Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Khảo sát các phương pháp lên men thu nhận L-Lysine bằng chế phẩm cố định Corynebacterium Glutamicum

L-lysine được tổng hợp bằng các phương pháp hóa học và sinh học như táchchiết từ dịch thủy phân protein động vật , thực vật và lên men vi sinh vat.. Trong đóphương pháp lên men vi sinh v

NGO NAM LUAN

KHAOS TC C PHUONG PH P LEN MEN THUNHAN L-LYSINE BANG CHE PHAM CO DINH

CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM

Chuyên ngành : Công nghệ sinh hoc

Mã số : 604280

LUẬN VÁN THẠC SĨHướng dẫn khoa học: PGS TS NGUYÊN THÚY HƯƠNG

TP HO CHÍ MINH, tháng 08 năm 2012

Cán bộ hướng dẫn khoahọc: (Ghi rõ ho, tên, hoch m,hocviv ch k ) — PGS.TS.NGUYÊN THUY HUONG

Cán bộ chấm nhậnxétl: —

(Ghi rõ ho, tên, học h m, học vịv ch k ) — cc sec.

Cán bộ chấm nhậnxếét2

(Ghi rõ ho, tên, học h m,hocviv ch k ) — — sec.

Luận văn Thạc sĩ sẽ được bảo vệ tại trường Đại học B ch Khoa, ĐHQG Tp HCM,

ngày 16 tháng 11 năm 2012.

Th nh phần H id ng đ nhgi Luận văn Thạc sig m:(Ghi rõ họ, tên, học h m, học vị của Hội đông châm bao vệ luận văn thạc sĩ)

¬ c cece cence eee ee eee ee eee eeeeeeeeeeeeeeeeee tees eeeeeeeeaeeenaeens

X c nhận của Hội đông đánh gia Luận van va Truong Khoa quan lý chuyên ngànhsau khi Luận văn đã được sửa chữa (nêu có).

CHU T CHH IĐÓNG TRUONG KHOA KT HOA HOC

Tp HCM, ng y th ng năm 2012

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ và tên học viên: NGÔ NAM LUẦN Gidi tính: Nam

Ng y, th ng, năm sinh: 06—09-— 1983 Nơi sinh: BR-VTChuyên ngành: Công nghệ sinh học MSHV: 09310576

1- TEN DE TÀI: Khảo s tc c phương ph p lên men thu nhận L-lysine bang chéphẩm cô định Corynebacterium glutamicum

2- NHIỆM VỤ LUẬN VĂN:% Khao sát giống vi sinh vật.% Có định tế bào Corynebacterium glutamicum trên chat mang Alginate.% Lên men fed-batch liên tục với tế bào tự do và chế phẩm cô định

NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: Th ng 2/2011

NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: Th ng 8/2012HO VÀ TEN CÁNB_ HƯỚNG DAN: PGS TS NGUYEN THUY HƯƠNG

Suốt thời gian 1 m luận văn tốt nghiệp , tôi đã hoc được rất nhiều điều bố ích

từ thay cô,bạnb v môi trường | m việc Ch nhnh ng diéun y đã gi p tôi trưởngth nh hon rat nhiêu Tôi muôn gui lời cam ơn chân thành nhật đền tat ca mọi người.

Đầu tiên, cho tôi gửi lời cảmơn sâu sắc và chân thành nhất đến cô —PGS.TS Nguyễn Thúy Hương Cô không chil người đã gi pd v hướng d nôitận tinh trong suốt qu tr nh thực hiện để t i,m c nd ng viên, chia sẻ trong lúc tôigặp những kh khăn trong cu c sống Em cảm ơn cô rất nhiều !

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Trường Đại học b ch Khoa, Khoa Kỹ thuật h ahoc v B mon Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi ho n th nh

luận văn n y.

Xin cảm onc c thầy cô trongb môn Công nghệ sinh học đã gi pd, truyềnđạt nh ng kiến thức cũng như kinh nghiệm để tôi c được nh ng kiến thức quý báuv ho nth nh tốt luận văn n y

Xin cảm ơn chi Như Ngọc đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong | ctôig pkh khăntrong qu_ tr nh thực hiện đề t ¡ Cảm onc c bạn học viên cao học, c c ban sinh viênđã cùng chia sẻ những niềm vui, nỗi buôn và những kinh nghiệm quý báu trong suốtthời gian làm việc chung với nhau.

Cuối cùng cho tôi gửi lời triân đến Ba, M , những người đã luôn chăm sócv lo lăng cho tôi từngng y.Ba,M luônl ch dựav ng ch c cho con suốt cu eđời này.

chế phẩm cố định Corynebacterium glutamicum ”.

Dé tai thu duoc két qua sau:Điều kiện tối ưu dé cố định tế bao C glutamicum trên chat mang Alginate là :nông độ Alginate 3%, CaCl, 2%,t lệ gi agiốngv Alginate! 1:4 (mật độ giống

| 10” tế bao/ml) Hiệu suất có định đạt 94,6% (mật độ tế bảo vi khuẩn là 26.10” tế

28,08 gil.

immobilized Corynebacterium glutamicum’.

The result is given as follows:The optimal conditions of immobilized C glutamicum in Alginate carrierare: Alginate concentration 3%, CaCl, 2%, the ratio between innoculum and

Alginate is 1:4 (the cells density is 10'? CFU/ml) the immobilization efficiency is94,6% (the cells density is 2.6.10° CFU/ g)

The continuous fed-batch fermentation: the media was added to culturemedia after 12 hours with fedding rate is 40ml/h.

% With free cells: innoculum 10% (cultural quality 2.10° CFU/ml), the

L-lysine yield is 33,55 g/l.

* With immobilized cells: 3% (w/v) immobilized cells (the cells density is

26.10 CFU/g), the L-lysine yield is 28,55 g/l

The immobilized cells could reused about 6 times in continuous fed-batchfermentation the average L-lysine yield is 28,08 g/l.

MO ĐẦU 5-5<° <7 1707.020 07 029.0706078 pordepoette 1CHƯƠNG 1 TONG QUAN TÀI LIỆU

1.1 VIKHUAN CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM s-5-<5-ses2 21.1.1 Lich sử phát trién và phân lodi c cccecccsccscscsscsessesesessssesessssesessesesesseseseesesesen 21.1.2 Ð c điểm của vi khuẩn Coryebacterium gÏufaImiCHi -5-5-555555¿ 21.1.3 Ð c điểm di truyền của vi khuẩn Coryebacterium glutamicum 31.1.4 Sự chuyển hóa vật chat trong Coryebacterium glutamicum - 4

1.2 AMINO ACID LYSINE sac s5 5 9990009 90009599000009569000660095969066809096 6067[.2.1 Giới thiỆU - G0 HT nọ re 7

1.2.3 Sinh tổng hop L-lysine ¿55-5 5c St E2 3E E1 12111121211 xe creeg 81.2.3.1 Cum gen sinh tổng hợp L-lysine - ¿5-5 + 552s+cce+xsrerezeerered 81.2.3.2 Quá trình tổng hợpv điều hòa sinh amino acid lysine 9

124 Lên men thu nhận L-lysine - - << «5 55 9999999355111 1 ke 14

1.2.4.1 Ảnh hưởng của thành phan dinh dư ng -55+: 141.2.4.2 Ảnh hưởng củam t số điều kiện ngoại cảnh - 5+: 17

1.2.4.3 KY thuật lÊn mein - (<< + 3 0S 1111 ke 19

1.3 CÔ ĐỊNH TE BAOvsssssssssssssssssssssssssssssssssssssssessssssssssssssssssssssssssssssssssssssessessses 22

1.3.1 Dinh nghĩa G09 22

1.3.2 Phuong ph p cố định tế bào Vi sinh Vat - 2 555 55+s+c+csccezsccee 221.3.3 Chat mang Alginate - +©+Se St t3 1 191121211121 211 111111 cryeU 241.3.3.1 CẤu tạO Q ST HH ng TT HH TH TT TT HH gu 241.3.3.2 Tính Chat cccccccccccccccccceccccsccsccsccsssessesecsscsscescesscsscesesssessecsuesscesscssceseeseeas 24

1.4 CÁC NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC LIEN QUAN DEN DE

SL — ,ôÔỎ 25

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP2.1 NGUYÊN VAT LIEU, HÓA CHAT, MOI TRƯỜNG 5 °-5-<¿ 292.2 NỘI DUNG THI NGHIEM uu sssccssssssssscssssssssssessssesssessssssssssessssesesesesesessesesees 302.3 BO TRÍ THÍ NGHIEM cccscsssssssssssssssscsssssssssssssesesssessssssesesessssssesesesesessesesees 322.3.1 Kiểm tra giOng cccecccccccccsscsssesssscsesscssssssssesscsssesscsssessesesesessesesessesesesseseeeeees 322.3.2 Cố định tế bào trên chất mang Alginate - + 25s cs+ccscxsxersceee 332.3.3 Khảo sátt lệ chế phẩm cô định trong quá trình lên men - 34

2.3.4 Lén men fed-batch lIÊn ỤC - 22+ 1111111115111 1111111351111 342.34.1 Lên men ba(CH c2 c2 11301131 H SH cv ng ven 34

2.3.4.2 Lên men fed-batch liên tục với tế bào tự do - -ccsssscxcxc: 342.3.4.3 Lên men fed-batch liên tục với chế phẩm cố định 362.4 PHƯƠNG PHAP PHAN TÍCH THÍ NGHIEM s-ssesesesesees 36

24.1 Phương ph p Vi sinh - c0 ke 362.4.2 Phương ph ph a sinh << << 00 ng ke 37

242.1 Phương ph p định lượng đường khử bang thuốc thử DNS 372.4.2.2 Phân t ch định lượng sob amino acid trong dich lên men bang

phương ph p đo mật d quang, - <5 5553201101111 13 9111111 ng ke 39

242.3 Phân t ch định tính amino acid trong dịch lên men bằng phương ph pX23, 7 :1-£1 39CHƯƠNG 3 KET QUA VA BIEN LUẬN

3.1 GIỐNG VI SINH VAT ssscscssssssscssscsssssssscssscsssssssssssssssssssssssssscssssscscssssssseseseses 413.1.1 Ngu n gốc Vi sinh VAt ee cecccccccccscscsesssesscsesesscsesesscsesesscsssesscseseseessseeeeees 41

3.2 CÓ ĐỊNH TE BAO TREN CHAT MANG ALGINATTE -«-ss-css 45

3.2.1 Khaosdtn ngd Alginate anh hưởng đến quá trình cố định 45

3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng củan ng d CaCl, đến khả năng tao hat 46

3.2.3 Khảo sátt lệ [Giống : Alginate] ảnh hưởng đến quá trình cố định 47

3.2.4 Khảo sátt lệ chế phẩm cô định trong quá trình lên men - 49

3.3 LÊN MEN FED-BATCH s<s<s°sSsEEseEEseEEsetEenEsesesesssosee 493.3.1 Lên men bafCh G999 909000 0 ke 493.3.2 Lên men fed-batch với tế bao tự dO 6 6S EeEsEskekeerersesed 503.3.3 Lên men fed-batch với chế phâm cố định - ¿5-52 2 s+s+£z£scsez 533.3.3.1 Lên men fed-batch liên tục với chế phâm cô định - 53

3.3.3.2 Khảo s t khả năng t ¡ sử dụng của chế phẩm cô định 55CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VẢ KIEN NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Bảng 2 1 Thành phần môi trường - ¿2 + 2+ £E+E+E£E£EeEezErvvverererreee 29Bảng 3 1 Ð c điểm sinh học của chủng C glutamicum VTCC B — 656 4]Bang 3.2 Anh hưởng can ngd Alginate đến quá trình cố định tế bào 45Bảng 3 3 Ảnh hưởng củan ngd CaCl, đến khả năng tạo hạt ‹‹cccss: 46Bảng 3 4 Ảnh hưởng củat lệ [Giống : Alginate] đến hiệu suất cố định 47

DANH MỤC HÌNHHình 1.IB_ gen vi khuẩn Corynebacterium glutamicum .- 255555552 cscscscs2 3Hình 1 2 Quy trình chuyển hóa các chất trong C.glutamicum sinh amino acid L-

ð 6

Hình 1 3 Công thức cau tạo của ÏySine ¿5-5252 2xx +EEeErkrkrrerrrrerrreee 8Hình 1 4 Cụm gen sinh tong hop lysine c.cccccccsessssessssesessesesesessssesessesssessssesesseseeeeees 9H nh 1 5 Con đường sinh tổng hop L-lysine cccccccsessesessesssesseesesesesesesseseeeesesen 10Hình 1.6 Sod c cphuong ph p cố định tế bào Vi sinh Vat eee 22Hình 2.1 Sod n ¡ dung thực hiện GE tai cc cccccecescscssecsccessecececeesevscsceceesevavsceceees 31Hình 2 2 Hệ thống lên men fed-batch liên tục -<<<<<<<<++<ssssss 35

Hình 2 3 Phản ứng gi a đường khử va acid 3,5-dinitrosalicylic trong môi trường

SP 37Hình 3 1 Hình dạng tế bào C glutamicum VTCC B — 656 ở vật kính 100X 42Hình 3 2 Hình dạng va mau s c khuẩn lạc C glutamicum VTCC B — 656 42Hình 3 3 Hạt chế phẩm có định C glufdrmiCHIH 22-5-5252 5252 S2+£+£+£s££s+eccst 48

cua Corynebacterium glutamicum theo thời gØ1an -ẶẶ S931 ke 43

DP thị3.2 Ảnh hưởng củat lệ chế phẩm cô định lên năng suất sinh L-lysine 49

Ð thị3.3.H m lượng L-lysine theo thời gian trong lên men batch 50

DP thi 3.4 Lên men fed-batch ở tốc d 30, 40 và 50ml/h sau 12h lên men 51

BD thi 3.5 Lên men fed-batch ở tốc d 30,40 và 50ml/h sau 24h lên men 52

PD thi 3.6 Lên men fed-batch với tế bào tự do và chế phẩm cố định ở thời điểm saulên men 12h, tốc d fed-batch là 4Oml/h - :-c-t+e St e3 SE SE EESEEeESEEeEreErereerersed 54D thi 3.7.H m lượng L-lysine qua các lần tái sử dung chế phẩm cố định 55

TONG QUAN

TAI LIEU

MO DAUL-lysine là một trong 9 amino acid cần thiết mà co thé người va động vậtkhông thé tự tong hợp được mà phải nhận từ nguồn bồ sung bên ngoài L-lysineđược ứng dụng rộng rãi trong thực phẩm và duoc phẩm như bổ sung vào thức ăn gia

s c, gia cầm, khâu phan ăn của trẻ em, phô biến hơn cả là bố su ng vao các thựcphẩm chức năng

L-lysine được tổng hợp bằng các phương pháp hóa học và sinh học như táchchiết từ dịch thủy phân protein động vật , thực vật và lên men vi sinh vat Trong đóphương pháp lên men vi sinh vật có nh iều ưu điểm hơn như kiểm soát được qua

tr nh sản xuất, hiệu suất thu hồi cao , khắc phục được nhiều nhược điểm của phương

ph ph ahọc, gi th nh sản phẩm đã giảm đi rất nhiều , do đó phương pháp này dathay thế hoàn toàn phương pháp hóa học va được sản xuất theo quy mô côngnghiệp Vi sinh vật chuyên dùng để sản xuất L -lysine là Corynebacteriumglutamicum (C glutamicum) (Nguyén Đức Lượng, 2006)

Trên thế giới L -lysine đã được đưa vào sản xuất công nghiệp _ với nhu causản phẩm ng yc ng tăng mạnh Tại Việt Nam, nhu cầu sử dụng L-lysine trong thứcăn chăn nuôi v thực phẩm cho người ng y c ng cao, song lượng L-lysine hoàn toànđược nhập khẩu từ nước ngoài M t số nghiên cứu trong nước của H Sưởng

(1980), Nguyễn Thùy Châu và cs (2006), Nguyễn Duy Lâm và cs (2008), Nguyễn

Th y Hương v Trần Thị Minh Tâm (2009) với sản lượng từ 15 -35 g/L Tuy nhiên,có rat ít nghiên cứu hoàn chỉnh quy tr nh lên men dé đưa v o sản xuất công nghiệp,

ngoài nhà máy VEDAN (công nghệ lên men nhập từ nước ngoài, L-lysine được sản

xuất ra tập trung cho xuất khẩu) Nhăm tiến tới quá trình sản xuất L-lysine r ng rãiở quy mô công nghiệp phục vụ nhu cau trong nước cũng như xuất khâu chúng tôitiến hành nghiên cứu dé tài “Khảo sát các phương pháp lên men để thu nhận L-lysine bang chế pham cô định Corynebacterium glutamicum ”

Nội dung chính của đề tài:1 Khảo sát giống vi sinh vật.2 Có định tế bào Corynebacterium glutamicum trên chất mang Alginate.3 Lên men fed-batch liên tục với tế bào tự do và chế phẩm cô định

1.1 VIKHUAN CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM1.1.1 Lich sử phát triển và phân loại

Cuối thế k XIX, Lehmann v Neumann (1896) đã tm ra giốngCorynebacterium Đến gia thé k XX, Kinoshita va cs (1957) mới tim ra chính

danh loài Glutamicum với tên gọi trước đây | Micrococcus glutamicus — m t loàivi khuân sinh lượng lớn amino acid.

Theo khóa phân loại Stackebrandt va cs (1997), Corynebacteriumglutamicum thu c:

Gidi: BacteriaLop: ActinobacteriaPhan lớp: ActinobacteridaeB : Actinomycetales

Phân b : CorynebacterineaeHọ: Corynebacteriaceae

Giỗng: Corynebacterium

Loài: Corynebacterium glutamicum (Stackebrandt và cs., 1997).

1.1.2 Đặc điểm của vi khuẩn Coryebacterium glutamicum

Coryebacterium glutamicum là vi khuẩn Gram (+), hình que ng n, không did ng, là vi khuẩn hiếu khí, vách tế bào chứa acid mycolic và arabino-galactan chứa26-36C Thanh phan G và C trong DNA của vi khuẩn Corynebacterium glutamicum

khoang 54,1% (Eggeling Lothar va cs., 2001; Pfefferle Walter va cs., 2003).

Trong qu trnh sinh trưởng Corynebacteria cần bỗ sung các ngu n dinhdư ng cơ bản như carbon, nito, c c kho ng chất cần thiết, là vi khuẩn phát triển trên

môi trường giàu biotine (vitamin H) Corynebacteria có giới hạn nhiệt đ r ng từ

20°C — 40°C, đa số sinh trưởng tốt ở 28°C — 30°C trên môi trường chuẩn DSMZ

(Duetsche Sammlung von Mikioorganismen und Zellkulturen GmbH) bao g m: 1%peptone, 0,5% yeast extract, 2% glucose, 0,5% NaCl ở pH 7.2 - 74.

Corynebacterium glutamicum là vi khuẩn quan trọng trong công nghiệp,chuyên sử dụng dé lên men thu nhận acid glutamic va amino acid lysine Trong quátrình lên men cần bồ sung lượng biotine, thiamine ho c acid p-amino benzoic sựt ch Itty san pham bậc hai được cải thiện (Lothar Eggeling và Michael Bott, 2005).1.1.3 Đặc điểm di truyền của vi khuẩn Coryebacterium glutamicum

B gen di truyền C.glutamicum được xác minh vào gi a thập niên 80 thế kXIX Các nhà khoa học đã t m thấy rất nhiều gen tham gia trong chu trình sản xuấtamino acid v đã nhân d ng, phân t ch vai tr của c c gen liên quan đến năng suấtthu nhận amino acid Vi khuẩn C.glutamicum mang vật chat di truyền cấp đ phântử là DNA, dạng vòng, k ch thước 3.282 kbp,t lệ GC là 53% Nhiều plasmid dạngvòng hay thang được tạo ra từ chủng n y như pCG2, pCG4, pCGR1, pAGI1, pAG2,

pAG3, pXZ10142, pXZ10145.1, pAM30, pSR1, pTET3 (Lothar Eggeling và cs.,2005; Pfefferle Walter va cs 2003).

1.1.4 Sự chuyển hóa vật chất trong Coryebacterium glutamicum

Nhờ vào sự hấp thụ của tế bao, glucose chuyền thành glucose-6-phosphat khitiêu thụ phosphoenolpyruvate (hệ thông vận chuyển phospho), trong khi đ sucroselại biến đối thành glucose-6-phosphat va fructose dưới tác dụng của enzymeinvertase và hệ thong vận chuyển phospho Glucose được x e t c theo con đườngEMP và pentose phosphate Trong suốt quá trình phân giải glucose thì glucose-6-isomerase và glucose-6-phosphat dehydrogenase làm chất nền cho glucose-6-phosphat, kết quả là thành fructose-6-phosphate ho c 6-phosphogluconolactone

Phần oxy hóa của chu trình pentose phosphate làm biến đổi phosphate thành ribulose-5-phosphate, cung cấp tương đương trong hình thànhNADH Chu tr nh pentose phosphate, pentose, hexose v triophosphat được biếnđổi qua lại | n nhau 5-phosphoribosyl-l-pyrophosphate (pentose phosphate) đượcđ i hỏi trong tổng hợp sinh của nucleotide và như là m t tién chất của m t amino

glucose-6-acid thơm và L-histidine Hoạt tính NADPH bị làm giảm bớt trong chu id ng hóa

trong khi bốn phân tử của NADPH được tiêu thụ trong chu i sinh học tổng hợp m t

phân tử lysine từ acid oxalacetic Vi vay, dòng carbon hướng tới oxaloacetate

(OAA) gi nguyên tình trạng rỗi loạn của hệ thống

Pyruvate carboxykinase (PEP carboxykinase), phosphoenol pyruvate

carboxylase v pyruvate carboxylase đã được tim thấy như enzyme anaplerotic, nó

xúc tac phan ứng thêm m t mol CO, vào pyruvate va phosphoenol pyruvate, hoàn

thành chu trình TCA với oxaloacetic acid (OAA)v đ ng vai tr cung cấp acidaspartic dé sau đ h nh th nh lysine, threonine, isoleucine( được hình thành từ acidaspartic) thông qua tiến tr nh trao đổi chat và trong sản xuất amino acid từ nh ngacid h u cơ của chu trình TCA (chang hạn như acid glutamic, glutamine, praline,

arginine, citrulline, ornithine, ).

Con đường tong hợp lysine b t đầu với L-aspartate, chất được tổng hop băngcách chuyển hóa oxaloacetate, Corynebacterium glutamicum có khả năng biễn đôi

L-lysine trung gian qua piperidine 2,6- dicarboxylate thành diaminopimelate thông

qua hai tuyến đường khác nhau băng nh ng phản ứng ảnh hưởng tới succinylateho c bang nh ng phản ứng đơn của diaminopimelate dehydrogenase.

M tcách tổng qu t, d ng carbon v o được điều hòa bởi hai điểm: điểm thứnhất, thông qua khả năng ức chế ngược của aspartate kinase đối với mức đ tạo L-threonine và L-lysine và điểm thứ hai, thông qua kiểm soát mức đ tổng hợp

| asd va operon dapB

L-Aspartate B-semialdehyde » Homoserine

Hình 1 2 Quy trình chuyền hóa các chat trong C glutamicum sinh amino acid

L-lysine (Burkovski Andreas va Kramer, 1991).

Dựa trên quy trình nay, nhiều nhà khoa hoc như Burkovski (2002), Eggeling

(2005), Kramer R (1994), Cremer (1991) đã nhân d ng, phân t ch c c gen asp,

lys (lysC, lysE, lysA), asd, hom, dap (dapA, dapB) va nhiéu gen khac nhăm mụcđ ch tạo chủng vi khuẩn siêu sản xuất amino acid ở quy mô công nghiệp (Burkovski

Andreas va Kramer, 1991 ; Eggeling Lothar va Sahm Hermann, 2001).

1.2 AMINO ACID LYSINE1.2.1 Giới thiệu

Amino acid lysine thu c lớp aspartate nam trong ho oxaloacetate Codon mãhóa là AAA va AAG Lysine la m t trong số amino acid m cơ thể ngudiv d ngvật không tự tong hợp được mà phải nhận từ ngu n bo sung bên ngoài Lysine cóhai dạng d ng phân (L-lysine và D-lysine), nhưng hoạt tính sinh học chỉ biểu hiện ở

dạng đ ng phan L-lysine mới có giá tri dinh dư ng với người v d ng vật L-lysine

duoc ứng dụng r ng rãi trong nhiều lĩnh vực, bố sung vào thức ăn gia s cl m tăngchất lượng và sản lượng thịt của đ ng vật nuôi Trong dược phẩm, L-lysine sử dụngnhư m t chất dinh dư ng kích thích sự ngon miệng, chống nhiễm trùng máu, giảmstress Trong thực phẩm, L-lysine là chất bố sung làm giàu thực phẩm, nâng caochất lượng hạt (lúa mi, b p, gạo) Trong công nghiệp, L-lysine được sản sinh từ quátrình lên men vi sinh vat chủ yếu là nhóm Corynebateria ho c thu nhận từ dịch thủy

phân protein đ ng vật, thực vật (Imaizumi A và cs., 2005).

Trên thé giới, L-lysine được sản xuất từ đầu thé k 20 Nhật bản dic 50năm sản xuất L-lysine và áp dụng ở quy mô công nghiệp, chủ yếu hai nhà máy lớnKiowa Hakko và Ajinamoto Ở Pháp có nhà máy Eurolysine và nhiều nhà máy sảnxuất L-lysine kh c đ tớc c nước như Mỹ, Tây Ban Nha, Nga Ở Việt Nam, nhucầu sử dung L-lysine cho thực phẩm con người và thức ăn chăn nuôi tăng nhanhch ng, nhưng ho n to n nhập khẩu từ nước ngoài, có m t số nghiên cứu ở quy môphòng thí nghiệm về L-lysine từ vi khuẩn như H Sưởng (1980), Vũ Kim Thoa(2003), Nguyễn Thùy Châu và cs (2006), Nguyễn Duy Lâm và Trần Thị Mai(2008), Trần Thị Minh Tâm (2009), sản lượng L-lysine đạt được nằm trong khoảng15 — 30 g/l Tuy nhiên, rất ít nghiên cứu hoàn chỉnh về quy trình sản xuất L-lysine

Xu hướng chung c c nước sử dụng các chủng có hoạt tính cao và ứng dụng

để sản xuất amino acid đều là các chủng dt biến Dc biệt, các chủngC.glutamicum có khả năng ph t triển tốt trong môi trường giàu ngu n carbon, ítngu n nitơ Do mat cân bằng gi a qu tr nh trao đối chat carbon v d ngh anito

d n đến sự hình thành amino acid với sô lượng lớn so với nhu câu của tê bào và tích

lũy ở tế b o hay tho t ra ngo i môi trường Hiện tượng này gọi là siêu tổng hợpamino acid của vi sinh vật và thường do t c đ ng của con người bằng phương ph pđ t bién gen.

1.2.2 Đặc điểm

Lysine có công thức phân tử là C¿H¡xNzOzs, khối lượng phân tử 146.9 g/mol,thu e nhóm amino acid có gốc R kiềm, ở dạng dung dich lysine làm quỳ tím hóaxanh, phenoltalein hóa h ng Lysine tao màu xanh tím khi g p thuốc thử Ninhydrinvà hap thu mạnh ở bước sóng 515 nm — 570 nm (Vũ Kim Thoa v_ cs., 2003)

NH,

5 ân

HC“ ”?”

P buH.cZ 2Ÿ

Hà Aor

Hình 1 3 Công thức cầu tạo của lysine (internet).1.2.3 Sinh tổng hop L-lysine

1.2.3.1 Cum gen sinh tong hop L-lysine

Lysine được thu từ nh ng chủng vi khuẩn có kha năng san sinh acid

aspartate và chu i gen như h nh 1.5 Gen lysC sản sinh enzyme aspartokinase, gen

asd sản sinh aspartate semi-dehyde dehydrogenase Hai enzyme này gây ức chế

ngược phản ứng tạo thành lysine M t chu i gen dapA, dapB, ddh san sinh các

enzyme tham gia chu trình Dihydrodipicolinate xảy ra bên trong tế bào Nhờ

enzyme /ysA sinh Diaminopimelate decarboxylase thủy phan D, L —

Diaminopimelate tao lysine bên trong tế bào Cudi cùng lysine bên trong tế bàođược giải phóng ra ngoài nhờ gen lysE tiết enzyme permease (Eggeling Lothar và

Michael Bott, 2005).

lysC, asd dapA, dapB ddh (dapC, lysA Lysine | lysE Lysine

dapD, dapE, cellular external

Hinh 1 4 Cum gen sinh tong hop lysine (Eggeling Lothar va Michael Bott, 2005).1.2.3.2 Qua trình tổng hợp và điều hòa sinh amino acid lysine

Qu_ tr nh điều hòa tổng hop amino acid được điều h a theo cơ chế feedback.Sản phẩm cuối cùng của quá trình ức chế lại enzyme xúc tác cho phản ứng đầu tiên;c c enzyme n y thường là enzyme dị lập thé và sản phẩm của quá trình ở n ng đcao đ ng vaitr 1 các chất ức chế dị lập thé Trong các tế bào phát triển thì sự tổnghop amino acid không chỉ là sự tổng hợp c c amino acid đơn lẻ mà nó còn tổng hợpamino acid cho tong hợp protein Sự phối hợp nhịp nhàng gi a quá trình sinh tonghợp amino acid và quá trình sinh tổng hợp protein là yếu tố làm cho tế bào vi khuẩnphát triển nhanh Quá trình sinh tổng hợp amino acid có thé qua nhiều bước trunggian Các chất trung gian n y đ ng vai tr ức chế ngược theo từng ch ng v_ điềuhòa này goil điều h a theo cơ chế feedback kế tiếp nhau (Nguyễn Đức Luong,

2006).

L-lysine chỉ điều chỉnh ngược enzyme aspartokinase mà không ức chế ngượcenzyme dihydropicolinate synthase Enzyme aspartokinase chịu ức chế ngược củaL-lysine và threonine Enzyme homoserine dehydrogenase chịu ức chế ngược củathreonine Ở chủng hoang dai L-lysine và threonine cùng gây ra m t sự ức chế phốihợp đối với aspartokinase Do khuyết homoserine dehydrogenase mà không có sựtạo thành threonine Dihydropicolinate synthase không m n cảm dị lập thể Kết quảlà sự ức chế bởi sản phẩm cuối cùng bị triệt tiêu và có sự tông hop L-lysine(Nguyễn Đức Lượng, 2006)

Quá trình sinh tổng hợp Iysine chịu ảnh hưởng chủ yếu do aspatokinase vàaspartate semialdehyde dehydrogenase Meso-diaminopimelate là m t chất trunggian của quá trình tong hợp lysine, nó là m t cau trúc thiết yếu trong cau trúc thànhtế bào Corynebacteria, các enzyme dùng cho sự hợp nhất meso-DAP vàopeptidoglucan cũng c thé ảnh hưởng đến nhóm diaminopimelate va lysine Cuốicùng, m t yếu tố thiết yếu trong việc sản xuất lysine có hiệu quả đ 1 c c sản phẩmbài tiết của Corynebacteria, điều này làm cho Corynebacteria đ c biệt thích hopcho các ứng dụng công nghiệp Thuận lợi khác của Corynebacferia trong sản xuấtacid amin công nghiệp là không có sự phân hủy nhiều acid amin Ví dụ, không cóenzyme lysine decarboxylase (enzyme này có ở E.coli) hay bat kỳ enzyme phân hủylysine n o được tìm thay ở Corynebacteria Điểm thứ ba, tạo thuận lợi rat lớn trongviệc thiết kế các chủng đ t biến để sử dụng như là các chủng siêu sản xuất acidamin, d | việc diéuh acon đường sinh tong hợp lysine.

Các hiệu ứng ức chế ngược được phối hợp bởi lysine va threonine có ảnhhưởng trên enzyme dau tiên d 1 aspartokinase Ngo i ra, enzyme đầu tiên củanhánh threonine là homoserin dehydrogenase bị ức chế bởi threonine và quá trìnhtong hop threonine bi ức chế bởi methionine Sự hiện diện của c c đ ng enzymetrong Corynebacterium glutamicum cũng 1 m t hiện tượng bất thường Vi dụ nhưlà cả B.subtilis và E.coli déuc 3 đ ng enzyme của aspartokinase, hai trong ba đ ng

enzyme n y được dung hợp với đ ng enzyme homoserine dehydrogenase trong cácchủng về sau.

Việc siêu sản xuât lysine có thê được thu nhận băng c ch ngăn ch n hiệu ứngức chê ngược aspartokinase Sau d , c c mức đ enzyme riêng lẻ có thê được giatăng băng cách khuéch dai hay siêu biêu hiện các gen quan trọng trong con đường

sinh tong hợp

Nói chung, có hai phương ph p kh c nhau dé ngăn ch n sự ức chế ngược đốivới aspartokinase M_ t phương pháp là chọn lọc cho các thé đ t biến khuyết dư nghomoserine Các thé khuyết dư ng này có thể được cấy trong môi trường có sự hiệndiện m t lượng homoserine được kiểm soát và môi trường này phải duy trì n ng đ

threonine đủ thấp dé ngăn cản hiệu ứng ức chế ngược Vì thế, bang c ch ngăn cảncả hai tác nhân ức chế của aspartokinase và loại bỏ aspartate semialdehyde ra khỏicon đường sinh tổng hop, năng suất lysine đ ng kế có thé được thu nhận Phươngpháp thứ hai có liên quan tới việc sử dụng c c đ ng đăng acid amin dé chọn lọc cácchủng đ t biến có aspartokinase không nhạy cảm với tác nhân ức chế ngược Ð ngđăng cua lysine được sử dụng r ng rai là S-(-2-aminoethyl-)-L-systeine (AEC) Khichất này kết hợp với threonine sẽ gây chết đối với C.glutamicum hoang dại Cácchủng đ t biến kháng AEC thường cho thay aspartokinase không bị ức chế v năngsuất Iysine lên tới 30 g/L.

Để tạo d nge cgenc_ liên quan đến quá trình sinh tong hop lysine, có bac ch sau dé thực hiện:

e Phuong ph p đầu tiên liên quan đến sự bố trợ của các thể đ t biến khuyếtdư ng E.coli Các gen sau đây c thể được tạo dòng: các gen mã hóa cho

dihydrodipicolinate synthase và dihydrodipicolinate reductase (dapA, dapB), diaminopimelate dehydrogenase (ddh), diaminopimelate decarboxylase (lysA).M c

meso-dù gen ddh chỉ định rõ hoạt tinh enzyme không có ở E.coli, các thé đ t biến dapDcủa E.coli được bố trợ thành công bằng cách thêm gen ddh, giúp hình thành nênm t con đường thay thế khác cho quá trình sinh tong hợp meso-DAP

e Phương pháp thứ hai đ 1 tạo dòng các gen kháng AEC từ các thể đ t biếnvào C.giufamicum dạng hoang dại Băng việc sử dụng cách tiếp cận này, các genmã hóa cho aspartokinase có kha năng kh ng AEC (lysC ””®) và các gen mã hóa

cho aspartate semialdehyde dehydrogenase (asd) (gen n y được định vi ở vi trí xuôi

dòng với gen lysC) đã được tạo d ng Dé phân tách gen aspartokinase ra khỏiCorynebacterium glutamicum hoang đại, gen asd n y được sử dung dé bồ sung chochủng d t biến asd của E.coli, băng cách nay d n tới việc hiện diện cả nhóm gen

lysC-asd.e Phương pháp thứ ba là tao dòng gen ma hóa cho sự chuyên cho lysine.

Lysine v AEC được vận chuyển vào tế bào bằng cùng m t hệ thống vận chuyền.Bang cách này, các thé đ t biến thiếu kha năng hấp thu lysine/AEC 1 đ t biến

kháng AEC, nhưng đ t biến này có thé được chuyển lại thành nhạy cảm với AECbang cách tạo dòng gen hấp thụ lysine dạng hoang dại Tuy nhiên, gen được taodòng chịu trách nhiệm về việc hấp thụ lysine không tham gia vào cơ chế tiết lysine

đ c hiệu.

Trong số các gen tong hợp lysine được tạo d ng cho đến nay, chỉ có lysC vaasd được tìm thấy năm cạnh nhau trong nhiễm s c thé của Corynebacteriumglutamicum Câu trúc của con đường sinh tổng hợp lysine đã được phân tách bangcách sử dụng phương ph p gây đứt gấy gen và thay thế gen Các gen dapA, ddh,lysA đã được chọn làm mục tiêu để gây đứt gấy gen bang cách sử dụng c c đoạnDNA n i sinh Như dự tính, các thể đ t biến g n xen /ys4 là dạng khuyết dư ngIysine, không có sự hiện diện của thể đ t biến đapA Điều này hiển nhiên là do cácthê đ t biến n y không được bố sung m t cách hiệu quả bởi diaminopimelate ngoạisinh Các thé đ t biến ddh được thiết kế bởi các kỹ thuật đứt gãy gen cho thaykhông có d t biến khuyết dư ngnom x c định sự hiện diện của c c con đườngtong hợp thay thé hoàn toàn có chức năng cho việc hoàn thành meso-DAP và cả haicon đường ny đều tham gia vào quá trình sinh tổng hop lysine của

năng lượng cung cấp cho sinh tong hop lysine cũng như các hệ thống điều hòa n i

bào (Nguyễn Đức Lượng và cs., 2007)

Nhân tô quan trọng khác trong sản xuất amino acid là sự bài tiết Sinh vật thìkhông bài tiết amino acid, do có sự ức chế ngược hay k m hãm trong đ t biến bìnhthường không xảy ra trong tế bào Vi khuẩn C.glutamicum dùng sản xuất côngnghiệp amino acid cần biotine Thiếu hụt biotine d n đến sự tốn thương m ng té baov dưới điều kién n ib o amino acid được bài tiết Môi trường sử dụng để sản xuấtamino acid chứa day đủ biotine trong giai đoạn sinh trưởng, sau đ biotine bị thiếuhụt và bài tiết amino acid (Nguyễn Thùy Châu, 2006)

1.2.4 Lên men thu nhận L-lysine

1.2.4.1 Anh hưởng của thành phần dinh dưỡng

Ảnh hưởng của nguồn carbonThể đ t bién của Corynebacterium và giỗng vi sinh vật họ hàng có kha năngsản xuất các amino acid từ ngu n carbon băng cách lên men trực tiếp Cáccarbonhydrate được sử dụng riêng lẻ ho ch_n hợp trong sản xuất L-lysine bao g m

glucose, fructose, sucrose, mat ri (chứa ca glucose, fructose, sucrose, v.V ),maltose, thủy phân tinh b t, thủy phan cellulose, acid h u co như acid acetic,propionic, benzoic, fomic, malic, citric, fumaric, c n nhu ethanol, propanol,

glycerol, hydrocarbon, tinh dau và chất béo như dau hat dau nành, tir hoa hướngdương, đậu ph ng, dau dừa cũng như acid béo như palmitic, stearic, linoleic

(Anastassiadis Savas, 2007).

Khi n ng d_ glucose cao sẽ ức chế tốc đ phát triển của vi sinh vật, d ngthời làm hiệu suất lên men thấp Khi tiến hành m t cu c khảo sát bố sung từ 6% đến12% glucose thì nhận thấy 6n ng đ 10%, L-lysine đạt cao nhất Trong lên mentheo mẻ, tốc đ sản xuất cao nhất ở 65g/L glucose (Haleem Shah Abdul và cs.,

2002).

Ảnh hưởng của nguồn nitoCung cấp phong phú ngu n nito phù hợp thì rất thiết yếu trong lên men L-lysine bởi vi phân tử này chứa 19,16% nitơ C ¢ muối amonium, chăng hạn nhưmuối amonium clorua, amonium sulphate thường dễ d ng đ ng h a Lượng L-lysine được t ch lũy cao nhất ởn ng đ amonium sulphate 2,5% Hơn 2,5% sẽ ứcchế tốc đ phát triển (Haleem Shah Abdul và cs., 2002).

Ảnh hưởng của canxi carbonateTrong tiến tr nh lên men, pH môi trường giảm dan do sự t ch lũy của acidpyruvic, acid lactic, acid gluconic, kết quả là vi sinh vật sẽ ngừng phát triển, đ ngthời làm giảm hiệu suất lên men Khi pH giảm đ t ng t, lượng L-lysine giảmkhoảng m t nửa Bên cạnh đ ,pHI m t trong nh ng yếu tô quan trọng nhất ảnhhưởng đến sự nhân giống Khi thành phần dinh dư ng được tiêu thụ và biến đổithành sản phẩm trong suốt quá trình lên men, pH thay đổi ghi nhận sự v ng m t củahệ thống kiểm so t Để duy trì pH tối ưu, chất phản ứng như canxi carbonate phảiđược thêm v o môi trường ở thời điểm b t đầu lên men Vì thế, canxi carbonatehoạt đ ng như yếu tổ đ ng lực t c đ ng từ bên trong Có m t nghiên cứu cho rangm c dù pH môi trường được kiểm soát tự đ ng bằng NH; nhưng v n cần thêm vàom t lượng nhỏ CaCO; vì ngoài tác dung là 6n định pH, nó còn góp phan rút ng n

thời gian lên men (Haleem Shah Abdul và cs., 2002).

Ảnh hưởng của thiamine va biotine

Young v Chipley (1984) đã nghiên cứu vai trò của biotine trong quá trình

sinh tong hợp L-lysine và nhận thay rang biotine giúp tế bào hap thu nhiều glucosehơn do biotine gây ram tv i thay đổi về thành phan cau tạo trên màng tế bào, chophép tế bào gia tăng khả năng hấp thu glucose

Khi tiến hành khảo sát từ 1-30zg/100ml biotine thì thấy ở n ng đ5„g/100ml, sinh khối tế b o tăng 15yg/100ml Tương tự ở n ng d 5zg/100mlthiamine, sinh khối tế b o gia tăng 20ug/100ml, hiệu suất lysine đạt cao nhất

(Haleem Shah Abdul và cs., 2002).

Ảnh hướng cia KH;PO¿ và những muối khoáng khácKhi sử dụng c e môi trường thiên nhiên dé nuôi cấy vi sinh vật thì không cầnthiết bố sung các nguyên tô kho ng Ngược lại, khi l mc c môi trường tổng hợp(dùng nguyên liệu là hóa chất) b t bu c phải b6 sung đủ các nguyên tô khoáng canthiết H m lượng các chất khoáng chứa trong nguyên sinh chất vi sinh vật thườngthay đối tùy lo i, tùy giai đoạn phát triển v tùy điều kiện nuôi cấy (Nguyễn Lân

Dũng và cs., 2000).

Phospho bao giờ cũng chiếm t lệ cao nhất trong số các nguyên tố khoángcủa tế bào vi sinh vật P có m t trong cau tạo của nhiều thành phan quan trọng củatế bào, cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp các nucleic acid va adenosinetriphosphate (ATP) -là m t hợp chất cực ky quan trọng trong việc t ntr và chuyểnđổi năng lượng Việc bổ sung phosphate (nhất là phosphate kali) vào các môitrường dinh dư ng, ngoài tác dụng cung cấp P còn có tác dụng tạo ra t nh đệm củamôi trường Với các tỉ lệ thích hợp, muối KH>PO, và K;HPO¿ có thé tạo ra nh ngmức pH 6n định trong khoảng pH = 4,5 — 8,0 (Nguyễn Lân Dũng và cs., 2000;

Haleem Shah Abdul và cs., 2002).

Lưu huỳnh cũng | m t nguyên tố khoáng quan trọng trong tế bào vi sinhvật S không nh ng tham gia vào cấu trúc protein mà còn có vai trò quan trọng

trong các quá trình oxy hóa khử.

S t là nguyên tố rất cần thiết để giúp vi sinh vật có thể tong hợp m t số

enzyme loại pocphirin chứa s t (như xitocrom, xitocromoxidase, peroxidase, ).

Bên cạnh đ ,Mgl nguyên tô được vi sinh vật đ i hỏi cũng với lượng khá cao Mgmang tính chất của m t cofactor, chúng tham gia vào nhiều phản ứng enzyme cóliên quan đến các quá trình phosphoryl hóa (chuyển H3PO, từ m t hợp chat h u conày sang m t hợp chấth u cơ kh c) Mg “có thé làm hoạt hóa các enzyme oxy hóakhử của chu trình Krebs, có vai trò quan trọng trong việc làm liên kết các tiéu phan

ribosome với nhau (Nguyễn Lần Dũng và cs., 2000; Haleem Shah Abdul và cs.,

2002).

Kali là nguyên tổ chiếm m tt lệ khá cao trong thành phân khoáng của tếbào vi sinh vật, nhưng cho đến nay người ta chưa thấy kali tham gia vào bất kìthành phần nào của nguyên sinh chất, cũng chưa tm thấy bất kỳ enzyme nào cóchứa K Kali thường t n tại dưới dạng ion K* ở m t ngoài của cau trúc tế bào

(Nguyễn Lân Dũng và cs., 2000)

Tuy nhiên, sự có m t của các nguyên tố kho ng không như nhau trong tế bàovi sinh vật, có nh ng nguyên tô khoáng mà vi sinh vật đ i hỏi phải được cung cấpvới liều lượng lớn nhưng cũng c nh ng nguyên tô mà vi sinh vật chỉ đ i hỏi vớilượng rất nhỏ, có khi chỉ ở dạng vết bởi vì sự t n tại m te ch dư thừa các nguyêntố khoáng là không cân thiết và có thể d n đến nh ng ảnh hưởng xấu Có m tnghiên cứu cho thấy rang khi h m lượng KH;PO¿ ở 0,1g/100mL; sản lượng L-lysine đạt cao nhất Trên 0,1g thì hiệu suất lên men sẽ giảm M c dù KCI và NaClkhông ảnh hưởng sâu s c đến lên men nhưng năng suất sẽ giảm nh nếu KCl đượcthêm v o hơn 10mg/100mL Bên cạnh d , L-lysine được sinh tong hop nhiéu khi

h m lượng MgSO, 1 50mg/100mL, h m lượng FeSO, va MnCl, là 0,2mg/100mL(Haleem Shah Abdul va cs., 2002).

Anh hướng của bactocasamino acid

Bactocasamino acid chứa tất cả các amino acid cần thiết cho cả sinh vật sảnxuất L-lysine và sinh vật thé nguyên dư ng Bactocasamino acid cải thiện đ ng kếnăng suất L-lysine trong môi trường tong hợp Ở 0,5g/100mL bactocasamino acid,năng suất thu đạt được cực đại Ứng với n ng đ đ, L-lysine t ch lũy tăng đến

0,5g/100mL (Haleem Shah Abdul và cs., 2002; Pfefferle Walter và cs., 2003).

1.2.4.2 Anh hưởng của một số điều kiện ngoại cảnh

Ảnh hưởng của không khíOxy là m t thành phần dinh dư ng quan trọng, thường được cung cấp băngcách | c mạnh trên máy | c Trong điều kiện thiếu oxy, m t lượng lớn acid lactic và

acid succinic được t ch lũy, trong khid sự thừa mua oxy sé! m gia tang m t lượnglớn acid a-keto glutaric Nhu vậy, trong ca hai trường hợp quá phong phú hay qua

ngh o oxy đêu không được sản phầm như mong muôn do trước tiên ức chê sự pháttriên của tÊb ov saud | ức chê khả năng sản xuât L-lysine Giới hạn về oxy đãlàm giảm tôc đ tiêu thụ chât nên cũng như khả năng chuyên đôi hiệu quả chât nênthành lysine (Haleem Shah Abdul và cs., 2002).

Ảnh hướng của chế độ lắcL c môi trường lỏng nhằm tăng tnh đ ng đều của các thành phần dinh

dư ngc trong môi trường lên men, d ng thời | m tăng khả năng h a tan của lượng

oxy hiện diện sẵn trong môi trường Trong bình | c, tiến hành khảo sát các chế đ| c từ 50 đến 300 vòng/ phút nhận thấy khả năng sản xuất L-lysine tăng nhanhch ngv sauđ giảm dan Năng suất lysine đạt cực đại ở chế đ 1 c 200 vòng/phút

(Haleem Shah Abdul và cs., 2002).

Ảnh hướng của tỷ lệ giốngHallaert va cs (1987) nghiên cứut lệ giỗng cho v o môi trường lên men vànhận thay răngt lệ giống có ảnh hưởng rõ rệt đến quá trình lên men Mật đ giốngban đầu cho vào nếu quá ít thì không tạo ra được lượng sinh khối như mong muốnv ngược lại khi mat đ giống ban đầu cho vào quá nhiều thì lại tạo ra lượng sinhkhối khá lớn, kết quả làm cạn kiệt thành phan dinh dư ng cần thiết cho lên men tạolysine Tiến hành khảo sát bồ sung từ 2 -14% mật đ giống ban đầu, nhận thay răngsản lượng lysine đạt cao nhất ở 10% (Haleem Shah Abdul và cs., 2002)

Ảnh hưởng của pHSự phát triển của vi sinh vật dé dàng bị ảnh hưởng bởi sự biến đổi Hơn n a,quá trình phát triển của vi sinh vật cũng | m thay đôi pH của môi trường Khi tiếnhành m t cu c khảo sát với các giá trị pH khác nhau từ 5 đến 9 (pH môi trườngđược điều chỉnh tới giá trị mong muốn bằng HCI 2M và NaOH 1M) nhận thấy răng

ở giá tri pH 7.5 th lượng L-lysine tao ra cực đại và kha năng sử dụng đường đạt cực

đại Ở trên hay dưới mức 7.5 thì khả năng sản xuất L-lysine và sử dụng đường đềugiảm Giá trị pH không chế hoạt tính vận chuyển và tốc đ_ bài tiết L-lysine Sự sinhtổng hợp L-lysine giảm rõ rệt ở pH thấp hơn 5.5 nhưng không hề có sự khác nhaurõ rệt trong khoảng pH từ 5.5 đến 8 (Haleem Shah Abdul và cs., 2002)

Ảnh hướng của nhiệt độTốc d phát triển của vi sinh vật phụ thu c vào nhiệt đ thông quam tchu icác phản ứng được s p xếp với nhau trong toànb_ quá trình chuyển hóa Rất quantrọng khi nhận ra rang sự thay doi nhiệt đ ảnh hưởng đến tốc d sử dụng m tho cm t vài hop chất khi so sánh với các hợp chất khác, d n đến sự mat cân bang Sựcạn kiệt sớm thành phan dinh dư ng then chốt có thé | m thay đổi môi trường từtrạng thái cân băng đến không cân bang M t cách rõ ràng, nhiệt đ phải được kiếmsoát nghiêm kh c Nhiệt d là m t trong nh ng thông số lên men chính ảnh hưởngtới sự phát triển của Corynebacterium glutamicum cũng như c ch b i tiết lysine.Nh ng khảo sát cho thay 29°C là nhiệt đ tối ưu cho cả tăng sinh khối và sản xuấtL-lysine Vượt trên 29°C, sinh khối và khả năng bài tiết L-lysine sẽ giảm (Haleem

Shah Abdul và cs., 2002).

1.2.4.3 Ky thuật lên men

Khi mục tiêu dau tiên của nghiên cứu lên men! hướng tới sản xuât các sảnphâm sinh học mang lại lợi nhuận thì việc phát triên phương ph p lên men cho phépsản xuât các sản pham mong muôn ở mức đ_ cao về năng suât và kha năng sản xuât

rat quan trọng (Lee leongseok và cs., 1999)

C ba mô hnh lên men được x c định, d | lên men theo mẻ, liên tục và lênmen fed-batch.

Trong tiên trình lên men theo mẻ, tat ca các chat dinh dư ng cân thiệt, ngoạitrừ sự hiệu chỉnh pH va oxy nêu trong điêu kiện hiệu kh đêu được cho vào môi

trường lên men trước khi b t đầu

Trong lên men liên tục,t n tại đ ng thời cả dòng vào va dòng ra sao cho thét ch môi trường trong bình phản ứng v n được duy tr không đối và tất cả các thànhphần định dư ng trong môi trường ở tại mọi thời điểm không đối (Minihane B J và

Brown D E, 1986).

Trong suốt quá trình lên men fed-batch, m t ho c nhiều chất dinh dư ng

được cung cap vào fermentor, trong khiđ tê bao và các sản phầm v n được duy trì

trong fermentor mãi cho đến khi kết thúc quá trình vận hành Lên men fed-batchđược ứng dụng m t cách r ng rãi trong sản xuất các sản phẩm sinh học đa dang baog m các sản phẩm trao đối bậc m t và bậc hai, protein và m t số polymer sinh học

khác Fed-batch nh n chung | vượt hơn lên men batch v đ c biệt có lợi khi thay

đổi n ngđ của nh ng chất dinh dư ng mà nó ảnh hưởng tới khả năng sản xuấtcũng như năng suất của sản phẩm mong muốn Xét cả hai khía cạnh: cung cấp dưthừa ho c thiếu chất dinh du ng đều tốn hại đến sự phát triển của tế bào và cáchhình thành sản phẩm Trong lên men fed-batch, sự dé ra c c phương thức bố sungthức ăn đ ng vaitr quyết dinh Nh ng chiến lược kh c nhau đã được phát triển đểkiểm soát n ng đ các chất dinh dư ng trong m t day tối ưu Sự phát triển m t hệthống kiểm soát lên men thì phức tạp do:

(i) Thiếu mô hình mô tả sự phát triển của tế bào và sự hình thành sản phẩm

thoi khí và tốc đ b6 sung chất nền Hau hết nh ng biến số n y đều được sử dụngkết hợp để x c định tốc đ b6 sung chất dinh dư ng trong suốt quá trình lên men

fed-batch (Lee leongseok và cs., 1999; Stanbury Peter F và cs., 2003).

Lên men fed-batch đầu tiên được thiết lập dựa trên mồ hình lên men theo mẻ,sau đ bố sung cơ chat theo m t trong nh ng cách sau:

i) Thành phan môi trường được thiết lập trong lên men theo mẻ được thêmvào, kết qual | m tăng thé t ch môi trường

(ii) Hoa tan chất nên bị giới hạn ở cùng n ng d_ ngay khi được thêm vào môitrường, kết quả | m tăng thể tích

(iii) Cô đ c chất nền bị giới hạn lại, thêm vào với t lệ t hon (i) v (ii), kết quảcũng | m tăng thé tích

(iv) Cô đ chơnn achat nên bị giới hạn và thêm vào với t lệ t hon (i), (ii) v(iii), kết qua làm thé tích tăng nhẹ

Hệ thống fed-batch áp dụng c ch (i), (ii) được mô tả ở thể t ch thay đối,ngược lại c ch (iv) được mô tả ở thé tích có định Cách (iii) ở dạng trung gian gi athể † ch thay đối và thé tích có định (Stanbury Peter F và cs., 2003)

Ứng dụng của lên men fed-batch:

Sử dụng lên men fed-batch trong lên men công nghiệp đem lại nhiều thuận

lợi như: n ngđ của chất nền giới hạn được duy trì ở mức d thấp, chính vì thế

tr nh được ảnh hưởng c xu hướng ức chế chất nên n ng đ cao Xa hơn n a, hệthống fed-batch giúp kiểm so t được tốc đ phát triển của vi sinh vật dễ d ng hơndo kiểm so t được nhu cầu về oxy trên fermentor Cả hệ thống thé tích cố định vàthé t ch thay đôi được đều dat được kết quả làn ngd của chất nền giới hạn thấpnhưng trạng thái cân băng bên của hệ thống thé t ch thay đổi được có nhiều ưu điểmhơn trong việc duy tr lượng sinh khối cũng như n ng đ của chất dinh dư ngkhông bị giới hạn ở trạng th i không đổi Theo Pirt (1979), đây | m tđ c điểmquan trọng bởi vin ngđ của chất nền không bị giới hạn có thé ảnh hưởng m tc ch đ ng kế thành phan sinh khối và cách tạo thành sản phẩm

13 COD NHTE BAO1.3.1 Dinh nghia

Cố định tế b oc nghial cc tế b o được gi lại hay định vi trong m t khuvực không gian nhất định mà ở đ cc tế bào v n gi được các tính chất xúc tácsinh học và có thể sử dụng nhiều lần

1.3.2 Phương pháp có định tế bào vi sinh vật1.3.2.1 Phân loại phương pháp cố định tế bào

Có nhiều cách phân loại phương ph p cô định tế bào Gordon (1997) đã liệtkê rất nhiều phương ph p cô định tế bào trên các chất mang phù hợp Trên nên tảngcủa Gordon (1997), chúng tôi phác họa c c phương ph p cố định tế b o dưới dạng

tri hop gel

Hình 1.6 Sod c c phương ph p cố định tế bao vi sinh vat (Gordon, 1997)

1.3.2.2 Chat mang cô định tế bào vi sinh vậta Chất mang vô co

Cau tr cÍ xốp, kch thước c cl c thể điều chỉnh được, c thé hấp thụ tốt€ c enzym v té b o Nhu vat liéu thuy tinh xốp, c € oxit kim loại (nhôm oxit,mangan oxit, magie oxit, titan oxit), diatomit (celit) v gốm

b Chất mang hữu cơ

Polymer tổng hợp: polystyren, polyacrylamid, polyvinylacetate,polyvinylalcol, polyacrylic dùng cô định enzym v tế b o bang phương ph p nhốttrong | ng chất mang

c Chỉ tiêu đánh giá hiệu qua cô định tế bào

Khả năng sống sót của tế bào trong chất mang : lượng tế bào còn sống sót vàhoạt d ng sau m t thời gian nhất định ; khả năng chuyển h a cơ chất và thành phandinh dư ng div o; sản phẩm trao đối chất đi ra

DP bền cơ học của chất mang : sức chịu đựng của chất mang ở pH, nhiệt đ ,

lực t c đ ng của môi trường, của lực khuấy và lực thôi của không kh đưa v o môitrường nuôi cay vi sinh vật

Kha năng bảo vệ vi sinh vật trong chất mang t nh đến yếu tố bất lợi với điềukiện ngoại cảnh.

Khả năng tái sử dụng nhiêu lần, quá trình sản xuất liên tục vi sinh vật không

bị rửa trồi.

1.3.3 Chất mang Alginate1.3.3.1 Cấu tạo

Alginate là m t polymer mach thắng g m hai loại monomer:

1,4-B-D-mannuronic acid (M) va ơ-L-guluronic acid (G) Alginate duoc hình thành từ sự

liên kết gi a các monomer ở vị trí C-1 và C-4 Mach polymer g m ba khối : G, M,MG Vi trí, số lượng, tương quan của các khối này tùy thu c vào ngu n gốc của

pH của dung dich: pH > 11 Alginate bị khử polymer hóa làm giảm đ_ nhớt.

pH ~ 5.5 đ nhớt Alginate tăng ; pH tiếp tục giảm (3 — 4) chúng sẽ tạo thành gel.Tuy nhiên, lượng thừa Ca** trong dung dịch Alginate th gel đông đ c ở pH gầnbăng 5 (Cheetham và cs., 2004)

Kha năng tao gel: khi kết hop Alginate với cation hóa trị II, HI thườngdùng Ca”” sẽ xuất hiện cầu nối gi a các phân tu Alginate và tao gel theo hình « h p

trứng », gel này hình thành ở nhiệt đ phòng và không tan chảy khi bi nung nóng.

Dung dich Alginate cũng h nh th nh gel khi bi acid h a nhưng gel n y mềm hơn gelcalcium Cơ chế tạo hình «h p trứng » : do chu i phân tử Alginate cau tạo từ cácđơn vị acid guluronic có cấu trúc nếp gấp và khe hở mà Ca” có thể chui v o, địnhvị và liên kết lon CaTM* gi các chu i Alginate hình thành liên kết calcium Alginate

ch c hơn (Cheetham và cs., 2004).

1.3.3.3 Phuong pháp cố định tế bào trên chất mang Alginate

Dùng phương ph p b y tế bào trong lòng chất mang H n hợp huyền phù tếbào vi sinh vật và chất mang Alginate được nhỏ vào dung dịch đệm CaTM* dé thựchiện phản ứng tạo gel Nhờ phản ứng này tế bào vi sinh vật được cô định trong hệthống mạng lưới (Cheetham và cs., 2004)

1.4 CÁC NGHIÊN CUU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC LIEN QUAN DEN

DE TAI

1.4.1 Những nghiên cứu trong nước

H Sưởng (1980 — 1985) đã sản xuất L-lysine từ chủng tự nhiên (không có

tên chi và loài) ở quy mô 5000L/mẻ với sản lượng 30 — 35 g/l.

Vũ Kim Thoa v_ cs (2003) đã phân lập từ 454 m u đất, thu thập từ nhiều nơikh ¢ nhau được 264 chủng Corynebacterium sp., nh m đã tuyến chọn được 23chủng Corynebacterium sp có khả năng sinh tổng hop L-lysine, trong đ c 2chủng Corynebacterium sp lys 73 và lys 86 có khả năng sinh tong hợp L-lysine caonhất đạt mức 28-30g/L trong điều kiện phòng thí nghiệm

Nguyễn Thùy Châu và cs (2006) cũng đã tiến hành phân lập các chủngCorynebacterium glutamicum có khả năng sinh tông hop L-lysine cao từ các m uđất ở Việt Nam, sau đó gây đ t biến bằng nitrosoguanidine dé thu được các thé đ tbiến dị dư ng với homoserine ký hiệu là CM24 có khả năng sinh tổng hợp L-lysinecao nhất nhóm tác giả đã hoàn thành quy trình sản xuất L-lysine băng cách lên menchìm sục khí với quy mô 501/mé, 1501/mẻ, 15001/mẻ Môi trường lên men g m (thé

tích | lit): 130g ri đường, 20g NH4Cl, 5g urease, 1g KH;PO¿, 04g MgSOx.7HO,10mg FeSOx.7H;O, 8mg MnSOx.4H;O, 10g đậu tương thủy phan, 0,lmg thiamine,

0.3mg biotine , pH ~ 7.0, t lệ giống 10% ,1 c 200 vòng/phút, dO, 100% , năngsuất thu được 30g/1

Nguyễn Duy Lâm và Trần Thị Mai (2008) nghiên cứu lên men thu L-lysine

từ Corynebacterium glutamicum với san lượng 28g/L.

Trần Thị Minh Tâm và Nguyễn Th y Huong (2009) sản xuất L-lysine bangcách lên men trên fermentor với thành phần môi trường (w/v): 20% dịch chiết b p;

$,35% glucose; 1,57mg/L_ biotine; 0,74% urea; 0,1% KH;PO,; 0,025%

MgSOu.7H;O; 4mg/L thiamine, 30 vòng/phút; pH 7, 28°C; khuấy dao 300vòng/phút; dOz=100%, năng suất thu được 32.6g/L

Tóm lại, nh ng nghiên cứu trong nước về lĩnh vực n y chưa nhiều, chủnggiống chưa đạt chuẩn Các nghiên cứu đều tiếp cận theo hướng phân lập, cải thiệnvà tuyển chọn chủng cho năng suất cao Kết quả nghiên cứu đã mở đường chohướng cải thiện chủng giống băng phương ph p đ t biến dị dư ng, tạo dòng gencũng như cải thiện môi trường lên men và chuẩn hóa quy trình v điều kiện lên men

cho chủng siên sản xuât L-lysine tiên gân với quy mồ sản xuât công nghiệp.1.4.2 Những nghiên cứu ngoài nước

Những nghiên cứu về giống và cải thiện chất lượng giong C.glutamicum

Tu năm 1956 nh khoa học Konishita phân lập chủng C glutamicum có kha

năng sinh acid glutamic lớn Kế từ đ h ng loạt nh ng nghiên cứu đã tạo ra khánhiều chủng vi sinh vật quan trọng có khả năng sinh amino acid n i chung v L-lysine nói riêng từ nhiều loại co chất rẻ tiền, dé kiếm Với m i cơ chất khác nhau cónhiều chủng giống san sinh L-lysine từ 10 — 100 g/L, ưu thé là nh ng chủng đ tbiến cho hiệu suất kh cao D c biệt, C.glutamicum v n là chủng vi khuẩn có khanăng sản sinh amino acid với hiệu suất thu h ¡ cao nhất và phù hợp với quy mô sảnxuất công nghiệp

Kinoshita và cs (1957) đã th nghiệm trên 175 chủng nam mốc, 468 chủngnắm men, 372 chủng xạ khuẩn và 650 chủng vi khuẩn, thay rang có 22% trong sốđ c khả năng sinh amino acid, t nhất là nắm mốc (10%), nhiều nhất là xạ khuẩn(30%) trung bình là vi khuẩn (20%) Tuy nhiên hiệu suất lên men chi dat 1 — 2 g/l,riêng C glutamicum cho 30 g/l ở điều kiện tối ưu (Kutzner H và cs., 1991)

Năm 1991, Dieter J Reinscheid và cs gây đ t biến điểm định hướng trên

chủng C.glutamicum hom Gly378 gen G —> A (tại vi tr nucleotic 1133) (GGG —

GAG) Tác giả đã xác nhận chủng d t biến này gây ức chế ngược tao thành

L-threonine nên năng suất L-lysine đ ng kế được thu nhận Năm 2005, Ohnishi J gâyđ t biến điểm trên chủng C glutamicum ở vị trí Ser361 trên gen gnd thành Phe năngsuất lysine tăng lên 15% so với chủng gốc Năm 2006, Hayashi M và cs gây đ tbiến điểm trên gen iewC Gly456 — asp, hom 59, lysCT3111 của chủngC.glutamicum, sử dung operon lysC-asp năng suất thu nhận lysine tăng 14% so vớichủng gốc Năm 2007, Becker gây đ t biến điểm gen zwf (G6P dehydrogenase) ở vịtrí A243 trên chủng C glutamicum năng suất lysine tăng lên 70% so với chủng gốc.

Năm 2003, Ohnishi J và cs tạo được chung sinh trưởng ở nhiệtđ_ cao 40°C,năng suất lysine tăng lên 20% so với chủng gốc Ong xác minh ở nhiệt d này gengitA làm giảm sự biếu hiện citrate synthase, gen malE | m tăng sự biểu hiện yếu tổn y đ ng thời t i sinh pyruvate v NADPH, do đ năng suất lysine được tăng lên.Miroslav và cs (1994) thu được chủng C.giufamicưm tái t6 hợp cho năng suất tăng50% so với chủng gốc ở cùng điều kiện bằng cách khuếch đại 2 đoạn gen /euA

Năm 2006, Gunji Y và Yasueda H đã tiến hành chuyển gen iysE từ

Corynebacterium glutamicum vào Methylophilus methylotrophus AS1 kích thích

biểu hiện đ t biến dapA24 sẵn có trên Methylophilus methylotrophus kết qua chothay năng suất lysine được tăng lên đ ng kể

Năm 2007, Sindelar G và Wendisch VF đã tiễn hành nghiên cứu trên chủngC glutamicum bang kỹ thuật nhân dòng gen NCg10855 mã hóa methytransferase vasử dung operon amtA-ocd-soxA, năng suất lysine tăng lên 40%

Những nghiên cứu về môi trường lên men thu nhận L-lysine từ ching

Minato (2002), chỉ ra rang trong giới hạn 10 — 21% glucose trong môi trường

lên men chìm sục khí là phù hợp cho quá trình lên men thu nhận L-lysine Năm

2004, Patrick tiễn hành lên men fed-batch, ông khảo sát các ngu n carbon khácnhau glucose, mantose, fructose, sucrose, ethanol, benzoat, n-parafin, methanol kétquả khảo sát cho thay, trên cơ chat đường glucose hiệu suất thu h i lysine là caonhất Năm 2005, Georgi T và cs cũng cho thấy năng suất lysine tăng gấp đôi trêncơ chất đường glucose, ở ¢ e cơ chất khác không ảnh hưởng

Năm 2007, Tateno T và cs đã sử dụng cơ chất là tỉnh b t b p thô khảo sáthiệu suất lysine với quá trình lên men fed-batch và lên men liên tục Kết quả sảnlượng lysine tăng 2,5 lần ở nhiệt đ 34°C, 72 giờ lên men so với lên men theo mẻ,nhưng lợi thế là lên men fed-batch vì lên men liên tục dễ xảy ra tạp nhiễm

Tóm lại, các nghiên cứu trên thế giới về L-lysinekh phong ph v đa dạng.Các nhà khoa học đã xây dựng được chủng siêu sản xuất L-lysine bằng phươngpháp tạo d ng gen đa số từ chủng C.giufamicưm ATCC 13032 Ngoài ra, đã xâydựng được quy trình lên men chuẩn theo phương ph p lên men fed-batch, liên tụcphù hợp với quy mô công nghiệp đạt hiệu suất cao