Nghiên cứu điều kiện thu hồi và tạo chế phẩm nattokinase từ bacillus subtilis natto 5

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC * * Má KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Đề tài’ “Nghiên cứu điều kiện thu hồi tạo chế phẩm nattokinase tù' Bacillus subtìlìs natto 5” Giáo viên hướng dẫn : Ts.Hồ Tuyên Sình viên thực : Nguyễn Thị Diệu Linh Lóp : 1302 Hà Nội-2017 LỜI CẢM ƠN Đe thực tốt đề tài nghiên cứu này, nhận nhiều quan tâm giúp đỡ tận tinh từ phía gia đình, thầy cô bạn bè Trước hết xin gửi lời cám ơn tới TS Hồ Tuyên người hướng dần giúp đỡ tơi thực khóa luận tốt nghiệp với cán bộ, nhân viên, sinh viên thực tập phịng Cơng nghệ Lên men, Viện Cơng nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam chì bảo giúp đờ tơi q trình nghiên cứu đề tài Tơi xin gứi lời cảm ơn tới thầy cô Khoa Công nghệ Sinh học, Viộn đại học Mở Hà Nội giúp đờ tạo điều kiện thuận lợi cho q trình học tập thực khóa luận tốt nghiệp Cuối xin cảm ơn người thân gia đình, câm ơn anh chị em, bạn bè ln động viên, khích lệ tạo động lực cho tơi suốt q trình thực khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, ngày 15 tháng năm 2017 Sinh viên Nguyễn Thị Diệu Linh MỤC LỤC LỜI CÁM ƠN i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỪ VIẾT TẮT V DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii MỞ ĐÀU PHẦN - TÓNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu nattokinase 1.1.1 Nguồn gốc đặc tính cùa nattokinase 1.1.2 Cơ chế hoạt động nattokinase 1.1.3 ứng dụng nattokinasc 1.1.4 Nguồn gốc thu nhận nattokinase 10 1.2 Tình hình nghiên cứu nattokinasc The giới Việt Nam 11 1.2.1 Tình hình nghiên cứu Thế giới 11 1.2.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam .12 1.3 Giới thiệu Bacillus Subtilis natto 14 1.3.1 Hệ thống phân loại phân bố tự nhiên 14 1.3.2 Đặcđiểm hình thái 15 1.3.3 Đặc điểm sinh hóa 16 1.3.4 Đặcđiểm nuôi cấy 17 1.4 Ánh hướng cúa nguồn carbon nitơ tới sinh trướng phát triến vi sinh vật 18 1.4.1 Ảnh hướng nguồn carbon 18 1.4.2 Ảnh hưởng nguồn nitơ 19 1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình thu nhận nattokinasc 19 1.5.1 Ánh hường cùa nhiệt độ 19 1.5.2 Ảnh hưởng thành phần môi trường 20 1.5.3 Ánh hường pH môi trường 20 ii 1.5.4 Ảnh hưởng thời gian lên men 20 1.5.5 Độ thơng khí 21 PHẦN - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 22 2.1 Vật liệu 22 2.1.1 Chúng giống 22 2.1.2 Mơi trường hóa chất 22 2.1.3 Chất mang 23 2.1.4 Thiết bị 24 2.2 Phương pháp nghiên cứu 25 2.2.1 Phương pháp xác định mơi trường có nguồn carbon nguồn nitơ tối ưu sứ dụng lên men Baccìlus subtilis natto 25 2.2.2 Phương pháp kết tủa nattokinase bàng muối ammonium sulphate 26 2.2.3 Phương pháp kết túa nattokinasc bàng acetone 27 2.2.4 Phương pháp đông khô đế thu nhận enzyme tạo chế phẩm 28 PHÀN - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 Lựa chọn môi trường lên men có nguồn carbon nguồn nitơ thích hợp cho sinh tổng hợp nattokinase Bacillus Suhtilis Natto 30 3.1.1 Nguồn carbon 30 3.1.2 Nguồn nitơ 31 3.2 Kct xác định điều kiện thu hồi enzyme nattokinasc 32 3.2.1 Xác định nồng độ (NH4)2SO4 thích hợp để kết túa nattokinase có dịch lên men 32 3.2.2 Xác định nồng độ acetone thích hợp đề kết tủa nattokinase có dịch lên men 32 3.3 Xác định điều kiện quy trình tạo chế phẩm nattokinasc .34 3.3.1 Chất mang tạo chế phẩm 34 3.3.2 Quy trình cơng nghệ thu hồi tạo chế phấm nattokinasc từ B.sub tilis natto 36 PHẦN - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39 iii 4.1 Kết luận 39 4.2 Kiến nghị 39 TÀI LIỆU THAM KHÁO 40 iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TÁT STT Tên đầy đủ Từ viết tắt AA Amino acid ACE Angiotensin converting enzyme B.natto Bacillus natto B.subtilis Bacillus subtilis BSD Bột san dây DNA Deoxyribonucleic acid HATT Huyết áp tâm thu HATTr Huyết áp tâm trương LDL Low-density lipoprotein 10 MT Môi trường 11 NK Nattokinase 12 PAI-1 Plasminogen-Activator Inhibitor 13 Pr Protein 14 THA Tăng huyết áp 15 t-PA Tissue plasminogen activator 16 UK Urokinase 17 vsv Vi sinh vật 18 WHO Tổ chức Y tế Thế giới DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Đặc điểm cúa nattokinase Bảng 1.2 Phản ứng sinh hóa Bacillus suhtilis 17 Bảng 2.1 Danh mục hóa chất sứ dụng nghiên cứu 22 Bảng 2.2 Thiết bị sử dụng nghiên cứu 24 Bảng 2.3 Thành phần nguồn carbon nitơ môi trường MT2 25 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Natto truyền thống Nhật Bán Hình 1.2 Mơ cấu trúc không gian cùa nattokinase Hình 1.3 Huyết khối hình thành thơng qua nút tiểu cầu Hình 1.4 Các tác dụng sinh lý nattokinase fibrin Hình 1.5 Mơ hệ thống phân loại Bacillus subtilis natto .14 Hình 1.6 Hình thái cùa Bacillus subtilis 16 Hình 3.1 Ảnh hưởng nguồn carbon môi trường lên men đến hoạt tính nattokinasc B.subtilis natto 30 Hình 3.2 Ánh hướng nguồn nitơ mơi trường lên men đến hoạt tính nattokinasc B.subtilis natto 31 Hình 3.3 Biểu đồ hoạt tính nattokinase sau túa (NH4)2SO4 nồng độ khác 32 Hình 3.4 Biếu đồ thề hoạt tính cùa nattokinase sau túa acetone tý lệ khác 33 Hình 3.5 Ảnh hưởng loại, tỉ lệ chất mang tới khả làm tan huyết khối cúa chế phẩm nattokinase tạo từ enzyme trộn với chất mang sau đơng khơ 34 Hình 3.6 Ánh hưởng loại, ti lệ chất mang tới khả làm tan huyết khối cùa chế phàm nattokinase tạo từ cặn enzyme đơng khơ sau trộn với chất mang 35 Hình 3.7 Quy trình cơng nghệ thu hồi tạo chế phấm nattokinase từ Bacillus subtilis natto 38 vii MỞĐẰU Đặt vấn đề Trong thời gian gần đây, nghe nhắc nhiều đến nattokinase với nhiều tác dụng khác nhau, đặc biệt có the mang tới cho sức khóe tốt hoai, nâng cao chất krợng sống cùa người Vậy nattokinase gi? Nattokinasc enzyme tìm thấy sàn phẩm “Natto” - ăn truyền thống cúa người Nhật Bán Nattokinase protease chuỗi đơn chứa 275 amino acid Hyroyuki Sumi phát thấy khả làm tan huyết khối vào năm 1980 [ll) Huyết khối tượng máu đông động mạch hay tĩnh mạch nàm bên the Cục huyết khối sản phấm cuối cìmg cùa q trình đơng máu Bình thường có tác dụng cầm máu trường họp cháy máu tốn thương mạch máu (đứt rách) Khi q trình đơng máu xảy mạch máu khơng bị đứt rách gọi chứng huyết khối bệnh lý dần tới bệnh tim mạch như: nhồi máu tim, tắc nghẽn mạch máu não, đột quỵ nguy hiểm dẫn đến tứ vong đột ngột Theo WHO mồi năm có khoảng 17,5 triệu người tữ vong mắc phải bệnh tim mạch dự đốn đến 2020 số đạt tới 25 triệu người, mà nguyên nhân hậu quà cục máu đơng (huyết khối) Theo ước tính thị trường toàn cầu thuốc làm tan huyết khối gần 14 ti USD [l2' Các loại thuốc làm tan huyết khối Alteplase, Streptokinase, Urokinase có hiệu lực tức sau tiêm vào tĩnh mạch Tuy nhiên hiệu lực hoạt động sinh học cùa loại thuốc chi tạm thời, tồn không lâu sau tiêm, giá cao mà tác động vào triệu chứng, không chữa nguyên bệnh, đồng thời có nguy biến chứng gây xuất huyết Trong nattokinase coi thực phẩm chức hồ trợ làm tan huyết khối sở hữu nhiều ưu điềm an tồn, chi phí thấp dề sử dụng kèm theo khả ngăn ngừa bệnh Fibrin protein dạng sợi không tan hình thành chuycn hóa fibrinogen tác động cúa thrombin Fibrin với tế bào tiểu cầu yếu tổ phát triển nên cục máu đơng Nattokinase khơng chì làm giảm hàm lượng fibrin cách trực tiếp mà thúc đay tế bào phát triền chất hoạt hóa plasminogen để phân húy fibrin Hoạt tính làm tan huyết khối nattokinase tương đối mạnh kéo dài, làm giảm chứng cao huyết áp, phân giải protein dạng amyloid liên quan đến bệnh alzhemer hay bệnh bò điên [13J; tăng cường hoạt hóa plasminogen làm bất hoạt chất ức chế hoạt hóa plasminogen [14] Chính tác dụng dược lý to lớn nattokinase mà ngày nay, việc nghiên cứu thu nhận enzyme từ nguồn khác từ vi sinh vật quan tâm Một số chủng vi sinh vật có khả sinh nattokinase kể đến Bacillus spp Bacillus có mặt khắp nơi tự nhiên Đây vi khuẩn Gram dương, hiếu khí có cấu trúc bề mặt phức tạp, có đặc điếm kết dính, cỏ khả chống chịu điều kiện khắc nghiệt cao Một số chủng Bacillus phân lập từ thực phâm lên men trun thơng có khà sinh enzyme nattokinase làm tan huyết khối cao kể đến như: Bacillus subtilis LSSE-22 từ Bắc Kinh, Trung Quốc [l5]; Bacillus sp CK từ Chungkook- Jang Bacillus sp DJ-4 từ Doe-Jang, Hàn Quốc [l6]; hay B.natto từ Natto, Nhật Bán |l?l Hiện nay, thị trường lưu hành số thực phẩm chức chứa nattokinase dạng viên nhộng nhập từ Nhật Bản, Hoa Kỳ Nattospes (3000 FU/g), Japato (600 FƯ/g), Nattokinase plus™ (3000 FU/g), Dosaka (300 FU/g) với đơn giá cao (trên 10 triệu đồng/kg) Dạng thực phẩm truyền thống Nhật Bán nhập khấu khơng dùng phổ biến nặng mùi, nhớt, khó ăn, khơng phù hợp với khấu vị người Việt Nam, hoạt tính nattokinasc thấp |IJ Phịng Cơng nghệ Lên men, viện Cơng nghệ Sinh học, viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam tuyên chọn nghiên cứu thành công PHẦN - KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Lựa chọn mơi trường lên men có nguồn carbon nguồn nito- thích họp cho sinh tống họp nattokinase Bacillus Subtilis Natto Chất dinh dưỡng bao gồm nguồn carbon, nguồn nitơ, muối khoáng vitamin nguyên liệu cung cấp cho trình sinh tống họp chất, enzyme, tạo thành phần cùa tế bào phục vụ cho trình trao đoi lượng vi sinh vật Trong việc xác định nguồn carbon nguồn nitơ quan trọng Theo phương pháp xác định đưa mục 2.2.1 thu nhận kết quà sau: 3.1.1 Nguồn carbon Hình 3.1 Ánh hưởng cùa nguồn carbon mơi trường lên men đến hoạt tính nattokinase cùa B.subtilis natto Từ kết thu nhận được, môi trường lên men có chứa nguồn carbon khác hoạt tính nattokinase thay đồi Cụ thể, hoạt tính enzyme cao thu hồi môi trường lên men chứa maltose với lượng huyết tan 96%; hoạt tính enzyme giảm xuống mơi trường có nguồn carbon glucose với kết quà lượng huyết tan đạt 93%; hoạt 30 tính enzyme thấp 66% mơi trường có nguồn carbon dextrin Như vậy, maltose nguồn carbon tối ưu đê lên men B.subtilis natto sinh tổng hợp nattokinase 3.1.2 Nguồn nitơ Hình 3.2 Ảnh hướng nguồn nitơ mơi trường lên men đến hoạt tính nattokinase cùa B subtilis natto Cũng tương tự kết phương pháp xác định nguồn carbon, môi trường lên men có nguồn nitơ khác nhau, hoạt tính nattokinase nhu nhận thay đổi Sữa đậu nành nguồn nitơ tốt đe chủng B.subtiỉis natto sinh tông hợp nattokinase có hoạt tính cao làm tan 96% huyết khối; đó, lượng huyết tan thấp 59% môi trường lên men sử dụng sodium glutamate nguồn nitơ Cao nấm men casein nguồn cung cấp nitơ tốt, bổ sung vào mơi trường hoạt tính nattokinasc cao (trên 80%) Ket luận: Môi trường tối ưu đế lên men B.subtilis natto sinh tống hợp nattokinase MT2-312 với thành phần: Sữa đậu nành 20,0 (g/1); Maltose 30,0 (g/1); K2HPO4 1,0 (g/1); MgSO4 0,2 (g/1); pH 7-7,2 Thời gian lên men 72 37°c 31 3.2 Kết xác định điều kiện thu hồi enzyme nattokinase 3.2.1 Xác định nồng độ (NH4)2SO4 thích họp để kết tủa nattokinase có dịch lên men Sứ dụng (NH4)2SO4 để túa protein-enzyme phương pháp sử dụng đơn giàn phố biến Kết cùa phương pháp nattokinase sau: Hình 3.3 Biểu đồ thể hoạt tính nattokinase sau tủa (NH4)2SO4 nồng độ khác Từ hình 3.3, dịch enzyme có hoạt tính cao tủa (NH4)2SO4 với nồng độ muối 50% Ở nồng đồ này, tỷ lệ huyết tan sau ủ 37°c 82% ứng với lượng huyết khối lại 18% Ở mức nồng độ muối thấp 50% enzyme thu có hoạt tính khơng cao Cụ thể, nồng độ 10% 20% muối, lượng huyết lại 55% nồng độ muối cao 50% hoạt tính enzyme khơng cho kết tốt nong độ muối cao làm biến tính enzyme nên hoạt tính khơng giữ mức ổn định 3.2.2 Xác định nồng độ acetone thích họp để kết tua nattokinase có dịch lên men Theo phương pháp tủa protein acetone nêu mục 2.2.3 ta có kết q sau: 32 Hình 3.4 Biếu đồ hoạt tính cùa nattokinase sau tủa acetone tỷ lệ khác Qua đồ thị (hình 3.4) ta thấy tý lệ I dịch enzyme : acetone lượng huyết khối tan cao (86,5%) Nhìn chung, khối lượng huyết khối lại sau bố sung enzyme tủa bang acetone mức thấp Phương pháp tủa acetone phương pháp thu nhận enzyme đem lại kết quà cao mà không làm hoạt tính Ỡ tý lệ acetone khác khả cùa Tỷ lộ 1:2, lượng acetone so với khối lượng cặn nên không đủ để tủa protein Tại tỷ lệ cao 1:6; 1:8 phần trăm khối lượng huyết tan giảm dần theo ti lệ acetone bồ sưng, lượng acetone nhiều hoạt tính enzyme bị giám Như vậy, ti lệ dịch enzyme acetone thích hợp đế túa nattokinase 1:4 Ket luận: Qua kết hai phương pháp, ta kết luận rằng, tùa acetone giữ hoạt tính cao so với tủa muối, qua phần trăm khối lượng lại huyết khối Đế đáp ứng nhu cầu kinh tế chất lượng sản phẩm, acetone dung môi cho giá thành rẻ so với muối (NH4)2SO4 đồng thời cho hoạt tính mức ồn định Vì tiến hành thu hồi nattokinase phương pháp tủa acetone chọn phương pháp 33 3.3 Xác định điều kiện quy trình tạo chế phẩm nattokinase 3.3.1 Chất mang tạo chế phẩm Đe thu nhận chế phẩm sinh học nattokianse từ B.subtilis natto ta sử dụng phương pháp đông khô, để đánh giá khả phương pháp đơng khơ có giữ hoạt tính enzyme mức ốn định thích hợp cho việc trộn chế phẩm không ta đánh giá qua cách thức: Cách 1: Cặn enzyme trộn với chất mang đem đơng khơ, sau thử hoạt tính với huyết khối Cách 2,- Cặn enzyme đông khô trước, sau trộn với chất mang, sau thử hoạt tính với huyết khối a, Chế phẩm tạo từ cặn enzyme trộn với chất mang đông khô Dịch lên men sau thu hồi phương pháp tủa acetone với ti lệ 1:4 trộn riêng rẽ với hai chất mang bột đậu tương bột sắn dây theo tỉ lệ khác sau đơng khơ Kết thể hỉnh 3.5 Hình 3.5 Ảnh hường loại, ti lệ chất mang tới khả làm tan huyết khối chế phẩm nattokinase tạo từ enzyme trộn với chất mang sau đơng khơ Từ kết thấy ràng việc tạo chế phẩm cách trộn enzyme với bột sắn dây cho hiệu tan huyết tốt chế phấm trộn enzyme với bột 34 đậu tương Việc giừ lại hoạt tính sau đơng khơ chất mang tương đối tốt tí lệ 1:2 đánh giá qua phần trăm khối lượng huyết khối cịn lại Ở tì lệ 1:1, lượng enzyme khơng đủ để kết hợp với chất mang nên hoạt tính thấp, khối lượng tan chì đạt xấp xì 38% Đặc biêt, sử dụng Ig bột sắn dây trộn với 2ml dịch nattokinase thỉ hiệu tan huyết tốt, lượng huyết tan sau bố sung chế phẩm qua nhiêt độ 37°c 88,5% h, Chế phấm tạo từ cặn enzyme đông khô trộn với chất mang Dịch lên men sau thu hồi phương pháp tủa accton với ti lệ 1:4 đơng khơ sau trộn riêng rẽ với hai chất mang bột đậu tương bột sắn dây theo tỉ lệ khác Kết thu sau: Hình 3.6 Ảnh hưởng loại, tỉ lệ chất mang tới khả làm tan huyết khối chế phẩm nattokinase tạo từ cặn enzyme đông khô sau trộn với chất mang Bột đậu tương ■ Bột sắn dây ■ Đối chứng Qua kết thu có thổ thấy dịch lên men sau tủa acetone đơng khơ trộn với chất mang chế phẩm giữ hoạt tính cùa enzyme với tý lệ 1:2 cho kết tốt (89%) Sau đơng khơ, hoạt tính cùa enzyme khơng vần giữ mức ốn định Bột sắn dây mang lại hiệu tốt trì hoạt tính cúa enzyme Kết luận: Qua hai phương pháp ta thấy bột sắn dây chất mang phù hợp cho việc giữ lại hoạt tính cùa enzyme cách tốt Chế 35 phấm nattokinasc có thề thu cách trộn dịch bột nattokinasc với bột sắn dây theo ti lệ 2ml dịch enzyme: Ig bột sắn sau đông khô 2g bột enzyme đông khô: Ig bột sắn dây, cho tác dụng làm tan huyết khối cúa chế phâm tốt 3.3.2 Quy trình công nghệ thu hồi tạo chế phẩm nattokinase từ B.suhtilis natto Sau q trình nghiên cứu, tơi xác định quy trình cơng nghệ thu hồi tạo chế phàm nattokinase từ B.subtilis natto (hình 3.7) với bước: Hoạt hóa chúng: Chúng B.subtilis natto sau trình giữ giống cấy ria đìa pcptri chứa mơi trường MPA rắn đe hoạt hóa chúng Thời gian nuôi 24 tú ấm 37°c Nhân giống: Sau chủng giống hoạt hóa, cấy B.subtilis natto vào binh tam giác chứa 100ml mơi trường MPA lịng; ni điều kiện lắc 200 vịng/phút, nhiệt độ 37°C; thời gian ni 24 Lên men: Tiếp giống vào bình tam giác chứa 250ml môi trường MT2 với tĩ lệ tiếp giống 5%; nuôi điều kiện lắc 200 vịng/phút, nhiệt độ 37°C; thời gian ni 72 Thu hoi dịch nattokinase thô: Ly tâm lạnh dịch sau lên men tốc độ 6000-8000 vòng/phút thời gian 5-10 phút để loại bò sinh khối tế bào thu dịch enzyme Tủa nattokinase thô bang acetone: tủa enzyme bang acetone với tỷ lệ dịch enzyme thô : accton Loại bò acetone bàng cách sấy bàng gió thời gian 30-60 phút Kết thúc bước 5, thu hồi nattokinasc dạng dịch đặc, có hai cách tạo chế phẩm sau: 36 Cách Cách Phối trộn: Nattokinase Đông khô: Nattokinase phối trộn với chất mang chuyển vào hệ thống đông bột sắn dây với tỷ lệ 2ml khô thành dịch đặc sau sấy NK-lg BSD 35°c khô Đông khô: Hồn hợp sau phối Phối trộn: Nattokinase sau trộn chuyến vào hệ đông khô dạng bột thống đông khô thành dịch phối trộn với chất mang bột đặc sau sấy 35°c cho sắn dây theo tý lệ 2g NK-lg đến khô BSD Kiểm tra chất lượng hoạt tính nattokinase: Đe kết thúc quy trinh cần kiểm tra hoạt tính nattokinasc Sản phẩm thu sau quy trình chế phẩm nattokinase 37 Hình 3.7 Quy trình cơng nghệ thu hồi tạo chế phẩm nattokinase từ Bacillus subtilis natto 38 PHÀN - KÉT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Sau hồn thành thí nghiệm, phân tích, xử lý số liệu đánh giá kết quá, rút kết luận sau: • Mơi trường lèn men thích hợp cho chủng B.subtilis natto sinh tổng hợp nattokinase xác định gom thành phần: Sữa đậu nành 20,0 (g/1); Maltose 30,0 (g/1); K2HPO4 1,0 (g/1); MgSO4 0,2 (g/1); pH 77,2 • Enzyme nattokinase từ B.subtìlis natto thu hồi tốt tủa bàng acetone với tỷ lệ enzyme thơ:acetone 1:4 • Chất mang thích hợp đế tạo chế phấm nattokinasc bột sắn dây Có thê trộn dịch enzyme với bột sắn dây sau tiến hành đông khô theo tỉ lệ 2ml dịch enzyme: 1g bột sắn dây đông khô để thu bột enzyme trộn với bột sắn dây theo ti lệ 2g bột enzyme đông khô: Ig bột sắn dây để tạo chế phẩm nattokinase, che phẩm thu theo hai cách cho hiệu quà làm tan huyết 4.2 Kiến nghị Trong trinh tiến hành đề tài, hạn chế thời gian điều kiện nghiên cứu Vì vậy, tơi xin đưa số đề nghị sau: • Cần nghiên cứu thêm ánh hưởng điều kiện môi trường nhiệt độ, độ ẩm, thời gian đến trinh báo quán chế phẩm nattokinasc từ B.subtilis natto • Nghiên cứu tạo chế phàm nattokinase từ B.siibtilis natto đe hướng tới thực phấm chức 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Lê Thị Bích Phượng, Võ Thị Hạnh, Trần Thạch Phong, Lê Tấn Hưng, Trương Thị Hồng Vân, Lê thị Hương, 2012 Phân lập tuyển chọn số chùng Bacillus sinh tống hợp nattokinase Tạp chí sinh học 2012, 34(3SE): 99-104 Lý Thị Bích Thủy, Đồ Thị Tuyên, Nguyền Thị Ngọc Dao, 2006 Tinh xác định số tính chất cùa enzym thủy phân fibrin tách chiết từ loài giun quế (Perionyx excavatus) Tạp Sinh học 28(3): 77-82 Vũ Hồng Diệp, Nguyễn Thị Ngọc Dao, Quyền Đình Thi, 2008 Nhân dịng phân tích trình tự gcnc mã hóa SK từ chủng Streptococcus pyogenes DT7 Tạp chi Công nghệ sinh học (4A): 757-763 Quyền Đình Thi, 2010 Nghiên cứu xây dụng quy trình cơng nghệ sản xuất chế phấn enzym tái tô hợp Streptokinase yếu tố hoạt hóa plasminogen mơ (tPA) sử dụng điều trị Viện cơng nghệ sinh học Nguyễn Lân Dũng, Đồn Xn Mượu, Nguyền Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty, 1976 Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học tập NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội Nguyễn Duy Khánh, 2006 Khảo sát điều kiện nuôi cấy sinh bảo tử vi khuẩn Bacillus Subtilỉs Đại học nông lâm tp.HCM Đặng Tuyết Phương, Lê Gia Hy, 2010 Enzym vi sinh vật chuyển hóa sinh học -Nguyên lý, ứng dụng Nxb Khoa học tự nhiên công nghệ, pp.82-106 Bùi Thái Hằng, Phạm Thị Thanh Mai, 2010 Công nghệ vi sinh vật Nxb Trường Cao đăng lương thực - thực phẩm, pp.69-72 40 Nguyen Đức Lượng, 2004 Công nghệ enzyme, NXB Đại học Quắc gia TPHCM 10 Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Phan Thị Trâu Châu, Nguyễn Lâm Dũng, 1982 Enzym vi sinh vật NSB khoa học kĩ thuật, tập Tài liệu tiếng Anh 11 Sambrook J., Russel DW., 2001 Molecular Cloning A Laboratory’ Manual, 3rd cd Cold spring Harbor Laboratory, NY 12 Cong w., Ming D., Dongmei z., Fandong K., Guoren z., Yibing F., 2009 Purification and characterization of nattokinase from Bacillus subtilis natto Bl2, J.Agric.Food Chern 57: 9722-9729 13 Ruei LH., Rym A., Anissa H., Mohamed H., Fakher F., Laila M., Kernel J., Monccf N., 2009 Fibrinolytic enzymes from a newly isolated marine bacterium Bacillus subtilis A26: characterization and statistical media optimization Can J Microbiol 55: 1049- 1061 14 Sumi H., Hamada H., Nakanishi K., Hiratani H., 1990 Enhancement of the fibrinolytic activity in plasma by oral administration of nattokinase Acta Haematol 84(3): 139-43 15 Wei w., Li M., Wang J., Nie F., Li L., 2012 The E3 ubiquitin ligase ITCH negatively regulates canonical Wnt signaling by targeting dishevelled protein Mol Cell Biol 32(19): 3903-12 16 Kim w„ Choi K„ Kim Y., Park H., Choi J., Lee Y., Oh H„ Kwon L, Lee s., 1996 Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme produced from Bacillus sp strain CK 11-4 screened from Chungkook-Jang Appl Environ Microbiol 62(7): 1488-2482 17 Fujita M., Hong K., Ito Y., Misawa s., Takeuchi N., Kariya K., Nishimuro s., 1995 Transport of nattokinase across the rat intestinal tract Biol Pharm Bull., 18: 1194-1196 41 18 Mcruvu H., Vangalapati M., 2011 Nattokinasc: A Review on Fibrinolytic Enzyme International Journal of Chemical, 2(1): 61 -66 19 Astrup T., Mullertz s., 1952 The fibrin plate method for estimating fibrinolytic activity Archives of biochemistry and biophysics 40 (2): 346-351 20 Deepak V., Kalishwaralal K., Ramkumarpandian s., Babu SV., Senthilkumar SR., Sangiliyandi G., 2008 Optimization of media composition for Nattokinasc production by Bacillus subtilis using response surface methodology, Bioresour Technol, 99 (17): 8170- 8174 21 Ku TW., Tsai RL., Pan TM., 2009 A simple and cost-saving approach to optimize the production of subtilisin NAT by submerged cultivation of Bacillus subtilis natto J Agric Food Chern 57(1): 6-292 22 Chen PT., Chao YP., 2006 Enhanced production of recombinant nattokinase in Bacillus subtilis by the elimination of limiting factors Biotechnology letters 28 (19): 1595-1600 23 Peng Y., Huang Q., Zhang R H., Zhang Y z., 2003 Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme produced by Bacillus amyloliquefaciens DC-4 screened from douchi, a traditional Chinese soybean food Comp Biochem Physiol., 134: 45-52 24 Lyden p., 2005 Thrombolytic Therapy for Acute Stroke Second Edition.Humana Press Inc 25 Wang c., Ji B., Li B., Ji H., 2006a Enzymatic properties and identification of a fibrinolytic serine protease purified from Bacillus subtilis DC33 World J Microbiol Biotechnol 26 Sahelian R., Borkens., 1998 Dehydroepiandrosterone and cardiac arrhythmia Annals of internal mcdicin, 129 (7): 588-595 42 27 Kim JY., Gum SN., Paik JK., Lim HH., Kim K., Ogasawara K., 2008 Efcsof nattokinase on blood pressure: a randomized, controlled trial Hypertension Research 31(8): 1583-1588 28 Chang YY„ Liu JS., Lai SL„ Wu HS„ Lan MY., 2008 Cerebellar hemorrhage provoked by combined use of nattokinase and aspirin in a patient with cerebral microbleeds" Intern Med 47 (5): 9-467 29 Juan MY., Wu CH., Chou cc., 2010 Fermentation with Bacillus sp As a bioproccss to enhance anthocyanin content, the angiotensin converting enzyme inhibitory effect, and the reducing activity Ò black soybeans, FoodMicrobioloogy 15: 261-266 30 Chen PT., Chiang CJ., Chao YP., 2007 Strategy to approach stable production of recombinant nattokinase in Bacillus subtilis Biotechnol 23 (4): 808-813 31 Lee J., Park s., Choi Won A., Lee KyungHee., Jeong Y K., Kong In­ Soo., Park s., 1999.Production of a fibrinolytic enzyme in biorcactor culture by Bacillus subtilis BK-17 J Microbiol Biotechnol 9(4): 443-449 32 Liang X., Jia s„ Sun Y„ Chen M„ Chen X., Zhong J„ Huan L„ 2007 Secretory expression of nattokinase from Bacillus subtilis YF38 in Escherichia coli Mol Biotech., 37(3): 187-194 33 Wang JK., Chiu HH., Hsieh cs., 2009 Optimization of the Medium Components by Statistical Experimental Methods to Enhance Nattokinase Activity, Fooyin J Health Sci 1(1): 21 -27 34 Liu J G., Xing J M„ Chang T s., Ma z Y., Liu H z., 2005 Optimization of nutritional conditions for nattokinasc production by Bacillus natto NLSSE using statistical experimental methods Process Biochcm., 40: 2757-2762 35 Wang s H„ Zhang c„ Yang Y L., Diao M., Bai M F., 2008 Screening of a high fibrinolytic enzyme producing strain and 43 characterization of the fibrinolytic enzyme produced from Bacillus subtilis LD-8547, World J Microbiol Biotechnology 24: 475482 36 Zu X., Zhang z„ Yang Y., Che H., Zhang G„ Li j., 2010 Thrombolytic Activities of Nattokinase Extracted from Bacillus Suhtilis Fermented Soybean Curd Residues International Journal of Biology, 2(2) 37 Jonh G.Holt., 1992., Stedman’s Bergey’s Bacteria Words., Williams & Wilkins 38 Hui Yiu Ư., Lisbeth Meunier - Goddik, Josephesen Jiste, Nip WaiKit., 2005 Handbook of Food and Beverage Fermentation Technology, pp.612-620 Tài liệu Internet 39 Huỳnh Văn Minh, 2015 Đôi điều chưa biết men đậu nành Natto http://www.vusta.vn/vi/ncws/Thong-tin-Su-kicn-Thanh-tuu-KHCN/Doi-dieu-chua-biet-ve-men-dau-nanh-NATTO-57090.html 40 Tống Ngọc Triêm, 2016 Đặc tính sinh học vi khuẩn Bacillus sutilis http://kythuatnuoitrong.com/dac-tinh-sinh-hoc-cua-vi-khuan- bacillus-sutilis/ 41 Đông khô: Phương pháp đơng khơ (phần 1) Nguồn Labacon http://www.biomedia.vn/review/dong-kho-phuong-phap-say-dongkho-phan-l.html 42 https://www.researchgate.net/figure/228117497_fíg9_Figure-8- Physiologic-effects-of-nattokinase-on-fibrin-Nattokinase-lyses-fibrindircctly 44 ... suất thu hồi hoạt tính enzyme Vi đề tài ? ?Nghiên cứu điều kiện thu hồi tạo chế phầm nattokinase từ B .subtilis natto 5? ??’ quan tâm sâu nghiên cứu Mục tiêu chung Xác định điều kiện thích hợp đổ thu hồi. .. cúa chế phâm tốt 3.3.2 Quy trình cơng nghệ thu hồi tạo chế phẩm nattokinase từ B.suhtilis natto Sau q trình nghiên cứu, tơi xác định quy trình cơng nghệ thu hồi tạo chế phàm nattokinase từ B .subtilis. .. định điều kiện thu hồi nattokinase từ B .subtilis natto 5; - Xác định chất mang chế độ sấy để tạo chế phẩm nattokinase có khả làm tan huyết khối tốt PHÀN - TÓNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu nattokinase