Mục tiêu của đề tài là phân lập, khảo sát khả năng gây bệnh và định danh được loài nấm Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư trên cây ớt chỉ thiên trồng ở Thành phố Hồ Chí Minh, Đồng Tháp và Tây Ninh; tạo được oligochitosan-silica nano trên cơ sở các phân đoạn chitosan có trọng lượng phân từ thấp với hạt nano silica có độ ổn định và hiệu quả kích kháng cao đối với bệnh thán thư trên ớt.... Mời các bạn cùng tham khảo.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - PHẠM ĐÌNH DŨNG NGHIÊN CỨU TẠO OLIGOCHITOSAN-SILICA NANO VÀ KHẢO SÁT TÍNH KÍCH KHÁNG BỆNH THÁN THƯ DO NẤM Colletotrichum spp GÂY HẠI CÂY ỚT (Capsicum frutescens L.) Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số: 42 02 01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Tp Hồ Chí Minh – 2020 Cơng trình hồn thành tại: Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: PGS TS NGUYỄN TIẾN THẮNG Người hướng dẫn khoa học 2: PGS TS BÙI VĂN LỆ Phản biện 1: … Phản biện 2: … Phản biện 3: … Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp Học viện Khoa học Công nghệ Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi … ’, ngày … tháng … năm 20… Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Ớt (Capsicum sp.) gia vị trồng vùng nhiệt đới, tiêu thụ khắp giới có giá trị kinh tế cao Tuy nhiên, dịch bệnh nấm, virus vi khuẩn gây ớt vấn đề gây trở ngại lớn đến trình canh tác Trong loại bệnh ớt, bệnh nấm bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng làm tổn thất từ 10 - 80% sản lượng ớt Việt Nam nước giới Ấn Độ, Thái Lan, Hàn Quốc Các loại bệnh nấm thường gặp ớt bệnh héo (Rhizoctonia solani), bệnh thán thư (Colletotrichum spp.), bệnh mốc xám (Botrytis cinerea), bệnh héo vàng (Fusarium oxysporum), bệnh sương mai (Phythopthora capsici), bệnh thán thư nấm Colletotrichum spp gây loại bệnh phổ biến gây thiệt hại nghiêm trọng ớt Bệnh thán thư ớt nấm Colletotrichum spp gây ra, nấm gây hại cành, lá, trái Trên vỏ trái vết bệnh lúc đầu đốm hình trịn úng nước lỏm vào bên trong, sau lan rộng dần, nặng nhiều vết hoà lẫn với bao gần hết vỏ trái khô dần chuyển sang màu nâu xám hay xám, bên có nhiều vịng đồng tâm có chấm nhỏ li ti màu đen, làm cho trái teo quắt lại không ăn gây rụng trái, gây thiệt hại làm giảm suất 70 - 80% Hiện nay, nhiều loại thuốc hóa học sử dụng để phòng trừ loại nấm gây hại cho trồng, nhiên việc sử dụng với liều lượng cao thời gian dài làm cân quần thể vi sinh vật có ích đất, tạo điều kiện để nấm bệnh loài trùng có hại cho trồng trở nên kháng thuốc Dư lượng thuốc trừ sâu sản phẩm nông nghiệp đất làm ô nhiễm nguồn nước ngầm, môi trường gây tác hại nghiêm trọng sức khỏe người vật nuôi Biện pháp trồng giống chống chịu bệnh bị hạn chế suất độ ổn định giống không cao Biện pháp sinh học sử dụng chất kích kháng thực vật (elicitor) giúp kích hoạt chế đề kháng bệnh trồng xu hướng phát triển nông nghiệp xanh áp dụng rộng rãi giới với mục đích giảm thiểu tối đa việc sử dụng hóa chất độc hại sử dụng giống chuyển gen Chitin silic hai nguồn nguyên liệu phổ biến tự nhiên Nhiều nghiên cứu cho thấy chitosan, oligochitosan (dẫn suất chitin) với silic silica nano dùng riêng lẻ phối hợp có hoạt tính sinh học kháng khuẩn, kháng nấm làm tăng khả chống chịu bệnh đa số loài thực vật, giúp tiết số enzyme, hoạt chất chống lại xâm nhập nấm, vi khuẩn gây bệnh; kích thích tăng trưởng phát triển trồng Xuất phát từ lý đề tài ‘Nghiên cứu tạo oligochitosan-silica nano khảo sát tính kích kháng bệnh thán thư nấm Colletotrichum spp gây hại ớt (Capsicum frutescens L.)’ thực Mục tiêu nghiên cứu luận án - Phân lập, khảo sát khả gây bệnh định danh loài nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán thư ớt thiên trồng Thành phố Hồ Chí Minh, Đồng Tháp Tây Ninh - Tạo oligochitosan-silica nano sở phân đoạn chitosan có trọng lượng phân từ thấp với hạt nano silica có độ ổn định hiệu kích kháng cao bệnh thán thư ớt - Đánh giá khả phòng trừ bệnh thán thư nấm Colletotrichum spp gây ớt điều kiện phịng thí nghiệm, nhà màng ngồi đồng ruộng oligochitosan-silica nano tạo Các nội dung nghiên cứu luận án Luận án gồm nội dung sau: - Nội dung 1: Phân lập, khảo sát khả gây bệnh mẫu phân lặp định danh hình thái, đặc điểm phân tử lồi nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán thư ớt thiên (Capsicum frutescens L.) - Nội dung 2: Hoàn thiện công nghệ tạo oligochitosan-silica nano - Nội dung 3: Đánh giá khả kích kháng bệnh thán thư nấm Colletotrichum gloeosporioides C truncatum gây oligochitosan-silica nano tạo ớt điều kiện phịng thí nghiệm - Nội dung 4: Đánh giá khả kích kháng bệnh thán thư nấm C gloeosporioides C truncatum gây oligochitosan-silica nano tạo ớt trồng điều kiện nhà màng đồng CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung ớt Cây ớt (Capsicum sp.) thuộc họ cà (Solanaceae) có nguồn gốc từ Châu Mỹ, có dạng bụi nhỏ, thường cao 60-80 cm cao đến m; thân nhẵn, có nhiều cành; Lá mọc so le, hình thn dài, đầu nhọn; Hoa mọc đơn độc kẽ Ớt dễ trồng, khơng kén đất thích hợp với nhiều vùng sinh thái Trong vỏ ớt có chứa alkaloid capsaicin Cây ớt địi hỏi khí hậu ấm áp độ ẩm cao cho tăng trưởng thời tiết khơ q trình trưởng thành Nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng phát triển ớt từ 18-30oC Nhiệt độ cao 32oC thấp 15oC tăng trưởng hoa dễ rụng (Tripodi vả Kumar, 2019) Chi (genus) ớt có khoảng 25-30 lồi có năm lồi (Capsicum frutescens L., C annuum L., C chinense Jacq, C pubescens Keep C baccatum L.) hóa canh tác Hiện nay, C frutescens L loài trồng phổ biến kế C annuum L (Jaret cộng 2019) 1.2 Sơ lược nấm Colletotrichum spp bệnh thán thư ớt 1.2.1 Giới thiệu chung nấm Colletotrichum spp Nấm Colletotrichum spp thuộc giới Fungi, ngành Ascomycota, lớp Sordarriomycetes, Phyllachorales, họ Phyllachoraceae Bệnh nấm Colletotrichum spp phổ biến trồng (cây hoa kiểng, ăn ăn quả) Theo xếp hạng Tạp chí Bệnh học thực vật phân tử (2012), nấm Colletotrichum spp., gây bệnh thán thư, xếp vị trí thứ 10 loại nấm gây bệnh hàng đầu, làm ảnh hưởng nghiêm trọng tới sinh trưởng, phát triển suất nhiều loại trồng có giá trị có múi, ớt (Capsicum sp.), đậu tương (Glycine max (L.) Merr.), cà chua (Solanum lycopesicum) (Dean cộng 2012; Cannon cộng 2012) Hính 1.2 Nảy mầm Bào tử nang phát triển Hình 1.2 Chu trình gây bệnh nấm Colletotrichum spp thực vật (A, B) phân loại nấm (C) 1.3 Tổng quan Cơ chế kháng kích kháng bệnh thực vật 1.3.1 Cơ chế kháng bệnh thực vật: Có chế kháng bệnh thực vật: chế thuộc cấu trúc mơ học chế thuộc sinh hóa học (Andersen cộng 2018) Cơ chế kháng bệnh mặt mơ học có chế, tùy thuộc vào cách xâm nhập nấm gây bệnh (Shen cộng 2017) Đối với chế kháng bệnh thuộc sinh hóa học chế kháng bệnh phản ứng vi trí xâm nhiễm (Localized Acquired Resistance hay LAR) sau lan truyền đến hệ thống thực vật (Systemic Acquired Resistance hay SAR) (Gao cộng 2015) SAR (kháng hệ thống) liên kết với tác động gây nhiểm PAMPs hay DAMPs cịn MAMPs liên kết với tính kháng cảm ứng thực vật hay ISR (Induced Systemic Resistance) SAR ISR giúp thực vật chống lại công tác nhân gây bệnh (Virus, nấm, vi khuẩn hay trùng, động vật ăn cỏ, hóa chất) Các nghiên cứu sinh học phân tử cho biết elicitor hormone thực vật acid salicylic (SA), acid jasmonic (JA) Ethylen (ET) đóng vai trị quan trọng kiểm sốt mạng lưới tín hiệu tạo tính kháng thực vật SA tham gia đường SAR cịn JA, ET theo đường ISR (Imran Yun 2020) 1.3.2 Chất kích kháng bệnh (elicitor) thực vật Gần số chất phát có vai trị này, gọi chất kích kháng (elicitor) Khi xử lý chất kích kháng trực tiếp hạt giống, cây, rễ cho vào đất, chế kháng trồng “đánh thức” giúp trồng kháng lại xâm nhiễm mầm bệnh hay hạn chế tổn thương tác động từ yếu tố mơi trường Chất kích kháng khơng trực tiếp tiêu diệt mầm bệnh mà kích hoạt chế đề kháng trồng Số lượng nguồn gốc chất kích kháng đa dạng Các elicitor thơng qua thụ quan (receptor) đường truyền tín hiệu (perception and signal transduction) tạo nên đáp ứng miễn dịch thực vật (plant innate immunity) Chất kích kháng phân loại thành hai nhóm: Chất kích kháng tổng quát chất kích kháng chuyên biệt Chất kích kháng tổng qt có khả gây đề kháng loài thực vật chủ nào, chất kích kháng chun biệt tạo tính kháng vật chủ chuyên biệt Chất kích kháng tổng quát tạo nên đáp ứng miễn dịch sơ cấp thực vật (primary innate immunity) PTI (PAMP triggered immunity) Chất kích kháng chuyên biệt tạo vài tác nhân gây bệnh (nấm, vi khuẩn) phóng thích chất cảm ứng đặc biệt (effector hay cịn gọi protein Avr) ức chế đường kháng bệnh sơ cấp PTI thực vật, làm cho số thực vật trở nên mẫn cảm với tác nhân gây bệnh Trong trường hợp để kháng bệnh, thực vật hoạt hóa đường đề kháng thứ hai để tạo tính miễn dịch (Secondary innate immunity) hay ETI (Effector-triggeredimmunity) thơng qua trung gian gen kháng R (gen R) dùng trung hòa sản phẩm gen gây nhiễm (gen Avr) Các chất kích kháng thường khơng có chung cấu trúc hóa học, phổ rộng nhóm chất khác oligosaccharide, peptide, protein, glycoprotein lipid Các chất kích kháng oligosaccharide bao gồm oligoglucan, oligochitin, oligochitosan oligogalacturonic Chúng thường phân tử từ cấu tạo vách tế bào (glucan, chitin, flagellin vi khuẩn hay lipopolysaccharide (LPS), hay chất xâm nhập công tác nhân gây bệnh Một vài elicitor có chức chưa rõ Trong tương tác gây bệnh thực vật, elicitor cảm ứng sản xuất enzyme phân hủy vách tế bào, phóng thích phân đoạn pectic, oligogalacturonides (OGAs) đóng vai trị nội elicitor (Abdul-Malik cộng 2020) Hình 1.4 Hình 1.4 Cơ chế kháng bệnh nấm thực vật (A) chế kích kháng chitin (B) Các elicitor virus hay trùng acid béo amino acid liên hợp (Fatty acid Amino acid Conjugates) dẫn tới hình thành hợp chất bay dẫn dụ hay hoạt hóa gen kháng trùng Các elicitor hóa học hoạt hóa tính kháng bao gồm việc tích lũy phytoalexin Các elicitor tác nhân phi sinh học (abiotic) ion kim loại hợp chất vô hay chất chuyển hóa từ sinh vật khác chất hóa học phóng thích từ vị trí cơng hay tích lũy hệ thống bệnh hay côn trùng gây (Tawasaki cộng 2017; Jamiolkowska 2020) 1.4 Chitin/Chitosan Silic kích kháng bệnh trồng 1.4.1 Vai trị chitin/chitosan kích kháng bệnh Chitin (poly N-acetylglucosamin) đại phân tử trùng hợp từ N-acetyl-D-glucosamin liên kết cầu nối β (1-4) glucoside, có trọng lượng phân tử lớn Chitosan polyglucosamin chuyển hóa từ chitin sau khử nhóm acetyl (deacetylation) Mức độ deacetyl hóa ảnh hưởng đén khả hòa tan chitosan dung dịch acid lỗng Một tính đặc biệt cấu trúc hóa học chitosan diện nhóm amin bị oxi hóa Những nhóm trở thành cation mơi trường acid thúc đẩy hịa tan chitosan thành đơn vị poly-electrolyte dung dịch Đây sản phẩm tự nhiên, không độc, an tồn với mơi trường sử dụng rộng rãi (Katiyar cộng 2015) Các khảo sát chitin phân đoạn thủy phân cho thấy chúng có khả tác động trực tiếp chống lại tác nhân gây bệnh nấm Oomycete thông qua chế gia tăng khả đề kháng dựa theo đường PTI (PAMP triggered Immunity), giúp tiết chất kháng lại xâm nhập mầm bệnh (Imran cộng 2020) Bên cạnh đó, chitin xâm nhập vào mơ cây, thường kết dính quanh vị trí xâm nhập có ba tác động chính: Thứ lập hàng rào cách ly vị trí xâm nhập để tránh mầm bệnh lây lan bảo vệ tế bào khỏe mạnh khác Tại vị trí cách ly, nhận biết để kích thích phản ứng nhạy cảm giúp tiết oxygen hoạt hóa (Reactive oxygen species, ROS) để giúp tăng cường thành tế bào báo động cho tế bào bên cạnh Chitin có điện tích dương có khả bám chặt vào màng sinh học, chitin cung cấp khả làm lành vết thương nhanh chóng có tổn hại học hay mầm bệnh cơng Chitin chất có khả kích hoạt chế phòng thủ cây, chitin tiếp xúc với mơ thực vật kích thích tiết enzyme bảo vệ chitinase, glucanase, protein kháng bệnh hay hợp chất phytoalexin để từ tiêu diệt mầm bệnh kích kháng trồng (Jamiolkorska 2020) Các nghiên cứu sử dụng chitin oligochitin cho kích kháng bệnh thực vật cho thấy chế kích kháng bệnh chitin thơng qua đường PTI với vai trị thụ quan kinase chitin tương tác chitin thực vật (Hình 1.4B) Chitin liên kết với tiểu phần thụ quan CEBiP (Chitin elicitor binding protein, motif lysine hay LYM) CERK1 (Chitin elicitor receptor kinase 1) màng tế bào mở đầu đường truyền tín hiệu RLCK (Receptor Like cytoplasmic Kinase) dẫn truyền đến RLCK185 qua phosphoryl hóa MAPKK (Mitogen activated ptotein kinase) theo tầng để cảm ứng tính kháng bệnh thực vật từ chitin Một chế tương tự tìm thấy thụ quan PBL27 Arabidopsis thaliana Trong thí nghiệm phân đoạn oligochitin (DP = - 8) tìm thấy thích hợp cho đường truyền tín hiệu Arabidopsis thaliana (Kawasaki cộng 2017) Kết dựa mơ hình thực khẳng định vai trị kích kháng thực vật chitin 1.4.2 Vai trị Silic kích kháng bệnh Silic (Si) ứng dụng rộng rãi nông nghiệp nhiều lĩnh vực khác Si báo cáo làm tăng cường tăng trưởng nâng cao suất thực vật Si cải thiện số hình thái đặc tính học (chiều cao, số ure, tiếp xúc với ánh sáng, kích kháng) số lồi thực vật Si giảm bốc nước tăng cường sức đề kháng cho trồng chịu hạn, mặn, nhiễm độc kim loại làm tăng hoạt động enzyme Si tham gia vào tái tạo vách tế bào hàng rào phòng thủ hữu hiệu thực vật Si bảo vệ thực vật chống lại stress, không làm ảnh hưởng đến tăng trưởng suất trồng Hơn nữa, Si chứng minh giúp cải thiện sức đề kháng nhiều thực vật tác nhân gây bệnh (nấm, vi khuẩn virus) khác (Sakr 2016; Bhat cộng 2019] Có hai giả thuyết cho SI nâng cao kháng nấm bệnh đề xuất Đầu tiên liên kết với lắng động cao sI để hình thành rào cản vật lý để cản trở tác nhân gây bệnh xâm nhập (phòng thủ vật lý) Điều thứ hai có liên quan đến vai trị hoạt tính sinh học biểu chế phịng vệ tự nhiên (phịng thủ sinh hóa) với tăng hoạt động 12 2.2.2.3 Điều chế hỗn hợp oligochitosan-silica nano Dùng phương pháp phối trộn nguyên liệu oligochitosan silica nano độ bền pH thích hợp (5; 6,5; 7,5; 8,5) kết hợp với chất tạo đặc HEC (Hydroxylethylcellulose) khảo sát tính chất chế phẩm tạo hành (TEM, FT-IR) 2.2.3 Nội dung3 Đánh giá khả kích kháng bệnh nấm Colletotrichum spp oligochitosan-silica nano ớt điều kiện phịng thí nghiệm 2.2.3.1 Đánh giá tình hình bệnh thán thư nấm Colletotricum spp ớt - Thí nghiệm xác định yếu tố ảnh hưởng đến hiệu kích kháng bệnh phịng thí nghiệm thực vỉ xốp loại 50 lỗ (55 cm x30 cm x5 cm) Cây giai đoạn chuyển sang ly nhựa trồng phòng sinh trưởng điều kiện 16 sáng/ngày với nhiệt độ khoảng 28oC±2oC Cây ớt xử lý nấm bệnh chế phẩm theo nghiệm thức trước phân tích 2.2.4 Nội dung Đánh giá khả kháng nấm Colletotrichum spp oligochitosan-silica nano ớt điều kiện nhà màng đồng ruộng Thí nghiệm nhà màng đồng ruộng bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên, yếu tố lần lặp lại Mỗi nghiệm thức bố trí 30 ớt/lần lặp lại Số thí nghiệm nghiệm thức x lần lặp lại = 15 Mỗi thí nghiệm có diện tích 20 m2, tổng diện tích thí nghiệm 900 m2 2.2.5 Xử lý số liệu Số liệu phân tích phương sai ANOVA trắc nghiệm phân hạng Duncan với xác suất tin cậy P < 0,01 chương trình SAS 9.1 Các số liệu chuyển đổi trước phân tích: chuyển đổi arsin√x tiêu tỷ lệ bệnh; √x tiêu số bệnh (Gomez Gomez, 1984) 13 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập, khảo sát khả gây bệnh định danh loài nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán thư ớt thiên (Capsicum frutescens L.) Tổng cộng thu thập 20 mẫu bệnh thán thư hại ớt (trên thân, trái) ruộng ớt sản xuất Củ Chi (Thành phố Hồ Chí Minh), Thanh Bình (Tỉnh Đồng Tháp) Tân Châu (Tỉnh Tây Ninh) Kết ghi nhận cho thấy có 20 mẫu phân lập nấm Colletotrichum spp dựa khóa phân loại Sutton (1992) [103] với đặc điểm: hệ sợi nấm khí sinh mọc bung mặt thạch hay mọc sát mặt thạch Tản nấm có dạng hình hoa hay hình trịn Tản nấm có màu trắng, cam nhạt đến màu hồng hay màu nâu xám đến xám đen; mép gợn sóng hay mép cong tròn Xuất hạch nấm màu đen bề mặt hệ sợi nấm Bào tử có dạng từ hình trụ, hai đầu trịn, đầu nhọn đầu trịn hay hai đầu nhọn, đến dạng bào tử hình thoi nhọn hai đầu hay bào tử có dạng hình liềm Ổ bào tử dạng giọt dầu màu cam đến đen Đĩa cành có khơng có lơng gai Bào tử nảy mầm sau 12 giờ, hình thành giác bám sau 24 giờ, giác bám có dạng hình trịn, hình trụ, hình thùy, hình trứng ngược hay bất định, có khơng có phân thùy Lúc hình thành giác bám khơng màu sau có màu nâu đến nâu đen, bề mặt trơn hay gồ ghề Kết lây nhiễm chủng nấm Colletotrichum spp phân lập mẫu trái điều kiện phịng thí nghiệm cho thấy có 20 chủng nấm Colletotrichum spp gây bệnh trái điều kiện gây vết thương có mẫu nấm gây bệnh điều kiện khơng gây vết thương sau ngày NSLN TN-Tr2 TN-L3, TN-Th1, ĐT-Th1.Kết lây nhiễm chủng nấm Colletotrichum spp phân lập mẫu cho thấy, điều kiện có gây vết thương dịng nấm gây bệnh không gây bệnh điều kiện không gây vết thương Các mẫu phân lập TN-L3, TN-Tr2, TN-L1 TN-Th1 cho tỷ lệ bệnh cao thời điểm NSLN, NSLN có khác biệt có ý nghĩa thống kê Các mẫu phân lập TN-L3, HCM-Tr2 TNTh1 có số bệnh có giá trị cao Kết đánh giá khả 14 gây bệnh chủng nấm Colletotrichum spp giống ớt thiên điều kiện nhà màng cho thấy mẫu phân lập TN–L3, HCM-Tr2, TN-Tr2, HCM-L2, TN-Th1 ĐT-Th1 có khả gây bệnh ớt thí nghiệm cao Sự khác biệt nghiệm thức thí nghiệm có ý nghĩa mặt thống kê TN-Tr2 HCM-Tr2 Hình 3.2 Đặc trưng hình thái Colletotrichum gloeosporioides qua mẫu TN-Th1 HCM-L2 ĐT-Th1 Hình 3.3 Đặc trưng hình thái Colletotrichum truncatum qua mẫu Kết định danh chủng nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán thư ớt (Capsicum frutescens L.) phân lập có độc tính cao đặc điểm hình thái học phương pháp sinh 15 học phân tử cho kết mẫu phân lập TN-Tr2 HCM-Tr2 thuộc phức hợp loài Colletotrichum gloeosporioides mẫu phân lập TN-Th1, TN-L3, HCM-L2 ĐT-Th1 Colletotrichum truncatum Bảng 3.6 Kết định danh lồi Colletotrichum spp dựa vào trình tự vùng gen Tên mẫu/ Vùng gen TN-Tr2 (1) C.gloeosporioides ITS (I) C siamense ACTIN (A) C siamense GAPDH (G) C siamense TUBULIN (T) C gloeosporioides GS (S) C fructicola CHS (C) C siamense CAL (L) HCM-Tr2 (2) ĐT-TH1 (3) C scovillei C siamense C scovillei C scovillei C acutatum C scovillei C scovillei C truncatum C truncatum C truncatum C truncatum C truncatum C truncatum C siamense TN-TH1 (4) HCM-L2 (5) TN-L3 (6) C truncatum C truncatum C truncatum C truncatum C truncatum C truncatum C siamense C truncatum C truncatum C truncatum C truncatum C truncatum C truncatum C siamense C truncatum C truncatum C truncatum C truncatum C truncatum C truncatum C siamense 3.2 Hồn thiện cơng nghệ tạo oligochitosan-silica nano 3.2.1 Điều chế oligochitosan có trọng lượng phân tử thấp phương pháp xác định liều lượng chiếu xạ tia ɣ Co60 kết hợp với H2O2 Khi tăng liều xạ, khối lượng phân tử (KLPT) chitosan giảm xuống mẫu dung dịch chitosan 4% có khơng có H2O2 (Bảng 3.7) Khi có mặt H2O2, mức độ suy giảm KLPT chitosan nhanh so với dung dịch khơng có H2O2 mức độ suy giảm tăng hàm lượng H2O2 tăng từ 0,5 đến 1% Từ kết Bảng 3.7, chọn 02 mẫu oligochitosan từ dung dịch chitosan 4%/H2O2 1%, chiếu xạ liều 10,5 17,5 kGy có KLPT tương ứng 7,7 kDa 4,6 kDa dùng cho thí nghiệm ức chế nấm bệnh thực vật Bảng 3.7 Sự suy giảm KLPT chitosan dung dịch 4% có khơng có H2O2 theo liều xạ Liều xạ, kGy CTS 4% CTS 4%/H2O2 0,5% CTS 4%/H2O2 1% 3,5 7,0 10,5 14,0 17,5 21,0 44,500 19,000 14,800 12,300 10,500 9,100 7,900 44,500 17,900 12,600 9,000 6,600 5,500 5,000 44,500 16,700 10,500 7,700 5,500 4,600 4,200 16 Bảng 3.8 Độ ĐĐA% số đa phân tán (PI) chitosan Liều xạ, kGy 3,5 7,0 10,5 14,0 17,5 21,0 CTS 4% ĐĐA % PI 91,3 90,2 89,4 89,0 88,7 88,5 88,3 3,37 2,63 2,60 2,56 2,49 2,43 2,30 CTS 4%/H2O2 0,5% ĐĐA % PI 91,3 89,9 89,1 88,6 88,0 87,6 87,2 CTS 4%/H2O2 1% ĐĐA % PI 3,37 2,78 2,52 2,48 2,18 1,97 1,88 91,3 89,6 88,5 87,7 86,2 85,9 85,6 3,37 2,69 2,55 2,31 1,95 1,81 1,71 Kết Bảng 3.8 cho thấy mẫu chitosan 4%/H2O2 1%, liều xạ 21 kGy, ĐĐA giảm từ 91,3% chitosan trước chiếu xạ xuống thấp 85,6% KLPT chitosan oligochitosan nhỏ số PI thấp chứng tỏ độ phân tán hẹp đồng mẫu chitosan ban đầu (PI=3,37) Với nồng độ chitosan nhỏ hơn, cụ thể 2% mức độ suy giảm KLPT theo liều xạ nhanh so với dung dịch chitosan nồng độ cao (4%) Từ kết bảng 3.9, lựa chọn mẫu oligochitosan có KLPT 2,5 kDa nhận liều xạ 21 kGy dùng để thí nghiệm kích kháng ớt Bảng 3.9 KLPT (Mw), PI ĐĐA chitosan dung dịch 2%/ H2O2 0,5% theo liều xạ Liều xạ, kGy 0,0 KLPT, Mw 44.500 ĐĐA % 91,3 PI 3,37 3,5 7,0 11.900 6.300 90,7 89,4 2,90 2,33 10,5 4.400 88,1 1,63 14,0 17,5 3.500 2.900 87,6 86,4 1,40 1,32 21,0 2.500 85,9 1,25 Tính chất phổ hồng ngoại (IR): Kết phổ hồng ngoại hình 3.6 cho thấy chitosan cắt mạch tạo oligochitosan có KLPT từ 2,5 kDa đến 7,7 kDa có cấu trúc khơng thay đổi so với chitosan ban đầu (Hình IR 3.6a) 17 Đã lựa chọn 03 mẫu oligochitosan với KLPT là: 7,7 kDa; 4,6 kDa 2,5 kDa để làm thí nghiệm kích kháng bệnh tăng trưởng ớt Mẫu oligochitosan dùng để tạo hỗn hợp vật liệu lai với nano (SiO2) chế tạo từ vỏ trấu Các kết khảo sát cho thấy phân đoạn Oligochitosan (4,6 kDa) nồng độ 0,1% có khả ức chế nấm Colletotrichum spp thích hợp ba phân đoạn Oligochitosan khảo sát Hình 3.6 Phổ hồng ngoại (IR) nhiễu xạ tia X (XRD) mẫu chitosan (a) phân đoạn oligochitosan 7,7 kDa (b); 4,6 kDa (c) 2,5 kDa (d) 3.2.2 Điều chế hạt nano silica (SiO2) từ nguồn vỏ trấu Vỏ trấu xử lý với axít nung tạo nano SiO2 màu trắng độ tinh khiết cao Hiệu suất tạo nano SiO2 từ vỏ trấu xử lý thống kê là: 10,21± 0,38% (Bảng 3.15) Kích thước hạt nano SiO2 chế tạo khoảng 10-30 nm Bảng 3.15 Hiệu suất tạo nano silica từ vỏ trấu xử lý với axít 5% Mẫu Vỏ trấu (g) nano-SiO2 (g) Hiệu suất (%) 0,5105 10,33 0,5022 10,04 0,5128 10,26 Kết (theo Hình 3.8A, B) cho thấy kích thước hạt nano silica chế tạo nung vỏ trấu 700oC, khoảng 10 30 nm Kết cho thấy phân bố kích thước hạt nano silica phân bố hình chng (Gaussian distribution) Giản đồ 18 nhiễu xạ tia X nano silica Hình 3.8D cho thấy có đỉnh 2 ~22o Thí nghiệm dùng vỏ trấu (khơng phải than đốt từ vỏ trấu) xử lý với acid HCl trước nung, tạp chất oxíd kim loại loại bỏ Mặc dù nano silica tạp chất Al2O3 (k đỉnh 1.486 keV) với hàm lượng ~0,7% tính theo thành phần nguyên tử Các giá trị k Silicon (Si) oxy (O) phổ EDX tương ứng 1,739 0,525 keV (Hình 3.8E) Kết nầy tương tự với cấu trúc vơ định hình nano silica nhận từ nung vỏ trấu Hình 3.8 Hình chụp TEM (A, B); phân bố kích thước hạt đo phương pháp tán xạ laser (C); giản đồ XRD (D) EDX (E) hạt nano silica điều chế Kết luận: Đã chế tạo nano silica theo phương pháp nung vỏ trấu xử lý với acid để loại bỏ tạp chất chủ yếu ion kim loại Kích thước hạt nano silica nhận khoảng 10 - 30 nm với đặc trưng cấu trúc pha vô định hình có đỉnh nhiễu xạ tia X góc 2 ~22o Sản phẩm nano silica nhận dùng cho thí nghiệm kích kháng bệnh tăng trưởng ớt Ngồi ra, nano silica cịn sử dụng chế tạo hỗn hợp vật liệu lai oligochitosan-silica nano với mục đích 19 dùng cho thí nghiệm kích kháng bệnh tăng trưởng ớt 3.2.3 Điều chế hỗn hợp oligochitosan-silica nano Quan sát kết phối trộn nano silica với oligochitosan tạo gel xảy (Hình 3.9A giữa) Tuy nhiên gel tạo thành có độ bền khác tùy thuộc theo điều chỉnh pH hỗn hợp dung dịch oligochitosan-silica nano Kết cho thấy pH thấp 6,5 hỗn hợp dung dịch oligochitosan-silica nano tạo gel không tốt bị lắng, pH 7,5 tạo gel bền đồng (Hình 3.9D) Kết quan sát hiệu ứng pH phù hợp vớp kết nghiên cứu Tiraferri cộng (2014) ảnh hưởng pH lên mức độ hấp phụ chitosan lên bề silica Nhằm gia tăng độ ổn định gel dung dịch hỗn hợp oligochitosan-silica nano cho mục đích ứng dụng thực tiễn, HEC thêm vào với nồng độ 1% (w/v) (Hình 3.8E) Quan sát theo thời gian cho thấy dung dịch hỗn hợp oligochitosan-silica nano thêm 1% HEC có độ ổn định gel tốt so với hỗn hợp không thêm HEC Ảnh TEM Hình 3.9G cho thấy nano silica phân bố dung dịch oligochitosan với kích thước có phần biến dạng so với nano silica dạng tinh khiết Phổ FTIR silica nano Hình 3.8B cho thấy giải số sóng khoảng 3416-3454/cm đặc trưng cho dao động co giãn nhóm silanol bề mặt (Si−O−H) silica hấp thụ nước (Yan cộng 2015) Đặc trưng dao động bất đối xứng khung silica (Si−O−Si) bao gồm dao động co giãn bất đối xứng (asymmetric stretching vibration) đỉnh 1.101/cm, dao động co giãn đối xứng (symmetric stretching vibration) đỉnh 802/cm dao động uốn (bending vibration) đỉnh 467/cm Ngoài ra, Phổ FTIR cịn xuất đỉnh 1.635/cm, theo tác giả cơng trình (Wang cộng 2011) đỉnh đặc trưng cho giao động uốn liên kết H−O−H liên quan đến phân tử nước bị bẫy (trapped water moleces) cấu trúc matrix nano silica Phổ FTIR oligochitosan Hình 3.9C cho thấy dao động co giãn nhóm (C=O) đỉnh 1.647/cm nhóm (C−N) đỉnh 1593/cm (Al-Mla cộng 2013) Dao động uốn nhóm (N−H) đặc trưng cho chitin xuất đỉnh 771/cm Dao 20 động co giãn bất đối xứng nhóm (C−O−C) đặc trưng đỉnh 1.153/cm đỉnh dao động co giãn nhóm (C−O) đặc trưng chung cho polysacarit xuất đỉnh 1.031 1.074/cm Nhóm (OH) dao động đặc trưng vùng số sóng 3.420 – 3.450/cm Phổ FTIR hỗn hợp oligochitosan-silica nano Hình 3.9F cho thấy xuất đỉnh 1.083/cm 781/cm đặc trưng cho liên kết Si−O−C, đỉnh không xuất phổ FTIR oligochitosan nano silica Ngoài phổ đồ FTIR hỗn hợp oligochitosan-silica nano (Hình 3.9I) cịn xuất thêm đỉnh 927/cm đặc trưng cho liên kết Si−O−H q trình tạo liên kết hydro nhóm silanol nano silica nhóm –NH2, −OH oligochitosan (Kim Rajapakse, 2005) Nói chung đưa silica nano vào dung dịch oligochitosan cường độ đỉnh đặc trưng chitosan bao gồm nhóm (N−H) giảm số sóng thấp so với oilgochitosan tinh khiết tương tác bề mặt oilgochitosan với pha vô nano silica Hình 3.9 Sự phối trộn tạo gel tạo chế phẩm (A), khảo sát độ bền gel theo pH 5; 6,5; 7,5; 8,5 (D) thành phẩm pH 7,5 1% HEC (E) Các tính chất chế phẩm tạo thành hình chụp TEM (G) TEM pH (H) phổ FTIR ban đầu hạt nano silica (B) oligochitosan (C) phối trộn (F) thành phẩm (I) 21 3.3 Khả kích kháng bệnh thán thư nấm Colletotrichum gloeosporioides C truncatum gây oligochitosan-silica nano ớt trồng điều kiện phịng thí nghiệm Kết cho thấy phun oligochitosan nồng độ 25 đến 100 ppm cho kết tỷ lệ bệnh số bệnh thấp so với hai đối chứng Điều khẳng định rằng, oligochitosan có ảnh hưởng rõ đến tỷ lệ bệnh thán thư ớt, phun oligochitosan nồng độ 25 ppm giai đoạn 14 ngày sau xử lý cho tỷ lệ bệnh thấp giai đoạn 21 ngày sau xử lý, tỷ lệ bệnh lại có xu hướng tăng nhẹ trở lại Về silica nano oligochitosan-silica nano có ảnh hưởng rõ đến bệnh thán thư từ nồng độ 25-100 ppm cho tỷ lệ bệnh số bệnh thấp hai đối chứng Điều khẳng định oligochitosan-silica nano có tác động đến tỷ lệ bệnh số bệnh thán thư, tùy giai đoạn xử lý khác có tác động khác 3.4 Khả kích kháng bệnh thán thư nấm Colletotrichum gloeosporioides Colletotrichum truncatum gây oligochitosan-silica nano ớt trồng điều kiện nhà màng đồng ruộng Đánh giá khả kích kháng bệnh thán thư gây nấm C gloeosporioides C truncatum ớt oligochitosansilica nano suốt thời điểm sinh trưởng phát triển ớt trồng nhà màng đồng ruộng điều cần thiết Đặc biệt thời điểm có trái định đến suất chất lượng sản phẩm trái ớt sau thu hoạch 3.4.1 Khả kích kháng bệnh thán thư C gloeosporioides gây oligochitosan-silica nano ớt trồng điều kiện nhà màng Kết khảo sát khả ức chế nấm bệnh C gloeosporioides qua khảo sát chi tiêu tỉ lệ bệnh, số bệnh yếu tố cấu thành suất suất sử dụng chế phẩm điều chế với nồng độ khác tử 25100 ppm điều kiện nhà màng cho thấy: phun oligochitosan nồng độ 25 ppm cho kết tốt nhất; phun 22 silica nano nồng độ 50 ppm 100 ppm cho kết tốt nhất; phun oligochitosan-silica nano từ 25-100 ppm có tính kháng bệnh có ảnh hưởng đến suất ớt sau thu hoạch, đó, kết đạt tốt phun oligochitosan-silica nano nồng độ 50 ppm 3.4.2 Khả kích kháng bệnh thán thư Colletotrichum truncatum gây oligochitosan-silica nano ớt trồng điều kiện nhà màng Qua tiêu theo dõi thí nghiệm, phun oligochitosan có tác động đến tình hình bệnh thán thư suất ớt Trong đó, phun oligochitosan nồng độ 25 ppm cho kết tốt qua tiêu theo dõi Đối với nano silica, phun nano silica có tác động đến tình hình bệnh thán thư tình hình sinh trưởng phát triển ớt Trong đó, phun nano silica nồng độ 100 ppm cho kết tốt Khi phun oligochitosan-silica nano có tác động đến tình hình bệnh thán thư trái tình hình sinh trưởng phát triển ớt Trong đó, phun oligochitosansilica nano nồng độ 50 ppm cho kết tốt 3.4.3 Đánh giá khả kích kháng bệnh thán thư C gloeosporioides gây oligochitosan-silica nano ớt trồng đồng ruộng Qua tiêu bệnh tiêu yếu tố cấu thành suất suất cho thấy: Oligochitosan có tác động rõ đến tính kháng bệnh thán thư tác động đến sinh trưởng phát triển ớt Các nồng độ oligochitosan khác có tác động khác nhau, phun oligochitosan nồng độ 25 ppm cho kết tốt Đối với nano silica, có tác động đến tình hình bệnh thán thư tình hình sinh trưởng phát triển ớt Trong đó, phun nano silica nồng độ 100 ppm cho kết tốt Đối với oligochitosan-silica nano, phun oligochitosan–silica nano từ 25 đến 100 ppm có tác động đến tính kháng bệnh có ảnh hưởng đến suất ớt sau thu hoạch Trong đó, kết đạt tốt phun oligochitosan-silica nano nồng độ 50 ppm 23 3.4.4 Đánh giá khả kích kháng bệnh thán thư C truncatum gây oligochitosan-silica nano ớt trồng đồng ruộng Qua tiêu theo dõi thí nghiệm, thí nghiệm có phun oligochitosan, nano silica oligochitosan- silica nano có tác động đến tình hình sinh trưởng phát triển ớt Trong đó, phun oligochitosan nồng độ 25 ppm cho kết tốt Đối với nano silica, có tác động đến tính kháng bệnh thán thư tình hình sinh trưởng phát triển ớt Trong đó, phun nano silica nồng độ 50 100 ppm cho kết tốt Đối với oligochitosan-silica nano, thí nghiệm có tác động đến tính kháng bệnh thán thư trái tình hình sinh trưởng phát triển ớt; phun oligochitosan- silica nano nồng độ 50 ppm cho kết tốt Theo kết nghiên cứu thu được, việc ứng dụng vật liệu oligochitosan-silica nano thực tiễn khả thi Việc sử dụng loại vật liệu có tính kích kháng thực vật xu hướng nông nghiệp để ứng dụng sản xuất Hiệu phòng bệnh loại chế phẩm sản xuất luận án tương đương so với phương pháp sử dụng thuốc hóa học truyền thống Do vậy, khả ứng dụng sản phẩm chế tạo luận án vào thực tiễn lớn Tuy nhiên cần phải tiếp tục thử nghiệm diện rộng Các kết ghi nhận cho thấy oligochitosan-silica nano hứa hẹn sản phẩm tiềm ứng dụng để kiểm soát bệnh thán thư ớt nhiều loại trồng khác sản xuất nông nghiệp Phương pháp tạo oligochitosan phương pháp chiếu xạ gamma Co-60 giúp sản xuất oligochitosan quy mô lớn Đồng thời, nano silica tổng hợp từ tro trấu-phụ phẩm nông nghiệp nguồn nguyên liệu dồi Do nâng cao khả ứng dụng oligochitosan-silica nano thực tế sản xuất nông nghiệp quy mô lớn nhằm cảm ứng khả kích kháng bệnh thán thư trồng, thay dần việc sử dụng hóa chất độc hại, giúp phát triển nông nghiệp bền vững thân thiện với môi trường 24 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN Đã phân lập định danh 20 mẫu nấm bệnh thán thư ớt tiến hành định danh hình thái dựa theo Sutton (1992), mẫu phân lập thuộc hai nhóm phức hợp loài Colletotrichum gloeosporioides C truncatum Kết phân loại dựa trình tự vùng gen chuyên biệt thực mẫu nấm có độc lực cao (TN-L3, TN-Tr2, TN-Th1, HCM-Tr2, HCM-L2, ĐT-Th1) Đã thu phân đoạn oligochitosan có phân từ thấp (7,7 kDa; 4,6 kDa 2,5 kDa) kiểm tra hoạt tính kháng nấm bệnh cao phân đoạn oligochitosan (0,5 - 1%) điều chế thành công hạt nano silica kích thước 30 nm từ vỏ trấu dùng làm vật liệu cho chế tạo hỗn hợp dung dịch oligochitosan-silica nano bền pH 7,5 với chất làm đặc HEC (1%) khảo sát số đặc trưng tính chất vật liệu oligochitosan, silica nano hỗn hợp oligochitosan-silica nano Kết bước đầu hiệu ứng tăng trưởng yếu tố có liên quan đến kích kháng bệnh vật liệu cho thấy thể ứng kích kháng bệnh tốt thông qua biểu hoạt chất liên quan đến tính kích kháng hoạt tính enzyme chitinase, β1,3 glucanase, tích lũy capsidiol hay salicylic acid jasmonic acid, cụ thể phun oligochitosan-silica nano nồng độ 50 - 100 ppm 21 ngày sau xử lý Kết đánh giá tính kích kháng bệnh thán thư điều kiện nhà màng: + Đối với nấm C gloeosporioides: Qua tiêu theo dõi bệnh tiêu cấu thành suất suất, kết đạt tốt phun oligochitosan 25 ppm nano silica 100 ppm oligochitosan-silica nano 50 ppm +Đối với nấm C truncatum: Qua tiêu theo dõi bệnh tiêu cấu thành suất suất, kết đạt tốt phun oligochitosan 25 ppm; nano silica 50100 ppm oligochitosan-silica nano 50 ppm 25 Kết đánh giá tính kích kháng bệnh thán thư trồng đồng ruộng: + Đối với nấm C gloeosporioides: Qua tiêu theo dõi bệnh tiêu cấu thành suất suất, kết đạt tốt phun oligochitosan 25 ppm; nano silica 50, 100 ppm oligochitosan-silica nano 50 ppm + Đối với nấm C truncatum: Qua tiêu theo dõi bệnh tiêu cấu thành suất suất, kết đạt tốt phun oligochitosan 25 ppm; nano silica 100 ppm; oligochitosan-silica nano 50 ppm ĐỀ NGHỊ Bước đầu ứng dụng sử dụng oligochitosan-silica nano kích kháng bệnh thán thư Colletotrichum spp ớt thiên Trong trình trồng ớt nhà màng hay đồng ruộng, phun oligochitosan-silica nano nồng độ 50 ppm Tiến hành phun oligochitosan-silica nano lần cách ngày, thời điểm phun lần đầu vào khoảng thời gian chuẩn bị hoa (25 ngày sau trồng - NST) để hạn chế bệnh thánh thư gây hại lá, trái giúp làm tăng suất ớt NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN - Luận án hồn thiện quy trình sản xuất oligochitosansilica nano ứng dụng sản xuất quy mơ cơng nghiệp: + Tạo oligochitosan có khối lượng phân tử nhỏ (7,7; 4,6 2,5 kDa) phương pháp chiếu xạ dung dịch 4% chitosan/0,5% H2O2 dung dịch 2% chitosan/0,5% H2O2; + Tạo vật liệu nano silica có độ tinh khiết cao phương pháp thiêu kết vỏ trấu xử lý loại bỏ thành phần khoáng + Tạo oligochitosan-silica nano bền pH gần trung tính (pH ~ 7,5) - Luận án ứng dụng oligochitosan-silica nano tạo kích kháng bệnh thán thư nấm C gloeosporioides C truncatum ớt thiên trồng Thành phố Hồ Chí Minh 26 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Pham Dinh Dzung, Dang Van Phu, Bui Duy Du, Le Si Ngoc, Nguyen Ngoc Duy, Hoang Dac Hiet, Dang Huu Nghia, Nguyen Tien Thang, Bui Van Le, Nguyen Quoc Hien, Effect of foliar application of oligochitosan with different molecar weight on growth promotion and fruit yield enhancement of chili plant, Plant Production Science, 2017, 20 (1), 1-7 Pham Dinh Dzung, Le Thanh Hung, Le Si Ngoc, Hoang Dac Hiet, Bui Van Le, Nguyen Tien Thang, Dang Van Phu, Nguyen Ngoc Duy, Nguyen Quoc Hien, Induction of anthracnose disease resistance on chili fruit by treatment of oligochitosan— nano hybrid material, Agrictural Sciences, 2017, (10), 11051113 Phạm Đình Dũng, Nguyễn Tiến Thắng, Dương Hoa Xô, Lê Quang Luân, Nghiên cứu hiệu lực kháng nấm Collectotrichum capsici gây bệnh thán thư ớt phân đoạn oligochitosan chế tạo phương pháp chiếu xạ kết hợp xử lý hóa học, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 2017, 15 (1), 105-112 Pham Dinh Dung, Le Si Ngoc, Nguyen Ngoc Thuy, Lu Thi Minh Truc, Bui Van Le, Dang Van Phu, Nguyen Ngoc Duy, Nguyen Quoc Hien, Effect of nanosilica from rice husk on the growth enhancement of chili plant, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ - Journal of Science and Technology, 2016, 54 (5), 607613 ... ? ?Nghiên cứu tạo oligochitosan-silica nano khảo sát tính kích kháng bệnh thán thư nấm Colletotrichum spp gây hại ớt (Capsicum frutescens L.)’ thực Mục tiêu nghiên cứu luận án - Phân lập, khảo sát. .. capsici), bệnh thán thư nấm Colletotrichum spp gây loại bệnh phổ biến gây thiệt hại nghiêm trọng ớt Bệnh thán thư ớt nấm Colletotrichum spp gây ra, nấm gây hại cành, lá, trái Trên vỏ trái vết bệnh. .. pháp nghiên cứu 2.2.1 Nội dung Phân lập, khảo sát khả gây bệnh định danh chủng nấm gây bệnh thán thư nấm Colletotrichum spp ớt 2.2.1.1 Phương pháp phân lập nấm gây bệnh thán thư ớt - Phân lập nấm