Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Khảo sát tác động của oligochitosan lên khả năng chịu mặn của cây mạ lúa (Oryza sativa L.)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

NGUYỄN TRẦN PHƯƠNG THANH

KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG CỦA OLIGOCHITOSAN LÊN KHẢ NĂNG CHỊU MẶN CỦA CÂY MẠ LÚA

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

NGUYỄN TRẦN PHƯƠNG THANH

KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG CỦA OLIGOCHITOSAN LÊN KHẢ NĂNG CHỊU MẶN CỦA CÂY MẠ LÚA

Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Bách Khoa – ĐHQG-HCM Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS Lê Thị Thủy Tiên

Cán bộ chấm nhận xét 1: TS Bùi Thị Mỹ Hồng

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

Nguyễn Thúy Hương

TRƯỞNG KHOA

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Nguyễn Trần Phương Thanh MSHV: 1870594 Ngày, tháng, năm sinh: 07/03/1995 Nơi sinh: Tp Hồ Chí Minh Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 8420201

I TÊN ĐỀ TÀI:

Khảo sát tác động của oligochitosan lên khả năng chịu mặn của cây mạ lúa

(Oryza sativa L.) - Effects of oligochitosan on salt stress tolerance in rice seedlings (Oryza sativa L.)

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

Đánh giá tác động hỗ trợ của phân đoạn oligochitosan 5.994 Da nồng độ 75 ppm lên sự sinh trưởng và phát triển của cây mạ lúa trong điều kiện mặn nồng độ muối 0,6%

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 14/02/2022

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 17/06/2022 V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS TS Lê Thị Thủy Tiên

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian thực hiện đề tài tôi đã nhận được sự giúp dỡ tận tình và động viên từ thầy cô, anh chị và các bạn cũng như từ phía gia đình Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến

Toàn thể thầy, cô trường Đại học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh; đặc biệt

là các thầy cô, cán bộ Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học, Bộ môn Công nghệ sinh học, Khoa Kĩ thuật Hóa học đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, thực hiện luận văn tốt nghiệp

Cô Lê Thị Thủy Tiên đã giảng dạy, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm

và luôn động viên tôi trong quá trình làm luận văn

Các thầy, cô trong hội đồng đã dành thời gian đọc và đóng góp nhiều ý kiến cho

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 18 tháng 7 năm 2022 Học viên thực hiện

Nguyễn Trần Phương Thanh

TÓM TẮT

Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu đánh giá ảnh hưởng của oligochitosan kích thước 5.994 Da ở nồng độ 75 ppm lên sự sinh trưởng của cây mạ lúa IR64 trong

điều kiện mặn (NaCl 0,6%) in vitro Khi gặp stress mặn, sự sinh trưởng của cây bị ức

chế đồng thời kích hoạt hệ thống kháng mặn của cây Sự bổ sung oligochitosan làm tăng khả năng chống chịu của cây để duy trì ổn định hoạt động sinh trưởng của cây Thông qua các biến đổi hình thái (số lá, số rễ, chiều dài lá, chiều rộng lá, chiều dài thân tăng), sinh lý (cường độ quang hợp tăng, hô hấp giảm), sinh hóa (tăng hàm lượng chất khô, sắc tố, protein, giảm hàm lượng proline, đường tan và hoạt tính enzyme ascorbate peroxydase) và mức độ biểu hiện gene đáp ứng mặn (tăng mức độ biểu hiện gene P5CS ở lá và rễ , P5CR ở lá, cytosolic APX ở lá và rễ, thylakoid bound – APX ở lá và rễ, stromal APX ở lá)

ASTRACT

This study was investigated to evaluate the effect of oligochitosan size 5.994 Da

at 75 ppm on the growth and salt tolerance of IR64 rice seedlings in in vitro under salinity

stress at 0,6% NaCl Under saline conditions, the growth of plant is inhibited while activating the salt resistance system Oligochitosan treatment helped seedlings to increase their salt tolerance by significantly improving morphological traits (increase number of leaves, number of roots, leaves length, leaves width, stem length), physiologycal (increase photosynthesis intensity, reduced respiration), photosynthetic (increased content of dry weigth, pigments proteins, decreased proline content, soluble surgar and enzyme activity ascorbate peroxydase) and gene expression (increased levels of P5CS gene expression in leaves and roots, P5CR in leaves, cytosolic APX in leaves and roots, thylakoid bound - APX in leaves and roots, stromal APX in leaves)

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và được sự hướng dẫn khoa học của PGS TS Lê Thị Thủy Tiên Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa công bố dưới bất kỳ hình thức nào trước đây Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá được chính tác giả thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi rõ trong phần tài liệu tham khảo

Ngoài ra, trong luận văn còn sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng như số liệu của các tác giả khác, cơ quan tổ chức khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc

Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung luận văn của mình Trường Đại học Bách Khoa TP Hồ Chí Minh không

liên quan đến những vi phạm tác quyền, bản quyền do tôi gây ra trong quá trình thực

1.1.1 Đặc điểm sinh học của cây lúa nước 3

1.1.2 Giống lúa IR64 4

1.2 Căng thẳng do muối 5

1.2.1 Định nghĩa 5

1.2.2 Tác hại của căng thẳng do muối lên cây lúa 6

1.3 Cơ chế kháng mặn ở cây lúa 9

1.4 Các nghiên cứu khắc phục lúa bị nhiễm mặn 13

1.5 Chitosan – Oligochitosan 16

1.5.1 Cấu trúc – Tính chất 16

1.5.2 Tác động của Chitosan – Oligochitosan lên khả năng kháng mặn 17

1.5.3 Các nghiên cứu về Chitosan – Oligochitosan 18

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 21

2.1 Vật liệu 21

2.1.1 Giống lúa IR64 21

2.1.2 Oligochitosan 21

2.2 Phương pháp nghiên cứu 21

2.2.1 Tạo hạt lúa nảy mầm in vitro 23

2.2.2 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của oligochitosan lên khả năng đáp ứng với stress mặn của cây mạ lúa in vitro 23

2.2.2.1 Mục tiêu 23

2.2.2.2 Phương pháp 23

2.2.2.3 Phương pháp thực hiện 24

2.3 Phương pháp phân tích thống kê 30

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 32

3.1 Kết quả 32

3.1.1 Sự biến đổi hình thái của cây lúa trong điều kiện mặn 32

3.1.2 Các biến đổi sinh lý của cây mạ lúa trong điều kiện mặn 34

3.1.3 Các biến đổi sinh hóa trong cây mạ lúa trong điều kiện mặn 35

3.2.1 Ảnh hưởng của stress mặn lên sự sinh trưởng của cây lúa 40

3.2.2 Tác động của oligochitosan lên sự sinh trưởng của cây mạ lúa trong điều kiện mặn 41

3.2.3 Tác động của oligochitosan lên sự biểu hiện gene 42

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43

4.1 Kết luận 43

4.2 Kiến nghị 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

PHỤ LỤC 50

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Phân loại đất mặn và ảnh hưởng lên cây 5 Bảng 2.1: Trình tự cặp mồi 30 Bảng 3.1: Hình thái của cây mạ lúa xử lý ở các điều kiện khác nhau 32 Bảng 3.2: Sự biến thiên cường độ quang hợp và hô hấp của cây mạ lúa trong điều kiện mặn 35 Bảng 3.3: Sự biến thiên hàm lượng chất khô của cây mạ lúa trong điều kiện mặn 35 Bảng 3.4: Sự biến thiên hàm lượng sắc tố quang hợp của cây mạ lúa trong điều kiện mặn 36 Bảng 3.5: Sự biến thiên hàm lượng proline của cây mạ lúa trong điều kiện mặn 36 Bảng 3.6: Sự biến thiên hàm lượng đường tan của cây mạ lúa trong điều kiện mặn 37 Bảng 3.7: Sự biến thiên hàm lượng protein của cây mạ lúa trong điều kiện mặn 38 Bảng 3.8: Sự biến thiên hoạt tính enzyme ascorbate peroxydase của cây mạ lúa trong điều kiện mặn 38

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Con đường xâm nhập của muối vào cây 6

Hình 1.2: Các bào quan sản xuất ra ROS 9

Hình 1.3: Tín hiệu ban đầu khi cây gặp căng thẳng mặn 10

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình thực hiện thí nghiệm 22

Hình 3.1: Hình thái của cây mạ lúa ở các điều kiện xử lý khác nhau 33

Hình 3.2: Mặt bên dưới lá được chụp dưới kính hiển vi điện tử quét 33

Hình 3.3: Sự biến thiên mức độ biểu hiện 2 gene liên quan đến proline của cây mạ lúa trong điều kiện mặn 39

Hình 3.4: Sự biến thiên mức độ biểu hiện 3 gene liên quan đến hoạt động của enzyme ascorbate peroxydase (APX) của cây mạ lúa trong điều kiện mặn 40

MỞ ĐẦU

Ngành nông nghiệp Việt Nam trong những năm gần đây phát triển nhanh và ứng dụng được nhiều thành tựu khoa học, khẳng định vai trò trụ cột của nền kinh tế thông qua việc đảm bảo an ninh lương thực quốc gia trong mọi tình huống, tạo việc làm và thu nhập ổn định cho người nông dân, giữ vững kim ngạch xuất khẩu, tỷ trọng GDP luôn ổn định qua các năm Từ năm 2016, Việt Nam là một trong các nước đứng nhất thế giới về xuất khẩu như gạo, chè, cà phê … Trong đó lúa gạo chiếm phần lớn trong cơ cấu cây trồng và là một trong những cây trồng chính đem lại lợi nhuận xuất khẩu cao

Cây lúa nước là một trong năm loại cây lương thực quan trọng nhất thế giới và là cây lương thực chính của Việt Nam Cây lúa cung cấp lượng thực cho 65% dân số thế giới và là nguyên liệu cho nhiều thực phẩm thiết yếu như các loại bánh, sản xuất rượu, bột gạo, … Ngoài ra các sản phẩm phụ từ cây lúa cũng được sử dụng rộng rãi như: cám gạo làm thức ăn gia súc, trấu làm phân bón hữu cơ, rơm rạ làm chất đốt, xăng sinh học, … Ước tính tổng sản lượng lúa xuất khẩu trong năm 2020 là 6,5 triệu tấn đạt 3,07 tỷ USD kim ngạch xuất khẩu Nhưng so với sản lượng lúa năm 2019, con số này giảm 3,5% Một trong những nguyên nhân chính là do ảnh hưởng của sự xâm nhập mặn Theo báo cáo của Bộ trưởng Nông nghiệp và Phát triển nông thôn: “Xâm nhập mặn mùa khô năm 2019-2020 ở khu vực Đồng bằng Sông Cửu Long đạt mức nghiêm trọng nhất trong lịch sử”

Lúa nước là loại cây nhạy cảm với độ mặn, nồng độ muối cao gây ảnh hưởng trực tiếp lên quá trình phát triển của cây thậm chí là gây chết hàng loạt Trước tình trạng xâm nhập mặn hằng năm có xu hướng ngày càng cực đoan và khó dự báo trước, cần tìm ra giải pháp cấp thiết và kịp thời để xử lý Ứng phó với tình trạng này, người nông dân đã thực hiện một số biện pháp canh tác như đắp đê, bón phân kali, rửa mặn, … nhưng phương pháp này tốn nhiều công sức và hiệu quả chưa cao Hiện nay, Việt Nam đã có nhiều công trình lai tạo giống để tìm ra giống lúa chịu mặn và năng suất cao nhưng quá trình này thường kéo dài 5-10 năm cho một nghiên cứu tạo giống lúa Một số quốc gia khác đang hướng đến việc chuyển gen tăng khả năng chịu mặn vào cây lúa như Nhật Bản, Trung Quốc Tuy nhiên việc chuyển gen vào cây lương thực

hiện nay vẫn còn có nhiều tranh cãi giữa các nước trong việc trồng trọt và cách hướng dẫn sử dụng cũng như khuyến cáo với thực phẩm biến đổi gen

Một trong những phương hướng khắc phục mặn đang được quan tâm nghiên cứu là sử dụng yếu tố ngoại sinh để tăng khả năng chống chịu của thực vật đối với các yếu tố phi sinh học Trong đó, chitosan là một trong những chất được nghiên cứu ứng dụng rất nhiều trong nông nghiệp Chitosan là một hợp chất tự nhiên phổ biến, không gây hại cho cây trồng và có độ tương thích sinh học cao với nhiều loài thực vật được nhiều nghiên cứu khẳng định có khả năng kích hoạt hệ thống phòng vệ ở thực vật trước các yếu tố gây hại đặc biệt là các yếu tố phi sinh học Oligochitosan có kích thước nhỏ hơn chitosan, dễ hoà tan trong nước, được chứng minh là cũng có tác dụng tích cực đối với cây trồng như chitosan, giúp làm tăng khả năng sinh trưởng của thực vật trong điều kiện bất lợi cũng như hạn chế sự tấn công của vi sinh vật gây bệnh

Với mục tiêu góp phần làm tăng khả năng chống chịu với sự nhiễm mặn của lúa, đề tài “Khảo sát tác động của oligochitosan lên sự sinh trưởng của cây mạ lúa trong điều kiện mặn” được thực hiện Nghiên cứu này dựa vào các đặc điểm, sinh lý, sinh hóa và mức độ biểu hiện gene ở cấp độ phiên mã của cây mạ lúa để đánh giá sự ảnh hưởng của oligochitosan lên khả năng chống chịu mặn của cây lúa Các nội dung trong nghiên cứu này thuộc về phần thứ 2 của đề tài nghiên cứu khoa học B Đại học Quốc gia TPHCM, sau khi đã xác định được phân đoạn oligochitosan 5.994 Da, nồng độ 75 ppm có tác động hỗ trợ cây mạ lúa chống chịu được với nồng độ muối 6‰ qua các biểu hiện về hình thái

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây lúa nước

1.1.1 Đặc điểm sinh học của cây lúa nước

Cây lúa nước có tên khoa học là Oryza sativa L., là một trong năm loài cây

lương thực quan trọng nhất trên thế giới và phổ biến nhất ở Châu Á Phân loại khoa học của cây lúa nước:

− Giới: Plantae

− Ngành: Tracheophytes − Bộ: Poales

− Họ: Poaceae

− Chi: Oryza

− Loài: Oryza sativa

Lúa thuộc loài Hòa Thảo, rễ chùm, chiều dài thân có thể dài tới 1-1,8 m, đôi khi cao hơn, lá mỏng, hẹp khoảng 2-2,5 cm và dài 50-100 cm và hoa lúa có khả năng tự thụ phấn Hoa mọc thành các cụm hoa, phân nhánh, cong hay rủ xuống, dài 35-50 cm, hạt lúa dài 5-12 mm Cấu tạo của hạt lúa gồm: vỏ trấu, cám, nội nhũ và mầm Vỏ trấu cấu tạo từ hai lá của gié lúa, bên dưới lớp vỏ trấu là lớp cám, lớp cám chứa nhiều vitamin, chất khoáng, protein dầu và ít tinh bột Phần nội nhũ chủ yếu là tinh bột và mầm nằm trong nội nhũ Từ mầm, hạt lúa phát triển thành cây lúa Cây lúa non được gọi là mạ [1]

Cây lúa phát triển qua sáu giai đoạn chính là:

− Giai đoạn nảy mầm: hạt lúa sau khi hấp thụ đủ nước phôi được chuyển hóa và phân chia thành mầm chồi và mầm rễ và được đẩy ra khỏi vỏ

− Giai đoạn mạ: hạt lúa nảy mầm, rễ phát triển nhưng còn chậm, số lá khoảng từ 3-6 lá

− Giai đoạn đẻ nhánh: cây phát triển mạnh mẽ rễ và lá đến khi cây đạt được số lượng chồi tối đa

− Giai đoạn phát triển đốt thân: cây lúa hình thành thân lúa thật, số lóng phụ thuộc vào giống lúa

− Giai đoạn làm đòng: là quá trình phân hóa cơ quan sinh sản của cây, có những khác biệt rõ về hình thái, sinh lý, khả năng chống chịu

− Giai đoạn làm hạt: chất dinh dưỡng tích lũy trong thân, bẹ lá được chuyển sang hạt lúa, hạt lúa lớn dần và chuyển màu vàng khi chín

Trong đó, giai đoạn mạ có ý nghĩa quan trọng với sự phát triển của cây lúa Cây mạ tốt, khoẻ giúp cho cây lúa khi cấy chóng hồi xanh, khả năng đẻ nhánh tốt, tạo điều kiện cho các giai đoạn sinh trưởng phát triển sau này Giai đoạn mạ dài, ngắn tuỳ thuộc vào giống, mùa vụ hoặc phương pháp gieo trồng Thời gian từ lúc hạt nảy mầm đến khi ra lá thật tốc độ tương đối nhanh khoảng 3 - 4 ngày, rễ mầm cũng phát triển và hình thành vài lứa rễ đầu tiên nhưng số lượng rễ chưa nhiều Giai đoạn này dinh dưỡng của cây mạ chủ yếu dựa vào chất dự trữ trong hạt nên chưa cần bổ sung dinh đưỡng Ở giai đoạn mạ, cây còn nhỏ, yếu, khả năng chống chịu kém đối với các yếu tố môi trường như mặn, hạn hán, … Vì vậy cây mạ dễ dàng bị ảnh hưởng do các tác động tiêu cực của môi trường dẫn đến chết

1.1.2 Giống lúa IR64

Giống lúa IR64 là giống được chọn lọc từ tập đoàn giống nhập nội của Viện lúa Quốc tế (IRRI), được lai tạo từ tổ hợp lai giữa IR 5657-33/IR 2061-465 Năm 1985, giống indica IR64 do IRRI phát triển đã được công bố ở Philippines và được Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Việt Nam công nhận là giống chính thức tại Quyết định số 402 QĐ/BNN-KHCN ngày 27/11/1986 và đưa vào thử nghiệm trên vùng lòng chảo Điện Biên từ năm 1986 Sau đó lúa IR64 được mở rộng và phát triển mạnh ở Việt Nam từ năm 1988 Giống cho năng suất cao, chín sớm và kháng một số bệnh, chất lượng hạt gạo tốt, phù hợp với thị hiếu người tiêu dùng Nhiều gene có giá trị đã được đưa vào IR64 thông qua lai tạo và sử dụng trong hàng nghìn con lai IR64 được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu di truyền của cây lúa, chủ yếu là vì nó đại diện cho một giống indica năng suất cao và chất lượng cao, thích nghi rộng rãi với các điều kiện trồng trọt ở vùng đất thấp nhiệt đới

Giống lúa IR64 có phẩm chất gạo tốt, hạt gạo dài, chất lượng cao và ổn định Hạt gạo IR64 có cả hàm lượng amylose trung bình và nhiệt độ hồ hóa trung gian, đặc điểm này được coi là quan trọng đối với kết cấu lý tưởng của cơm, đặc biệt là với

người tiêu dùng gạo ở Việt Nam và Đông Nam Á Vì vậy, IR64 là một trong các giống lúa ngắn ngày ưa chuộng được người dân lựa chọn

Chất lượng hạt cao giúp IR64 trở thành tiêu chuẩn cho các yêu cầu về chất lượng gạo ở một số quốc gia Với sự phổ biến đối với nông dân, IR64 còn được sử dụng như một giống bố mẹ trong nhân giống lúa là vật trung gian nhận các gen mới thông qua phép lai và biến đổi gen có hỗ trợ đánh dấu và là tiêu chuẩn kiểm tra cho các nghiên cứu cơ bản của nhiều nhà nghiên cứu lúa gạo [2] Điển hình như giống lúa lai IR64-Sub1 cũng được sử dụng để phát triển các giống chịu ngập ở Việt Nam, Sub1 là gen chống chịu ngập úng của lúa SUB1 được đưa vào bằng cách lai ngược hỗ trợ đánh dấu vào IR64 [3]

1.2 Căng thẳng do muối

1.2.1 Định nghĩa

Căng thẳng do muối là một trong những loại căng thẳng phi sinh học phổ biến và gây tác hại nghiêm trọng đến không chỉ cây trồng mà còn đối với đất trồng Căng thẳng do mặn ảnh hưởng đến 20% diện tích đất nông nghiệp trên toàn cầu và có xu hướng gia tăng liên tục do các hoạt động của con người gây ô nhiễm môi trường [4] Dựa vào nồng độ muối bảo hòa trong đất người ta chia độ mặn của đất thành 5 loại như bảng 1.1

Bảng 1.1: Phân loại đất mặn và ảnh hưởng lên cây [5]

Độ mặn của đất Nồng độ muối bão

hòa trong đất (dS/m) Ảnh hưởng đến cây trồng Bình thường 0-2 Độ mặn ảnh hưởng không đáng kể

Mặn nhẹ 2-4 Năng suất của các loại cây trồng nhạy cảm có thể bị hạn chế

Độ mặn của đất là một vấn đề toàn cầu lớn do tác động tiêu cực của nó đến năng suất nông nghiệp và tính bền vững Hơn sáu phần trăm đất trồng trên thế giới đang chịu ảnh hưởng của xâm nhập mặn, nguyên nhân chính gây ra căng thẳng mặn là do nồng độ các muối trong đất tăng cao, nhất là NaCl, gây độc cho cây trồng và đất Đất bị nhiễm mặn có thể do hạn hán kéo dài, tình trạng nước biển xâm lấn hay hệ thống tưới tiêu không phù hợp với loại đất trồng đang sử dụng Các muối tích tụ trong đất thường ở dạng ion như: Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Cl-, SO42- Trong đó nồng độ Na+ tích tụ cao là nguyên nhân chính của sự nhiễm mặn của đất Nồng độ Na+ cao không chỉ gây tổn hại trực tiếp đến hình thái, sinh lý, sinh hóa ở thực vật mà còn phá

hủy cấu trúc đất trồng do làm giảm tính xốp và sự thấm nước [6]

1.2.2 Tác hại của căng thẳng do muối lên cây lúa

Độ mặn cao trong đất là một yếu tố bất lợi cho cây trồng, do hàm lượng khoáng chất vô cơ trong môi trường tăng gây mất cân bằng áp suất thẩm thấu cho rễ Cơ chế muối xâm nhập vào rễ đã được nghiên cứu trong nhiều năm và chỉ ra rằng muối được hấp thụ thông qua hai con đường tế bào chất (symplast) và con đường vách tế bào (apoplast) Ở lúa, con đường vách tế bào hấp thu 50% tổng lượng Na+ trong đất [7]

Nồng độ muối cao ảnh hưởng trực tiếp lên sự nảy mầm của hạt, quá trình sinh trưởng, phát triển và năng suất của nhiều loại cây trồng Đặc biệt đối với lúa là loại

Hình 1.1: Con đường xâm nhập của muối vào cây

Trong đó, epidermis: biểu bì, cortex: vỏ, endodermis: nội bì, pericycle: chu luân, xylem: mạch mộc, Casparian strip: đai Caspary [7]

cây nhạy cảm với mặn, lúa phát triển kém hoặc ngừng phát triển trong thời gian nhiễm mặn gây ảnh hưởng lớn đến năng suất Phản ứng của cây lúa đối với stress rất phức tạp Mức độ ảnh hưởng của căng thẳng muối đến cây lúa phụ thuộc vào độ mặn, thời gian chịu mặn, giai đọan phát triển của cây Khi cây lúa bị căng thẳng mặn thì sau từ 5-7 ngảy sẽ biểu hiện ra hình thái như lá vàng, khô héo, lá non không phát triển, chiều dài thân và rễ ngắn, số rễ ít, ở giai đoạn mạ cây có thể ngừng phát triển, ở giai đoạn trổ bông cho hạt lép, ít bông Lúa nhạy cảm hơn với căng thẳng mặn ở giai đoạn mạ lúa so với các giai đoạn khác trong chu trình sinh trưởng Các thử nghiệm trong nhà kính và đồng ruộng đã cho thấy mức độ tăng trưởng cây, trọng lượng tươi giảm khi ứng suất muối tăng từ 5 đến 7,5 dSm–1 Nồng độ muối cao làm giảm mật độ lúa và sinh khối cây mạ lúa, giảm đáng kể chiều dài rễ trung bình, số rễ trung bình và chiều dài chồi Sự phân chia tế bào và sự kéo dài tế bào của cây lúa bị ảnh hưởng nghiêm trọng bởi căng thẳng mặn, dẫn đến giảm sự phát triển của rễ, lá và năng suất cây lúa Tỷ lệ lá lúa chết tăng lên khi bị nồng độ muối tăng ở tất cả các giống lúa ở giai đoạn cây mạ lúa và nằm vào khoảng 0 đến 300% sau khi chịu nồng độ muối cao một tuần Sau một vài tháng, độ mặn sẽ làm giảm tốc độ tăng trưởng và phát triển Nguyên nhân là do lá khô héo dẫn đến giảm diện tích lá và không phát triển lá non từ đó làm giảm tốc độ quang hợp của cây Ngoài ra, sự căng thẳng do muối có những ảnh hưởng trực tiếp đến sự trao đổi chất của tế bào thực vật, đặc biệt gây ra sự già đi của lá, điều này gây ảnh hưởng nghiêm trọng với sự phát triển của cây [8]

Việc tích tụ nồng độ Na+ và Cl- do hàm lượng muối cao là nguyên nhân chính gây ra việc mất cân bằng quá trình sinh hóa, sinh lý của cây Nồng độ muối cao gây sự mất cân bằng ion trong đất và trong cây, gây giảm hoạt động hút nước và dinh dưỡng do áp suất thẩm thấu thay đổi, gián đoạn quá trình trao đổi chất của cây và gây độc cho tế bào Nồng độ ion Na+ hấp thu dư thừa sẽ gây mất cân bằng áp suất của màng tế bào và quan trọng hơn làm mất cân bằng tỷ lệ K+/Na+ trong cây, tỷ lệ quan trọng trong nhiều phản ứng sinh hóa của tế bào thực vật Kali là yếu tố đa lượng quan trọng đối với trong đời sống của thực vật, chiếm 10% hàm lượng chất khô và tham gia vào nhiều quá trình sinh trưởng, phát triển, sinh sản và sinh lý như nảy mầm, điều hòa thẩm thấu, điều hòa hoạt động khí khổng, hoạt hóa enzyme, điều chỉnh pH tế bào,

vận chuyển protein đến không bào lưu trữ protein, … Nồng độ ion Na+ cao sẽ cạnh tranh vị trí trên kênh vận chuyển ion K+ ở màng tế bào, thay thế vào các quá trình sinh hóa phụ thuộc ion K+ gây ức chế enzyme, phản ứng hoặc cả một quá trình sinh hóa Ví dụ như ion Na+ có thể thay thế ion K+ trong các vị trí liên kết trên các enzyme dẫn đến vô hiệu hóa enzyme, làm gián đoạn các quá trình trao đổi chất liên quan [9] như enzyme pyruvate kinase liên quan trực tiếp đến tổng hợp ATP trong tế bào được kích hoạt bằng K+ [10]

Để giảm hút nước kèm thêm giảm hấp thu muối, cơ thể thực vật đã phát tín hiệu sản xuất acid abscisic (ABA) nhằm đóng khí khổng trên lá làm giảm lực hút do thoát hơi nước ra gây Điều này dẫn đến việc giảm quang hợp của cây và thúc dẩy các quá trình trao đổi chất khác tạo ra nhiều sản phẩm có hại cho cây như ROS (reactive oxygen species) ROS gồm những hợp chất oxy hóa mạnh như H2O2, O2-, OH-, là sản phẩm phụ của các quá trình trao đổi chất hiếu khí trong cây ROS gây ra những tổn thương không thể phục hồi trong cây do các chất oxy hóa mạnh kích thích lên hệ thống đề kháng của cây Chúng có vai trò rất quan trọng trong quá trình điều hòa, lập trình quá trình chết và liên kết với các phân tử tín hiệu khác trong quá trình sống ở thực vật Ở nồng độ thấp, ROS có vai trò là tín hiệu căng thẳng kích thích các gen chống chịu ở cây nhưng ở nồng độ cao ROS lại là chất gây độc cho thực vật Ở thực vật, lục lạp và ti thể đều là những trung tâm kiểm soát trao đổi chất và sản xuất ROS, điều phối phản ứng căng thẳng Vì vậy ROS được sinh ra quá nhiều sẽ tác động trực tiếp và mạnh mẽ lên nơi sản xuất ra chúng, ROS có khả năng phân hủy sắc tố trong lục lạp, điều chỉnh trạng thái oxy hóa khử trong chất nền (stroma) của lục lạp, tác động lên màng ty thể, oxy hóa màng ngoài của peroxisomes Nồng độ ROS cao (đặc biệt là H2O2) có thể làm hỏng gene khi tạo ra các liên kết chéo với DNA làm thay đổi hoặc làm sai lệch tính ổn định của hệ gene [11]

Hình 1.2: Các bào quan sản xuất ra ROS [11]

1.3 Cơ chế kháng mặn ở cây lúa

Để chống chịu với nồng độ muối cao, một số quá trình sinh hóa ở thực vật được kích hoạt nhằm giảm thiểu tác hại của muối Cơ chế của cả quá trình vẫn chưa được tìm hiểu rõ ràng nhưng nhiều nghiên cứu đã thấy được rằng ở nồng độ muối cao hai quá trình chính gây hại cho cây là nhiễm độc ion và mất cân bằng nội môi Từ đó, cây sẽ kích hoạt quá trình chống lại hai tác nhân trên Nhưng nếu thời gian nhiễm mặn kéo dài cây vẫn sẽ chết

Nguyên nhân chính sự nhiễm mặn gây hại cho thực vật là do nồng độ NaCl trong đất cao ảnh hưởng đến các quá trình sống của thực vật Việc này sẽ gây ra các hiện tương rối loạn quá trình trao đổi chất trong tế bào, các ion độc ức chế các enzyme cần thiết cho quá trình sống và kích thích tạo ra những sản phẩm phụ gây hại cho cây Để giảm nồng độ ion Na+ trong cây, cây lúa thường tích lũy ion Na+ trong không bào của lá, từ đó gây ra hiện tượng cháy nắng trên chóp ngọn Đồng thời ion K+ cũng được chuyển từ không bào sang tế bào chất để cân bằng tỷ lệ K+/Na+ Tế bào thực vật tăng tích lũy ion K+ nội bào bằng cách giảm khử cực màng sinh chất nhằm giảm thất thoát ion kali ra bên ngoài qua các kênh, tăng hấp thu ion K+ chọn lọc thông qua các kênh protein, kích hoạt các kênh K+ chỉnh lưu ra bên ngoài Các quá trình này tốn nhiều năng lượng và phụ thuộc chủ yếu vào khả năng chống chịu căng thẳng mặn của từng loại thực vật, vì ion Na+ có thể di chuyển trở lại tế bào chất qua các kênh của không bào, kênh fast vacuolar (FV), slow vacuolar (SV) [9]

Ở nồng độ muối cao, cây sẽ giảm thiểu hấp thu muối thông qua giảm việc hút nước và chất dinh dưỡng, đồng thời giảm quá trình thoát hơi nước qua khí khổng nhằm giảm lực hút nước do khí khổng và cân bằng nồng độ nội môi trong tế bào Từ đó, gây giảm hoạt động quang hợp Khi nồng độ Na+ trong tế bào cao, không bào sẽ đẩy Ca2+ bên trong ra và hấp thu Na+ dư thừa vào Nồng độ Ca2+ tăng cùng với ROS phát tín hiệu cho cây sản sinh ra acid abscisic (ABA), chất điều hòa đóng mở khí khổng, được vận chuyển đến khí khổng trên lá giúp giảm thoát hơi nước Khí khổng đóng, cường độ quang hợp giảm mạnh, nồng độ CO2 từ không khí hấp thu vào trong cây sẽ thấp dần và nồng độ O2 trong tế báo tích tụ sẽ tăng cao dẫn đến tăng quá trình hô hấp Quá trình hô hấp trong tế bào diễn ra mạnh mẽ nhằm cung cấp năng lượng thông qua chuyển hóa chất dự trữ như tinh bột, protein

Hình 1.3: Tín hiệu ban đầu khi cây gặp căng thẳng mặn [12]

Song song với việc hoạt động quang hợp bị giảm mạnh, nhiều quá trình sinh hóa ngăn chặn các yếu tố bất lợi cho cây diễn ra một cách mạnh mẽ như sản xuất ROS, sinh tổng hợp một số hợp chất cân bằng áp suất nội môi Nồng độ ROS tăng cao gây nhiều phản ứng bất lợi cho cây [11] Để giảm thiểu tác hại của ROS, thực vật kích thích các cơ chế chống oxy hóa, bao gồm hệ thống enzyme và không enzyme để bảo vệ tế bào khỏi độc tính của các loại oxy linh động Hệ thống enzyme bao gồm tập hợp các chất SOD (superoxide dismutase), POD (peroxidase), CAT (catalase) và APX (ascorbate peroxidase), v.v và hệ thống không phải enzyme như carotenoid,

flavodoxin, α-tocopherol, melatonin… giúp loại bỏ các chất oxy hóa mạnh mà hệ thống enzyme không làm được [13] Trong đó enzyme APX là tác nhân chính giúp loại bỏ hoạt động của H2O2, có mặt ở nhiều bào quan trong cây như lục lạp, bào tương, ti thể và peroxisome Ở cây lúa, họ gene APX có 8 gene gồm 2 cytosolic, 2 peroxisomal và 2 chloroplastic (stromal và thylakoid-bound) Tuy nhiên mức độ biểu hiện của gene APX tùy thuộc vào đặc điểm của mô, cơ quan của cây và nồng độ, thời gian chịu căng thẳng Mức độ biểu hiện của từng nhóm gene APX riêng biệt giúp điều hòa cân bằng nội môi trong mỗi loại tế bào [14]

Nồng độ Na+ nội bào cao và thiếu nước đã kích thích quá trình chuyển hóa các chất dự trữ cung cấp năng lượng và sinh tổng hợp các chất bảo vệ giúp cân bằng nội môi của cây Cụ thể, thực vật sẽ tăng cường sinh tổng hợp các hợp chất bảo vệ có tác động ổn định và duy trì áp suất thẩm thấu như các chất hòa tan Chúng thường là các phân tử nhỏ, hòa tan trong nước và không gây sự xáo trộn các chức năng của tế bào, ngay cả khi có mặt ở nồng độ cao Các chất này thường ưa nước nên có thể thay thế nước ở bề mặt của protein hoặc màng, hoạt động như các chaperone trọng lượng phân tử thấp bao gồm hợp chất có chứa nitơ như ammino acid, amin và betaine và các acid hữu cơ, đường, polyol Trong số các chất hòa tan, được biết đến nhiều nhất là proline, glycine betaine đối với ammino acid và sucrose, fructose đối với đường Các hợp chất này được xác định là tăng lên rất nhiều khi chịu tác động của muối hoặc hạn hán trong nhiều nghiên cứu [15]

Proline là một ammino acid phổ biến trong thực vật và có vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất sơ cấp, thường được tích lũy với số lượng lớn khi thực vật gặp điều kiện bất lợi như hạn hán hoặc nhiễm mặn Proline được tổng hợp trong cytosol và lục lạp với tiền chất là glutamate được xúc tác bởi enzyme pyttoline-5-carboylatesynthelase (P5CS) và pyttoline-5-reductase (P5CR) Proline tích tụ trong tế bào giúp điều chỉnh quá trình thẩm thấu của tế bào chất, góp phần ổn định các cấu trúc dưới tế bào (ví dụ như màng và protein), loại bỏ các gốc tự do, ROS và đóng vai trò là đệm oxy hóa khử của tế bào ở điều kiện bất lợi Proline còn có thể hoạt động như một hydrotrope tương thích với protein giúp duy trì tỷ lệ NADP+/NADPH tương ứng với sự trao đổi chất [16] Sau khi yếu tố căng thẳng giảm, proline bị phân hủy

nhanh chóng thành các chất khử hỗ trợ quá trình phosphoryl hóa oxy hóa ty thể và tạo ra ATP giúp thực vật phục hồi và sửa chữa các tổn thương do căng thẳng gây ra Thêm vào đó, proline là tín hiệu cho hoạt động của các gen đáp ứng với căng thẳng muối, ví dụ gene PRE, ACTCA [17]

Sự hô hấp mạnh sẽ kích thích quá trình đường phân trong thực vật, chuyển hóa các chất dự trữ polysaccharide thành các phân tử đường ngắn, có khả năng hòa tan và được tích tụ trong tế bào như sucrose, trehalose, raffinose, sorbitol và mannitol Điều này giúp ổn định áp suất thẩm thấu của màng tế bào Các phân tử đường hòa tan điều chỉnh sự trao đổi chất của thực vật thông qua việc kích thích sự biểu hiện của các gene nhạy cảm với đường và kích thích hoạt động của một số enzyme Sucrose và hexose là tín hiệu điều hòa biểu hiện của gene liên quan đến điều hòa căng thẳng và gene liên quan đến điều hòa tăng trưởng do cả hai quá trình này đều phụ thuộc vào hexokinase Ngoài ra, protein kinase SNF1 và SnRKs ở thực vật sử dụng đường là tín hiệu trong điều hòa và cân bằng hoạt động giữa trao đổi chất và chống chịu căng thẳng Nồng độ đường khác nhau giữa các bào quan, trong đó lá là nơi tích tụ đường cao trong căng thẳng mặn Nguyên nhân là một số thực vật có khả năng vận chuyển và tích muối trong không bào dẫn đến màng tế bào lá gặp nhiều sự mất cân bằng và cần sự có mặt của đường để giúp cân bằng áp suất thẩm thấu giữa trong và ngoài tế bào [15] [18] [19]

Nếu tình trạng ngập mặn kéo dài cây vẫn sẽ chết do không thể cân bằng các quá trình trong cơ thể Cây giảm mạnh việc hấp thu chất được dinh dưỡng và nước, quang hợp kém do khí khổng đóng, các hợp chất giảm căng thẳng được sinh ra tốn nhiều năng lượng nhưng không đủ để thực vật chống chịu, hoạt động hô hấp mạnh tạo ra nhiều sản phẩm phụ gây hại tế bào nhưng không thể cung cấp đủ lượng năng lượng chất dự trữ ngày càng cạn kiệt gây ra việc kiệt quệ ở các cơ quan Hậu quả là cây không sinh trưởng được và chết Đặc biệt, đối với thực vật nhạy cảm mặn như cây lúa, nồng độ muối tối đa cây lúa chịu được thấp khoảng 2 g/L và khả năng thích ứng với điều kiện bất lợi kém dẫn đến việc khi bị nhiễm mặn cây lúa suy kiệt nhanh chóng và dẫn đến chết hàng loạt

1.4 Các biện pháp khắc phục lúa bị nhiễm mặn

Để đối phó với tình hình xâm ngập mặn diễn biến phức tạp trên thế giới và trong nước, nhiều công trình nghiên cứu cải thiện khả năng chịu mặn trên cây lúa đã được thực hiện Các nghiên cứu theo 3 hướng chính: cải thiện độ mặn của đất, cải tạo giống lúa và tăng khả năng chống chịu của giống lúa đã tuyển chọn

Cải thiện độ mặn của đất gồm những phương pháp xử lý vật lý bằng canh tác rất phổ biến đối với người nông dân Mục đích chính của phương pháp là ngăn chặn nồng độ muối cao xâm nhập bằng đắp bờ đê ngăn nước biển và có kế hoạch bón phân hợp lý, bổ sung các chất đinh dưỡng và kali cho cây nhằm nâng cao nồng độ các chất này để cạnh tranh với muối Khi đã bị nhiễm mặn, có thể loại muối ra khỏi đất bằng cách sử dụng nước rửa trôi, sử dụng vôi để hấp thụ natri trong đất và bón phân để cân bằng lại dinh dưỡng trong đất Các phương pháp này tương đối thủ công, đơn giản và dễ thực hiện với người nông dân nhưng hiệu quả không cao Nếu ở diện tích canh tác rộng và tình trạng ngập mặn nghiêm trọng thì không thể khắc phục bằng phương pháp canh tác Với tình trạng biến đổi khí hậu thất thường hiện nay gây khó khăn trong việc dự đoán xâm nhập mặn, các chỉ số luôn biến động phụ thuộc vào mức độ ô nhiễm của trái đất theo từng năm Mỗi năm mực nước biển xâm nhập đều tăng và dao động nên khó để dự đoán mực nước tràn vào, kéo dài bao lâu trong khi các phương pháp trên chủ yếu là phương pháp phòng ngừa, khắc phục cơ bản nên hiệu quả còn kém [20]

Cải tạo giống lúa là phương pháp phổ biến hiện nay Ở Việt Nam đã có nhiều công trình lai tạo để tạo giống lúc có khả năng chịu mặn cao và cho năng suất ổn định Ví dụ giống lúa OM6529 chịu mặn được 4-6‰, hàm lượng amylose đạt 24,5%; OM8017 chịu mặn được 3-4‰, hàm lượng amylose đạt 22%; OM4900 chịu mặn 2-3‰, hàm lượng amylose đạt 16%; OM232 chịu mặn 3-4‰, hàm lượng amylose đạt 16-18%… Các công trình lai tạo để tìm ra giống lúa chịu mặn và năng suất cao thường kéo dài 5-10 năm cho một giống lúa Hơn nữa nếu là giống lúa lai, cần được cải thiện mỗi 3-5 năm do khả năng bị thoái hóa giống qua các thế hệ [21]

Nhiều nước trên thế giới đã và đang nghiên cứu cải tạo giống lúa thông qua việc biến đổi gene Nghiên cứu của ShouQiang Ouyang và đồng nghiệp vào năm

2014 đã chuyển gene điều hòa biểu hiện gene OsVTE1 trên cây lúa nhằm giảm tác hại của ROS khi cây bị nhiễm mặn Trong đó, gene OsVTE1 mã hóa tổng hợp hợp chất tocophenol, một chất chống oxy hóa mạnh, là tín hiệu cho thấy cây đang chịu căng thẳng phi sinh học Kết quả cho thấy cây lúa đã chuyển gene có lượng H2O2

thấp hơn so với cây thông thường khi gặp nồng độ muối cao Năm 2014 Manu Kumar và cộng sự chuyển gene OsDhn1 có chỉnh sửa (OsDhn1-OXs) vào cây lúa để làm tăng khả năng chống chịu với stress Trong đó, OsDhn1-OXs là gene kích thích quá trình khử nước làm tăng khả năng chống chịu của cây thông qua việc loại bỏ các loại oxy phản ứng (ROS), đặc biệt là H2O2 Kết quả của nghiên cứu thấy khả năng chống chịu của cây với hạn hán và mặn được nâng cao được đánh giá qua hàm lượng sắc tố, trọng lượng tươi và khô, hàm lượng nước và tỷ lệ sống sót đều cao hơn so với cây bình thường ở điều kiện tương tự Đặc biệt nồng độ H2O2 thấp hơn so với cây thông thường [22] Nghiên cứu của Yongchang Liu và đồng nghiệp năm 2016 đã nghiên cứu gene biểu hiện quá mức ATAF1 ở lúa thông qua việc chuyển gene này lên cây

lúa ATAF1 là gene liên quan đến khả năng chịu mặn của loài Arabidopsis, được kích

thích bởi abscisic acid (ABA) ở nồng độ muối cao Kết quả cho thấy cây lúa được chuyển gen đã cải thiện đáng kể khả năng chịu mặn và không mẫn cảm với ABA Kết quả PCR cho thấy gene ATAF1 kích thích sự phiên mã của 3 gene OsLEA3, OsSalT1 và OsPM1, là những gene liên quan đến khả năng chịu mặn trên lúa Các gene này đóng vai trò quan trọng trong việc ứng phó với điều kiện mặn của cây lúa [23] Tuy có đã có nhiều nghiên cứu chuyển gene trên cây lúa thành công và được thử nghiệm trên vườm ươm song vẫn chưa có giống lúa chuyển gene nào được trồng đại trà và đưa giống ra sản xuất Nguyên nhân chính là chưa đáp ứng quy định nghiêm ngặt liên quan đến việc trồng trọt và sử dụng sản phẩm biến đổi gene, GMO Đặc biệt đối với các châu Âu và châu Mỹ người tiêu dùng vẫn còn e ngại về việc sử dụng lượng thực, thực phẩm biến đổi gene Theo Trung tâm An toàn Thực phẩm Mỹ (CFS), Zambia, Benin và Serbi là 3 nước có lệnh cấm nhập khẩu chính thức đối với thực phẩm biến đổi gen Ở một số nước khác, sản phẩm GMO cần được dán nhãn và quy định liều lượng cụ thể nhưng người tiêu dùng vẫn rất e ngại sử dụng.

Hiện nay, lĩnh vực nông nghiệp của thế giới đang hướng đến “Nền nông nghiệp xanh”, là trồng trọt hữu cơ không sử dụng hóa chất hoặc chỉ sử dụng các hợp chất tự nhiên, an toàn với môi trường và không gây mất cân bằng sinh học Vì vậy hướng nghiên cứu sử dụng các hợp chất sinh học hỗ trợ nông nghiệp đang được quan tâm Tăng khả năng chống chịu của cây đối với tác nhân phi sinh học bằng các biopolymer là hướng được quan tâm nghiên cứu ở nhiều nước trên thế giới Năm 2018, Piotr Salachar và cộng sự đã thử nghiệm khả năng alginate làm tăng độ chống chịu mặn

trên cây Eucomis autumnalis bằng cách phủ natri alginate lên củ Kết quả cho thấy

những cây mọc từ củ được phủ natri alginate có khối lượng phân từ 32.000 g.mol-1

phát triển tốt hơn rõ rệt, lá chứa nhiều sắc tố và hàm lượng polyphenol tổng số cao hơn so với những cây bình thường ở nồng độ muối cao Điều này chứng minh rằng oligoalginate khối lượng phân tử thấp có thể được sử dụng làm chất kích thích sinh

học thực vật để hạn chế các tác động tiêu cực của độ mặn ở E autumnalis và có triển

vọng áp dụng lên các cây có củ [24] Nghiên cứu của Lida Shams Peykani và cộng sự năm 2018 về ảnh hưởng của chitosan ở những nồng độ khác nhau trên hai giống lúa mì Triticum aestivum L and Zea mays L. được trồng trong điều kiện nồng độ muối cao Kết quả cho thấy chitosan làm tăng hoạt tính của enzyme chống oxy hóa, tăng hàm lượng proline và giảm tích tụ MDA (malondialdehyde) trên cả hai giống là

Triticum aestivim L và Zea mays L Trong đó chitosan nồng độ 25% cho kết quả khả

quang nhất [25] Nghiên cứu của Mittraphap Rd và cộng sự năm 2020 đã thử nghiệm chitosan với trọng lượng phân tử khác nhau lên cây lúa để tăng khả năng chịu hạn Kết quả cho thấy chitosan ở trọng lượng phân tử thấp có khả năng tăng sự chống chịu của cây với hạn hán tốt nhất Trong đó các cây được xử lý chitosan đều giúp giảm bớt các tác động do căng thẳng hạn hán gây ra như làm giảm rò rỉ chất điện giải, malondialdehyde (MDA) và hydrogene peroxyde (H2O2), hoạt động của các enzyme chống oxy hóa tăng cao như superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), hoạt động của ascorbate peroxydase (APX) và guaiacol peroxydase (GPX) [26] Năm 2021, Geng Zhang và đồng nghiệp nghiên cứu khả năng ứng dụng chitosan như phân bón lá trên rau diếp được trồng ở điều kiện có nồng độ muối cao Kết quả cho thấy tổng diện tích lá, trọng lượng chồi tươi, trọng lượng khô của chồi và rễ đều tăng, hàm

lượng diệp lục a, proline và đường hòa tan trong lá cao hơn so với cây chưa được xử lý Các enzyme peroxydase và catalase hoạt động mạnh làm giảm tác động xấu của các ROS, quá trình peroxy hóa lipid màng giảm so với cây trồng chưa được xử lý Nghiên cứu trên chứng minh chitosan có thể giảm tác động tiêu cực của stress do muối đối với sự phát triển và sinh khối của thực vật bằng cách điều chỉnh nồng độ ion nội bào, kiểm soát áp suất thẩm thấu và tăng hoạt tính của enzyme chống oxy hóa trong lá rau diếp [27]

Các nghiên cứu ứng dụng của các hợp chất sinh học vào môi trường ngày càng được chú trọng và ứng dụng trực tiếp vào trong thực tiễn Do tính an toàn với môi trường, nguồn cung cấp dồi dào từ tự nhiên, một số hợp chất chiết xuất từ phụ phẩm của các ngành chế biến thực phẩm, không gây độc cho cây và các sinh vật sinh sống xung quanh, khả năng tự phân hủy cao Trong đó, chitosan và oligochitosan là nhóm hợp chất được nhiều nhà khoa học đánh giá cao do độ an toàn đối với thực vật, con người và môi trưởng, tính ứng dụng rộng đã được nghiên cứu trên nhiều loài cây trồng và có nguồn cung dồi dào, sản xuất từ phụ phẩm của ngành chế biến tôm, giúp hạn chế ô nhiễm từ chất thải của ngành công nghiệp chế biến

1.5 Chitosan – Oligochitosan

1.5.1 Cấu trúc – Tính chất

Chitin là polymer với đơn phân tử là N-Acetylglucosamine, một hợp chất sinh học phổ biến trong tự nhiên và có trong thành phần cấu tạo vỏ của loài giáp xác Chitosan là hợp chất polysacharide được chiết xuất từ chitin bằng cách deacetyl hóa gốc amine [28] Về mặt cấu trúc, chitosan là một polymer mạch thẳng bao gồm hai tiểu đơn vị, D-glucosamine và N-acetyl-D-glucosamine, liên kết với nhau thông qua liên kết 1,4-glycosidic Chitosan tan trong nước ở pH > 7, tuy nhiên ở pH 2,5 – 6,5 thì kém tan và thường tách pha, điều này gây hạn chế việc sử dụng chitosan trong các lĩnh vực thực phẩm, y tế và nông nghiệp Chitosan có nhiều hoạt tính sinh học được ứng dụng trong nông nghiệp, y sinh, nghiên cứu khoa học, … vì độ tương thích sinh học cao, khả năng tự phân hủy sinh học và hoạt tính sinh học ổn định Ở thực vật, chitosan có khả năng kích thích hệ thống phòng vệ liên quan đến căng thẳng sinh học và phi sinh học Khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh của chitosan đã được phát hiện,

nghiên cứu và ứng dụng trên cây trồng, như giúp cây kháng lại nấm hại trong nông nghiệp, làm màng thực phẩm trong ngành chế biến thực phẩm…[29]

Tuy nhiên, chitosan có nhược điểm là kém tan có thể được khắc phục bằng cách sử dụng các oligomer hoặc monomer của chitosan để thay thế Oligochitosan là một trong những dẫn xuất có độ hòa tan cao, được tạo ra bằng cách phân cắt các liên kết glycosidic không bền bằng các phương pháp khác nhau như thủy phân bằng acid, enzyme, bằng các tác nhân oxy hóa, sóng siêu âm hoặc tia bức xạ (tia gamma) Các oligochitosan cũng được sử dụng ở thực vật nhằm tăng khả năng chống lại các căng thẳng phi sinh học như hạn hán, nhiễm mặn, nhiệt độ bất lợi và nhiễm độc kim loại nặng Oligochitosan có trọng lượng phân tử nhẹ, kích thước nhỏ, dễ hòa tan trong nước, thân thiện với môi trường và giữ được những đặc tính sinh học của chitosan [28]

1.5.2 Tác động của Chitosan – Oligochitosan lên khả năng kháng mặn

Chitosan và oligochitosan đã được nghiên cứu nhiều trong việc giúp tăng khả năng chống chịu các yếu tố phi sinh học trên thực vật Tuy nhiên cơ chế đầy đủ và cụ thể về khả năng kích thích các quá trình chống chịu với căng thẳng phi sinh học vẫn đang được tìm hiểu Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh rằng chitosan cảm ứng các thụ thể trên màng tế bào thực vật như một tín hiệu đặc biệt Trên màng tế bào thực vật có những thụ thể nhận biết chitin, hoặc những polymer hay monomer của chitin, truyền tín hiệu kích thích các phản ứng phòng vệ trong cây khi gặp điều kiện bất lợi Chitin elicitor binding protein (CEBiP), thụ thể nhận biết chitin, được phân lập ở nhiều loại cây trồng khác nhau Tín hiệu này được truyền đến các thụ thể thứ cấp để kích thích quá trình “miễn dịch” của cây thông qua các chất có hoạt tính sinh học giúp chống lại tác nhân gây hại Chitosan cũng là tín hiệu kích thích quá trình kháng oxy hóa giảm tổn hại bào quan, cân bằng áp suất thẩm thấu, bảo vệ màng tế bào, điều hòa lượng nước trong cây… Ngoài kích thích phản ứng phòng vệ ở cây, nó còn xúc tác sự tăng cường biểu hiện gene đáp ứng với căng thẳng phi sinh học Chen và Xu năm 2005 đã ly trích được một glycoprotein liên kết chitosan (họ lectin) từ lá cây cải

(Brassica campestris) hay nghiên cứu của Amborabe và cộng sự năm 2008 trên

Mimosa pudica và Cassia fasciculate cho thấy sự hoạt hóa nhanh chóng của H+

-ATPase, một kênh ion quan trọng trên màng nguyên sinh chất, khi có sự hiện diện của các phân tử chitosan Chitosan và các dẫn xuất của nó làm tăng nhiều hợp chất kích thích trong một số loài thực vật [28]

Căng thẳng gây ra bởi muối khiến thực vật bị hạn chế về mặt sinh lý và sinh hóa cững như ức chế hấp thụ chất dinh dưỡng và nước Điều này dẫn đến việc mất cân bằng chuyển hóa bên trong tế bào, cản trở hoạt động sống và kích thích sản sinh ra ROS gây hại cho tế bào Tín hiệu từ chitosan được các receptor đặc biệt nhận biết, kích thích quá trình tạo ra các tín hiệu thứ cấp như các ROS, nitric oxide và chất điều hòa sinh trưởng trong tế bào thực vật gây ra phản ứng sinh lý Năm 2013, Pongprayoon đã báo cáo rằng H2O2 hoạt động như một phân tử tín hiệu chống lại sự mất cân bằng áp suất thẩm thấu ở hai giống lúa LPT123 và LPT123-TC171 đột biến Khi xử lý bằng chitosan trong điều kiện căng thẳng phi sinh học, quá trình chống lại tác nhân có hại diễn ra mạnh mẽ như kích thích sản xuất ra nhiều hợp chất giúp cân bằng áp suất nội bào (như proline, glycine betain, các đường đơn), làm giảm tác động của ROS bằng việc kích thích quá trình tạo ra các enzyme chống oxy hóa như ascorbate peroxidase (APX), superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) là các enzyme chống oxy hóa được phát hiện tăng khi thực vật phải chịu đựng sự căng thẳng của muối và giảm tích tụ MDA (malondialdehyde) Trong đó, MDA là sản phẩm của quá trình peroxy hóa màng lipid, việc tăng MDA có thể gây ra tổn thương màng tế bào Chitosan còn kích hoạt tổng hợp jasmonate (JA) và acid absicic (ABA) Trong đó, JA và ABA đóng vai trò quan trọng trong điều hòa lượng nước của cây, giúp cân bằng áp suất thẩm thấu Tất cả các phân tử tín hiệu này góp phần vào cơ chế thích nghi của thực vật để đáp ứng với căng thẳng phi sinh học [28]

1.5.3 Một số nghiên cứu ứng dụng chitosan và oligochitosan trong nông nghiệp

Nghiên cứu về ảnh hưởng của chitosan và oligochitosan lên khả năng chịu măn của thực vật đã được nghiên cứu trên nhiều loài thực vật Nghiên cứu của Ruan Songlin và Xue Qingzhong năm 2002 đã chứng minh hạt giống của tổ hợp lúa lai

Shanyou 10 và Eryoupeijiu được phủ chitosan cho khả năng thích ứng cao ở nồng độ

muối 50, 100 và 150 mm/L so với hạt lúa thông thường Các chỉ số như hoạt động của α, β-amylase tăng lên, chỉ số chống chịu và tỷ lệ chống chịu của cây con tăng,

hàm lượng proline, đường tổng hòa tan, fructose và sucrose đều cao hơn trong cây con phát triển từ hạt được phủ chitosan [30] Nghiên cứu của Lianju Ma và cộng sự năm 2011 đã khảo sát ảnh hưởng của oligochitosan lên khả năng chịu mặn của cây lúa mì bằng cách xử lý hạt lúa mì với oligochitosan ở nhiều nồng độ khác nhau Kết quả, hạt lúa mì được tiền xử lý với 0,0625% oligochitosan cho cây con có chiều dài rễ, chiều dài chồi, trọng lượng khô, hàm lượng diệp lục cao hơn những cây phát triển từ hạt không được xử lý Điều này chứng minh oligochitosan có khả năng cải thiện các tác động bất lợi và giảm thiếu ảnh hưởng của nồng độ muối thông qua kích thích hoạt động của enzyme chống oxy hóa (SOD, CAT và POD), làm giảm hàm lượng MDA trong lá và sự tích tụ của proline được tăng rõ rệt kể cả trong thời gian sinh trưởng sau đó [31]

Năm 2015, Martínnez González L cùng đồng nghiệp đã nghiên cứu trên giống lúa INCA LP-5 Hạt lúa được xử lý với chitosan ở các nồng độ 0 mg.L-1, 100 mg.L-1

và 500 mg.L-1 trong 24 giờ và chuyển sang môi trường nồng độ muối 100 mmolL-1

sau khi nảy mầm Kết quả là cây phát triển từ hạt giống đã xử lý chitosan có chiều dài chồi và hàm lượng chất khô cao, hàm lượng malondialdehyde thấp và hàm lượng proline cao, hoạt động của các enzyme catalase và peroxidase mạnh mẽ hơn so với cây từ hạt không được xử lý Trong đó nồng độ chitosan 500 mg.L-1 cho kết quả tốt hơn cả [32] Trong nghiên cứu của Yang Zhang và cộng sự năm 2019 về khả năng kích thích quá trình sinh tổng hợp proline của oligochitosan giúp tăng khả năng chống chịu căng thẳng trên cây lúa Kết quả cho thấy cây được xử lý với oligochitosan có khả năng chịu lạnh tốt, chiều dài của rễ tăng và quá trình phát triển của cây vẫn được duy trì Oligochitosan được chứng minh làm tăng hàm lượng proline và glutamate thông qua việc kích thích quá trình sao chép của các gene quan trọng liên quan đến con đường sinh tổng hợp glutamate và proline trong điều kiện lạnh Trong đó glutamate và proline là hai hợp chất nội sinh giúp điều hòa hoạt động thẩm thấu trong tế bào từ đó giúp sự tăng trưởng của cây con và khả năng chịu lạnh ở cây lúa [33]

Hiện nay chitosan và oligochitosan được sử dụng phổ biến trong các nghiên cứu sinh học do có khả năng tự phân hủy sinh học, độ tương hợp sinh học cao, không độc hại và không gây phản ứng dị ứng Nhưng ứng dụng của chitosan và oligochitosan

trên thực vật còn hạn chế, chủ yếu chitosan được ứng dụng nhiều trong công nghệ bảo quản sau thu hoạch do hoạt tính kháng vi sinh vật gây hại, còn trong lĩnh vực ứng dụng như chất kích thích sinh học vẫn còn ít Phương thức hoạt động cụ thể của chitosan và oligochitosan trên hệ thống đề kháng thực vật vẫn chưa được hiểu một cách tường tận Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh khả năng của chiotsan và oligochitosan trong việc kích thích tăng khả năng chống chịu của cây với các yếu tố phi sinh học nhưng chưa chỉ ra được liều lượng, cách thức áp dụng cụ thể lên từng loại cây trồng và ở từng điều kiện căng thẳng phi sinh học khác nhau Vì vậy, cần nghiên cứu kỹ hơn phản ứng bên trong thực vật với căng thẳng do muối gây ra khi có mặt của chitosan và oligochitosan từ đó làm nền tản cho việc ứng dụng chitosan và oligochitosan trong ứng phó với căng thẳng phi sinh học của thực vật

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu

2.1.1 Giống lúa IR64 (OM89):

Giống lúa IR64 được cung cấp bởi Công ty Cổ phần Giống nông nghiệp Điện

Biên

2.1.2 Oligochitosan:

Oligochitosan trọng lượng phân tử 5.994 Da từ dung dịch chitosan 8B (Funakoshi – Tokyo, Nhật Bản) 5%, độ deacetyl hóa 80%, được phân cắt bởi tia bức xạ gamma liều xạ 150 kGy (cung cấp bởi phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Vật liệu và Nano thuộc Trung tâm Công nghệ Sinh học thành phố Hồ Chí Minh) Nồng độ dung dịch oligochitosan sử dụng xuyên suốt các thí nghiệm là 75 ppm

2.2 Phương pháp thí nghiệm

Bố trí thí nghiệm (Hình 2.1)

7 ngày, chiếu sáng 2500 lux, nhiệt độ 30oC Hạt lúa IR64

Khử trùng

Ngâm hạt với nước cất

Chuyển sang đĩa petri trong tối 4 ngày

Chọn cây mạ lúa khỏe

Chuyển sang các hũ thủy tinh

Theo dõi các chỉ tiêu

2 NaCl 0,6%

3 Oligochitosan 75 ppm 4 NaCl 0,6% và

Oligochitosan 75 ppm 1.Hình thái

2.Sinh lý 3.Sinh hóa 4.Gene

2.2.1 Tạo hạt lúa nảy mầm in vitro

Mục tiêu: Tạo nguyên liệu khởi đầu cho các thí nghiệm khảo sát

Phương pháp: Hạt lúa được khử trùng với javel 15 % trong 20 phút, rửa sạch

với nước cất Ngâm hạt trong nước cất trong 24 giờ Sau đó đặt hạt trên giấy thấm được làm ẩm với nước cất trong đĩa Petri đường kính 15 cm, trong điều kiện tối ở 25  2oC trong 4 ngày để nảy mầm Cây mạ lúa có chiều dài rễ mầm từ 2 – 3 cm được sử dụng sử dụng cho các thí nghiệm khảo sát tiếp theo Quá trình tạo nguyên liệu cho thí nghiệm được thực hiện trong điều kiện vô trùng

2.2.2 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của oligochitosan lên khả năng đáp ứng với stress mặn của cây mạ lúa in vitro

2.2.2.1 Mục tiêu: Xác định tác động hỗ trợ của oligochitosan lên khả năng kháng

mặn (NaCl 0,6%) của cây mạ lúa in vitro

2.2.2.2 Phương pháp: hạt lúa đã nảy mầm được chuyển sang hũ thủy tinh (đường

kính đáy 6,4 cm, chiều cao 11,8 cm) với mật độ 20 hạt/hũ chứa 20 mL dung dịch bố trí theo 4 nghiệm thức:

(1) Nước cất (đối chứng âm) (2) NaCl 0,6% (đối chứng dương) (3) OC 75 ppm

(4) OC 75ppm/NaCl 0,6%

Các thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nghiên, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi hũ có 20 cây Thí nghiệm được thực hiện ở điều kiện chiếu sáng 2500 lux và nhiệt độ 30 ± 2oC

Các chỉ tiêu được theo dõi sau 7 ngày từ khi cây mạ lúa được chuyển sang nuôi trong hũ thủy tinh:

− Hình thái: số lượng lá, chiều dài lá, chiều rộng lá, số lượng rễ, chiều cao cây, quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM)

− Sinh lý: cường độ quang hợp và cường độ hô hấp của lá

− Sinh hoá: tỷ lệ trọng lượng khô/trọng lượng tươi, hàm lượng đường tổng số, hàm lượng proline, hàm lượng protein tổng số, hàm lượng diệp lục tố a, diệp lục tố b, hàm lượng carotenoid và hoạt tính enzyme ascorbate peroxydase

− Phân tử: mức độ biểu hiện của gene liên quan đến tổng hợp proline P5CS và P5CR,

gene liên quan đến tổng hợp enzyme ascorbate peroxidase (APX) là Cytosolic APX, Thylakoid bound- APX, Stroma APX

2.2.2.3 Phương pháp thực hiện:

a Chỉ tiêu hình thái:

− Số lượng lá: đếm tất cả các lá mở có chiều dài từ 1 cm − Số lượng rễ: đếm tất cả các rễ nhô ra khỏi gốc thân từ 1 mm − Chiều dài lá: đo từ chóp lá đến gốc lá của lá đầu tiên mở − Bề rộng lá: đo bề rộng lớn nhất của lá mở đầu tiên − Chiều cao cây: đo chiều dài từ chóp lá đến gốc thân

− Hình thái: sử dụng kính hiển vi điện tử quét (SEM): Model S – 400, hãng Hitachi, Nhật Bản để quan sát hình thái giải phẫu của lá (thực hiện tại Trung tâm Nghiên cứu – Triển khai Khu Công nghệ cao TP.HCM)

b Chỉ tiêu sinh lý:

− Cường độ hô hấp: Cường độ hô hấp (µmol O2/g trọng lượng tươi/phút) của lá được xác định bằng điện cực oxygen dựa trên sự giảm oxygen trong buồng đo (LeafLab2, Hansatech) theo thời gian, ở 27oC, trong tối

− Cường độ quang hợp: Cường độ hô hấp (µmol O2/g trọng lượng tươi/phút) của lá được xác định bằng điện cực oxygen dựa trên sự thoát oxygen trong buồng đo (LeafLab2, Hansatech) theo thời gian trong điều kiện chiếu sáng 10.000 lux, ở 27oC (đo tại phòng thí nghiệm Sinh lý Thực vật - Đại học Khoa học Tự nhiên)

c Chỉ tiêu sinh hóa:

− Tỷ lệ chất khô: Cân cây mạ bằng cân phân tích có độ chính xác 0,001g để xác định

trọng lượng tươi, sau đó đặt cây vào tủ sấy ở 80°C đến khi trọng lượng không đổi Trọng lượng khô của cây mạ được xác định bằng cân phân tích có độ chính xác 0,001g

Tỷ lệ chất khô được tính theo công thức:

𝑇ỷ 𝑙ệ 𝑐ℎấ𝑡 𝑘ℎô = 𝑇𝑟ọ𝑛𝑔 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑘ℎô

𝑇𝑟ọ𝑛𝑔 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑡ươ𝑖× 100 [2.1] − Hàm lượng sắc tố quang hợp (Diệp lục tố a, b và carotenoid):