Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Thử nghiệm tạo viên nang synbiotic từ Bacillus subtilis natto

TÊN ĐỀ TÀI: Thử nghiệm tạo viên nang synbiotic từ Bacillus subtilis natto II.NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG  Khảo sát đặc tính sinh học của vi khuẩn. Khảo sát hoạt tính probiotic, các enzyme hỗ

Mục tiêu nghiên cứu

Tạo sản phẩm viên nang synbiotic từ B.subtilis natto, tích hợp cả hai khía cạnhProbiotic và Nattokinase.

Nội dung nghiên cứu

 Khảo sát đặctính sinh học của vi khuẩn.

 Khảo sát hoạt tính probiotic, các enzyme hỗ trợ tiêu hóa và enzyme nattokinase.

 Vi gói B.subtilis natto với tinh bột biến tính và maltodetrin bằng kỹ thuật sấy phun

 Tái xác định hoạt tính probiotic của vi khuẩn B.subtilis natto và hoạt tính nattokinase trong thời gian bảo quản sản phẩm.

TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung về vi khuẩn B.subtilis natto

Đặc điểm sinh học của vi khuẩn B.subtilis natto

Theo phân loại của Bergey (1974), B.subtilis natto có những đặc điểm sau: là trực khuẩn Gram dương, hiếu khớ, hỡnh que ngắn, kớch thước 3 – 5 ì 0,5– 0,8àm, cỏc tế bào tồn tại riêng lẻ hay dính với nhau tạo thành chuỗi ngắn Nhiệt độ phát triển từ 36 –50 0 C, nhiệt độ tối thích là 37 0 C Chịu ngưỡng pH từ 5,8 –8,5 [41] Khi còn non có khả năng di động nhờ tiêm mao, về sau tiêm mao rụng khi tế bào già nên vi khuẩ n mất khả năng di động trong môi trường.

Hình 1.1: B.subtilisnatto dưới kính hiển vi [5]

Hình 1.2:Đặc điểm khuẩn lạc của B.subtilis natto [117]

Khi gặp điều kiện không thuận lợi của môi trường sống, tế bào B.subtilis sẽ tạo bào tử Khác với nấm mốc, bào tử vi khuẩn (nha bào) không phải là cơ quan sinh sản và thường có hai dạng: hình cầu và hình bầu dục Bào tử có chứa acid dipicolinic (5 –10% so với chất khô), được bao bọc bởi vỏ trong cấu tạo từ glycan peptid và vỏ ngoài Kích thước của bào tử không lớn hơn kích thước của tế bào nên vi khuẩn giữ nguyên hình dạng khi hỡnh thành bào tử Kớch thước bào tử 0,8 –1,8àm Bào tử chịu nhiệt khỏ cao và phỏt triển bằng cách nảy mầm.

Chúng phân bố rộng rãi trong ngoại cảnh, nhất là trên bề mặt thực vật (cỏ khô, khoai tây).

B.subtilis natto phát triển rất nhiều trong đậu nành Vi khuẩn này cũng phát triển trên loại đậu khác, trong thực phẩm có nguồn gốc thực vật khác như tảo biển,… B.subtilis natto sử dụng nguồn carbon là glucose, sucrose, fructose, … trong đó sucrose cần thiết cho vi khuẩn phát triển và sản xuất chất nhớt B.subtilis natto cũng cần biotin, trong môi trường không có biotin các tế bào sinh dưỡng không thể phát triển và bào tử của chúng không nảy mầm được.

B.subtilis natto cần oxy, có thể phát triển ở nồng độ oxy lớn hơn 3% Nhiệt độ tối ưu cho sự sinh bào tử là 40 0 C, nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển 39 – 43 0 C.Ở 55 0 C vi khuẩn ngừng phát triển và có sự ly giải tế bào sinh dưỡng diễn ra B.subtilis natto phát triển ở pH trung tính, sự nảy chồi vàức chế ở pH = 4,5 hoặc thấp hơn [39][50].

Các sản phẩm trao đổi chất củaB.subtilis natto rất phong phú và đa dạng Trong đó có enzyme tiêu hóa như amylase, protease, cellulase, … và enzyme chức năng như nattokinase, … được sinh ra trong quá trình hoạt động sống, có ý nghĩa thương mại rất lớn.

Sinh tổng hợp nattokinase

Nattokinase được mã hóa bởi gen aprE (subtilisin E từ B.subtilis), aprN (subtilisin nattokinase từ Bacillus subsp natto), gen này chủ yếu được biểu hiện ở pha ổn định trong tăng trưởngở B.subtilis natto dưới sự kiểm soát của promoter có liên quan đến sự tạo bào tử (Ps, s-porulation) Ps chỉ hoạt động khi có sự gắn kết với Spo0A, là một DNA-binding-protein giữ vai trò điều hòa chủ đạo (master regulator) - điều hòa trực tiếp và gián tiếp khoảng 500 gen và có liên quan chặt chẽ đến quá trình tạo bào tử và hiện tượng khả nạp ởB subtilis Do có vai trò điều hòa khá quan trọng, lượng Spo0Aở dạng hoạt hóa (dạng phosphoryl hóa) được kiểm soát khá nghiêm ngặt bởi phosphorelay (chuỗi các protein chuyển nhóm phosphoryl) và vòng tự điều hòa (autoregulatory loop).

Vì vậy, thực nghiệm đã cho thấyrằng sự tổng hợp nattokinase (subtilisin) trong tự nhiên ở B subtilis khá phức tạpvà chỉ đạt mứcđộ giới hạn.

Hình 1.3: Cơ chếtổng hợp và tiết protein ởvi khuẩn [32]

Vi khuẩn là sinh vật đơn bào, chưa có sự phân hóa thành các hệ màng nội bào Nên ribosome 70S (gồm hai tiểu đơn vị 30S, 50S) là nơi diễn ra quá trình sinh tổng hợp protein, nằm rải rác trong tế bào chất Khi nhận tín hiệu tổng hợp protein, vùng tương tự nhân chứa một phân tử DNA trần thực hiện quá trình phiên mã tạo mRNA mRNA di chuyển ra tế bào chất cùng với ribosome tổng hợp nên protein Protein được sản xuất theo hình thức preproprotein trong đó presequence và prosequence được gắn vào đầu N của protein trưởng thành Ribosome tổng hợp protein còn phụ thuộc vào sự hiện diện (+SP) hoặc vắng mặt (-SP) của một peptide tín hiệu N-terminal và tín hiệu duy trì đặc hiệu.

Presequence đóng vai trò như một tín hiệu peptide cho tiết protein ra ngoài môi trường và prosequence là chaperone nội nguyên tử, điều khiển việc gấp cuộn chính xác protein trưởng thành và bị phân cắt bởi autoproteolysis Protein sau khi biệt hóa kết hợp với màng sinh chất và giải phóng ra ngoài tế bào (xuất bào) Protein ngoại bào đư ợc tiết trực tiếp ra môi trường ngoài qua con đường Sec hoặc Tat hoặc vận chuyển qua ABC.

Từ trướcđến nay nattokinaseđược thu nhận chủ yếu bằng con đường lên men bán rắn chủng B.subtilis natto trên cơ chất đậu nành hấp chín hay lên men dịch thể Để thu được nattokinase có hàm lượng cao và hoạt tính ổn định, người ta thường sử dụng chủng bằng con đường tái tổ hợp (loại bỏ yếu tố giới hạn, sử dụng vector biểu hiện với cấu trúc ổn định cao, tối ưu hóa promotor) [10] hoặc tiếp cận với các thông số đã được nghiên cứu tối ưu hóa trong môi trường lên men bằng phương pháp bề mặt đáp ứng (response surface methodology) [59][34].

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp nattokinase

Lựa chọn các thành phần môi trường là một yếu tố quan trọng trong công nghiệp lên men nói chung Do các loài vi sinh vật khác nhau có các đặc tính sinh lý khác nhau, nên rất cần thiết để tối ưu hóa thành phần dinh dưỡng và điều kiện môi trường cho sự phát triển và sản xuất enzyme thủy phân fibrin[37]. Để có thể ứng dụng thành công trên quy mô công nghiệp cần phải đưa ra được lựa chọn tối ưu cho hoạt tính enzyme và giá thành sản phẩm Thành phần môi trường là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến chi phí của sản xuất Lựa chọn tối ưu nhất đó là tìm kiếm những nguồn dinh dưỡng sẵn có, giá thành thấp mà cho hoạt lực enzyme cao Các yếu tố dinh dưỡng quan trọng ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme là nguồn carbon, nguồn nitơ, muối khoáng.

Các chủng khác nhau thì thành phần môi trường và nguồn dinh dưỡng cũ ng tương đối khác nhau.

Nguồn carbon là nguồn năng lượng chính để vi sinh vật sinh trưởng, phát triển [119] và tổng hợp enzyme protease Tuy nhiên, tùy thuộc vào nồng độ của cơ chất nhiều hay ít mà B.subtilis sẽ tiết ra lượng enzyme khác nhau để phân giải chúng và cung cấp năng lượng cho tế bào Các nghiên cứu của K.Gouda (2001) trên 30 chủng vi khuẩn thuộc chi

Bacillusđã xácđịnh bột cám mì, rỉ đường và maltose là ba nguồn carbohydrate giúp sinh nhiều protease kiềm nhất [83] Nhiều tối ưu hóa về tối ưu hóa nguồn carbohydrate cho vi khuẩn B.subtilis natto sản xuất nattokinase đều xác định maltose là nguồn carbohydrate thích hợp nhất Nhưng nồng độ maltose ở các nghiên cứu chưa thống nhất như JunguoLiu (2005) tối ưu hóa các điều kiện dinh dưỡng cho sinh tổng hợp nattokinase từ chủngB.subtilis natto NLSSE sử dụng maltose 2% [87], Dja-Shin Wangxác định maltose 3% là nguồn carbohydrate tốt nhất cho B.subtilis natto sản xuất nattokinase [88], Hu Ling-li

(2011)xác định maltose 1% là nguồn carbohydrate thích h ợp nhất [89].

Nguồn nitơ thường được sử dụng để nuôi cấy vi sinh vật gồm bột đậu nành, cao thịt, cao nấm men Đây là chất quan trọng trong hầu hết các đại phân tử sinh học (protein, acid nucleic, enzyme, …) và trong cấu tạo tế bào B.subtilis natto có thể sử dụng cả nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ cho sự tăng trưởng và phát triển của chúng Việc thiếu nitơ sẽ làm cho quá trình sinh tổng hợp protein và các đại phân tử sinh học bịhạn chế Tuy nhiên nếu hàm lượng nitơ dư thừa thì quá trình sinh tổng hợp có xu hướng giảm Vì khi nồng độ nitơ bên ngoài tế bào vượt quá ngưỡng cho phép sẽ xảy ra hiện tượng chênh lệch áp suất thẩm thấu trong và ngoài màng tếbào, làm hạn chếsự hấp thu các chất dinh dưỡng vào trong tế bào, làm giảm quá trình sinh tổng hợp các đại phân tử sinh học Trong đó peptone soya bean vừa cung cấp nguồn nitơ choB.subtilis natto vừa là chất cảmứng kích thích tếbào tiết nattokinase.

Các yếu tố khoáng cũng có ảnh hưởng rõ rệt đến quá trình sinh tổng hợp enzyme nattokinase Deepak (2008) nghiên cứu tối ưu hóa môi trường cho sinh tổng hợp nattokinase từ B.subtilis cho hoạt tính enzyme cao nhất khi có mặt 0,2% MgSO4, 0,5%

CaCl2 [59] Ngoài ra, Ca 2+ tham gia vào trung tâm hoạt động và làm bền enzyme nattokinase [119], nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng Ca 2+ có ảnh hưởng tốt đến khả năng sinh tổng hợp enzyme nattokinase [59] Nhiều nghiên cứu cho thấy tác dụng tích cực của muối vô cơ đến khả năng sinh protease của vi khuẩn Tuy nhiên, nồng độ muối cao có thể kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn [12].

Chất cảm ứng được xem như yếu tố quan trọng dùng để điều khiển quá trình sinh tổng hợp enzyme từ vi sinh vật Khi cho cơ chất vào môi trường nuôi cấy với liều lượng tăng dần thì khả năng tổng hợp enzyme cảm ứng sẽ tăng dần, đến mộ t lúc nào đó quá trình này chậmlại và thậm chí sẽ giảm do hiện tượng tăng áp suất thẩm thấu bởi cơ chất gây nên [12].

Probiotic và vai trò của probiotic

Probiotic là thuật ngữ có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp bao gồmhai từ: pro- vì, biosis–sự sống Probiotic là chế phẩm chứa các vi sinh vật sống đã được chọn lọc màkhi đưa vào cơ thể qua đường miệng với lượng lớn sẽ ảnh hưởng có lợi đến sức khoẻ vật chủ.

Khái niệm này bắt nguồn từ giảthiết của nhà bác học Nga Metchinikoff (1845-1916) cho rằng người nông dân Bulgari luôn sống rất khoẻ mạnh là vì họ thường xuyên dùng sữa chua có chứa vi khuẩn lactic, chúng ảnh hưởng tới hệ vi sinh vật đường ruột và làm giảm tác động gâyđộc của vi sinh vật gây hại.

Những công trình nghiên cứu về probiotic mới chỉ bắt đầu vào thế kỷ XX, Henry Tisser (1900), một bác sỹ khoa nhi người Pháp đã quan sát và thấy rằng phân của những đứa trẻ mắc bệnh tiêu chảy có ít vi khuẩn lạ hình trứng hoặc hình chữ Y hơn những đứa trẻ khỏe mạnh Ông cho rằng những vi khuẩn này có khả năng chống lại bệnh tiêu chảy giúp khôi phục hệ thống visinh vật đường ruột.

Cùng thời đó, Elie Metchinikoff – một nhà khoa học người Nga, đạt giải Nobel Y học (1908) vì khám phá của ông về quá trình thực bào Ông nổi tiếng với những nghiên cứu tiên phong trong lĩnh vực miễn dịch học và là người đầu tiên đưa ra liệu pháp chữa trị bằng vi khuẩn lactic Ông đã chứng minh được rằng việc tiêu thụ Lactobacillus sẽ hạn chế các nội độc tố của hệ vi sinh vật đường ruột Ông giải thích được điều bí ẩn về sức khỏe của những người Cô-dăc ở Bulgary, họ sống rất khỏe mạnh và tuổi thọ có thể lên tới 115 tuổi hoặc hơn, nguyên nhân do họ tiêu thụ rất lớn các sản phẩm sữa lên men, điều này được ông báo cáo trong sách “sự kéo dài cuộc sống” – The Prolongation of life (1908).

Có thể nói Tisser và Metchinikoff là người đầu tiên đưa ra những đề xuất mang tính khoa học về probiotic, làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo về probiotic Mặc dù vậy, thuật ngữ probiotic vẫn chưa được biết đến, mãi chođến khi Lilly và Stillwell (1965) đặt tên cho những chất tạo bởi một vi sinh vật có tác dụng kích thích sự phát triển của vi sinh vật khác [91] Packer là người đầu tiên đã sử dụng thuật ngữ probiotic theo ý nghĩa gần với định nghĩa ngày nay Ông định nghĩa: “Probiotic là những sinh vật và những chất góp phần vào sự cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột”, những chất trong định nghĩa củaPacker mang ý nghĩa bao gồm cả chất kháng sinh Sau đó Fuller (1989)đã nỗ lực để cải tiến định nghĩa probiotic của Packer và định nghĩa như sau: probiotic là phần bổ sung vào thực phẩm những vi sinh vật sống, tạo những ảnh hưởng có lợi trên đọng vật chủ bằng cách cải thiện sự cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột vật chủ [92] Một định nghĩa tương tự về probiotic đã được đưa ra bởi Havenaar (1992): probiotic là một hoặc hỗn hợp vi khuẩn có thể tồn tại được khi đưa vào cơ thể động vật hoặc con người và tạo nên những tác động có lợi trên vật chủ bằng cách cải thiện đặc tính hệ vi sinh vật của vật chủ [93].

Gần đây hơn, một định nghĩa khác về probiotic cũng được đưa ra bởi Guarner (1998):

Probiotic là những vi sinh vậtsống mà khi được tiêu thụ một lượng thích hợp, sẽ tạo nên những hiệu quả tốt trên sức khỏe của cơ thể chủ [94].

Các vi sinh vật dùng làm probiotic thường có các đặc điểm sau:

 Có khả năng bám dính vào niêm mạc đường tiêu hóa vật chủ.

 Không sinh độc tố và g ây bệnh cho vật chủ.

 Có khả năng tồn tại trong một thời gian dài.

 Có khả năng sinh các enzyme, chất kháng sinh hoặc các sản phẩm cuối cùng mà vật chủ có thể sử dụng được.

 Chịu được pH thấp ở dạ dày và muối mật ở ruột non.

 Biểu hiện hiệu quả có lợi đối với vật chủ. Ảnh hưởng của các chế phẩm probiotic có thể trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua khu hệ vi sinh vật đường ruột Nhiều chế phẩm loại này rất có lợi cho sức khỏe con người.

Chúng được sản xuất ở ba dạng: dạng viên, bột hoặc nước.

Hoạt tính kháng khuẩn: Lựa chọn các chủng có khả năng sản sinh các chất kháng khuẩn là đặc tính quan trọng nhất trong phát triển probiotic Các chủng probiotic cần có hoạt tính ức chế các vi khuẩn gây bệnh như E.coli, Salmonella, Campylobacteria, Listeria monocytogene, … Hoạt tính kháng khuẩn của chúng có thể thực hiện theo các cơ chế: sản sinh các chất bacteriocin, nisin, làm giảm pH do tạo acid lactic, acid acetic, tạo ra H2O2, làm kháng độc tố theo các cơ chế khác nhau.

Tăng cường hệ thống miễn dịch: Probiotic là phương tiện phân phát các kháng nguyên cho đường ruột Chính các kháng nguyên này kích thích tế bào niêm mạc ruột sản sinh ra kháng thể Đẩy mạnh sự báo hiệu cho tế bào chủ để giảm đáp ứng viêm và tạo đáp ứng miễn dịch để giảm dị ứng, tăng cường khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh, bảo vệ biểu mô Sự đáp ứng miễn dịch của probiotic được bày theo 3 cách:

 Tăng cường hoạt động của đại thực bào, nâng cao khả năng thực bào của sinh vật.

 Tăng khả năng sản xuất kháng thể thường là loại IgG , IgM và in terferon (nhân tố kháng virus không đặc hiệu).

 Tăng cường khả năng định vị kháng thể trên bề mặt ruột thường là IgA [97].

Khả năng tiêu hóa hấp thụ thức ăn: Probiotic tham gia vào sự trao đổi chất dinh dưỡng như carbohydrate, protein, lipid và khoáng nhằm tăng khả năng hấp thu chất dinh dưỡng Vi khuẩn probiotic sản sinh vitamin K, nhóm B, kích thích hấp thu khoáng và trợ giúp chuyển hóa, loại bỏ các chất độc tố Tăng cường khả năng hấp thụ các chất khó tiêu trong cơ thể như lactose nhờ enzyme β galactosidase chuyển hóa thành acid lactic dễ hấp thu và giảm triệu chứng cho người không dung nạp lactose [58].

Những người có enzyme β-galactosidase bất hoạt không có khả năng tiêu hóa và hấp thu lactose Ở các bệnh nhân này, các vi khuẩn hoạt động chuyển hóa lactose và có thể tạo ra các chất gây buồn nôn và tiêu chảy L.bulgaricus và các Lactobacilli khác thường được dùng trong các sản phẩm sữa lên men có tác dụng làm giảm lactose trong sản phẩm Báo cáo của Kilara (1975) cho rằng sữa chua chứa L.bulgaricus và S.thermophilus có lợi cho những người không có khả năng dung nạp lactose [95].

Giảm cholesterol: LAB (lactic acid bacteria) có một vai trò quan trọng trong việc giảm mức cholesterol gián tiếp bởi sự chuyển hóa cholesterol để tạo ra acid mật Vì vậy, làm giảm lượng cholesterol tổng số của cơ thể.

Khi nghiên cứu về việc giảm cholesterol cho thấy L.reuteri CRL 1098 giảm cholesterol toàn phần 38% khi nó được đưa vào cơ thể chuột trong 7 ngày với tỷ lệ 10 4 tế bào/ ngày Cũng với liều lượng L.reuteri này, triglyceride giảm 40%, không có sự di chuyển của hệ vi sinh vào lá lách và gan [61].

Chống viêm nhiễm hệ thống niệu đạo: Viêm nhiễm đường sinh dục là mất cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột do sử dụng kháng sinh, các chất khử trùng, hormones và các yếu tố khác Nhữngnghiên cứu sử dụng các viên thuốc chứa các chủng Lactobacillus

GR – 1, B – 54, RC – 14 đã thuđược kết quả khả quan trong việc phục hồi hệ sinh vật đường tiết niệu Bằng cách gia tăng hàng rào sinh học Lactobacillus ở âm đạo, người ta cho rằng tác nhân gây bệnh sẽ khó xâm nhập vào bàng quang Vì vậy, ngăn chặn được E.coli gây hiện tượng nhiễm trùng đường tiết niệu ở phụ nữ [62].

Ngăn ngừa ung thư: Hiện tượng đột biến xảy ra trong các tế bào có thể gây ra ung thư và các amin thơm dị vòng hình thành trong quá trình chế biến thức ăn có thể là tác nhân tiềm tàng gây ra ung thư Các nghiên cứu in vitro đã chứng minh rằng vách tế bào của vi khuẩn lactic có thể gắn kết các amin dị vòng Các vi khuẩn lactic hoặc các sản phẩm sữa lên men đều thể hiện tác dụng kháng các chất gây đột biến trong các thử nghiệm đột biến Salmonella typhimurium hoặc trên mô hìnhđộng vật [96] Các vi khuẩn có lợi có thể giảm các enzyme liên quan đến các tác nhân gây ung thư (β-glucoronidase, azoreductase, nitrosuctase, β-glucosidase) và làm giảm nguy cơ gây ung thư ruột kết [66]

Prebiotic và synbiotic

Prebiotic là chất xơ tan, là nguồn thức ăn cho vi sinh vật hữu ích trong đường ruột vật chủ (không phải cho vật chủ) Prebiotic không được tiêu hóaở đoạn trên của ống tiêu hóa do cơ thể vật chủ không có enzyme tương ứng nhưng sau khi qua dạ dày, ruột non đến ruột già thì kích thích sự sinh trưởng của vi khuẩn hữu ích phát triển, làm thay đổi hệ vi sinh vật đường ruột theo hướng có lợi cho vật chủ [101].

Các prebiotic thường được sử dụng là FOS, GOS và Inulin Các nghiên cứu chỉ ra rằng, sự kết hợp của probiotic với prebiotic làm tăng tác dụng hữu ích của probiotic đối với cơ thể [64].

Trong đó, tinh bột đề kháng (resistant starch) hoạt động như một chất xơ hòa tan, không bị thủy phân bởi amylase tuyến tụy khi vào hệ tiêu hóa, tồn tại dưới dạng khó tiêu [57] Sự phóng thích tế bào ở hệ tiêu hóa cũng tạo cho chúng chức năng prebiotic vì chúng có thể được sử dụng bởi vi khuẩn probiotic có trong ruột, trấn áp vi khuẩn có hại và những độc tố của chúng Khi vi khuẩn lên men tinh bột đề kháng sẽ hình thành một số hợp chất như chất khí và acid béo mạch ngắn (SCFA) như butyric acid Vì thế, tinh bột đề kháng gián tiếp cung cấp butyric acid cho tế bào thành ruột già và trực tiếp làm giảm pH, giảm viêm đại trực tràng của cơ thể vật chủ.

Tùy vào cách hình thành mà tinh bột đề kháng có các loại sau đây:

RSI: Tinh bột được tổng hợp trong nội nhũ của hạt ngũ cốc hay các hạt họ đậu và hạt tinh bột bao quanh bởi protein và vách tế bào Những cấu trúc vật lý cản trở khả năng tiêu hóa tinh bột và làm giảm các phản ứng đường huyết.

RSII: Có trong thực phẩm giàu bột như tinh bột khoai tây, tinh bột chuối xanh (chuối chưa chín), tinh bột cao ngô, … hiển thị kiểu đa hình B, C, có khả năng chống thủy phân enzyme.

RSIII: Sự thoái hóa tinh bột Hình thành từ một số loại thực phẩm như khoai tây hoặc gạo nấu chín rồi để nguội Quá trìnhđể nguội đã chuyển hóa một số loại tinh b ột dễ tiêu hóa thành tinh bột đề kháng thông qua cơ chế thoái hóa tinh bột Các phân tử amylose có khuynh hướng lớn tạo xoắn kép nên không có vị trí phù hợp gắn amylase nên không bị thủy phân bởi enzyme này.

RSIV: Tạo ra bằng phương pháp hóa học.

RSV: Sự hình thành phức hợp amylose – lipid khi amylose và amylopeptin tương tác tạo phức xoắn ốc với các acid béo và rượu nên hạn chế sự thủy phân enzyme.

Prebiotic có thể tác động theo nhiều cách để giúp ngăn ngừa các tác nhân gây bệnh như: (1) kích thích chọn lọc các vi khuẩn lactic, cho phép chúng cạnh tranh hiệu quả nguồn dinh dưỡng trong ruột với các tác nhân gây bệnh; (2) sản phẩm cuối của quá trình lên men prebiotic cung cấp nguồn dinh dưỡng cho các tế bào niêm mạc ruột; (3) acid hữu cơ và các protein kháng nguyên (các bacteriocin) được tiết ra bởi các vi khuẩn lactic có thể ảnh hưởng ức chế các tác nhân gây bệnh phổ biến trong đường ruột Khi oligofructose được bổ sung vào môi trường nuôi cấy Bifidobacterium infantis và hai tác nhân gây bệnh tiềm năng (E.coli và Clostridium perfringens) đã làm giảm nhanh chóng số lượng của hai tác nhân gây bệnh này khi so sánh với môi trường đối chứng (chứa glucose thay vì prebiotic) [102] Một số nghiên cứu khác đã xác minh ảnh hưởng của inulin và oligofructose lên việc ứcchế sự phát triển và ký sinh của các tác nhân gây bệnh.

1.3.2 Synbiotic và vai trò của synbiotic

Synbiotic được định nghĩa như là “một hỗn hợp các probiotic và prebiotic tác động có lợi đến vật chủ bằng việc cải thiện sự tồn tại và sinh sống của các sinh vật trong đường tiêu hóa thông qua kích thích chọn lọc sự phát triển của chúng và/ hoặc kích thích sự trao đổi chất của một hoặc một số lượng giới hạn những vi khuẩn có lợi” [103] Probiotic và prebiotic có thể sử dụng riêng lẻ hoặc chúng có thể kết hợp với nhau trong hạt vi gói.

Các nhà khoa học tìm thấy hiệu quả của synbiotic mang lại cho con người nhiều tác động hơn so với khi sử dụng từng chất riêng lẻ như khả năng chống vi khuẩn gây hại, chống lại các chất sinh ung thư, khả năng chống tiêu chảy, khả năng chốn g dị ứng, ngăn ngừa loãng xương, điều hòa hệ miễn dịch, giảm mỡ trong máu Nghiên cứu về ảnh hưởng của synbiotic lên hoạt động enzyme và trao đổi chất của các vi khuẩn trong phân chuột khi cho chúng ăn B.longgum, inulin hoặc kết hợp [104] Kết quả cho thấy, việc sử dụng riêngB.longgum làm giảm 30% hoạt động của β-glucuronidase, trong khi đó 55% khi sử dụng cả hai tác nhân là B.longgum và inulin [65].

Bệnh huyết khối và enzyme nattokinase

Nguyên nhân của hơn 28% các ca tử vong trên thếgiới là do bệnh huyết khối gây ra Trên thế giới, hàng năm có khoảng 5 triệu người chết vì đột quỵ do tai biến mạch máu não (nhồi máu não và xuất huyết não) và 7 triệu người tử vong vì nhồi máu cơ tim [122] Hàng năm ở Liên hợp chủng Hoa Kỳ (USA) có khoảng 6 triệu người bị suy tim, trong số này khoảng 1,5 triệu bị bệnh tim mạch và 1/3 của con số đóbị tử vong Khoảng 1/5 trong số các trường hợp bị bệnh tim mạch không hề có triệu chứng hay cảnh báo trước Tỷ suất đàn ông người Mỹ chết vì bệnh tim là khoảng 200/100000 dân số trong khi ở Scotland là 320/100000; Anh là 250/100000 cao gấp hai lần so với các nước như Hà Lan, Pháp Ở một số nước châu Á như Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc, Philippin, Việt Nam… tỷ lệ mắc bệnh nghẽn động mạch cao hơn[123].

Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), cứ mỗi 2 giây có 1 người chết vì bệnh tim mạch Cứ mỗi 5 giây thì có 1 trường hợp nhồi máu cơ tim và mỗi 6 giây thì có 1 trường hợp đột quỵ Hiện có đến 300 yếu tố nguy cơ kết hợp với bệnh mạch vành và đột quỵ sẽ dẫn đến bệnh tim mạch Ngoài đột quỵ do tim mạch, đột quỵ do tai biến mạch máu não ở Việt Nam ngày càng cao có nhiều người trẻ tuổi mắc phải Theo thống kê,thành phố Hồ Chí Minh mỗi năm có khoảng 17500 người bị đột quỵ do tai biến mạch máu não, trongđó 9000 người bị tử vong, đa số còn lại là sống kiểu thực vật hay mất khả năng lao động[124].

1.4.2 Huyết khốivà phân loại huyết khối theo lâm sàng.

Huyết khối có thể được định nghĩa là một quá trình bệnh lý do một sự phát động và lan rộng bất hợp lý của phản ứng đông cầm máu của cơ thể dẫn đến hình thành cục máu đông trong lòng mạch máu [11] Tuỳ theo kích thước của huyết khối, đường kính mạch máu mà huyết khối có thể gây tắc mạch hoàn toàn, bán tắc hay nghẽn mạch,

Vềcấu trúc, huyết khối thường có hai loại là huyết khối trắng và huyết khối đỏ, ngoài ra còn có thểgặp huyết khối hỗn hợp Huyết khối trắng được hình thành khi tế bào nội mạc bị tổn thương, tiểu cầu dính và ngưng tập, hình thành nút cầm máu với thành phần chủ yếu là tiểu cầu Vì vậy huyết khối có màu trắng, đây là loại huyết khối thường gặpở động mạch như động mạch vành, động mạch não,động mạch thận Huyết khối đỏ được hình thành chủ yếu khi dòng máu chảy chậm, thành phần chủ yếu là sợi fibrin bao bọc hồng cầu,đây là loại huyết khối thường gặp ở tĩnh mạch như tĩnh mạch chi dưới,

Trong thực tế, ta có thểgặp một huyết khối với cấu trúc ban đầu (phầnđầu dính vào thành động mạch) là huyết khối trắng với thành phần chủ yếu là tiểu cầu còn phần hình thành muộn hơn (phần đuôi, buông tự do trong lòng mạch) được hình thành khi lòng động mạch đã bị hẹp tốc độdòng chảy đã chậm, lại là huyết khối đỏ với thành phần chủ yếu là sợi fibin và hồng cầu.

Tuỳtheo loại huyết khối mà có sựkhác nhau vềthành phần huyết khối cũng như vai trò của các yếu tốkhác nhau trong hình thành huyết khối[11] :

Huyết khối động mạch: thành phần chủ yếu của cục đông trong huyết khối động mạch là tiểu cầu, sau đó mới là fibrin và những thành phần khác Tổn thương thành mạch và tăng hoạt hoá tiểu cầu đóng vai trò chủ yếu trong tăng đông gây huyết khối động mạch Các yếu tố nguy cơ thường gặp: tănghuyết áp, đái tháo đường, rối loạn lipid,

Huyết khối tĩnh mạch: thành phần chính của huyết khối tĩnh mạch là fibrin Tăng đông do giảm các chất ức chế sinh lý đông máu (giảm AT III, PC, PS ) hoặc tăng hoạt hoá các yếu tố đông máu (hoạt hoá yếu tố đông máu bởi yếu tốtổchức sau phẫu thuật, tai biến sản khoa ) là nguyên nhân chính gây ra huyết khối tĩnh mạch Một tình trạng bất động, nhiễm trùng, có thai sẽ làm tăng khả năng bị huyết khối tĩnh mạch ở những bệnh nhân này.

Huyết khối ở các vi quản : thường gặpở bệnh nhân có hội chứng đông máu rải rác trong lòng mạch (DIC: Disseminated Intravasscular Coagulation), xuất huyết giảm tiểu cầu huyết khối (TTP: Thrombotic Thrombocytopenic Purpura) thường do một tình trạng tăng đông gây nên bởi đa yếu tố: thành mạch, tiểu cầu, hoạt hoá các yếu tố đông máu huyết tương.

1.4.3 Sự phân hủy huyết khối bởi enzyme nội sinh plasmin.

Trong cơ thể, sau khi nút huyết khối được hình thành và hoàn thành nhiệm vụ cầm máu của mình, nó sẽ bị hòa tanđể trảlại sự lưu thông bình thường của lòng mạchbởi hệ thốngtiêu sợi huyết Trongquá trình này plasmin là chấttiêu fibrin hiệuquảnhất. Ở giaiđoạn này, plasminogen (dạng không hoạt động) trong huyết tươngđược hoạt hóa để trở thành plasmin (dạng hoạt động) Plasmin hình thành có chứcnăng phân hủy fibrinogen, fibrin và một số yếu tố đông máu khác như: IX, VII… Plasmin là một serine protease tuần hoàn dưới dạng preproenzyme Plasmin tuần hoàn tự do thường bị ức chế bởiα 2 –antiplasmin [2].

Plasminogen là proenzyme của plasmin, được tổng hợp bởi tế bào gan, có mặt trong huyếttương, tiểu cầu và tế bào nội mạc mạch máu Plasmin là một serine protease nội sinh được chuyển từ tiền chất của nó là plasminogen bởi các chất hoạt hóa plasminogen trongđó hai dạng quan trọng nhất trong cơ thể là t-PA (tissue Plasminogen Activator: chất hoạt hóa plasminogen mô) được sản xuất chủ yếu bởi tế bào nội mạc và Urokinase (u-PA: urokinase Plasminogen Activator) được tổng hợp bởi tế bào thận dưới dạngtiềnchấtprourokinase. u-PA tạo ra từ pro-uPA là nhân tố có ái lực với thụ thể (receptor) chuyên biệttrên bề mặt tế bào uPAR, sự gắn kết giữa pro-uPA và receptor uPAR hoạt hóa uPA chuyển plasminogen thành plasmin Protein C là chất kháng đông sinh lý chính, một enzym serine protease phụ thuộc vitamin K được thrombin hoạt hóa thành APC(activated protein C), dạng hoạt hóa này sẽ ức chế PAI-1 là nhân tố ngăn cản các chất hoạt hóa tPA và uPA chuyển plasminogen thành plasmin Quá trình tiêu sợi huyết được kiểm soát bởi những chất cótínhức chếcác yếu tố hoạt hóa plasminogen và những chấtlàm bấthoạt plasmin Nhờ đómà ngăn ngừađược sự mấtfibrinogen và những yếu tố đôngmáu khác [48].

Hình 1.5: Cơ chế thủy phân fibrin [48]

1.4.4 Cấu trúc của enzyme nattokinase

Nattokinase là một enzyme có hoạt tính fibrinolytic cao, có thể sinh ra từ Bacillus subtilis, Bacillus fusarium và Rhizomucor sp.

Bác sỹ Sumi Hyroyuki đã nghiên cứu trong thời gian dài các enzyme hoạt huyết và khám phá ra nattokinase năm 1980 khi ông đang giảng dạy tại khoa Hóa sinh trường Đại học Chicago – Mỹ Sau khi thử nghiệm trên 173 loại thực phẩm tự nhiên và nhận thấy natto làm tan cục máu đông nhân tạo (fibrin) trên đĩa Petri ở 37 o C, các cục máu đông xung quanh natto hòa tan dần và tan hoàn toàn trong vòng 18 giờ Ông đặt tên enzym này là "nattokinase", có nghĩa là "enzyme trong natto".

Năm 1986 Sumi Hyroyuki công bố toàn bộ kết quả nghiên cứu về tác dụng của nattokinase sau khi thử nghiệm gần 200 loại thực phẩm khác nhau để so sánh Xác định nattokinase là một loại enzyme có khả năng phân hủy huyết khối một cách hữu hiệu và mạnh nhất trong các loại enzyme, gấp 4 lần plasmin enzyme nội sinh làm tan máu đông.

Nattokinase đã được chứng minh lâm sàng về hiệu quả và an toàn trong điều trị huyết khối ở người qua đường uống [27] [10].

Kí hiệu: EC=3.4.21.62 Trong đó:

Hình 1.6 :Cấu trúc bậc 3 của nattokinase [46]

Nattokinase là một enzyme ngoại bào có bản chất là protein, có cấu trúc không gian tạo thành từ một chuỗi polypeptide duy nhất bao gồm 275 amino acid, có trọng lượng phân tử WM = 27738Da, pI = 0,8+0,3, có tính chất tương đồng cao với cơ chất và không có cầu disulfide [36] pH tối thích 8,0, nhiệt độ tối thích 40 0 C, 80% hoạt tính tồn tại ở50 0 C sau một giờ, 70% ở 60 0 C sau 40 phút và mất hoạt tính hoàn toàn ở nhiệt độ trên60 0 C.

Nattokinase thuộc họ subtilisin của serine protease kiềm, cũng có trung tâm ho ạt động bao gồm nhóm hydroxyl của Ser – 221, nhóm imidazol của His – 64 và nhóm carboxyl của Asp–32[36][40].

1.4.5 Cơ chế hoạt động của nattokinase

Nattokinase lần đầu tiên được phân lập từ B.subtilis natto và được phát hiện có khả năng làm tan đặc hiệu fibrin bởi nhóm Sumi và cộng sự (1987) Sau đó nhóm này tiếp tục chứng minh nattokinase rất hữu dụng trong việc phân hủyhuyết tụ nội sinh ở người vì hoạt tính cao được duy trì ở nội mạc trong thời gian dài bằng liều uống do chịu được tác động của hệ tiêu hóa Hơn nữa, enzyme này cũng tăng cường sản sinh ra plasmin.

Kỹ thuật vi gói sấy phun

Phương pháp vi gói là cách bẫy hoặc nhốt tế bào vi sinh vật bằng các chất vi gói và vỏ bọc hydrocolloid Mục đích là bảo vệ probiotic trong quá trình chế biến (nhiệt độ, tác động cơ học, …), dự trữ (thời gian, độ ẩm, …),môi trường tiêu hóaở dạ dày và ruột non (muối mật, pH thấp, …) và p hóng thích những nơi ta mong muốn trong ống tiêu hóa. Để sản phẩm probiotic ổn định, tăng giá trị cảm quan và phân bố đồng đều trong sản phẩm thìđường kính hạt vi gói phải thích hợp từ vài nanomet đến vài milimet Một sản phẩm probiotic đạt chất lượng phải đảm bảo mật độ vi khuẩn lớn và khả năng chống chịu điều kiện khắc nghiệt tốt Đó cũng chính là lý dođể quyết định sử dụng vật liệu vi gói và phương pháp vi gói phù hợp.

Hình 1.8: Cấu tạo hạt bao vi gói [31]

1.5.1 Vật liệu vi gói 1.5.1.1 Tinh bột biến tính

Tinh bột gồm hai hợp phần: amylose và amylopectin Đa số tinh bột trong tự nhiên có từ 10 – 30% maylose và 70 –90% amylopectin Amylose có cấu tạo từ các đơn phân αD glucose liên kết với nhau bằng liên kết O 1 – 4 glycoside tạo thành mạch dài không phân nhánh Amylopectin có cấu tạo từ các đơn phân αD glucose liên kết với nhau bằng liên kết O 1 –4 glycoside và O 1–6 glycoside tạo thành mạch dài có phân nhánh.

Tinh bột biến tính còn gọi là tinh bột đề kháng (RSIV), là sản phẩm của quá trình làm biến đổi về mặt hóa học của tinh bột, bằng cách hình thành cross-linking hoặc gắn thêm các nhóm chức khác nhau [57] Tinh bột với nhiều cross-linking sẽ không bị thủy phân bởi amylase Một số nhóm chứccủa tinh bột như nhóm octenyl succinic, nhóm acyl làmthay đổi cấu trúc hoặc một phần của tinh bột hạn chế các enzyme thủy phân phân hủy tinh bột Phần của tinh bột không có gắn nhóm chức có thể bị phân hủy bởi vi khuẩn lên men amylase và để sản xuất acid béo mạch ngắn (SCFA).

Starch cross-linking Starch octenyl succinic

Hình 1.9: Công thức cấu tạo của tinh bột biến tính [57].

Ngoài ra, tinh bột biến tính đóng vai trò như một tá dược rã nhằm làm tăng khả năng khuếch tán của dung dịch vào khối bột, tăng tốc độ hòa tan giúp phóng thích nhanh [3][9] Vì tinh bột biến tính liên kết chặt chẽ với nước nên khi hấp thu nước sẽ trương phồng lên khoảng 10 – 15% tùy loại Tinh bột càng khô thì hút nước và trương nở càn g mạnh, độ tan không phụ thuộc vào pH [3][9].

Maltodextrin là loại polysaccharide có công thức (C 6 H10O5)n.H2O (2< n 0,05).Điều này được giải thích như sau: khả năng sống sót của vi khuẩn probiotic sau sấy phun cũng phụ thuộc vào loại và nồng độ chất mang được sử dụng cũng như nhi ệt độ đầu vào và ra của thiết bị sấy Màng tếbào vi khuẩn rất dễbị tổn thương trong quá trình sấy phun Sự loại nước có thểgây tổn hại đến màng tế bào và protein trên màng, vì nước là thành phần quan trọng trong việc ổn định các phân tửsinh học.

Dựa vào kết quả hoạt tính nattokinase thu được thì ở tỷ lệ tinh bột biến tính và maltodextrin là 1: 9 cho hoạt tính cao nhất 518,5 FU/g Trong khi đó ở tỷlệtinh bột biến tính và maltodextrin là 0,5:9,5 cho hoạt tính nattokinase thấp nhất 510,8 FU/g Điều này chứng tỏ hàm lượng maltodextrin bổsung vào dịch trước khi sấy có ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi chế phẩm nattokinase Việc bổ sung maltodextrin càng nhiều thì lượng bột thu được sau sấy càng nhiều, tuy nhiên hiệu suất thu hồi chế phẩm lại không cao Hoạt tính nattokinase có trong mẫu tăng từ 8,5g maltodextrin đến 9g maltodextrin nhưng ở lượng maltodextrin 9,5g thì hoạt tính bắt đầu giảm dần. Đồng thời, khi khảo sát tỷlệtinh bột biến tính và maltodextrin là 1,5 : 8,5 nghĩa là hàm lượng maltodextrin chiếm 85% cho hiệu suất thu hồi là thấp nhất 54,46% Khi tăng hàm lượng maltodextrin lên 90% tương ứng với hiệu suất thu hồi sản phẩm là 78,66%.

Nhưng nếu tiếp tục tăng hàm lượng maltodextrin lên 95% thì hiệu suất thu hồi sản phẩm giảm còn 70,20% Nguyên nhân của sự thay đổi hiệu suất thu hồi sản phẩm không cao này do khi hàm lượng chất khô phối trộn dịch sấy phun quá thấp hoặc cao có thể gây ra sự kết dính sản phẩm vào buồng sấy trong quá trình sấy Khi hàm lượng chất khô vừa đủ thì hiệu suất thu hồi sản phẩm cực đại Dựa vào tiêu chí đánh giá hiệu suất thu hồi sản phẩm nên chọn tỷlệtỷlệphối trộn giữa tinh bột biến tính và maltodextrin 1:9 là phù hợp.

Ngoài ra, theo tiêu chuẩn chất lượng sản phẩm probiotic phải đạt độ ẩm≤10% Dựa vào tiêu chí này, tỷlệphối trộn giữa tinh bột biến tính và maltodextrin là 1 : 9 và 0,5 : 9,5 cho giá trị độ ẩm tốt nhất lần lượt là 9,11% và 9,01%.

Bảng 3.4: Hiệu suất vi gói của các tỷlệvật liệu vi gói

Tỷlệvật liệu vi gói Tổng mật độtếbào ban đầu log(CFU)

Tổng mật độtếbào sau vi gói log(CFU)

Hiệu suất vi gói (%) Tinh bột biến tính : Maltodextrin

Tinh bột biến tính : Maltodextrin

Tinh bột biến tính : Maltodextrin

Kết quả được tính dựa trên giá trịtrung bình với độlệch chuẩn n=3

Kết quả khảo sát cho thấy tinh bột biến tính kết hợp với maltodextrin sau khi sấy mật độgiảm đi 2 log(CFU) ởcác tỷlệ Với nồng độ chất mang là 5% (w/v) thì tỷlệphối trộn thích hợp giữa tinh bột biến tính và maltodextrin là 1:9, đểvi gói B.subtilis natto thì hiệu quả vi gói cao nhất là 81,20% Kết quả này cũng khá tương đồng với một nghiên cứu của Yufeng Wang (2014) về sấy phun B.amyloliquefaciens ở tỷlệtinh bột biến tính và maltodextrin là 1:9 cho hiệu suất vi gói cao nhất [55].

Dựa vào sựchênh lệch về mật độ vi khuẩn, hoạt tính natokinase, độ ẩm, hiệu suất thu hồi sản phẩm và hiệu suất vi gói của vi khuẩn B.subtilis natto khi sửdụng 3 tỷlệphối trộn khác nhau giữa tinh bột biến tính và maltodextrin, chúng tôi lựa chọn tỷlệphối trộn giữa tinh bột biến tính và maltodextrin là 1:9 đểtạo chếphẩm vi gói B.subtilis natto bằng phương pháp sấy phun.

3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đầu vào

Nhiệt độ là yếu tốquan trọng trong quá trình sấy [107] Nhiệt độ không khí đầu vào không chỉ ảnh hưởng đến hiệu suất của quá trình sấy mà còn ảnh hưởng đến chất lượng của sản phẩm thu được sau sấynhư độ ẩm, độhòa tan, kích thước hạt và mật độ Nhiệt độ không khí đầu vào thấp, tốc độ bốc hơi nước trong vật liệu thấp, độ ẩm của vật liệu sấy cao gây nên hiện tượng bám dính trên bình thu mẫu, gây khó khăn cho quá trình thu mẫu đồng thời ảnh hưởng đến thời gian bảo quản của chếphẩm Khi tăng nhiệt độ không khí đầu vào thì tốc độbốc hơi nước tăng theo, kích thước hạt tăng và độ ẩm trong vật liệu sấy giảm Tuy nhiên, nếu nhiệt độ tiếp tục tăng cao sẽ ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm thu được và làm giảm tỷlệthu hồi sản phẩm Vì vậy, nhiệt độ không khí đầu vào là thông sốquan trọng cần được khảo sát.

Trong quá trình sấy phun, lượng nước sẽ bị tách ra tế bào trực tiếp với dòng không khí nóng dẫn đến kết quả là tỷ lệ sống giảm và khả năng sống thấp trong quá trình bảo quản nhưng một vài dòng tế bào tốt hơn Một công trình nghiên cứu của O’Riordan (2001) đã lấy nguyên liệu bao gói là gelatin và tinh bột biến tính để bao gói Bifidobacterium với kết quảcho khả năng tồn tại rất tốt khi nhiệt độ đầu vào là 100 0 C và nhiệt đầu ra là 45 0 C [53] Nhiệt độ đầu vào nhỏ hơn 60 0 C sẽ làm dính sản phẩm trong cylone nhiều hơn, còn nhiệt độ đầu vào lớn hơn 120 0 C và nhiệt độ đầu ra lớn hơn 60 0 C thì giảm khả năng sống của vi khuẩn [83].

Theo nghiên cứu của E.Ananta (2005), độ ẩm tối thiểu ứng với nhiệt độ đầu ra là 80 0 C là 7% [111] Tuy nhiên, Master (1991) đãđ ề nghị nhiệt độ đầu ra của quá trình sấy phun để giảm điều kiện khắc nghiệt cho tế bào vi sinh vật Một thuận lợi nữa của việc giảm nhiệt độlà giảm tiêu tốn năng lượng cho quá trình sấy phun Ứng với chế độnày thì độ ẩm 8% là tối thiểu để đảm bảo sức sống cho tếbào vi sinh vật [112].

Khảo sát đặc điểm, cấu trúc hạt vi gói vi khuẩn B.subtilis natto sau vi gói bằng phương pháp sấy phun

bằng phương pháp sấy phun

Vi gói bằng phương pháp sấy phun thường được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm, công nghệ vi sinh và dược phẩm Quá trình sấy phun bao gồm sự nguyên tử hóa thể nhũ tương ho ặc huyền phù chứa probiotic và chất mang, gây nên sự bốc hơi nước nhanh chóng và cuối cùng các hạt vi gói thu được ở dạng bột khô Quá trình sấy được kiểm soát bởi nhiệt độ không khí đầu vào, nhiệt độ không khí đầu ra, lưu lượng dịch nhập liệu và áp suất phun Chính các thông sốkỹ thuật của quá trình sấy phun đã ít nhiều ảnh hưởng đến đặc điểm và cấu trúc của hạt vi gói như độ hòa tan, kích thước hạt, Trong đó kích thước của hạt vi gói thu được rất quan trọng vì nó ảnh hưởng đến đặc tính cảm quan của chếphẩm vi gói Ngoài ra, nhiệt độ đầu ra có thể ảnh hưởng đến màu sắc của vỏ bọc do phảnứng Maillard.

Mẫu chế phẩm vi gói được chụp bởi kính hiển vi điện tử quét bằng máy FE SEM S4800 HITACHI của Nhật Bản tại Phòng thí nghiệm công nghệNano – Đại học quốc gia thành phốHồ Chí Minh Qua hình 3.1 (a) cho thấy hìnhảnh hạt vi gói sau khi sấy phun và hình 3.1 (c) cho thấy hạt chếphẩm có màu trắng mịn Cấu trúc hạt bị biến dạng có thể do ma sát của các chất khô, tốc độbốc hơi nước nhanh, vận tốc không khí thổi vào Cấu trúc hạt bị biến dạng có thể có thể làm tăng diện tích tiếp xúc của vi khuẩn với môi trường cực đoan SGF và SIF, điều này có thể làm giảm đi khả năng chống chịu của vi khuẩn với môi trường cực đoan.

Kết quả thu được sau khi đo kớch thước của hạt vi gúi dao động từ 1,68àm –3,64àm, kớch thước trung bỡnh là 2.41àm Điều này mang lại lợi thế về khớa cạnh cảm quan nhưng kích thước hạt vi gói từquá trình sấy phun không đồng đều Kết quảnày phù hợp với nghiên cứu của O’Riordan (2001) với chất mang là tinh bột biến tính cho kích thước trung bỡnh vào khoảng 5àm [53] Kớch thước chế phẩm vào khoảng 5,6àm đến 5,9àm với chất mang là tinh bột tựnhiờn cũng được bỏo cỏo bởi Sandra [54]. Đồng thời, kích thước của chế phẩm vi gói không bị ảnh hưởng bởi nồng độ chất mang cũng như nhiệt độ đầu vào của quá trình sấy phun [54] Kết quả tương tự thu được từ nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, việc bổsung tinh bột biến tính trong quá trình sấy phun không cóảnh hưởng đến kích thước và cấu trúc bềmặt của hạt vi gói (hình 3.1).

(c) Hình 3.1: (a)ảnh hạt vi gói được chụp bằng SEMở độ phóng đại 10000 lần, (b) kích thước hạt vi gói, (c) chếphẩm vi gói

Tái khảo sát một số đặc điểm và hoạt tính probiotic của B.subtilis natto trong chế phẩm vi gói theo thời gian bảo quản

chế phẩm vi gói theo thời gian bảo quản

Nghiên cứu kết hợp giữa probiotic và prebiotic trong hạt vi gói cũng nhận được rất nhiều sự quan tâm của các nhà nghiên cứu Sự kết hợp cả hai, giữa prebiotic và calcium alginate trong lớp áo có thểbảo vệprobiotic tốt hơn trong đường tiêu hóa [108][109].

Với mục đíchkhảo sát ảnh hưởng của phương pháp sấy phun và vai trò bảo vệ của vật liệu vi gói (tinh bột biến tính và maltodextrin) dùng trong vi gói sấy phun tới khả năng cải thiện số lượng và bảo toàn đặc tính probiotic của B.subtilis natto trong các môi trường cực đoan và điều kiện kỹthuật của sấy phun.

Tếbào B.subtilis natto dạng tự do giảm khả năng sống sót trong môi trường pH 2 và môi trường muối mật 0,3% Với tinh bột biến tính và maltodextrin giúp vi khuẩn B.subtilis natto cải thiện khả năng sống trong môi trường pH 2 và muối mật 0,3%.

Khả năng sống sót của B.subtilis natto trong SGF, SIF ở chế phẩm vi gói ban đầu, sau 30 ngày và 60 ngày bảo quản được thể hiện ở đồ thị 3.5 Ở tế bào vi gói khả năng sống sót của vi khuẩn B.subtilis natto sau vi gói còn rất cao cao sau 2 giờ ủtrong SGF và sau 4 giờ ủtrong SIF. Đồthị 3.5: Khả năng sống sót của B.subtilis natto sau khiủtrong SGF và SIFởchếphẩm vi góiban đầu, sau 30 ngày và sau 60 ngày bảo quản.

Trong môi trường SGF sau 2 giờ ủ, mật độ vi khuẩn ở chế phẩm vi gói ban đầu giảm 0,57 log(CFU/g), trong khi đó mật độtếbào tựdo giảm 1,96 log(CFU/ml) Mẫu chế phẩm được bảo quản đến ngày thứ 30, chúng tôi tiếp tục thửnghiệm trong SGF sau 2 giờ ủthì kết quảcho thấy khả năng sống sót không có sự khác biệt so với vi góiban đầu, mật độ vi khuẩn chỉ giảm 0,61 log(CFU/g) Sau 60 ngày bảo quản và thử nghiệm chế phẩm trong môi trường SGF, mật độ vi khuẩn giảm sau 2 giờ ủ 0,55 log(CFU/g) Trong môi trường SIF sau 4 giờ ủ, mật độvi khuẩnởchếphẩm vi góiban đầu giảm 1,13 log(CFU/g) trong khi đó mật độ tế bào tự do giảm 1,84 log(CFU/ml) Sau 30 ngày và 60 ngày bảo quản, mật độ vi khuẩn giảm lần lượt là 1,39 log(CFU/g) và 1,58 log(CFU/g) sau 4 giờ ủ trong SIF.Điều này chứng tỏvai trò bảo vệcủa vật liệu vi gói đã cải thiện được khả năng sống của B.subtilis natto so với tế bào tự do Trong môi trường SGF và SIF, khả năng sống sót của B.subtilis natto vi gói đãđược cải thiện trong suốt quá trình bảo quản là 60 ngày.

Việc vi gói tạo sản phẩm synbiotic cho hiệu quả bảo vệ B.subtilis natto cao hơn đáng kể so với dạng tự do Vì tinh bột biến tính thực hiện chức năng như một prebiotic, đã cải thiện khả năng sống của vi khuẩn B.subtilis natto trong điều kiện pH 2 và muối mật nhân tạo 0,3% Iyer (2005) cho rằng các probiotic có cơ chế trao đổi cơ chất đặc biệt hiệu quả đối với các prebiotic hơn là các đường đơn [80] Sự kết hợp này đã giúp nâng cao tỷlệsống của vi khuẩn B.subtilisnatto trong điều kiện pH 2 và muối mật 0,3%.

Kết quả thực nghiệm cho thấy: chế phẩm vi gói đã cải thiện khả năng sống của B.subtilis natto trong môi trường SGF và SIF.

Tóm lại, từ những nghiên cứu trên cho thấy vi khuẩn B.subtilis được bao vi gói bằng phương pháp sấy phun đã bảo toàn và cải thiện đáng kể vi khuẩn probiotic vượt qua điều kiện cực đoan của hệ tiêu hóa (pH thấp của dạdày, muối mật của ruột non) và điều kiện bảo quản của sản phẩm Sự kết hợp giữa tinh bột biến tính và maltodextrin được lựa chọn trong nghiên cứu này đã bảo vệ tế bào vi khuẩn vượt qua điều kiện cực đoan đó.

3.6 Thửnghiệm tạo viên nang synbiotic

Sau khi tạo chếphẩm vi gói đểthuận lợi cho việc sử dụng và kéo dài thời gian bảo quản chếphẩm, đề tài tiến hành thử nghiệm đóng viên nang Viên nang là một cách giúp bảo vệ tế bào B.subtilis natto trong quá trình bảo quản Vỏ nang ngăn cản sự thẩm thấu của oxi vào sản phẩm, hạn chếsự cảm ứng probiotic tạo H2O2 làm giảm chất lượng sản phẩm. Ép viên được thực hiện tại Công ty cổphẩn dược phẩm Tiền Giang (Tipharco) với đầu rót tương ứng 500mg/viên.

Hình 3.2: Chếphẩm synbiotic dạng viên nang từ B.subtilis natto

Bảng 3.7: Sựthay đổi mật độB.subtilis natto, nattokinasevà độ ẩm theo thời gian bảo quản

Thời gian Mật độtếbào log(CFU/g)

Nattokinase (FU/g) Độ ẩm (%) Chếphẩm vi gói ban đầu 8,55 ± 0,18 518,2 9,11

Chếphẩm vi gói sau 30 ngày 8,31 ± 0,04 518,5 9,14

Chếphẩm vi gói sau 60 ngày 7,92 ± 0,09 515,5 9,18

Kết quả được tính dựa trên giá trị trung bình ±độlệch chuẩn (n=3)

Sản phẩm viên nang synbiotic được lưu trữ ở nhiệt độ phòng (25 0 C) và chỉ tiêu được đánh giá là mật độvi khuẩn B.subtilis natto, hoạt tính nattokinase và độ ẩm của sản phẩm theo ngày.

Qua hai tháng bảo quản mẫu ở nhiệt độ phòng, số liệu từ bảng 3.7 cho thấy không có dấu hiệu sụt giảm mật độ vi khuẩn B.subtilis natto, hoạt tính nattokinase hay gia tăng độ ẩm của sản phẩm Đối với mật độvi khuẩn B.subtilis natto, sau vi gói là 8,55 ± 0,18 log(CFU/g) cho đến ngày thứ 60 là 7,92 ± 0,09 log(CFU/g) và không có sự khác biệt (p>0,05).

Qua kiểm tra nattokinase, kết quả cho thấy hoạt tính của chế phẩm khá ổn định trong 60 ngày theo dõi dao động trong khoảng (518,2 - 515,5) FU/g Hiện nay một số thực phẩm chức năng trên thị trường chứa nattokinase dạng viên nang nhập khẩu từ Nhật Bản, Mỹ như Nattospes (3000 FU/g), Japato (600 FU/g), Nattokinase plusTM (3000 FU/g), Dosaka (300 FU/g) [16] Qua đó cho thấy sản phẩm của chúng tôi nằm trong mức có thể cao hơn hoặc thấp hơn trên thị trường (mức trung bình) về hoạt tính nattokinase Nhưng điểm khác so với các sản phẩm khác trên thị trường là có sự tích hợp thêm hoạt tính probiotic Hoạt tính này được bảo vệbằng kỹthuật vi gói sấy phun. Ở chỉ tiêu độ ẩm, viên nang synbiotic vẫn giữ ở mức 0,05) so với ngày thứ60 khoảng 9,18%. Đồthị3.6: Khảnăng sống sót của vi khuẩn B.subtilisnatto trong các giai đoạn bảo quản sản phẩm

Qua đồthị 3.6 cho thấy mật độvi khuẩn B.subtilis natto giảm dần theo thời gian bảo quản sản phẩm Nguyên nhân dẫn đến mật độ giảm dần theo thời gian là do vi khuẩn tồn tại trong môi trường có độ ẩm thấp Chính nhiệt độ cao cần phải có trong kỹ thuật sấy phun đểkích hoạt quá trình bốc hơi nước đã làm giảm khả năng sống của probiotic và cả hoạt động của chúng trong sản phẩm cuối cùng.

Theo Karrtheek (2013), maltodextrin ngoài vai trò hỗ trợ quá trình sấy phun, maltodextrin còn có vai trò như prebiotic [82] Theo chúng tôi, lượng chất mang tinh bột biến tính và maltodextrin 5% (w/v) trong nghiên cứu đã thực hiện đầyđủ vai trò của một prebiotic đểcải thiện khả năng sống của B.subtilis natto trong quá trình bảo quản.

Khả năng sống sót của vi khuẩn trong thời gian bảo quản là rất cao 92,63% tương ứng sau 60 ngày cho thấy vi khuẩn B.subtilis natto phù hợp trong tạo chế phẩm bằng phương pháp sấy phun tạo ra dạng chế phẩm khô bảo quản lâu và hướng tới ứng dụng của nó.

Sau quá trình theo dõi bảo quản viên nang, một số so sánh sản phẩm khác trên thị trường Về khía cạnh probiotic, tiêu chuẩn của WHO bắt buộc sản phẩm phải có mật độ probiotic tối thiểu là 10 6 CFU/g Tiêu chuẩn vềnattokinase, một sốsản phẩm nattokinase trên thị trường dao động khoảng (300 – 3000) FU/g trong khi đó sản phẩm của nghiên cứu này từ(518,2 - 515,5) FU/g Về độ ẩm của sản phẩm nằm trong mức chấp nhận được là dưới 10% Trong sản phẩm này có hai tính mới: một là hoạt tính probiotic được vi gói bằng kỹ thuật sấy phun cho thấy có khả năng bảo toàn một số hoạt tính và cải thiện những điều kiện cực đoan trong hệtiêu hóa; hai là hoạt tính nattokinase nằmởmức trung bình trong các dòng thực phẩm chức năng trên thịtrường Vì vậy, tính mới của đề tài là sự tích hợp cả hai hoạt tính này trong cùng một sản phẩm với hy vọng tạo ra dòng thực phẩm chức năng vừa có hoạt tính probiotic vừa có hoạt tính nattokinase để phòng ngừa bệnh huyết khối.