn 30 phút Lắng 6-12 giờ

1/ Thành phần hóa học Asp 5,45 Đường tổng (%) 14 Gln 2,56

Tỷ trọng 1,08 Asn 3,53 Độ khô ( o Bx) 18,5 Met 2,56 pH 5,6 Phe 2,24

Arg 4,49 4/ Thành phần vi lượng (%)

Protide 0,5 3/ Thành phần vi lượng (%)

2/ Thành phần vitamin (%) Lưu huỳnh 3,00

1/ Giá trị thực hiện tại tâm phương án trên môi trường nước dừa già

2/ Giá trị thực hiện tại tâm phương án trên môi trường rỉ đường

3/ Giá trị thực hiện tại tâm phương án trên môi trường nước mía

4/ Giá trị thực hiện tại tâm phương án trên môi trường dịch thơm

5/ Giá trị thực hiện tại tâm phương án trên môi trường Whey protein

7/ Giá trị tính phương sai dư và giá trị Fisher trên môi trường rỉ đường

(Y theo PTHQ) y-y mu (y-y mu)² (Sdư)² F F(1-p)(f1,f2) Kết luận

8/ Giá trị tính phương sai dư và giá trị Fisher trên môi trường nước mía

(Y theo PTHQ) y-y mu (y-y mu)² (Sdư)² F F(1-p)(f1,f2) Kết luận

9/ Giá trị tính phương sai dư và giá trị Fisher trên môi trường dịch thơm

(Y theo PTHQ) y-y mu (y-y mu)² (Sdư)² F F(1-p)(f1,f2) Kết luận

II Tối ưu hóa điều kiện dinh dưỡng

1/ Giá trị thực hiện tại tâm phương án trên môi trường nước dừa già

2/ Giá trị thực hiện tại tâm phương án trên môi trường rỉ đường

3/ Giá trị thực hiện tại tâm phương án trên môi trường nước mía

4/ Giá trị thực hiện tại tâm phương án trên môi trường dịch thơm

6/ Giá trị tính phương sai dư và Fisher trên môi trường nước dừa già

(Y theo PTHQ) y-y mu (y-y mu)² (Sdư)² F F(1-p)(f1,f2) Kết luận

7/ Giá trị tính phương sai dư và Fisher trên môi trường rỉ đường

(Y theo PTHQ) y-y mu (y-y mu)² (Sdư)² F F(1-p)(f1,f2) Kết luận

8/ Giá trị tính phương sai dư và Fisher trên môi trường nước mía

(Y theo PTHQ) y-y mu (y-y mu)² (Sdư)² F F(1-p)(f1,f2) Kết luận

9/ Giá trị tính phương sai dư và Fisher trên môi trường dịch thơm

(Y theo PTHQ) y-y mu (y-y mu)² (Sdư)² F F(1-p)(f1,f2) Kết luận

10/ Giá trị tính phương sai dư và Fisher trên môi trường Whey protein

(Y theo PTHQ) y-y mu (y-y mu)² (Sdư)² F F(1-p)(f1,f2) Kết luận