Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Khảo sát sự tạo rễ bất định Catharanthus Roseus có khả năng tổng hợp Alkaloid

NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Khảo sát sự hình thành, tăng sinh rễ bất định Catharanthus roseus dừa cạn bằng cách khảo sát ảnh hưởng của các loại môi trường khoáng, loại và nồng độ auxin, mật

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐHQG TP HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học : PGS TS LÊ THỊ THỦY TIÊN Cán bộ chấm nhận xét 1 : PGS TS BÙI VĂN LỆ

Cán bộ chấm nhận xét 2 : TS HUỲNH NGỌC OANH Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày 16 tháng 01 năm 2015

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: 1 Chủ tịch Hội đồng: PGS TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG

2 Thư ký Hội đồng: PGS TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG

3 Ủy viên Phản biện 1: PGS TS BÙI VĂN LỆ

4 Ủy viên Phản biện 2: TS HUỲNH NGỌC OANH

5 Ủy viên Hội đồng: TS NGUYỄN TẤN TRUNG

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA KTHH

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Ngày, tháng, năm sinh: 26 / 04 / 1987 Nơi sinh: Tp Hồ Chí Minh

I TÊN ĐỀ TÀI: Khảo sát sự tạo rễ bất định Catharanthus roseus có khả năng tổng

hợp alkaloid

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Khảo sát sự hình thành, tăng sinh rễ bất định

Catharanthus roseus (dừa cạn) bằng cách khảo sát ảnh hưởng của các loại môi trường

khoáng, loại và nồng độ auxin, mật độ mẫu cấy ban đầu, và đánh giá khả năng sinh tổng hợp alkaloid của rễ bất định

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 20 / 01 / 2014 IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 14 / 11 / 2014

V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS TS LÊ THỊ THỦY TIÊN

LỜI CÁM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Lê Thị Thủy Tiên, cô đã tận tình hướng dẫn, định hướng, thức đêm sửa bài, góp ý và động viên tinh thần để tôi hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành gửi lời cám ơn đến cô PGS TS Nguyễn Thúy Hương đã tạo điều kiện cho tôi trong những phát sinh về việc bảo vệ đề cương đề tài, các thầy cô trong bộ môn đã trực phòng thí nghiệm đến khuya để giúp tôi và các bạn có điều kiện làm thí nghiệm nhiều hơn, bạn Phúc và các bạn, các em sinh viên khóa 2010 trong phòng thí nghiệm đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt thời gian làm luận văn Nếu không có những sự giúp đỡ này, tôi đã không thể hoàn thành luận văn

Cám ơn ba mẹ và anh Nguyễn Nhật Trường đã luôn bên cạnh tôi, hỗ trợ tài chính và động viên tinh thần giúp tôi vượt qua những khó khăn

Tôi xin chân thành cám ơn và gửi lời chúc sức khỏe, thành công và hạnh phúc đến tất cả mọi người

TP Hồ Chí Minh, tháng 01 năm 2015

Trương Quỳnh Như

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Các vật liệu thực vật gồm rễ mầm, thân mầm, lá mầm 14 ngày tuổi và lá của chồi

Catharanthus roseus (dừa cạn) in vitro 5 tuần tuổi được dùng làm nguyên liệu khởi tạo rễ

thứ cấp và rễ bất định trên môi trường rắn ½ MS bổ sung lần lượt hai loại auxin IBA, NAA nồng độ thay đổi 0,1; 0,3; 0,5; 0,7 và 1,0 mg/L Kết quả cho thấy sự tạo rễ xảy ra tốt

nhất trên lá mầm với IBA 0,7 mg/L và ở lá của chồi in vitro với IBA 0,7 mg/L hoặc NAA

0,5 mg/L Tỉ lệ mẫu cấy tạo rễ và số lượng rễ tạo thành trung bình trên mỗi mẫu tương ứng lần lượt là 100% và 19,23; 29,63; 30,87 rễ Rễ bất định có nguồn gốc từ lá mầm và lá

của chồi in vitro sau 25 ngày nuôi cấy trên môi trường cảm ứng được cấy vào môi trường

lỏng để tăng sinh Sự tăng sinh của rễ bất định trong môi trường lỏng chịu ảnh hưởng bởi nguồn gốc vật liệu, loại và nồng độ môi trường khoáng, loại và nồng độ auxin Rễ bất định hình thành từ lá mầm không thích hợp cho sự tăng sinh trong môi trường lỏng Các môi trường lỏng có nồng độ muối khoáng cao và auxin cao gây ra hiện tượng tạo thành mô sẹo ở rễ Việc giảm nồng độ muối khoáng xuống còn ¼ ( ¼ MS, ¼ B5) đồng thời giảm nồng độ của auxin bổ sung (IBA 0,3 mg/L; NAA 0,1 mg/L) cho sự phát triển của rễ xảy ra tốt nhất, sự hình thành mô sẹo giảm đi rõ rệt Trọng lượng rễ khởi đầu có ảnh hưởng đến sự tăng sinh rễ bất định trong môi trường lỏng Trọng lượng khởi đầu thích hợp được xác định là 0,3 g/ 20 ml môi trường Sự tăng sinh của rễ bất định dừa cạn trong môi trường lỏng ¼ MS bổ sung IBA 0,3 mg/L xảy ra chậm và đạt đến cuối giai đoạn tăng trưởng từ ngày thứ 28, với chỉ số tăng trưởng 3,94 Rễ bất định dừa cạn sau 28 ngày nuôi cấy có khả năng sinh tổng hợp alkaloid, đặc biệt là ajmalicine với hàm lượng 804,6 và 750,3 µg/g trọng lượng khô (tương ứng môi trường nuôi cấy ¼ MS bổ sung NAA 0,1 mg/L và ¼ MS bổ sung IBA 0,3 mg/L) Tuy nhiên, hàm lượng vinblastine và vincristine tích lũy trong rễ bất định thấp

that the best rooting occured on cotyledons with IBA 0,7 mg/L and on leaves of in vitro

shoots with IBA 0,7 mg/L or NAA 0,5 mg/L The yield of rooting and number of roots obtained were 100% and 19,23; 29,63; 30,87, respectively After 25 days of induction, adventitous roots derived from cotyledons and leaves were transferred to liquid medium for proliferation The study showed that the rooting in liquid medium was influenced by the source of explants, the type and concentration of mineral and auxin Adventitous roots derived from cotyledons were not suitable for proliferation in liquid medium The high concentrations of mineral salts and exogenous auxin resulted in forming callus from the roots The decrease in concentration of mineral salts to ¼ (¼ MS, ¼ B5) and exogenous auxin (IBA 0,3 mg/L, NAA 0,1 mg/L) led to the development of roots and the significant decrease of callus formation The effect of inoculum size on growth of adventitious roots was also studied Inoculum size of 0,3 g/ 20 ml was found to be suitable The growth curve was performed over a culture cycle and showed that the retarded growth phase began at approximately 28th day After 28 days of cultures in ¼ MS medium supplemented with NAA 0,1 mg/L or IBA 0,3 mg/L, the obtained biomass were found to be capable of ajmalicine accumulation (804,6 or 750,3 µg/g dry weight, respectively)

Vinblastine and vincristine could also be detected, though at very low levels

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong công trình nào khác

1.1.1 Phân loài 3

1.1.2 Hình thái 3

1.1.3 Phân bố địa lý 5

1.1.4 Chất có hoạt tính sinh học trong C roseus 5

1.2 Tổng quan về alkaloid trong C roseus 5

1.2.1 Alkaloid 5

1.2.2 Alkaloid trong C roseus 6

1.2.2.1 Lịch sử phát hiện alkaloid trong C roseus 6

1.2.2.2 Con đường sinh tổng hợp các alkaloid trong C roseus 7

1.2.2.3 Tác dụng của các Vinca alkaloid 11

1.2.2.4 Phương pháp sản xuất Vinca alkaloid 14

1.2.2.5 Các nghiên cứu in vitro trên C roseus nhằm thu nhận alkaloid 16

1.3 Nuôi cấy rễ bất định in vitro thu nhận hợp chất tự nhiên 21

1.3.1 Ưu điểm và hạn chế của phương pháp nuôi cấy rễ bất định in vitro sản xuất hợp chất tự nhiên 21

1.3.2 Quy trình nuôi cấy rễ bất định in vitro nhằm thu nhận hợp chất tự nhiên 24

1.3.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự tăng trưởng rễ bất định in vitro và sự tổng hợp hợp chất tự nhiên 25

1.3.3.1 Loại môi trường và nồng độ muối khoáng 25

1.3.3.2 Chất điều hòa sinh trưởng thực vật 25

1.3.3.3 Nguồn và nồng độ carbohydrate 26

1.3.3.4 Mật độ mẫu cấy ban đầu 27

1.3.3.5 Điều kiện nuôi cấy 27

1.3.3.6 Gia tăng sự sinh tổng hợp hợp chất tự nhiên trong nuôi cấy rễ bất định in vitro nhờ các tác nhân cảm ứng 29

1.3.4 Nuôi cấy rễ bất định in vitro trong bioreactor 30

Chương 2: Vật liệu và phương pháp 2.1 Vật liệu 33

2.2 Phương pháp 33

2.2.1 Tạo cây mầm và chồi C roseus in vitro 34

2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của IBA và NAA lên sự tạo rễ bất định C roseus 35

2.2.3 Khảo sát sự tăng sinh rễ bất định C roseus trong môi trường lỏng lắc 36

2.2.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường khoáng lên sự tăng sinh rễ bất định C roseus trong môi trường lỏng lắc 36

2.2.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật bổ sung lên sự tăng sinh rễ bất định C roseus trong môi trường lỏng lắc 37

2.2.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của lượng mẫu cấy ban đầu lên sự tăng sinh rễ bất định C roseus trong môi trường lỏng lắc 37

2.2.3.4 Khảo sát sự tăng sinh rễ bất định C roseus theo thời gian nuôi cấy 38

2.2.4 Đánh giá sự tích lũy alkaloid trong rễ bất định C roseus 38

2.2.5 Phương pháp xử lý số liệu 38

Chương 3: Kết quả và bàn luận 3.1 Kết quả 40

3.1.1 Tạo nguồn nguyên liệu in vitro 40

3.1.1.1 Sự tạo cây mầm C roseus (dừa cạn) in vitro 40

3.1.1.2 Sự tạo chồi C roseus (dừa cạn) in vitro 40

3.1.2 Sự tạo rễ bất định C roseus (dừa cạn) in vitro dưới tác động của IBA và NAA 41

3.1.3 Sự tăng sinh rễ bất định C roseus trong môi trường lỏng 60

3.1.3.1 Ảnh hưởng của môi trường khoáng lên sự tăng sinh của rễ bất định C roseus 60

3.1.3.2 Ảnh hưởng của nồng độ IBA và NAA lên sự tăng sinh của rễ bất định C roseus trong môi trường lỏng 69

3.1.3.3 Ảnh hưởng của trọng lượng khởi đầu lên sự tăng sinh của rễ bất định C roseus trong môi trường lỏng 72

3.1.3.4 Sự tăng sinh của rễ bất định C roseus (dừa cạn) theo thời gian 73

3.1.3.5 Kết quả định lượng alkaloid 74

3.2 Bàn luận 75

3.2.1 Sự hình thành rễ bất định trong nuôi cấy in vitro 75

3.2.2 Sự tăng sinh của rễ bất định 76

i

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

C roseus Catharanthus roseus

ii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Một số alkaloid/ chất dẫn xuất quan trọng thu nhận được trong nuôi cấy tế bào/

cơ quan C roseus 16 Bảng 1.2: Danh sách các loài cây có rễ bất định in vitro được cảm ứng tạo thành và nuôi

cấy thành công nhằm sản xuất các hợp chất tự nhiên có giá trị cao 23 Bảng 1.3: Các yếu tố tác động nhằm gia tăng sản xuất hợp chất tự nhiên trong nuôi cấy tế bào và nuôi cấy cơ quan thực vật 24 Bảng 3.1: Ảnh hưởng của IBA và NAA lên sự tạo thành rễ bất định từ thân mầm 14 ngày tuổi 44 Bảng 3.2: Ảnh hưởng của IBA và NAA lên sự tạo thành rễ bất định từ lá mầm 14 ngày tuổi 48

Bảng 3.3: Ảnh hưởng của IBA và NAA lên sự tạo thành rễ bất định từ lá của chồi in vitro

5 tuần tuổi 55 Bảng 3.4: Ảnh hưởng của IBA và NAA lên sự hình thành rễ thứ cấp từ rễ mầm dừa cạn sau 25 ngày nuôi cấy 58 Bảng 3.5: Ảnh hưởng của các nồng độ của môi trường khoáng MS và auxin lên sự phát

triển của rễ bất định có nguồn gốc từ lá của chồi in vitro sau 28 ngày nuôi cấy 63

Bảng 3.6: Ảnh hưởng của các nồng độ của môi trường khoáng B5 và auxin lên sự phát

triển của rễ bất định có nguồn gốc từ lá của chồi in vitro sau 28 ngày nuôi cấy 64

Bảng 3.7: Ảnh hưởng của IBA và NAA lên sự tăng sinh rễ bất định trong môi trường lỏng sau 28 ngày nuôi cấy 69 Bảng 3.8: Ảnh hưởng của trọng lượng rễ ban đầu lên sự tăng sinh trong môi trường lỏng sau 28 ngày nuôi cấy 72 Bảng 3.9: Hàm lượng ajmalicine, vinblastine và vincristine trong sinh khối rễ bất định thu nhận từ các môi trường nuôi cấy 75

iii

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cây và hoa dừa cạn (Catharanthus roseus) 4

Hình 1.2: Trái và hạt dừa cạn (Catharanthus roseus) 4

Hình 1.3: Morphine, một loại alkaloid thực 6

Hình 1.4: Mescaline, một loại protoalkaloid 6

Hình 1.5: Pinidine, một loại pseudoalkaloid 6

Hình 1.6: Sơ đồ cơ bản tóm tắt sự sinh tổng hợp các loại terpenoid indole alkaloid trong C roseus 8

Hình 1.7: Sơ đồ thể hiện không gian bên trong và ngoài tế bào của con đường sinh tổng hợp terpenoid indole alkaloid ở các bộ phận/ tế bào khác nhau của C roseus 10

Hình 1.8: Sản phẩm thương mại từ vinblastine 11

Hình 1.9: Sản phẩm thương mại từ vincristine 12

Hình 1.10: Sản phẩm thương mại từ vinorelbine 12

Hình 1.11: Vinca alkaloid (Vin) tác động cản trở lên giai đoạn phân chia tế bào (Mitosis) dẫn đến tế bào chết theo chương trình (Apoptosis) 13

Hình 1.12: Tổng hợp anhydrovinblastine hoặc tổng hợp trực tiếp vinblastine từ hai alkaloid tiền chất là catharanthine và vindoline 15

Hình 1.13: Mô sẹo C roseus 17

Hình 1.14: Rễ tơ C roseus 20

Hình 1.15: Sơ đồ hệ thống BTBB 31

Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 33

Hình 2.2: Quy trình tạo cây mầm và chồi in vitro 35

Hình 3.1: Cây mầm dừa cạn 14 ngày tuổi 40

Hình 3.2: Chồi dừa cạn in vitro sau 5 tuần nuôi cấy 41

Hình 3.3: Rễ bất định dừa cạn hình thành từ thân mầm dưới tác động của IBA sau 14 ngày nuôi cấy 45

Hình 3.4: Rễ bất định dừa cạn hình thành từ mẫu cấy thân mầm dưới tác động của NAA sau 14 ngày nuôi cấy 45

iv

Hình 3.5: Rễ bất định dừa cạn hình thành từ mẫu cấy thân mầm dưới tác động của IBA sau 25 ngày nuôi cấy 46 Hình 3.6: Rễ bất định dừa cạn hình thành từ mẫu cấy thân mầm dưới tác động của NAA sau 25 ngày nuôi cấy 46 Hình 3.7: Rễ bất định dừa cạn hình thành từ mẫu cấy lá mầm dưới tác động của IBA sau 14 ngày nuôi cấy 49 Hình 3.8: Rễ bất định dừa cạn hình thành từ mẫu cấy lá mầm dưới tác động của NAA sau 14 ngày nuôi cấy 49 Hình 3.9: Rễ bất định dừa cạn hình thành từ mẫu cấy lá mầm dưới tác động của IBA sau 25 ngày nuôi cấy 51 Hình 3.10: Rễ bất định dừa cạn hình thành từ mẫu cấy lá mầm dưới tác động của NAA sau 25 ngày nuôi cấy 51

Hình 3.11: Rễ bất định dừa cạn hình thành từ mẫu cấy lá của chồi in vitro dưới tác động

của IBA sau 14 ngày nuôi cấy 53

Hình 3.12: Rễ bất định dừa cạn hình thành từ mẫu cấy lá của chồi in vitro dưới tác động

của NAA sau 14 ngày nuôi cấy 53

Hình 3.13: Rễ bất định dừa cạn hình thành từ mẫu cấy lá của chồi in vitro dưới tác động

của IBA sau 25 ngày nuôi cấy 56

Hình 3.14: Rễ bất định dừa cạn hình thành từ mẫu cấy lá của chồi in vitro dưới tác động

của NAA sau 25 ngày nuôi cấy 56

Hình 3.15: Rễ bất định dừa cạn hình thành từ mẫu cấy lá của chồi in vitro 5 tuần tuổi sau

25 ngày nuôi cấy 57 Hình 3.16: Rễ thứ cấp dừa cạn từ rễ mầm sau 25 ngày nuôi cấy dưới tác động của IBA.59 Hình 3.17: Rễ thứ cấp dừa cạn từ rễ mầm sau 25 ngày nuôi cấy dưới tác động của NAA 59 Hình 3.18: Sự tăng sinh của rễ bất định có nguồn gốc từ lá mầm trong các môi trường khoáng khác nhau bổ sung IBA 0,7 mg/L (A, B, C, D, E, F) hoặc IBA 0,3 mg/L (G, H, I, J, K, L) sau 28 ngày nuôi cấy 61

v

Hình 3.19:Rễ bất định có nguồn gốc từ lá của chồi in vitro trong các môi trường khoáng

khác nhau bổ sung IBA 0,7 mg/L (A, B, C, D, E, F) hoặc IBA 0,3 mg/L (G, H, I, J, K, L) sau 28 ngày nuôi cấy 66

Hình 3.20: Rễ bất định có nguồn gốc từ lá của chồi in vitro trong các môi trường khoáng

khác nhau bổ sung NAA 0,5 mg/L 67

Hình 3.21: Rễ bất định có nguồn gốc từ lá của chồi in vitro trong các môi trường khoáng

khác nhau bổ sung NAA 0,1 mg/L 68 Hình 3.22: Sinh khối rễ và mô sẹo dừa cạn sau 28 ngày nuôi cấy trong môi trường lỏng ¼ MS bổ sung IBA 71 Hình 3.23: Sinh khối rễ và mô sẹo dừa cạn sau 28 ngày nuôi cấy trong môi trường lỏng ¼ MS bổ sung NAA 71 Hình 3.24: Ảnh hưởng của trọng lượng rễ ban đầu lên sự tăng sinh trong môi trường lỏng sau 28 ngày nuôi cấy 73 Hình 3.25: Sự gia tăng sinh khối của rễ bất định dừa cạn theo thời gian trong môi trường lỏng ¼ MS bổ sung IBA 0,3 mg/L 74

1

MỞ ĐẦU

Có thể nói rằng, thực vật là những sinh vật vô cùng kì diệu của tạo hóa Ngoài việc là nguồn cung cấp thực phẩm cho nhiều loài động vật và con người, giúp cân bằng sinh thái, bảo vệ môi trường, tạo oxy cho bầu khí quyển…, thực vật còn mang một giá trị tuyệt vời là khả năng sinh tổng hợp những hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao có lợi cho con người Rất nhiều hợp chất tự nhiên có nguồn gốc từ thực vật được ứng dụng trong sản xuất thực phẩm, mỹ phẩm, đặc biệt là trong lĩnh vực y học Con đường chuyển hóa để tổng hợp nên những hợp chất tự nhiên do nhiều gen kiểm soát và điều hòa biểu hiện, là hoạt động biến dưỡng thứ cấp và thường được kích hoạt trong những điều kiện nhất định, chẳng hạn như khi cây bị “stress” bởi các yếu tố ngoại cảnh, bị vi sinh vật tấn công làm hoạt hóa cơ chế phòng vệ, khi cây phát triển đến một giai đoạn đặc biệt, hoặc khi môi trường dinh dưỡng có mặt các tiền chất, chất cảm ứng kích thích v.v… Ngoài ra, có những loài rất khó trồng hoặc phát triển rất chậm trong tự nhiên, chẳng hạn như loài

Cinchona (có khả năng sinh tổng hợp alkaloid) cần khoảng 10 năm tuổi mới có thể thu

hoạch [1] Như vậy, việc thu nhận các hợp chất tự nhiên trực tiếp từ cây nguyên vẹn sẽ bị giới hạn bởi nhiều yếu tố như điều kiện trồng trọt, vị trí địa lý, hàm lượng hợp chất trong cây thấp… dẫn đến cung không đáp ứng cầu Vì những lý do trên, trong hàng chục năm

qua đã có rất nhiều nỗ lực nghiên cứu về phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật in

vitro như là một phương pháp khả thi nhằm sản xuất thương mại hợp chất tự nhiên có giá

trị

Vinca alkaloid có chủ yếu trong Catharanthus roseus (dừa cạn), được ứng dụng

rộng rãi trong điều trị nhiều căn bệnh ung thư Hiện nay, nhu cầu sử dụng Vinca alkaloid

rất lớn, nhưng việc thu nhận hợp chất tự nhiên này từ cây nguyên vẹn lại gặp nhiều khó khăn vì hàm lượng được tổng hợp trong cây rất thấp, dẫn đến giá thành sản phẩm cao

Việc xây dựng quy trình sản xuất Vinca alkaloid trong phòng thí nghiệm được các nhà

khoa học rất quan tâm trong nhiều thập kỉ Trong đó, phương pháp tổng hợp hóa học đã được nghiên cứu thành công nhưng không hiệu quả trong sản xuất vì chi phí rất cao cũng như quá trình tổng hợp quá phức tạp Một phương pháp khác được đề xuất là phương

2

pháp bán tổng hợp các Vinca alkaloid chính (vinblastine, vincristine và một số dẫn xuất

khác) từ các tiền chất như catharanthine, vindoline, ajmalicine, serpentine Các tiền chất này là các alkaloid đơn phân tử được thu nhận từ nuôi cấy mô sẹo, dịch treo tế bào, rễ bất

định, rễ tơ in vitro từ C roseus Lịch sử nghiên cứu nuôi cấy dịch treo tế bào C roseus đã

có từ lâu đời, nhưng gần đây các nhà khoa học đang chuyển sang xu hướng mới là nuôi cấy cơ quan như chồi, rễ tơ, rễ bất định vì những ưu điểm vượt trội so với dịch treo tế bào

Rễ in vitro có thể sinh trưởng mạnh trên môi trường dinh dưỡng thích hợp, các quá trình

sinh hóa xảy ra mạnh và ổn định hơn so với dịch treo tế bào, do đó việc sản xuất thu nhận alkaloid ổn định hơn Với những lí do trên, công tác khảo sát sự hình thành và tăng sinh rễ

bất định C roseus in vitro nhằm thu nhận alkaloid là điều cần thiết

 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

Trong đề tài này, chúng tôi đã tiến hành khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến sự

cảm ứng hình thành và tăng sinh rễ bất định C roseus in vitro, bước đầu cần thiết trong

việc xây dựng quy trình nuôi cấy hai giai đoạn nhằm sản xuất các hợp chất alkaloid có giá trị cao trong y học

 Nội dung nghiên cứu của đề tài

- Tạo cây mầm và chồi C roseus in vitro

- Khảo sát ảnh hưởng riêng lẽ của IBA, NAA đến sự tạo rễ bất định từ lá

mầm, thân mầm, rễ mầm và lá của chồi C roseus in vitro

- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng lên sự tăng sinh rễ bất định trong môi trường

nuôi cấy lỏng lắc: loại và nồng độ môi trường khoáng, nồng độ IBA hoặc

NAA, mật độ mẫu cấy ban đầu, thời gian nuôi cấy

- Đánh giá khả năng sinh tổng hợp các hợp chất alkaloid của rễ bất định

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

3

1.1 Giới thiệu về Catharanthus roseus (L.) G Don (dừa cạn)

1.1.1 Phân loài

Giới: Thực vật Phân giới: Tracheobionta - cây có mạch

Ngành: Magnoliophyta - cây có hoa Lớp: Magnoliopsida - cây 2 lá mầm

Phân lớp: Asteridae Bộ: Gentianales

Họ: Apocynaceae - họ dừa cạn

Chi: Catharanthus G Don - periwinkle Loài: Catharanthus roseus (L.) G Don Danh pháp đồng nghĩa: Vinca rosea L., Pervinca rosea (L.) Moench, Lachnea

rosea (L.) Rchb., Ammocallis rosea (L.) Small, Lochnera rosea Reichenb F., Hittonia littoralis Lour [2], [3]

Tên thông dụng: Madagascar periwinkle, dừa cạn

1.1.2 Hình thái

Catharanthus roseus là cây bụi thấp, nhỏ, sống lâu năm, mọc thẳng đứng, cao 30

- 80 cm, phân nhánh nhiều và là loài có nhựa mủ

Lá cây mọc đối xứng, màu xanh đậm, trơn nhẵn, mặt trên sẫm bóng, hình oval, chiều dài khoảng 2 - 7 cm, rộng khoảng 1,5 - 3 cm, bo tròn ở đỉnh, cuống lá ngắn

Hoa có 5 cánh, mọc riêng lẻ hoặc thành đôi ở nách lá, dài 1,5 - 4 cm, xòe rộng khoảng 5 cm Màu sắc của hoa khá đa dạng với “mắt” ở ngay tâm Màu hoa được dùng để

phân biệt giống Giống album có hoa màu trắng với “mắt” màu vàng, giống roseus hay

violacea có hoa màu hồng - tím với “mắt” màu đỏ - tím, giống ocellatus hay oculata có

hoa màu trắng với “mắt” màu đỏ - tím (Hình 1.1)

Quả có dạng thuôn, có vỏ Bên trong vỏ chứa nhiều hạt màu nâu đen, nhỏ, có lông mịn (Hình 1.2)

4

Hình 1.1: Cây và hoa dừa cạn (Catharanthus roseus) [4].

Hình 1.2: Trái và hạt dừa cạn (Catharanthus roseus) [4]

5

1.1.3 Phân bố địa lý

C roseus là cây bản địa của đảo Madagascar ở vùng Ấn Độ Dương [5] Ngày

nay, loài cây này trở nên phổ biến và được trồng làm cảnh ở hầu hết các vùng nhiệt đới và cận nhiệt trên thế giới, trong đó có Việt Nam

1.1.4 Chất có hoạt tính sinh học trong C roseus

Catharanthus roseus (L.) G Don là một trong những loài cây dược liệu phổ biến

nhất, chứa hơn 130 loại terpenoid indole alkaloid (TIA) Đây là loài thực vật quan trọng nhờ có sự hiện diện của nhiều hợp chất tự nhiên có giá trị trong y học, trong đó có vinblastine và vincristine là hai loại alkaloid phổ biến chống ung thư được tìm thấy chủ yếu ở lá, ajmalicine được tìm thấy trong rễ Các loại alkaloid quan trọng khác như catharanthine, vindoline, serpentine…

Ngoài ra, trong cây còn có các acid hữu cơ như proto-cathechuic,

caffeic-p-hydroxybenzoic acid và ursolic Các acid hữu cơ và hợp chất phenolic được tìm thấy

trong rễ C roseus được đánh giá là những chất chống oxy hóa có tiềm năng [2]

1.2 Tổng quan về alkaloid trong C roseus

1.2.1 Alkaloid

Năm 1805, Friedrich Sertürner là người đầu tiên ly trích ra morphine, một trong những alkaloid quan trọng, nhưng cho đến năm 1819, khái niệm “alkaloid” mới được đề cập đến lần đầu bởi W Meißner, một nhà bào chế thuốc sống ở Halle (Đức) Những hợp chất này có đặc tính “giống alkali” (tính kiềm) nên được gọi là alkaloid [6]

Khái niệm alkaloid không đơn giản, vẫn còn là vấn đề gây tranh cãi Về phương diện sinh học, alkaloid là những hợp chất hóa học dị vòng có chứa nitơ và có hoạt tính sinh học, trong nhiều trường hợp được dùng cho y dược và môi trường

Alkaloid có thể được phân nhóm theo nhiều cách thức: theo hoạt tính sinh học và sinh thái học, theo cấu trúc hóa học, hoặc theo con đường sinh tổng hợp

Theo hoạt tính, người ta chia alkaloid thành 6 nhóm: (1) trung tính hoặc tính kiềm yếu; (2) alkaloid từ động vật; (3) alkaloid từ biển; (4) alkaloid từ rêu; (5) alkaloid từ vi khuẩn và nấm; (6) alkaloid không có nguồn gốc tự nhiên [6]

6

Về mặt cấu trúc, alkaloid được phân loại thành: (1) alkaloid thực; (2) protoalkaloid; (3) pseudoalkaloid Alkaloid thực là những hợp chất dị vòng có chứa nitơ và có nguồn gốc từ amino acid, ví dụ như morphine trong cây anh túc (hình 1.3), ajmalicine, catharanthine trong cây dừa cạn Protoalkaloid là những hợp chất có nhân nitơ có nguồn gốc từ amino acid, nhưng nitơ không nằm trong vòng, ví dụ mescaline (hình 1.4) Pseudoalkaloid có chứa nitơ nhưng không có nguồn gốc từ amino acid, ví dụ pinidine (hình 1.5), capsaicin [6]

1.2.2 Alkaloid trong C roseus 1.2.2.1 Lịch sử phát hiện alkaloid trong C roseus

Hình 1.5: Pinidine, một loại pseudoalkaloid [6] Hình 1.4: Mescaline, một loại protoalkaloid [6]

Hình 1.3: Morphine, một loại alkaloid thực [6]

7

Các alkaloid tự nhiên được tổng hợp chủ yếu trong C roseus còn được gọi là

Vinca alkaloid Vinca alkaloid đầu tiên được khám phá bởi Noble và các cộng sự tại

Canada vào năm 1957 và được đặt tên là vincaleukoblastine, sau đó được rút ngắn lại thành vinblastine Cùng khoảng thời gian này, một nhóm nhà nghiên cứu khác gồm Svoboda và các cộng sự ở Mỹ cũng phát hiện ra hai hợp chất trong cây dừa cạn có hoạt tính chống ung thư, một trong hai hợp chất này là vinblastine đã xác định trước đó, chất còn lại được đặt tên là leurosine Bằng các thử nghiệm lâm sàng, các nhà khoa học đã chứng minh được vinblastine có công dụng hữu hiệu trong việc điều trị bệnh Hodgkin, ung thư hệ bạch huyết và các loại ung thư khác, trong khi leurosine không phù hợp để dùng trong điều trị bệnh ung thư bởi độc tính của nó Về sau, Svoboda đã ly trích được thêm một loại alkaloid khác trong cây dừa cạn phù hợp cho điều trị ung thư Hợp chất này ban đầu được đặt tên là leurocristine, sau đó được đổi thành vincaleukocristine và cuối

cùng được gọi là vincristine Từ những khám phá này, Vinca alkaloid đã trở thành các

hợp chất tự nhiên chống ung thư đầu tiên được dùng trong lâm sàng và đến nay vẫn là một phần không thể thiếu được trong liệu pháp hóa học điều trị các căn bệnh ung thư [7]

1.2.2.2 Con đường sinh tổng hợp các alkaloid trong C roseus

Alkaloid trong C.roseus thuộc nhóm các alkaloid thực, có nguồn gốc từ

L-tryptophan Về mặt cấu trúc, chúng là các hợp chất terpenoid indole alkaloid (TIA) Trong

C roseus, có hơn 130 TIA có hoạt tính sinh học được tìm thấy Trong đó, vinblastine và

vincristine là các Vinca alkaloid nhị phân tử đã được chứng nhận và sử dụng rộng rãi trong điều trị một số căn bệnh ung thư Ngoài ra, các alkaloid khác trong C roseus gồm

các loại đơn phân tử như vindoline, catharanthine, ajmalicine, serpentine… cũng có những vai trò quan trọng [7], [8]

Con đường sinh tổng hợp các TIA trong C roseus trải qua khoảng 30 bước

được điều hòa bởi enzyme, có tối thiểu 35 hợp chất trung gian đã được xác định Tất cả TIA được sinh tổng hợp từ một phân tử tiền chất là strictosidine Strictosidine là hợp chất được tạo thành từ sự kết hợp của một tryptamine mang nhân indole có nguồn gốc từ tryptophan và phần terpenoid của secologanin có nguồn gốc từ geraniol (Hình 1.6) [7], [8]

8

Hình 1.6: Sơ đồ cơ bản tóm tắt sự sinh tổng hợp các loại terpenoid indole alkaloid trong

C roseus [8]

1 Geraniol-10-hydroxylase (G10H) 2 Loganic acid methyltransferase (LAMT) 3 Secologanin synthase (SLS)

4 TDC, tryptophan decarboxylase 5 Strictosidine synthase (STR)

7 Geissoschizine dehydrogenase (GDH) 8 Cathenamine reductase (CR)

9 Tabersonine 16-hydroxylase (T16H) 10 16-hydroxytabersonine-16-O-methyltransferase (16OMT)

11 Enzyme chưa xác định 12 16-methoxy-2,3-dihydro-3-hydroxy-tabersonine N-methyltransferase (NMT) 13 Deacetoxyvindoline 4-hydroxylase (D4H) 14 6-17-O-deacetylvindoline O-

acetyltransferase (DAT) 15 Class III basic peroxidase (PRX1) 16 Tabersonine 6,7-epoxidase (T6,7E) 17 Tabersonine 19 hydroxylase (T19H) 18 Minovincinine-19-O-acetyltransferase (MAT)

Phản ứng đầu tiên sau khi strictosidine được tổng hợp là chuyển hóa thành aglycone bằng việc loại bỏ nửa gốc glucose nhờ enzyme strictosidine -D-glucosidase

9

(SGD) Aglycone không bền và tiếp tục qua một số bước chuyển hóa chưa được xác định rõ, tạo thành cathenamine Cathenamine là hợp chất trung gian quan trọng ở điểm phân nhánh trong con đường sinh tổng hợp các loại TIA Cathenamine có thể bị khử để tạo thành ajmalicine, hoặc chuyển hóa thành tabersonine và từ đó đi theo con đường gồm nhiều bước trung gian để tạo thành vindoline, hoặc cathenamine có thể phản ứng với 4,21-dehydrogeissoschizine dẫn đến sự sinh tổng hợp stemmadenine rồi chuyển hóa thành catharanthine (Hình 1.6)

Ajmalicine sau khi bị oxy hóa bởi peroxidase III sẽ chuyển thành serpentine tích trữ trong không bào Catharanthine tích trữ trong lớp sáp trên bề mặt lá (Roepke và cộng sự, 2010) với vai trò là một hàng rào bảo vệ chống lại sự tấn công của côn trùng và vi sinh vật Vindoline có con đường chuyển hóa từ tabersonine gắn liền với sự có mặt của ánh sáng và sự phân hóa tế bào ở các giai đoạn phát triển khác nhau của cây (De Luca và cs, 1986; Vazquez-Flota và cs, 2002; Campous-Tamayo và cs, 2008; Shukla và cs, 2010) Vindoline và catharanthine là hai alkaloid đơn phân tử và là hai tiền chất quan trọng để tổng hợp vinblastine và vincristine có tác dụng chống ung thư, kết thúc con đường sinh

tổng hợp các TIA trong C roseus Nhờ phản ứng nhị hóa được xúc tác bởi enzyme

peroxidase III, vindoline và catharanthine kết hợp với nhau tạo thành -3’, anhydrovinblastine - tiền chất trực tiếp của vinblastine [7] [8]

4’-Vinblastine và vincristine chỉ khác nhau ở một điểm nhỏ duy nhất trong cấu tạo hóa học: vincristine có nhóm formyl ở vị trí thay cho nhóm methyl của vinblastine, nhưng hai alkaloid này lại khác nhau đáng kể về loại khối u mà chúng có tác động và khác nhau về độc tính [7]

Quá trình sinh tổng hợp các TIA trong C roseus không đơn giản chỉ là một

chuỗi các phản ứng enzyme xúc tác liên tiếp nhau, mà chúng còn biểu hiện khác nhau trong các cơ quan khác nhau cũng như phụ thuộc vào độ tuổi của cây Trong các nghiên cứu gần đây, các nhà khoa học thấy rằng hầu hết catharanthine được tích lũy trong lớp sáp trên bề mặt lá (Roepke và cs, 2010) trong khi vindoline lại thường hiện diện trong các tế bào nhựa mủ và các dị bào Sự khác biệt về không gian này giúp ngăn cản việc kết hợp

10

catharanthine và vindoline thành vinblastine và vincristine trừ khi cần thiết, vì bản chất vinblastine và vincristine cũng độc cho cây Điều này góp phần lí giải vì sao hàm lượng vinblastine và vincristine thu được từ cây nguyên vẹn trong tự nhiên rất thấp Hình 1.7 thể

hiện quá trình sinh tổng hợp các TIA trong C roseus đi qua các phần khác nhau, các tế

bào khác nhau và các cơ quan nội bào khác nhau

Hình 1.7: Sơ đồ thể hiện không gian bên trong và ngoài tế bào của con đường sinh tổng hợp terpenoid indole alkaloid ở các bộ phận/ tế bào khác nhau của C roseus [8]

Các phần màu xanh lá thể hiện phản ứng/ chất hình thành đặc trưng ở lá; các phần màu cam thể hiện các bước phản ứng/ chất hình thành đặc trưng ở rễ; các mũi tên đứt quãng màu đỏ thể hiện nhiều bước trung

gian hoặc thể hiện các phản ứng chưa được biết rõ; choloroplast-lục lạp; cytosol-nguyên sinh chất; ER-mạng lưới nội chất; nucleus-nhân; NC-dịch nhân;

plastid-lạp thể; vacuole-không bào

11

1.2.2.3 Tác dụng của các Vinca alkaloid

Vinblastine, với các tên thuốc thương mại là Velbé, Velban, Vinblastine… được sử dụng riêng lẻ hoặc kết hợp với các thuốc chống ung thư khác trong phác đồ điều trị bệnh Hodgkin, ung thư hệ bạch huyết, ung thư biểu mô tinh hoàn, ung thư dạ con và ung thư biểu mô vú… Tuy nhiên, việc sử dụng vinblastine có thể gây ra sự phá hủy tủy xương bởi độc tính của nó [8]

Hình 1.8: Sản phẩm thương mại từ vinblastine [9]

Vincristine, với các tên gọi thương mại như Oncovin, Vincasar, Vincrisul, Pericristine và Kyocristine… được dùng như một nhân tố kết hợp trong liệu pháp điều trị bệnh Hodgkin và ung thư hệ bạch huyết, bệnh bạch cầu cấp tính, bướu thịt, ung thư biểu mô Vincristine ít có tính độc đối với huyết học nhưng có tính độc đối với hệ thần kinh [7]

12

Hình 1.9: Sản phẩm thương mại từ vincristine [9]

Ngoài vinblastine và vincristine, còn có một số chất dẫn xuất của chúng cũng có công dụng chống ung thư như vinorelbine, vinflunine, vindesine Vindesine được dùng chính trong điều trị các khối u ác tính, bệnh bạch cầu nguyên bào cấp tính và bệnh ung thư tế bào lớn Vinorelbine được dùng rộng rãi trong điều trị bệnh ung thư tế bào lớn và ung thư vú Vinflunine, một chất dẫn xuất của vinorelbine thì đang trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng đối với một số bệnh ung thư [7], [8]

Hình 1.10: Sản phẩm thương mại từ vinorelbine [9]

Ngoài các Vinca alkaloid dùng trong điều trị ung thư kể trên, trong C roseus

còn có các alkaloid khác cũng có dược tính quan trọng, chẳng hạn như ajmalicine có công dụng chống tăng huyết áp, serpentine giúp giảm đau…

13

Các Vinca alkaloid chính như vinblastine, vincristine, vindesine, vinorelbine,

vinflunine… có thể kết hợp với các protein dimer tubulin tự do hoặc các tubulin ở 2 đầu vi ống, thậm chí là kết hợp với các tubulin dọc theo trục vi ống với ái lực kém hơn Việc kết hợp này làm phân hủy hoặc ngăn sự lắp ráp tubulin vào vi ống nên ngăn được sự kéo dài của vi ống, dẫn đến ngăn sự hình thành thoi vô sắc trong quá trình phân chia tế bào, từ đó kéo dài thời gian hoặc ngăn tế bào ung thư phân chia Về lâu dài, tế bào không phân chia sẽ chết theo chương trình (hình 1.11)

Hình 1.11: Vinca alkaloid (Vin) tác động cản trở lên giai đoạn phân chia tế bào (Mitosis)

dẫn đến tế bào chết theo chương trình (Apoptosis) [10]

Hoạt động của Vinca alkaloid trong tế bào động vật khác nhau ở các nồng độ

khác nhau Ở nồng độ thấp (< 1 M), các Vinca alkaloid làm giảm động năng của vi ống

giúp gia tăng khoảng thời gian của giai đoạn “nghỉ”, từ đó giúp kéo dài thời gian phân bào Ở nồng độ trung bình (1 – 2 M), Vinca alkaloid có tác dụng phá vỡ cấu trúc

polymer của vi ống hoặc ngăn cản sự gắn thêm dimer tubulin vào vi ống Còn ở nồng độ cao (> 10 M), Vinca alkaloid có thể gắn vào các dimer tubulin tự do tạo thành những

tinh thể lớn hoặc tạo thành khối khiến các tubulin không thể gắn vào vi ống [7]

14

1.2.2.4 Phương pháp sản xuất Vinca alkaloid

Hàm lượng alkaloid thu nhận từ C roseus trong tự nhiên rất thấp Theo Noble

và cộng sự (1990), khoảng nửa tấn lá khô mới thu nhận được một gram vinblastine [7]

Phương pháp tổng hợp Vinca alkaloid bằng con đường hóa học đã được thí

nghiệm thành công nhưng không hiệu quả trong sản xuất thương mại vì chi phí rất cao, đồng thời quá trình tổng hợp quá phức tạp [7]

Một phương pháp khác hiệu quả hơn đã và đang được ứng dụng là phương

pháp bán tổng hợp các Vinca alkaloid chính (gồm vinblastine, vincristine và một số dẫn xuất khác) từ các tiền chất là các alkaloid đơn phân tử tự nhiên trong C roseus như

catharanthine, vindoline Phương pháp này dựa trên cơ sở nghiên cứu thành công phản

ứng Potier-Polonovski giúp kết hợp catharanthine và vindoline trong C roseus thành 3’,4’-anhydrovinblastine, tiền chất trực tiếp của vinblastine Catharanthine, vindoline và

-các alkaloid có giá trị khác như serpentine, ajmalicine… được thu nhận từ nuôi cấy in

vitro mô sẹo, dịch treo tế bào, rễ bất định, rễ tơ C roseus Trong những năm gần đây, các

nhà khoa học đã thực hiện thành công thêm nhiều phản ứng hóa học khác để tổng hợp vinblastine từ catharanthine và vindoline (hình 1.12)

15

Hình 1.12: Tổng hợp anhydrovinblastine hoặc tổng hợp trực tiếp vinblastine từ hai

alkaloid tiền chất là catharanthine và vindoline [11].

16

1.2.2.5 Các nghiên cứu in vitro trên C roseus nhằm thu nhận alkaloid

Các phương pháp nuôi cấy in vitro khác nhau đã được nghiên cứu nhằm thu nhận các alkaloid từ C roseus, bao gồm nuôi cấy mô sẹo, dịch treo tế bào, chồi và rễ

(Bảng 1.1) Trong phần này, chúng tôi sẽ điểm qua một số ghi nhận đáng chú ý

Bảng 1.1: Một số alkaloid/ chất dẫn xuất quan trọng thu nhận được trong nuôi cấy tế

bào/ cơ quan C roseus [12]

Alkaloid Nguồn thu nhận

3,4 anhydro vinblastine Chồi

a) Nuôi cấy mô sẹo C roseus

Miura và cộng sự (1987) thu nhận được vinblastine trong mô sẹo hình

thành từ lá non C roseus dưới tác động của môi trường MS có bổ sung NAA 0,1 mg/L và

kinetin 0,1 mg/L Tuy nhiên hàm lượng vinblastine thu nhận được rất thấp (1 g/g trọng lượng khô) [13] Ngoài NAA và kinetin, 2,4-D với nồng độ 0,5 – 2,0 mg/L cũng thúc đẩy sự tăng sinh mô sẹo một cách nhanh chóng [12]

17

Hình 1.13: Mô sẹo C roseus [13]

(d) Dòng mô sẹo trắng được nuôi trên môi trường B5 bổ sung kinetin 0,1 mg/L và IAA 1,0 mg/L (e) Dòng mô sẹo xanh được nuôi trên môi trường B5 bổ sung kinetin 0,1 mg/L và IAA 1,0 mg/L

b) Nuôi cấy dịch treo tế bào C roseus

Nuôi cấy dịch treo tế bào C roseus được nhiều nhà khoa học nỗ lực

nghiên cứu từ nhiều thập kỉ qua, nhưng đến nay vinblastine và vincristine chỉ được tổng hợp với hàm lượng rất thấp bằng phương pháp này Do đó, phương pháp chủ yếu vẫn được sử dụng là nuôi cấy dịch treo tế bào để thu nhận vindoline và catharanthine, sau đó kết hợp thành vinblastine nhờ các phản ứng enzyme và hóa học Sự sản xuất

catharanthine trong nuôi cấy dịch treo tế bào C roseus có thể được điều khiển và thúc đẩy

bằng cách cải thiện các điều kiện nuôi cấy (Smith và cộng sự, 1987), dùng kĩ thuật cố định tế bào (Facchini và DiCosmo, 1991), hoặc dùng các yếu tố cảm ứng khác nhau Việc sản xuất sinh khối để thu nhận catharanthine và ajmalicine cũng được nghiên cứu ở quy mô bioreactor với nhiều loại và thể tích nuôi cấy khác nhau [13] Jian Zhao và cộng sự

(2001) nuôi cấy dịch treo tế bào C roseus trong các bình lỏng lắc 500 ml, 1000 ml và

air-lift bioreactor 20 L, tác nhân cảm ứng là malate kết hợp sodium alginate, thu nhận được catharanthine với hàm lượng rất cao (tương ứng 25 mg/L, 32 mg/L và 22 mg/L) sau 10 ngày nuôi cấy Nhóm tác giả cũng cho rằng việc kết hợp malate và alginate giúp thúc đẩy cơ chế phòng vệ, chẳng hạn như oxy hóa lipid, dẫn đến thúc đẩy sinh tổng hợp alkaloid thông qua con đường jasmonate [14]

18

c) Nuôi cấy cơ quan C roseus

Nuôi cấy cơ quan như chồi C roseus nhằm thu nhận alkaloid cũng có nhiều ghi nhận Trong nghiên cứu của Hirata (1987), chồi C roseus được hình thành trực

tiếp từ cây mầm và duy trì trong 18 tháng trên môi trường MS có bổ sung BA 1,0 mg/L Sinh khối gồm chồi mới có vài lá nhỏ và mô sẹo sau 4 tuần cấy chuyền từ chồi 18 tháng tuổi được đem đi chiết xuất và định lượng alkaloid bằng phương pháp HPLC Kết quả nghiên cứu này cho thấy vindoline (1,8 mg/g trọng lượng khô) và catharanthine (0,37 mg/g trọng lượng khô) có mặt chủ yếu trong chồi, nhất là ở lá, trong khi ajmalicine tích lũy chính trong mô sẹo với hàm lượng 0,072 mg/g trọng lượng khô [15] Năm 1988, Miura và cộng sự ly trích được vinblastine với hàm lượng 15 g/g trọng lượng khô khi

nuôi cấy chồi C roseus trong môi trường MS bổ sung BA 1,0 mg/L [16] Satdive và cộng sự (2003) quan sát thấy có sự tích lũy cao ajmalicine khi nuôi cấy chồi C roseus trên môi

trường MS bổ sung IAA 11,42 M và BA 2,22 M, nhưng vinblastine và vincristine lại không được tìm thấy [12]

Agrobacterium rhizogenes là vi khuẩn gây ra hiện tượng hình thành rễ tơ

ở thực vật Rễ tơ có thể phát triển nhanh và ổn định về di truyền trong môi trường dinh dưỡng thấp và không cần bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật Ngoài ra, rễ tơ của nhiều loài thực vật cũng được chứng minh là có khả năng sinh tổng hợp các hợp chất tự nhiên với hàm lượng cao hơn hoặc ngang với cây nguyên vẹn trong tự nhiên Chính vì

những ưu điểm này, việc nghiên cứu nuôi cấy rễ tơ C roseus nhằm sản xuất alkaloid đã

trở thành một lĩnh vực quan trọng kể từ sau công trình được báo cáo bởi Flores năm 1987

[13] Nghiên cứu về nuôi cấy rễ tơ C roseus nhằm thu nhận alkaloid có nhiều hướng,

chẳng hạn như chọn giống vi khuẩn thích hợp để cảm ứng tạo rễ, tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy gồm môi trường, pH, nhiệt độ, nghiên cứu sự tác động của các yếu tố cảm ứng sinh học, phi sinh học, và ứng dụng công nghệ gen để tạo ra các dòng rễ tơ tái tổ hợp có khả năng biểu hiện vượt mức các gen quan trọng trong con đường sinh tổng hợp TIA của

C roseus Jung và cộng sự (1992) khẳng định các nguồn đường khác nhau có tác động

khác nhau lên sự tăng sinh và tích lũy alkaloid của rễ tơ C roseus và đề nghị phương

19

pháp nuôi cấy 2 giai đoạn: giai đoạn đầu sử dụng sucrose làm nguồn carbon để tăng sinh khối và giai đoạn nuôi cấy còn lại sử dụng fructose Phương pháp nuôi cấy 2 giai đoạn này không làm thay đổi đáng kể sự tăng sinh của rễ tơ, nhưng lại làm gia tăng sản lượng catharanthine lên 41 mg/L, gấp 2 lần so với trường hợp nuôi cấy một giai đoạn chỉ sử dụng sucrose (20 mg/L) [17] S Guillon và cộng sự (2008) đã nhận định nồng độ 40 M methyl jasmonate (MeJA) không gây ảnh hưởng có hại trên sự sinh trưởng rễ tơ mà còn giúp gia tăng khả năng sản xuất ajmalicine và catharanthine [18] Sau đó, Eliel Ruiz-May và cộng sự năm 2009 một lần nữa chứng tỏ rằng MeJA ảnh hưởng lên sự sinh trưởng và

tổng hợp alkaloid của rễ tơ C roseus, và sự ảnh hưởng xảy ra khác nhau ở các nồng độ

khác nhau Khi được xử lý với 250 M MeJA, trọng lượng khô rễ tơ C roseus giảm đáng

kể nhưng lại gia tăng sự tổng hợp, tích lũy và tiết alkaloid ra môi trường [19]

(f) Rễ tơ phát triển từ hột nhân tạo C roseus trên môi trường NN bổ sung IBA 0,5 mg/L và BAP 0,1 mg/L

Nghiên cứu về nuôi cấy rễ bất định C roseus in vitro vẫn còn hạn chế

Điểm qua một số công trình nghiên cứu, chúng tôi có những ghi nhận như sau Pietrosiuk

và cộng sự (2001) cho rằng rễ bất định C roseus tăng trưởng tốt trong môi trường ½ B5

bổ sung NAA 0,5 mg/L và 0,25 mg/L, sinh khối nuôi cấy bao gồm các mảnh mô sẹo và rễ [20] Trước đó, Ciau-Uitz và cộng sự (1994) nuôi cấy rễ thứ cấp có nguồn gốc từ rễ mầm

21

in vitro trong các loại môi trường MS, B5, Phillips – Collins và Monnier có bổ sung riêng

lẻ IAA, IBA, NAA, BA và kinetin Khoảng thời gian trung bình để trọng lượng rễ tăng lên gấp hai lần ban đầu được cho là 19,5 ngày [21]

1.3 Nuôi cấy rễ bất định in vitro thu nhận hợp chất tự nhiên 1.3.1 Ưu điểm và hạn chế của phương pháp nuôi cấy rễ bất định in vitro sản xuất

hợp chất tự nhiên

Nhiều hợp chất tự nhiên có nguồn gốc từ thực vật đã được nghiên cứu và sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy mô sẹo và dịch treo tế bào Tuy nhiên, việc sản xuất ở quy mô lớn nhằm thương mại hóa các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao bằng phương pháp nuôi cấy tế bào gặp phải nhiều trở ngại như năng suất và tính ổn định không cao, trong một số trường hợp sinh khối tế bào không có khả năng sinh tổng hợp hợp chất tự nhiên cần thiết, hoặc tổng hợp với hàm lượng rất ít do tế bào chưa được phân hóa Sự sản xuất không đạt hiệu quả do cơ chế biến dưỡng nhằm sinh tổng hợp các hợp chất tự nhiên bị kiểm soát, đồng thời có những phản ứng xảy ra chủ yếu trong một vài cơ quan chuyên biệt, hoặc phụ thuộc vào độ tuổi và sự phân hóa tế bào Từ nhiều năm nay, các nhà khoa học tập trung vào việc phát triển các quy trình nuôi cấy cơ quan thực vật như chồi, phôi, rễ bất định, rễ tơ nhằm thu nhận các hợp chất tự nhiên có giá trị [22], [23]

Rễ bất định in vitro được cảm ứng tạo thành và nuôi cấy trong môi trường dinh

dưỡng có chất điều hòa sinh trưởng thực vật thích hợp sẽ có khả năng tăng sinh với tốc độ cao, có tiềm năng rất lớn trong việc sản xuất ổn định và tích lũy các hợp chất tự nhiên có giá trị (Hahn và cộng sự, 2003; Yu và cộng sự, 2005; Baque và cộng sự, 2012) Bảng 1.2 cho biết một số loài cây dược liệu quan trọng đã được nghiên cứu thành công trong việc cảm ứng và nuôi cấy rễ bất định, sản xuất hiệu quả các hợp chất tự nhiên có giá trị cao

Hạn chế của phương pháp nuôi cấy rễ bất định là trong một số trường hợp, việc nuôi cấy không hiệu quả để thu nhận một số hợp chất tự nhiên không được sinh tổng hợp hoặc chỉ một lượng rất ít được tạo thành ở loại cơ quan này Ngoài ra, việc nâng quy mô sản xuất rễ bất định đòi hỏi nhiều thách thức, vì việc nuôi cấy rễ bất định trong các bioreactor không thích hợp hoặc tốc độ khuấy trộn không thích hợp có thể gây ra hiện

22

tượng đứt gãy rễ nghiêm trọng làm ảnh hưởng đến sự phát triển, hình thái rễ và ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp hợp chất tự nhiên

23

Bảng 1.2: Danh sách các loài cây có rễ bất định in vitro được cảm ứng tạo thành và nuôi

cấy thành công nhằm sản xuất các hợp chất tự nhiên có giá trị cao [22]

Loài thực vật Hợp chất tự nhiên Dược tính Tham khảo

Panax ginseng Ginsenoside Chống ung thư, ngăn

sự mệt mỏi, chất kích thích miễn dịch, kháng viêm, chống oxi hóa

Paek và cs (2009); Choi và cs (2000); Jeong và cs (2006)

Panax notoginseng Saponin Chất kích thích miễn

dịch, chống ung thư

Kim và cs (2005); Son và cs (1999)

Morinda citrifolia Anthraquinone,

rubiadin, phenolic, flavonoid

Chống ung thư, kháng khuẩn, kháng virus, bảo vệ gan, chống oxy hóa, chống dị ứng

Baque và cs (2010, 2011)

Echinacea purpuria E angustifolia

Các chất dẫn xuất của caffeic acid

Kích thích miễn dịch, kháng viêm, chống oxy hóa

Wu và cs (2006, 2007); Jeong và cs (2009)

Hypericum perforatum

Hypericin, hyperin Chống trầm cảm,

kháng nấm, kháng viêm, kháng vi khuẩn gây bệnh lao

Cui và cs (2010); Cui (2011)

Eleutherococcus koreanum

Eleutheroside B, E, Chlorogenic acid

Chống mệt mỏi, giảm đau

Kang và cs (2004)

Rapanus sativus L cv Peking koushin

(2004)

Rhu javanica Galloylglucoses,

riccionidin A (polyphenol)

Chất chống oxy hóa Taniguchi và cs

(2000)

Dubosia myoporoides D leichhardtii

Scopolamine, hyoscyamine

Trị co thắt, tác nhân làm giãn đồng tử

Yoshimatsu và cs (2004)

Cornus capitata Tannin Chất chống oxy hóa Tanaka và cs

(2001)

Anthemis nobilis Geranyl isovalerte Kháng viêm, hương

liệu, tinh dầu

Omato và cs (1998)

Andrographis paniculata

Andrographolide Chống sốt, chống sốt

rét

Praveen và cs (2009)

24

1.3.2 Quy trình nuôi cấy rễ bất định in vitro nhằm thu nhận hợp chất tự nhiên

Quy trình nuôi cấy rễ bất định nhằm sản xuất sinh khối và tổng hợp hợp chất tự nhiên bao gồm hai giai đoạn chính: (1) giai đoạn phát triển, tăng sinh khối và (2) giai đoạn tổng hợp hợp chất tự nhiên từ sinh khối Trước đây, việc sản xuất sinh khối và hợp chất tự nhiên được tiến hành đồng thời, nhưng với phương pháp nuôi cấy hai giai đoạn thì có thể kiểm soát và thúc đẩy cả hai vấn đề quan trọng là sự sản xuất sinh khối và sự tích lũy hợp chất tự nhiên Để làm được điều này, trong từng giai đoạn nuôi cấy cần kiểm soát nhiều yếu tố tác động, chẳng hạn như chọn giống, tìm các yếu tố về môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp nhất, bổ sung chất cảm ứng, bổ sung cơ chất hoặc tiền chất, kích thích tiết sản phẩm ra môi trường, phương pháp cố định tế bào, phương pháp chuyển gen… (Bảng 1.3) [24]

Bảng 1.3: Các yếu tố tác động nhằm gia tăng sản xuất hợp chất tự nhiên trong

nuôi cấy tế bào và nuôi cấy cơ quan thực vật [24]

Giai đoạn 1 (phát triển, sản xuất sinh

khối)

Giai đoạn 2 (tích lũy hợp chất tự nhiên)

Bổ sung chất dinh dưỡng (cơ chất khởi đầu) Bổ sung tiền chất

Thẩm thấu tiết hợp chất tự nhiên ra môi trường

Cố định tế bào Chuyển gen Nâng quy mô nuôi cấy Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy

Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng và nồng độ muối

Ảnh hưởng của nguồn và nồng độ carbohydrate

Ảnh hưởng của nguồn nitơ Ảnh hưởng của phophate Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật

Ảnh hưởng của mật độ mẫu cấy ban đầu Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy

Ảnh hưởng của nhiệt độ Ảnh hưởng của cường độ và thời gian chiếu sáng

Ảnh hưởng của nồng độ ion H+ (pH môi trường)

Ảnh hưởng của tốc độ lắc, khuấy, sục khí…