Đồ án tốt nghiệp thử nghiệm cố định saccharomyces cerevisiae và pichia anomala trên chất mang pva alginate và ứng dụng trong lên men thu nhận ethanol từ vỏ cacao

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH o H hi C ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP h in M THỬ NGHIỆM CỐ ĐỊNH SACCHAROMYCES ity C CEREVISIAE VÀ PICHIA ANOMALA TRÊN CHẤT MANG PVA – ALGINATE VÀ ỨNG DỤNG TRONG U Ngành: ity rs ve ni LÊN MEN THU NHẬN ETHANOL TỪ VỎ CACAO CÔNG NGHỆ SINH HỌC of Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC ch Te : ThS Trần Thị Tưởng An Sinh viên thực : Ngô Lê Hồng Duyên TP Hồ Chí Minh, 2016 gy Lớp: 12DSH02 lo MSSV: 1211100062 no Giảng viên hướng dẫn Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng, đồ án tốt nghiệp “Thử nghiệm cố định Saccharomyces cerevisiae Pichia anomala chất mang PVA-alginate o H ứng dụng lên men thu nhận ethanol từ vỏ cacao” công trình nghiên cứu thực cá nhân tơi, thực sở nghiên cứu lý thuyết, kiến thức hi C dựa sở nghiên cứu lý thuyết dựa hướng dẫn khoa học Th.S Trần Thị Tưởng An Các số liệu sử dụng đồ án trung thực có nguồn gốc cụ thể, rõ M ràng Nội dung đồ án có tham khảo sử dụng tài liệu thơng tin đăng tải h in sách, tác phẩm, tạp chí trang web theo danh mục tài liệu khóa luận C ity Tp Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng 08 năm 2016 Sinh viên thực U Ngô Lê Hồng Duyên ity rs ve ni of lo no ch Te gy i Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN o H hi C Lời em xin cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Cơng nghệ Tp Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học – Môi trường – Thực phẩm tạo điều kiện cho em thực đồ án Em xin cảm ơn toàn thể thầy cô khoa Công nghệ sinh học – Môi trường – Thực phẩm tận tình truyền đat kiến thức kỹ để em hồn thành khóa luận Trong suốt khoảng thời gian làm khóa luận tốt nghiệp phịng thí nghiệm Năng Lượng Sinh Học Biomass – Đại học Bách Khoa Tp.Hồ Chí Minh Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến: Cô Trần Thị Tưởng An, trường Đại học Bách Khoa Tp.Hồ Chí Minh Cảm ơn gợi ý đề tài, tạo điều kiện cho em làm khóa luận đại học Bách Khoa, tận tình hướng dẫn chi tiết công việc, theo sát dẫn, động viên em, hỗ trợ kinh phí suốt q trình làm khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn đến anh, chị làm việc phịng thí nghiệm nhiệt tình hỗ trợ em suốt thời gian làm việc Cảm ơn ba mẹ người luôn bên cạnh động viên tinh thần em lúc em cảm thấy khó khăn Cuối cùng, cảm ơn tất bạn phịng thí nghiệm người bạn bên cạnh giúp đỡ em việc Mặc dù cố gắng để thực đề tài cách hoàn chỉnh Song buổi đầu làm quen với công tác nghiên cứu khoa học, tiếp cận với thực nghiệm máy móc đại hạn chế kiến thức kinh nghiệm nên khơng tránh khỏi thiếu sót Em mong góp q thầy bạn để kiến thức em lĩnh vực hoàn thiện Một lần em xin chân thành cảm ơn Tp Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng 08 năm 2016 Sinh viên thực h in M ity C ity rs ve ni U of Te Ngô Lê Hồng Duyên lo no ch gy ii Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẲT v o H DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH ẢNH vii LỜI MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Mục tiêu đề tài Nội dung nghiên cứu hi C M CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU h in 1.1 Giới thiệu bioethanol Khái niệm 1.1.2 Các hệ bioethanol C 1.1.1 Bioethanol hệ thứ ❖ Bioethanol hệ thứ hai ❖ Bioethanol hệ thứ ba 1.2 Quy trình sản xuất ethanol ity ❖ ni U Tiền xử lý 1.2.2 Thủy phân 10 1.2.3 Lên men 11 1.2.4 Chưng cất, thu hồi bioethanol 11 ity rs 1.3 ve 1.2.1 Nguồn nguyên liệu sản xuất bioethanol 13 Một số nguồn nguyên liệu sản xuất bioethanol 13 1.3.2 Sản xuất bioethanol sử dụng nguồn nguyên liệu vỏ cacao 15 of 1.3.1 Giới thiêu vỏ cacao 15 1.3.2.2 Tình hình sản xuất cacao Việt Nam 15 ch 1.4 Te 1.3.2.1 Cố định tế bào 17 Định nghĩa phương pháp cố định 17 1.4.2 Ưu điểm & nhược điểm 20 1.4.3 Chất mang 22 1.4.4 Saccharomyces & Pichia 26 1.4.5 Một số nghiên cứu cố định tế bào 28 lo no 1.4.1 gy CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1 Thời gian địa điểm thực đề tài 32 2.1.1 Thời gian nghiên cứu 32 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 32 iii Đồ án tốt nghiệp 2.1.3 Đối tượng nghiên cứu 32 2.1.4 Nội dung nghiên cứu 32 Vật liệu thiết bị 32 2.2 o H 2.2.1 Nguyên vật liệu dùng nghiên cứu 32 2.2.2 Hóa chất sử dụng 33 2.2.3 Thiết bị dụng cụ 34 Phương pháp nghiên cứu 35 hi C 2.3 2.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 35 2.3.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm 36 M 2.4 Phương pháp phân tích 39 Phương pháp Vi sinh 39 2.4.2 Phương pháp sinh hóa 42 2.4.3 Xử lý số liệu 43 h in 2.4.1 C CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 44 Quá trình cố định tế bào 44 ity 3.1 Cảm quan nồng độ sodium alginate 44 3.1.2 Ảnh hưởng nồng độ PVA 45 U 3.1.1 ve ni 3.2 Kết sử dụng chế phẩm S.cerevisia P.anomala cố định PVA để lên men thu bioethanol từ vỏ cacao 48 Ảnh hưởng thời gian (giờ) lên men 48 3.2.2 Ảnh hưởng pH 52 3.2.3 Ảnh hưởng tỷ lệ nấm men 54 ity rs 3.2.1 of 3.3 Khả tái sử dụng chế phẩm lên men S.cerevisiae P.anomala cố định gel PVA để lên men 57 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61 Kết luận 61 4.2 Kiến nghị 61 ch Te 4.1 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 no TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 62 TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI 62 lo TÀI LIỆU TỪ INTERNET 63 gy iv Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẲT 3,5-dibnitrosalycylic acid P.anomala Pichia anomala o H DNS hi C h in M Phụ lục PL Polyvinyl alcohol ity C PVA Saccharomyces cerevisiae SDA Sabouraud Dextrose Agar ity rs ve ni U S cerevisiae Sabouraud Dextrose Broth SHF Separate hydrolysis and fermentation SSCF Simultaneous saccharification and co-fermentation SSF Simultaneous saccharification and fermentation TSD Tái sử dụng of SDB lo no ch Te gy v Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG o H Bảng 1.1 Đặc tính hóa lý ethanol Bảng 1.2 Thông số bioethanol so với xăng hi C Bảng 1.3 Các phương pháp tiền xử lý Bảng 1.4 Các kỹ thuật lên men thu nhận bioethanol M h in Bảng 2.1 Thông tin thiết bị sử dụng trình nguyên cứu Bảng 2.2 Các nghiệm thức khảo sát khả cố định tế bào Saccharomyces ity C cerevisiae Bảng 2.3 Các nghiệm thức khảo sát khả cố định tế bào Pichia anomala ity rs ve ni U Bảng 2.4 Bố trí nghiệm thức thí nghiệm of lo no ch Te gy vi Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo ethanol o H Hình 1.2 Sơ đồ chuyển hóa sinh khối lignocellulose thành bioethanol hi C Hình 1.3 Trái cacao Hinh 1.4 Công thức cấu tạo phân tử polyvinyl alcohol h in M Hinh 1.5 Công thức cấu tạo phân tử polyvinyl acetate Hình 1.6 Saccharomyces cereviciae Hình 1.7 Pichia anomala ity C Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm ni U Hình 3.1 Mật độ tế bào cố định PVA ve Hình 3.2 Hiệu suất cố định tế bào rs Hình 3.3 Mật độ tế bào cố định PVA ity Hình 3.4 Hiệu suất cố định tế bào Hình 3.5 Sự thay đổi thành phần theo thời gian lên men of Hình 3.6 Sự thay đổi thành phần theo pH mơi trường lên men trường lên men Hình 3.8 Sự thay đổi thành phần qua số lần tái sử dụng lo no ch Te Hình 3.7 Sự thay đổi thành phần theo tỷ lệ nấm men cố định bổ sung vào môi gy vii Đồ án tốt nghiệp LỜI MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Như biết, kinh tế giới tương lai phụ o H thuộc nhiều vào nhiên liệu hóa thạch, nguồn tài nguyên có dầu thơ tác nhân gây ô nhiễm môi trường lớn báo động hi C vào giai đoạn cạn kiệt tất yếu tài nguyên tự nhiên hữu hạn bị khai thác tối đa M Bên cạnh đó, nhu cầu bảo vệ mơi trường sống trái đất h in dài lâu cần phát triển kinh tế với tốc độ cao quy mô rộng làm cho an ninh lượng toàn cầu ngày bị đe dọa nghiêm trọng Do đó, nhiệm ity C vụ tìm kiếm nguồn thay cho nhiên liệu hóa thạch đặt gần nửa kỷ qua ngày trở nên cấp thiết U Bioethanol nguồn nhiên liệu đầy hứa hẹn tương lai thay cho ni nguồn nhiên liệu hóa thạch, nguồn nhiên liệu tái tạo Bioethanol ve tồn dạng lỏng sử dụng làm nguồn nhiên liệu cho tương lai rs Tuy nhiên, sản phẩm bioethanol có nguồn gốc từ tinh bột dễ bị biến động ity tinh bột nguồn lương thực người Việc sử dụng tinh bột nguyên liệu giàu đường đẩy giá lương thực bioethanol tăng cao so với of sản xuất đường hóa học Trong đó, giá vật liệu trả 40– Te 75% tổng chi phí sản xuất ethanol Vì vậy, việc thay nguồn nguyên liệu để sản xuất bioethanol vô cần thiết Các nguồn nguyên liệu phụ phẩm ch ngành nơng nghiệp rơm rạ, bã mía, vỏ cacao…đang lựa chọn hàng no đầu nay, việc sản xuất bioethanol từ phụ phẩm nông nghiệp giúp giảm giá thành bioethanol, hạn chế rác thải nông nghiệp, tăng suất lao động người lo nông dân, … gy Bioethanol thường sản xuất nấm men tự do, nhiên lên men nấm men tự gặp số vấn đề thời gian lên men dài, suất lên men thấp, tiêu tốn nhiều lượng để tách nấm men sau trình lên men Để khắc phục, ta dùng phương pháp cố định nấm men với nhiều ưu điểm như: tốc Đồ án tốt nghiệp độ sử dụng glucose, tốc độ sinh tổng hợp ethanol cao dù diện tích bề mặt dùng để vận chuyển chất dinh dưỡng nhỏ hơn, khả tái sử dụng nấm men cố định giúp giảm thời gian nuôi cấy thời gian lên men, ổn định hoạt tính nấm men o H Bên cạnh đó, vỏ cacao nguồn phế phẩm nơng nghiệp giàu lignocellulose nên sử dụng để lên men tạo bioethanol hiệu quả, tận dụng nguồn vỏ hi C phế phẩm Với sản lượng năm khoảng 1-2 tấn/ha, lượng vỏ thải gánh nặng lớn môi trường Bên cạnh đó, cacao cho thu hoạch gần M quanh năm nên nguồn cung nguyên liệu thuận lợi Nguồn vỏ ca cao khổng lồ h in bị bỏ phí lâu tận dụng hiệu để thử nghiệm lên men ethanol sinh học C Do vậy, đề tài “Thử nghiệm cố định Saccharomyces cerevisiae & Pichia ity anomala chất mang PVA-alginate ứng dụng lên men thu nhận ethanol từ vỏ ca cao” thực để khảo sát lên men ethanol phương pháp cố U định tế bào ứng dụng nguồn nguyên liệu phế phẩm nông nghiệp vỏ trái cacao ve Mục tiêu đề tài ni rs Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình cố định tế bào nấm men ity Saccharomyces cerevisiae Pichia anomala sử dụng chất mang PVA-alginate, ứng dụng lên men ethanol từ vỏ cacao of Nội dung nghiên cứu Te Để đạt mục tiêu đề tài, tiến hành nghiên cứu nội dung sau: ch - Khảo sát chất mang PVA-alginate để cố định S cerevisiae P.anomala no - Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men sử dụng chế phẩm lên men S.cerevisiae P.anomala cố định chất mang PVA-alginate gy chất mang PVA để lên men thu bioethanol từ vỏ cacao lo - Thử nghiệm khả sử dụng chế phẩm S.cerevisiae P.anomala cố định Đồ án tốt nghiệp ❖ Nhận xét: Dựa vào đồ thị ta thấy, qua lần tái sử dụng (TSD) ta thấy độ cồn giảm dần từ lần (1%) xuống lần TSD (0,9 % ± 0,1) tiếp tục giảm lần TSD (0,7% ± 0,06) o H pH tăng dần từ lần tái sử dụng thứ (5,42 ± 0,08) đến lần tái sử dụng thứ ba hi C (6,1 ± 0,1) việc pH tăng ảnh hưởng lớn tới nấm men hạt gel cố định, pH tối ưu nấm men cố định nằm hạt tiếp tục hoạt động trao đổi chất sinh ethanol M h in Hàm lượng đường khử tăng từ lần thứ (4,1 ± 0,05 mg/ml) tới lần thứ (4,6 ± 0,22 mg/ml) giảm tiếp lần tái sử dụng thứ (3,4 ± 0,19 mg/ml) Tế bào cố định từ C lần TSD sang lần TSD nấm men cố định tiếp tục sử dụng đường lên men tạo ity ethanol nên hàm lượng đường, nhiên hoạt động giảm nên đường tăng lượng cellulose bị thủy phân thành đường, từ lần TSD sang lần TSD hàm U lượng đường tăng chứng tỏ hoạt động nấm men cố định giảm Hàm lượng ve ni cellulose giảm dần từ lần tái sử dụng thứ tới lần tái sử dụng thứ Từ thấy chế phẩm lên men S.cerevisiae P.anomala cố định ity rs gel PVA có khả tái sử dụng of gy lo no ch Te 60 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận o H Khi khảo sát nồng độ PVA nồng độ acid boric để đạt mật độ tế bào cao nhất: hi C - Với hai chủng nấm men Saccharomyces ceresiviae Pichia anomala: nồng độ chất tạo hạt PVA 12% - alginate 1,0% dung dịch tạo hạt acid boric 7,0% - CaCl2 M 2,0% tối ưu cho trình cố định tế bào nấm men h in Các yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men sử dụng tế bào cố định: Từ thí nghiệm khảo sát yếu tố, rút thông số tối ưu để sử C dụng tế bào P anomala S ceresiviae cố định chất mang PVA-alginate ity trình lên men từ vỏ ca cao đạt độ cồn cao nhất: Thời gian lên men: 54 - pH lên men: 5,5 - Tỷ lệ nấm men cố định bổ sung vào môi trường lên men: 3% ve ni U - tái sử dụng Kiến nghị of 4.2 ity rs Chế phẩm lên men S.cerevisiae P.anomala cố định gel PVA có khả Do điều kiện thời gian hạn hẹp nên trình nghiên cứu khả cố định tế Te bào PVA chưa khảo sát lần tái sử dụng nấm men cố định ch Hiệu suất lên men đề tài chưa cao nên cần nghiên cứu khảo sát việc tăng Đẩy mạnh việc ứng dụng kết nghiên cứu vào thực tiễn sản xuất 61 gy Đầu tư cho dự án sản xuất bioethanol lo no mật độ tế bào để cải thiện hiệu suất lên men Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT o H Võ Thị Thúy Huệ, 2013 Nghiên cứu sản xuất thanol sinh học từ vỏ cacao, Nghiên cứu khoa học, đại học Nơng Lâm TP.Hồ Chí Minh hi C Nguyễn Thị Hằng Nga, Nghiên cứu khả sản xuất bioethanol sinh học từ phụ phẩm nông nghiệp Luận văn thạc sĩ, ĐH Khoa Học Tự Nhiên Tp HCM, Việt Nam, 2009 M Phạm Thị Hồng Nga, 2007 Tổng quan tài liệu phương pháp cố định tế bào h in nấm men rượu vang, luận văn tốt nghiệp, Đh Bách Khoa, TP Hồ Chí Minh Nguyễn Văn Pháp, 2013 Bước đầu khảo sát tiền xử lý thủy phân vỏ cacao để làm C nguyên liệu cho q trình lên men bioethanol saccharomyces cerevisiae, Khóa ity luận tốt nghiệp đại học, đại học Cần Thơ, Việt Nam U Lê Văn Việt Mẫn, Bùi Thanh Huyền, Rượu lên men với nồng độ glucose ban defferent ve tập 11, SO 12- 2008 ni cách sử dụng nấm men cố định gel alginate, Tạp chí phát triển KH & CN, rs Nguyễn Lê Minh Thông (2013), Sản xuất bioethanol từ nguyên liệu vỏ cacao ity phuong pháp thủy phân lên men đồng thời, Khóa luận tốt nghiệp đại học, Ðại học Tơn Ðức Thắng, Việt Nam of Nguyễn Ðức Lượng (2011), Công nghệ enzyme, Nhà xuất Ðại học Quốc gia Tp Hồ Te Chí Minh Nguyễn Văn Phát (2013), Buớc đầu khảo sát tiền xử lý thủy phân vỏ cacao để làm ch nguyên liệu cho trình lên men bioethanol Saccharomyces cerevisiae, lo TÀI LIỆU NƯỚC NGỒI no Khóa luận tốt nghiệp đại học, Ðại học Cần Thơ, Việt Nam gy Graeme M.Wal-ker,London business School, August 10-2010, Bioethanol and technology of fuel alcohol, 8-9 62 Đồ án tốt nghiệp Kourkoutas, Y., Bekatorou, A., Banat, I.M., Koutionas, A.A., Immobilization technologies and support materials suitable in alcohol berverages production: a review, Food Microbiology, Vol.21, 2004, 377 – 397 o H Kourkoutas, Y., Kanellaki, M., Koutinas, A.A., Apple pieces as immobilization support of various microorganisms, LWT, Vol.39, 2006, 980-986 hi C Martynenko, N N and Gracheva, L M., Physiological and Biochemical Characteristics of Immobilized Champagne Yeats and Their Participation in M Champagnizing Processes: A Review, Applied Biochemistry and Microbiology, Vol h in 39, No 5, 2003, 439-445 Biofuel Production”, Industrial & Engineering Chemistry Research, 48, 3713-3729 ity C Bickerstaff, Gordon F., Immobilization of enzims and cells, 367p TÀI LIỆU TỪ INTERNET ni ethanol-viet-nam.html U Các nhà máy ethanol việt nam, http://dayvahoc.blogspot.com/2013/09/cac-nha-may- ve Bioethanol, https://de.wikipedia.org/wiki/Bioethanol rs Nguyễn Văn Chính, Nhiên liệu sinh học - nguồn lượng tái tạo tương lai, http://www.vinachem.com.vn/Desktop.aspx/Xuat-ban-pham/So-3-2005/1749/ ity 10 Tình hình phát triển ca cao Việt Nam, of http://cacao.khuyennongvn.gov.vn/news/tID47_Tinh-hinh-phat-trien-cacao-VietNam.html Te 11 Tìm hiểu xăng sinh học, http://mt.gov.vn/moitruong/tin-tuc/1129/35215/tim-hieu- ch ve-xang-sinh-hoc-.aspx no 12 Tình hình ngiên cứu sản xuất nhiên liệu sinh học giới Việt Nam, http://thegioidaunhon.vn/vn/detail/news/tinh-hinh-nghien-cuu-va-san-xuat-nhien-lieu- gy lo sinh-hoc-tren-the-gioi-va-viet-nam/1265 13 Tổng quan nhiên liệu sinh học, https://www.pvoil.com.vn/vi-VN/pvoil/chinh-sachchien-luoc/tong-quan-ve-nhien-lieu-sinh-hoc/281/639 63 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC A Phụ lục A1: Cách dựng đường chuẩn glucose o H - Cân xác 1g glucose hòa tan 200 mL nước cất - Hút 1, 2, 3, 4, mL dung dịch đường glucose vào bình định hi C mức 50 mL, thêm nước cất đến vạch mức Các dung dịch pha có nồng độ glucose 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 mg/mL M - Hút mL dung dịch glucose nồng độ vào ống nghiêm, thêm h in 3mL thuốc thử DNS Mẫu trắng: Hút mL nước cất cho vào ống nghiệm, thêm mL thuốc - C thử DNS bước sóng 540 nm ity Nung cách thủy hỗn hợp 15-20 phút Làm lạnh nhanh đo OD - Từ giá trị OD, vẽ đồ thị đường chuẩn glucose ve ni U - y = 3.4557x + 0.1066 R² = 0.9907 ity 1.793 1.573 1.166 of 0.706 0.438 0.2 0.3 Mật độ quang OD 0.4 0.5 0.6 gy lo no 0.1 ch Te 1.8 1.6 1.4 1.2 0.8 0.6 0.4 0.2 00.147 rs Hàm lượng glucose (mg/mL) Đồ thị đường chuẩn glucose Đồ án tốt nghiệp Phụ lục A2: Cách dựng đường chuẩn cellulose - Dung dịch cellulose chuẩn (20 mg/mL): cân xác 1g cellulose hòa tan 50 mL nước cất mức 100 mL,thêm nước cất đến vạch mức.Các dung dịch pha có nồng độ hi C cellulose 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2; 1,4 mg/mL - Cho 5mL thuốc thử anthrone vào ống nghiệm chứa 0,5mL dung dịch M h in - Mẫu trắng: Hút 0,5 mL nước cất cho vào ống nghiệm, thêm 5mL thuốc thử anthrone C - Nung cách thủy phút Làm lạnh nhanh đo OD bước sóng ity 630nm - Từ giá trị OD, vẽ đồ thị đường chuẩn cellulose U ni Đồ thị đường chuẩn celulose 1.8 1.6 1.4 1.2 0.8 0.6 0.4 0.2 ve y = 1.3455x + 0.0069 R² = 0.992 rs 1.843 1.597 ity 1.376 1.157 of Mật độ quang OD o H - Hút 1, 2, 3, 4, 5, 6, mL dung dịch cellulose vào bình định 0.857 0.201 0.2 0.4 0.6 0.8 1.2 Hàm lượng cellulose (mg/mL) 1.4 1.6 gy lo no ch Te 0.552 Đồ án tốt nghiệp Phụ lục A3: Xây dựng đường cong sinh trưởng Saccharomyces ceresiviae Điều kiện nuôi cấy: o H Môi trường Sabouraud Dextrose Broth - 30oC - Nuôi cấy tĩnh - Tỷ lệ giống bổ sung ban đầu 1%, mật độ 95,78 x 106 cfu/mL hi C - 8.5 h in M Đường cong sinh trưởng 7.5 C 6.5 ity log( cfu/mL) 10 20 ni U 5.5 30 40 50 60 70 80 ve Thời gian( giờ) rs Phụ lục A4: Đường tương quan OD- mật độ tế bào Saccharomyces ceresiviae ity Đường tương quan mật độ quang OD-mật độ tế bào nấm men S.cerevisiae cung cấp Phịng thí nghiệm Nhiên liệusinh học Biomass, Trường đại học of Bách Khoa - Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh 6.9 6.8 y = 1.3775x + 6.2834 R² = 0.9763 6.7 lo 6.6 gy log( số tế bào x10-6 / ml) no ch Te Đường tương quan OD- mật độ tế bào S ceresiviae 6.5 6.4 6.3 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 OD Đồ án tốt nghiệp Phụ lục A3: Xây dựng đường cong sinh trưởng Pichia anomala Điều kiện nuôi cấy: - Môi trường Sabouraud Dextrose Broth o H P.anomala hoạt hóa trước 24 mơi trường SDB để nấm men phát triển sinh khối, tiếp sau sử dụng để xây dựng đường tương quan mật hi C độ quang OD-mật độ tế bào nấm men M h in log(cfu/mL) y = 1.6486x + 7.5527 R² = 0.9824 8.5 8.4 8.3 8.2 8.1 7.9 7.8 7.7 7.6 ity C 0.1 0.2 0.3 OD 0.4 0.5 U ni Tương quan mật đọ quang OD-mật độ tế bào P.anomala ve Khảo sát đường cong sinh trưởng P.anomala dựa vào phương pháp xác định mậtđộ tế bào gián tiếp đường tương quan OD- mật độ tế bào P.anomala log (cfu/mL) 7.77 ch Te 8.53 of 8.5 87.59 7.5 9.06 ity 8.94 rs 9.5 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 lo no thời gian khảo sát (giờ) Đường cong sinh trưởng P.anomala gy Đường tương quan mật độ quang OD-mật độ tế bào nấm men S.cerevisiae cung cấp Phịng thí nghiệm Nhiên liệu sinh học Biomass, Trường đại học Bách Khoa - Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC B KẾT QUẢ XỬ LÝ SỐ LIỆU Bảng Kết khảo sát thời gian sử dụng chế phẩm S.cerevisiae P anomala cố định o H chất mang PVA để lên men thu bioethanol từ vỏ cacao Hàm lượng Hàm lượng (giờ) đường khử cellulose (mg/mL) (mg/mL) 42 6,73 ± 0,12 7,74 ± 0,24 1,77 ± 0,15 5,47 ± 0,15 45 5,48 ± 0,07 5,66 ± 0,12 1,87 ± 0,15 5,42 ± 0,02 6,39 ± 0,22 4,81 ± 0,07 1,87 ± 0,12 5,46 ± 0,02 7,66 ± 0,09 3,82 ± 0,15 1,83 ± 0,15 5,45 ± 0,03 1,90 ± 0,10 5,53 ± 0,06 1,87 ± 0,15 5,50 ± 0,09 hi C Thời gian 51 h in M 48 Hàm lượng cồn pH (%) 8,24 ± 0,05 C 2,42 ± 0,19 56 8,31 ± 0,07 2,85 ± 0,13 ity 54 ni U Bảng Kết khảo sát pH môi trường lên men sử dụng chế phẩm S.cerevisiae P ve anomala cố định chất mang PVA để lên men thu bioethanol từ vỏ cacao Hàm lượng đường khử cellulose (mg/mL) (mg/mL) 4,5 4,12 ± 0,14 5,9 ± 0,09 3,47 ± 0,11 3,6 ± 0,03 Te ity rs Hàm lượng 5,5 2,49 ± 0,27 6,2 ± 0,62 0,97 ± 0,12 pH Hàm lượng cồn of (%) 0,77 ± 0,06 0,93 ± 0,06 gy lo no ch Đồ án tốt nghiệp Bảng Kết khảo sát tỷ lệ nấm men cố định bổ sung vào môi trường lên men sử dụng chế phẩm S.cerevisiae P anomala cố định chất mang PVA để lên men thu bioethanol từ vỏ cacao o H Hàm lượng Hàm lượng men (%) đường khử cellulose (mg/mL) (mg/mL) 2,59 ± 0,06 7,1 ± 1,08 1,00 ± 0,00 5,33 ± 0,07 2,14± 0,07 2,3 ± 0,16 0,87 ± 0,06 5,03 ± 0,11 3,41 ± 0,19 3,6 ± 0,20 0,97 ± 0,06 5,27 ± 0,08 4,57 ± 0,26 19,4 ± 0,56 0,9 ± 0,10 5,33 ± 0,06 hi C Tỷ lệ nấm h in M Hàm lượng cồn pH (%) ity C Bảng Kết khảo sát khả tái sử dụng chế phẩm S.cerevisiae P anomala cố (lần) đường khử Hàm lượng ve Hàm lượng ni TSD U định chất mang PVA để lên men thu bioethanol từ vỏ cacao cellulose (mg/mL) 4,09 ± 0,05 24,77 ± 3,65 4,17 ± 0,24 23,20 ± 1,47 4,65 ± 0,22 10,17 ± 0,21 pH (%) rs (mg/mL) Hàm lượng cồn 1,00 ± 0,00 5,42 ± 0,08 ity 5,80 ± 0,16 0,67 ± 0,06 6,10 ± 0,10 of 0,87 ± 0,15 gy lo no ch Te Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC C HÌNH ẢNH o H Saccharomyces cerevisiae hi C h in M ity C ity rs ve ni U a) Khuẩn lạc S.cerevisiae of c) Cấy ria giữ giống S.cerevisiae ch Te gy lo no b) Tăng sinh S.cerevisiae Đồ án tốt nghiệp Pichia anomala o H hi C h in M C ity c) Cấy ria giữ giống P.anomala a) Khuẩn lạc P.anomala ity rs ve ni U of no ch Te d) Ly tâm thu sinh khối tế bào gy lo b) Tăng sinh P.anomala Đồ án tốt nghiệp Chế phẩm S.cerevisiae P anomala cố định chất mang PVA để lên men thu bioethanol từ vỏ cacao o H hi C h in M C c) nồng độ PVA 12%, alginate 1%, dung dịch acid boric (H3BO3) 7% dung dịch acid boric (H3BO3) 7% ity a) Nồng độ PVA 10%, alginate 1%, U CaCl2 2% ity rs ve ni CaCl2 2% of no ch Te d) nồng độ PVA 13%, alginate 1%, dung dịch acid boric (H3BO3) 7% dung dịch acid boric (H3BO3) 7% CaCl2 2% CaCl2 2% gy lo b) nồng độ PVA 11%, alginate 1%, Đồ án tốt nghiệp o H hi C h in M e) Nồng độ chất mang PVA 14%, alginate 1% dung dịch acid boric (H3BO3) 7% CaCl2 2% ity C ity rs ve ni U of Te b) Hạt gel PVA – alginate cho vào môi trường lên men gy lo no ch a) Hạt gel PVA-alginate trước cho vào môi trường lên men 10 Đồ án tốt nghiệp o H hi C h in M ity C ity rs ve ni U of gy lo no ch Te 11