Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Thử nghiệm lên men bia nồng độ cao, sử dụng nấm men cố định trên chất mang Cellulose vi khuẩn, tại cơ sở sản xuất bia viễn đông

TEN DE TÀI: THU NGHIỆM LEN MEN BIA NONG ĐỘ CAO, SỬ DỤNG NAM MEN CO ĐỊNH TREN CHAT MANG CELLULOSE VI KHUAN, TẠICO SO SAN XUAT BIA VIEN DONG NHIEM VU VA NOI DUNG:e Khao sát các điều kiện l

ĐẠI HỌC QUOC GIA TP HCM aTRUONG DAI HOC BACH KHOA TP HCM

HO THI MY NHAN

THU NGHIEM LEN MEN BIA NONG DO CAO, SU DUNG

NAM MEN CO DINH TREN CHAT MANG CELLULOSE VI

KHUAN, TAI CO SO SAN XUAT BIA VIEN DONG

CHUYEN NGANH: CONG NGHE SINH HOCMA NGANH: 60420201

LUAN VAN THAC SI

TP.HCM, thang 1 nam 2018

CÔNG TRÌNH DƯỢC HOÀN THÀNH TẠI

TRUONG ĐẠI HOC BACH KHOA - DHQG - HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thúy Hương

Cán bộ cham nhận xét 1: PGS.TS Nguyễn Tiến ThangCán bộ chấm nhận xét 2: TS Huỳnh Ngọc Oanh

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Dai học Bách Khoa, DHQG TP.HCMThời gian bảo vệ: Ngày 12 thang 1 năm 2018

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

1 PGS.TS Lê Thi Thủy Tiên2 TS Võ Đình Lệ Tâm

3 PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng4 TS Huỳnh Ngọc Oanh

5 TS Nguyễn Hữu PhúcXác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyênngành sau khi nhận luận văn đã được sửa chữa (nêu có).

CHỦ TỊCH HỘI ĐÔNG TRUONG KHOA KY THUẬT HÓA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨHọ tên học viên: HO THỊ MỸ NHÂN MSHV: 1570259Ngày, tháng, năm sinh: 19/01/1992 Nơi sinh: An GiangChuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Mã số : 60420201I TEN DE TÀI: THU NGHIỆM LEN MEN BIA NONG ĐỘ CAO, SỬ DỤNG

NAM MEN CO ĐỊNH TREN CHAT MANG CELLULOSE VI KHUAN, TẠICO SO SAN XUAT BIA VIEN DONG

NHIEM VU VA NOI DUNG:e Khao sát các điều kiện lên men thích hợp đối với chủng giống lên men bia

nông độ cao.e Xác định các điều kiện cố định tế bào nắm men trên chất mang cellulose vi

khuẩn.e Thu nghiệm lên men bia nông độ cao với nam men cố định trên cellulose vi

khuẩn quy mô phòng thí nghiệm

H NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 16/1/2017

Ill NGAY HOÀN THÀNH NHIỆM VU: 18/12/2017

IV CÁN BO HUONG DAN: PGS.TS Nguyễn Thúy Huong

Tp HCM, ngày 20 tháng 1 năm 2018

CÁN BỘ HƯỚNG DÂN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

TRUONG KHOA KY THUẬT HÓA HOC

LỜI CÁM ƠNTôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS.Nguyén Thúy Huong, ngườihướng dẫn khoa học trực tiếp cho tôi trong toàn bộ quá trình thực hiện luận văn này.Cô đã hết lòng hướng dẫn, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất để tôi thựchiện tôt luận văn của mình.

Bên cạnh đó không thể thiếu lời cảm ơn chân thành đến tập thể cán bộ, nhânviên tại cơ sở sản xuất bia Viễn Đông đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành tốt đề tàicủa mình.

Cuôi cùng, tôi xin cảm ơn gia đình Gia đình luôn là diém tựa tinh thần vữngchac cho tôi trong mọi hoàn cảnh.

Xin chân thành cảm ơn tât cả mọi người!

Tp.HCM, tháng 1 năm 2018

Học viên

Hồ Thị Mỹ Nhân

TÓM TAT LUẬN VĂNĐề tài “Thử nghiệm lên men bia nồng độ cao, sử dụng nắm men cố định trênchất mang cellulose vi khuẩn, tại cơ sở sản xuất bia Viễn Đông” nhằm tìm ra giảipháp dé nâng cao chất lượng bia cũng như cải thiện quy trình công nghệ tại cơ sở.Sử dụng nam men Saccharomyces cerevisiae có nguồn gốc tại cơ sở sản xuất biaViễn Đông có định trên chất mang cellulose vi khuẩn nhăm tăng khả năng lên menvà tao ra dòng sản phâm mới.

Khi lên men bia nông độ cao với nam men cô định thì khả năng lên men củanắm men cô định tốt hơn nắm men tự do Nong độ ethanol trong bia non sau lênmen cao gấp 2,2 lần (11,2% v/v so với 5% v/v) trong khi đó hàm lượng vật chất khôchỉ cao hon 1,83 lần so với bia lên men truyền thống (22°Plato so với 12° —

13°Plato)

Bên cạnh đó, tiến hành kiểm tra hóa lý sản phẩm bia non cho những kết quảkhả quan như độ màu cao 16 (EBC), độ chua 2,6 mL, hàm lượng CO; dat 5,6 g/L,nông độ ethanol đạt 11,2% (v/v) khi đó hàm lượng vật chất khô là 3°Plato Bước

đầu đánh giá được chất lượng sản phẩm, triển vọng sử dụng nắm men cô định trên

chat mang cellulose vi khuân tại cơ sở sản xuât bia Viên Đông.

ii

Research in “Experiment of high gravity brewing, using the immobilizedyeast on bacterial cellulose at the Vien Dong brewery” in oder to improve brewery’sprocess and enhance the quality of beer The key figure of this research is usingImmobilized Vien Dong’s Saccharomyces cerevisiae on bacterial cellulose cube inhigh gravity Brewing to increase fermentation Performance; Enhance qualityproduct and reinovate new product.

The Immobilized Yeast’s fermentation performance is much better than thefree Yeast as the result of this research In detail, Ethanol — main fermentationproduct — is 2.2 times higher (11.2%v/v compare 5%v/v) while the substrateconcentration only 1.83 times higer compared to that of traditional beer produced

(22°Plato compare |2 — 13°Plato)

Besides, some of green beer specification was tested It’s is possitive such asgreen beer colour is 16 EBC; total acidity is 2.6 mL; CO, concentration is 5.6 g/L;ethanol concentration is 11.2% and appearance extract is 3°Plato The first step toevaluate the quality of products, the prospect of using the immobilized yeast onbacterial cellulose at the Vien Dong brewery.

iil

LỜI CAM ĐOANTôi tên Hồ Thị Mỹ Nhân, học viên cao học chuyên ngành Công Nghệ SinhHọc, khóa 2015, Khoa Kỹ Thuật Hóa Học, Truong Dai học Bach Khoa Tp Hồ ChíMinh Tôi xin cam đoan:

Đề tài nghiên cứu này do chính tôi thực hiện, sô liệu là kêt quả nghiên cứu

thực sự của tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS Nguyễn Thúy Hương

Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về kêt quả nghiên cứu trong luận văn tôtnghiệp của mình.

Tp.HCM, tháng 1 năm 2018

Học viên

Hồ Thị Mỹ Nhân

IV

DANH MỤC HÌNHHình 1.1: Các phương pháp cô định tẾ bào ¿- - + 25225 E+E2E2£E£E£E+EzErErkrerreree 7Hình 1.2: A.xylinum và cau trúc cellulose Vi khuẩn ¿5-5 55s+c+cczcs+sccee 10

Hình 2.1: Hình đại thé, vi thé của nam men Saccharomyces CereviSide - 18

Hình 2.2: Chế độ nau dịch nha lên men bia tai cơ sở sản xuất bia Viễn Đông 25

Hình 2.3: Bình lên men sử dụng tại cơ sở sản xuất bia Viễn Đông - 26

Hình 3.1: Anh hưởng của mật độ giống cấy đến biến động quá trình lên men 28

Hình 3.2: Ảnh hưởng của hàm lượng vật chất khô đến biến động của quá trìnhTEN MCN 011177 ấễdtaa 30

Hình 3.3: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến sự sinh tong hợp ethanol 32

Hình 3.4: Hình chụp SEM cấu trúc chat mang cellulose vi khuẩn (trái) va hình tháinắm men cố định trên chất mang cellulose vi khuẩn (phải) bằng phương pháp hap100 BR 38Hình 3.5: Biến động lên men của nắm men cô định và nắm men tu đo 39

Hình 3.6: Biến động lên men của nam men cô định qua các chu kì - 42

DANH MỤC BÁNGBảng 2.1: Chỉ tiêu nước nấu bia tại co sở sản xuất bia Viễn Đông 18Bang 2.2: Nguyên liệu sử dung cho một mẻ nấu tại co sở sản xuất bia Viễn Đông.25Bang 3.1: Ảnh hưởng của mật độ tế bao ban dau trong huyền phù giống đến mật độtế bào và hiệu suất cô định trên chat mang cellulose vi khuẩn c+csessca 34Bảng 3.2: Ảnh hưởng của khối lượng chất mang đến mật độ tế bào và hiệu suất côđịnh trên chat mang cellulose vi khuân ¿+ - 2s + ++£+E+£++x+xe£ezxvxererecxee 35Bảng 3.3: Ảnh hưởng của tốc độ lac đảo đến mật độ tế bào và hiệu suất có định trênchất mang cellulose vi khuẩn -¿-¿- - ¿5 +52 +E+E+S££E£E£EEE£ESEEEEEEEEeEkrkrrrrererreee 36Bảng 3.4: Ảnh hưởng của thời gian hấp phụ nắm men đến mật độ tế bào và hiệusuất cô định trên chất mang cellulose vi khuẩn - 5-5 2 s22 5s+s+sezs>s+2 37Bảng 3.6: Kết quả khảo sát các chỉ tiêu hóa lý bia non sau lên men chính và so sánh

vi

DANH MỤC CAC CHỮ VIET TAT

BC Bacterial celluloseTCVN Tiêu chuẩn Việt NamTCCS Tiêu chuẩn co sở

vi

DANH MỤC CÁC CHU VIET TAT ou eececsesssessseesseeeseessnecrecesnesuneereceanecuneerneenneeneeenneennen vii//097100077a.“5 ,Ô |Chương 1: TONG QUAN - 5 2- 5221 E212152121211212112111111115 112127101211 01 212112101111 ae 3

1.1 Lên men bia nông độ CaO 5-5251 23 1E E1 1115211121171 01111111 01111111111 xe 3

[.1.I Định nghĩa SG HT ng KH HH ng 3

1.1.2 Anh hưởng của các yêu tố công nghệ đến quá trình lên men bia nồng độ cao 31.2 Nam men cố định - +: Set E23 E8 1515815115111 155115811 1115111 1111111111111 0111 1.1 EeE 5

I.2.I Dinh nghĩa SG SH ng HH HH 5

1.2.2 Chat mang trong kĩ thuật cô định tế bào - ¿52 52+E+ccEE2E2EeEcrzkererrkd 61.23 Cac phương pháp cố định té bào nâm men - ¿2-5 2 5225+£+££EzEz£szscx2 61.24 _ Yêu câu đối với chất mang và phương pháp cô định nắm men 91.2.5 Có định ndm men trên cellulose vi khuẩn -¿ +2 +s + x+E+e£2E+EzEEsEsxreserszd 91.2.5.1 Cellulose vi KAUAI oe eccecceeceesesssesseeseesneesnecseceseesnesueesueceneceeeeneeneeeneeateen 91.2.5.2 Cac phương pháp cô định tế bào trên chất mang cellulose vi khuẩn L0

1.2.6 Ưu nhược điểm của phương pháp cố định tế bào trên cellulose vi khuẩn L213 Ung dụng nam men cố định trong quá trình lên men bia nông độ cao 12

13.1 Tinh chat sinh lý của ndm men cố định ccccccccccccssseseesesesseseesssesseseseeseees 1213.2 Khả năng sử dụng cơ chất - 5-5-5 tt S2 E1 2121211111111 1101 re 12133 Khả năng chịu đựng những yếu tố bat lợi - ¿5252 522xccscxczzxescred 1313.4 Khả năng sinh tổng hop các sản phẩm trao đổi chất -. -5:5¿ 131.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về kỹ thuật lên men bia nồng độ cao sử

0001101010008119)ã090ã0))))) 002 14

Chương 2: NGUYEN LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - 5 18

2.1 Nguyên lIỆU - E11 HH vn 18

2.1.1 Nguyên liệu nấu dịch lên eM c.cccccccccccscsessesesesesssesssesesssscssesessseseeseseees 182.1⁄2 NAM men -c: 2t tt E2 2 2222 182.13 Chat mang cố định cellulose vi khuẩn c.ccccccccccssesssesesscstsseseesssesseseseeseees 19

2.2 Phuong 0)( 0000000034010 .n 19

2.2.1 So đồ thy nghiGM oo ccceccccccccccccsssscseseseessscssssesssssssssesscscsusseseessscsussesesees 19

Vili

2.2.2 _ Bồ trí thí nghiệm - 225: 22121 2121221 2121111211111 212111121 re 202.2.2.1 Thi nghiệm 1: Khảo sát các điều kiện lên men thích hợp đôi với chủng

nắm men Saccharomyces cerevisiae chịu được nông độ cao có nguồn gốc tại co sở

sản xuất bia Viễn Đông ¿ ¿E2 121 192212121521 11 21121 011111111 0101011011101 0101 re 20

2.2.2.2 Thi nghiệm 2: Khao sat diéu kién thich hop dé có định nấm men trên

chat mang cellulose vi khuânn - - + 1 1333111 99311199911 1 190 ng ngài 20

2.2.2.3 So sánh bien dong cua qua trinh lén men boi nam men cô định trên chat

mang cellulose vi khuân va nâm men tu do trong quá trình lên men chính 22

2.2.2.4 Khao sát khả năng tai sử dụng nam men cô định trên cellulose vi khuẩn

đê lên men bia nông dO CaO - - - 1119211111211 11199 111110111119 ku 22

2.2.2.5 _ Thử nghiệm lên men bia với ndm men cố định trên chất mang cellulosevi khuẩn quy mô phòng thí nghiệm tai cơ sở sản xuất bia Viễn Đông 23

"Nai 0030): 000.0 24

Chương 3: KET QUÁ VA BAN LUẬN - 5-21 E21 E2 215221211 2121271 2121112 e6 28

3.1 Khao sát các điều kiện lên men thích hợp cho chủng nâm men chịu được nồng độcao có nguôn gốc tại cơ sở sản xuất bia Viễn Đông 2552 S222 zezxzrcree 283.1.1 Khao sát ảnh hưởng của mật độ giống cấy ban đầu đến biến động của quá

trinh én men CHINN 2 28

3.1.2 Khao sát ảnh hưởng của ham lượng vật chat khô ban đâu đến biến động của

qua trinh lén men Chinh 0.5 e 30

3.13 Anh hưởng của nhiệt độ lên men đến sự sinh tong hợp ethanol (%v/v) trong

2I8090/)0812/8:12: 00002727 aA 31

3.2 Khao sat diéu kién thich hop dé có định nắm men trên chat mang cellulose vi khuan3.2.1 Anh hưởng của mật độ tế bao trong huyền phù giống -. 333.2.2 Anh hưởng của khối lượng chất mang 2 52 ©2£+2£+E+£++xezzxsed 353.2.3 Ảnh hưởng của tốc độ lắc đảo -¿- +5: c2 St x22 12121212112 erke 353.2.4 Ảnh hưởng của thời gian hấp phụ nắm men ¿5 2 ++sz5z+x+zzcx+2 373.3 Đánh giá khả năng lên men bia nồng độ cao bởi nắm men cô định trên chất mangCellulose vi khuẩn - 5% +s E9 E2E9EEEE219192521111 112121115 11211111 011111110101 11 01111 y0 3933.1 So sánh biến động lên men của nắm men cô định trên chất mang cellulose vi

khuân va nâm men tự do trong quá trình lên men chính - -«««<<+ss+2 39

3.3.2 Kha năng tái sử dụng nam men cô định trên cellulose vi khuẩn để lên men

IDE8/9:i50:0‹: 017 4]

3.3.3 Thử nghiệm lên men bia với nắm men cô định trên chất mang cellulose vikhuẩn quy mô phòng thí nghiệm tại cơ sở sản xuất bia Viễn Đông 43

Chương 4: KET LUẬN VÀ KIEN NGHỊ - 2-5522 EEEE SE 1212212121212 xe 46

TÀI LIEU THAM KHẢO 2-5 tt HT HH 47

PHU LUC 2A

1x

MỞ DAUBia là loại thức uống lên men có truyền thống lâu đời Bia được nhiều ngườiưa thích do hương vị hết sức đặc trưng và những tác dụng có lợi cho sức khỏe nhưgiá trị dinh dưỡng cao, mùi thơm đặc trưng, ngon và bé dưỡng.

Tại cơ sở sản xuât bia Viên Đông, nguồn nguyên liệu chính đề sản xuat bia làmalt dai mach, hoa bia (houblon), nước, nầm men và gạo Tuy nhiên, vì là cơ sở sảnxuât quy mồ nhỏ nên công nghệ sản xuât vân áp dụng theo phương pháp lên mentruyền thống

Ngày nay, công nghệ lên men bia nồng độ cao đã trở nên pho biến trongngành công nghiệp sản xuất bia do: chi phí đầu tư giảm, tiết kiệm năng lượng, tăngnăng suất sản xuất mà không cân tốn kém dau tư trang thiết bị nhà máy Hiện nay,hau hết các nhà máy sản xuất bia van sử dụng nam men Saccharomyces cerevisiaedạng tự do để lên men bia va còn khá nhiều nhược điểm Đặc biệt khi tiễn hành lênmen trong những điều kiện không thuận lợi thì sự sinh trưởng cũng như khả năngsinh tong hợp sản phẩm trao đôi chat của nam men tự do bị ức chế rõ rệt [19]

Một trong những giải pháp để khắc phục các nhược điểm trên là sử dụngnắm men cố định Các nghiên cứu về sử dụng nam men cố định trong sản xuất bianông độ cao đều cho thay nắm men cô định có nhiều ưu điểm hơn han so với nammen tự do Ngoài ra, khả năng tái sử dụng của nắm men cố định còn đem lại nhiềulợi ích về mặt kinh tế và chi phí sản xuất giảm [17], [42]

Để cố định nam men lên men bia nồng độ cao, nhiều nghiên cứu đã sử dụngphương pháp nhốt tế bào trong cau trúc gel, phố biến nhất là sử dụng alginate làmvật liệu để có định; hơn 80% các nghiên cứu về cô định tế bào trên thế giới đã sửdung alginate [37].

Trong những năm gân đây, có một vài công bố khoa học về việc sử dụngcellulose vi khuẩn làm chat mang cô định nắm men dé ứng dụng trong quá trình lênmen sản xuât rượu vang và ethanol [3], [44] Tuy nhiên, vân chưa có nhiêu nghiên

cứu báo cáo sử dụng nam men cô định trên chat mang cellulose vi khuân ứng dụngtrong lên men bia nông độ cao và chê phầm cellulose vi khuân van chưa đượcthương mại hóa trên thị trường.

Dé tài: “Thứ nghiệm lên men bia nông độ cao, sứ dung nam men co định

trên chat mang cellulose vi khuân, tại cơ sở san xuât bia Viên Đông”, với các

mục tiêu và nội dung sau:

— Khảo sat các điều kiện lên men thích hop cho chung giông Saccharomycescerevisiae chịu được nông độ cao có nguôn gôc và được lưu trữ tại cơ sởsản xuat bia Viên Dong.

2 Xác định điêu kiện cô định và thử nghiệm lên men— Khảo sát các điều kiện thích hợp để cố định nắm men Saccharomyces

cerevisiae trên chất mang cellulose vi khuẩn.— Khảo sát khả năng tái sử dụng chế phẩm nắm men cô định trong quá trình

lên men.— Thử nghiệm lên men bia với nam men cô định trên chất mang cellulose vi

khuẩn quy mô phòng thí nghiệm tại cơ sở sản xuất bia Viễn Đông

Chương 1: TONG QUAN1.1 Lên men bia nông độ cao

1.1.1 Định nghĩa

Lên men bia nông độ cao là quá trình lên men dịch nha có hàm lượng vậtchất khô ban đầu cao hơn thông thường hàm lượng vật chất khô có thé lên đến 16-18°Plato hoặc thậm chí cao hon, dẫn đến nồng độ ethanol trong bia non cao Sau khilên men, sản phẩm tạo thành (có nồng độ ethanol cao) sẽ được pha loấng để tạo rabia thành phẩm có nông độ ethanol như bia được lên men theo phương pháp truyềnthống từ dịch nha có hàm lượng vat chất khô (10-12°Plato) khi đó nồng độ ethanolsẽ là 5% (v/v) [29].

Lên men bia nông độ cao đã phát triển đáng ké trong nhiều năm qua do một sốlợi ich: tăng sản lượng bia, do đó các thiết bị sản xuất tại nhà máy được sử dụnghiệu quả hơn; giảm chi phí năng lượng, lao động, vệ sinh và chi phí nước thải Vidụ, khi lên men dịch nha 15°Plato thì năng lượng tiêu thụ có thể giảm tới 14% vàtăng năng suất lao động lên đến 25-30% hoặc công suất có thể tăng 50% đối vớidịch nha 18°Plato [29]

Tuy nhiên, lên men bia néng độ cao vẫn còn gặp một số khó khăn liên quanđến quy trình sản xuất như: kéo dài thời gian lên men; gia tăng stress cho nắm mendo áp suất thắm thấu và nồng độ ethanol cao Ngoài ra, sản xuất bia nồng độ caocòn tồn tại một số điểm hạn chế liên quan đến chất lượng sản phẩm như: giảm độbên bọt bia; thay đổi mùi vị của bia [40]

1.1.2 Anh hưởng của các yếu tố công nghệ đến quá trình lên men bia nồng độ

cao

Quá trình lên men bia nồng độ cao bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố: hàm lượngvật chất khô ban đầu trong dịch nha, trong đó chủ yếu là đường: thành phần dinhdưỡng trong dich nha; mật độ nam men gieo cấy ban đầu; hàm lượng oxy trong dịchnha ban đầu: nhiệt độ lên men và nông độ ethanol sinh ra trong dịch lên men

1.1.2.1 Anh hưởng của hàm lượng vật chất khô ban đầu trong dịch nha

Trong quá trình lên men bia, đặc biệt lên men bia nồng độ cao, stress áp suấtthâm thấu làm cho tế bào co lại và giảm thể tích Tuy nhiên, thể tích không bào củanam men lại gia tang; ty lệ tê bào sông trong bia non sẽ giảm mạnh.

Casey G.P (1983, 1984, 1985) cho răng quá trình lên men diễn ra chậm hankhi gia tăng hàm lượng vật chất khô ban đầu có trong dịch nha cao hơn 18°Plato.Tuy nhiên, McCaig R (1992) và Maijara M (1996) kết luận rang, quá trình lênmen bia diễn ra chậm hăn khi hàm lượng vật chất khô có trong dịch nha gia tăngtrên 24°Plato Nhìn chung, ngưỡng giá trị hàm lượng vật chất khô ban đầu của dịchnha làm cho quá trình lên men diễn ra chậm lại sẽ phụ thuộc vào chủng nắm mensử dụng [4].

1.1.2.2 Anh hưởng mật độ nam men gieo cấy ban đầu

Việc xác định mật độ nam men gieo cây ban đầu phù hợp để tối ưu hóa quytrình lên men bia nông độ cao sử dụng nắm men cô định đã trở thành một vẫn décấp thiết Đối với nắm men tự do, khi tăng mật độ giống cấy từ 10—10” tb/mL thìmật độ tế bào trong ImL dịch lên men khi kết thúc quá trình lên men chính khôngcó khác biệt nhiều Bên cạnh đó, khi tăng mật độ giống cây thi hàm lượng các sảnphẩm phụ của quá trình lên men cũng giảm, tốc độ lên men tăng, hàm lượng đườngsót giảm Hon nữa, khi tăng mật độ giống cấy từ 10” — 2.10” tb/mL dịch nha thì hàmlượng diacetyl giảm từ 0,45 mg/L xuống còn 0,32 mg/L, các sản phẩm phụ khácnhư aldehyde, ester cũng giảm [21].

1.1.2.3 Anh hưởng của hàm lượng oxy hòa tan trong dịch nha ban đầu

Nghiên cứu cua L Jones (2007) khi lên men dịch nha 22°Plato, nếu sục khívào dich nha với hàm lượng 25ppm ở giờ lên men thứ 12 thì thời gian lên men chicòn 96 giờ, tức là giảm 33% so với mẫu đối chứng được cung cấp oxy tại thời điểmcay giống nam men [28]

Theo O’Connor-Cox (1993) cũng cho rằng việc cung cấp oxy với nồng độ25ppm tại giờ lên men thứ 12 sẽ làm tăng hoạt tính lên men, tốc độ sinh tổng hợp

ethanol của nam men có sục khí tăng 20% so với không sục khí Việc sục khí saukhi cay giống làm tăng lượng acid béo tích lũy trong tế bào so với việc chỉ sục khítrước khi cây giống Tác giả cũng cho rang, môi trường thiếu oxy sẽ làm giảm khanăng sinh trưởng và hoạt động trao đối chất của nam men [22].

1.1.2.4 Anh hưởng của nhiệt độ lên men

Khi lên men dịch nha 15°Plato và 20°Plato, Dragone G (2003) thấy rang,nếu gia tăng nhiệt độ lên men từ 10°C lên 15°C thì tốc độ lên men từ 0.33 và 0.21g/L sẽ gia tăng lần lượt lên 0,56 va 0,37 g/L.h Hiện tượng gia tăng tốc độ lên menđược giải thích là do sự tăng tôc độ trao đôi chat của nầm men.

Kết quả nghiên cứu của Vesely P (2004) cũng cho thấy khi lên men dịch nha15°Plato và nhiệt độ gia tăng từ 10°C đến 15°C thì mật độ sinh khối nắm men cựcđại gia tăng 100%, nông độ diacetyl trong bia non giảm 70%, rượu cao phân tửtrong bia non tăng 21%, nồng độ ester hầu như không thay đổi, thời gian lên menđược rút ngăn từ 10 ngày xuống còn 6 ngày [4]

1.1.2.5 Anh hưởng của nông độ ethanol trong dịch lên men

Ethanol trong dịch lên men sẽ ảnh hưởng đến hình thái và sinh lý của nammen Khi ngâm nắm men trong môi trường ethanol 10% (v/v), Pratt P.L (2003)nhận thấy sự co rút tế bào nắm men trong quá trình ngâm Sau 96 giờ ngâm trongmôi trường ethanol 10% (v/v), thể tích của tế bào nắm men giảm 35-47% và tỷ lệsống sót của nim men giảm 15-18% Trong khi đó, Boswell C.D (2002) nhận thayrang ty lệ sống sót của tế bào nắm men giảm mạnh từ 95,3% xuống còn 35% khinông độ ethanol trong môi trường lên men tăng từ 76 g/L lên 126,7 g/L [4]

1.2 Nấm men cô định1.2.1 Định nghĩa

Nắm men cố định là nam men được gan trén chat mang hoặc được nhốttrong chất mang hoặc có vị trí hoạt động giới hạn trong một vùng không gian nhấtđịnh của bình lên men nhưng vẫn có khả năng duy trì được hoạt tính trao đổi chất[12].

Trong quá trình lên men bia, việc sử dụng nam men cô định có những thuậnlợi như: 6n định hoạt tính lên men của nắm men trong thời gian dai [25], tăng số lầntái sử dụng nam men trong phương pháp lên men chu kỳ [39]; tăng mật độ tế bàotrong một đơn vị thể tích dịch lên men, giảm kha năng tap nhiễm của vi sinh vật,tăng năng suất của thiết bị lên men [4].

1.2.2 Chất mang trong kĩ thuật có định tế bao

Chất mang cô định nắm men thường là những polymer tự nhiên, polymertông hợp hoặc các vật liệu vô cơ có trong tự nhiền.

— Chất mang vô cơ: chúng có độ bền cơ học và hóa học cao, chi phí thấp vađa dạng về chủng loại Chất mang vô cơ thường gặp là hạt thủy tỉnh,ceramic dạng khối tru hay dạng hat, các kissiris khoáng

— Chất mang hữu cơ: chủng có ưu điểm là bền nhiệt và tương đối 6n định vềmặt hóa học trong điều kiện lên men Chất mang hữu cơ cố định nắm menbao gồm các polymer tổng hợp như: gel polyvinylalcohol,polyvinylchloride, màng polyethylene; các chất mang tự nhiên có bản chấtpolysaccharide như: agar, alginate, chitosan, pectin, carrageenan, dẫn xuấtdiethylaminoethylen của cellulose (DEAE-cellulose), cellulose đã táchlignin (delignified cellulose), cellulose vi khuẩn (Bacterial cellulose), hạtlúa mì, lúa mach; các miếng trái cây như: táo, lê, nho ; một số loại phế liệunhư: bã malt, bã mía, vỏ dưa hấu và các chất mang có bản chất là proteinnhư: gelatin, viên gluten [6].

1.2.3 Các phương pháp cố định tế bào nam menDựa vào tương tác giữa tế bào và chất mang, các kĩ thuật cô định tế bào có thểchia làm 4 nhóm chính:

— Có định tế bào lên bề mặt chat mang rắn (carier — binding)— Nhốt tế bao trong cau trúc gel (entrapment)

— Kết bông tế bào (aggregation).— Vị bao tế bào (microencapsulation) [14]

Nhất tê bào bên trong Tê bao kêt bông Tê bao kêt bông nhân tạocầu trúc gel tự nhiên (liên kết ngang)

polymer ban thâm mảng mỏng mang membrane

QA Chat mang không tan a Cô định tê bào trên bêmặt

CC — ] miên

Chất mang xêp b Nhétté bào trong câu trúc gel

—m“mx m& Membre

Tác nhân liên kết ngang c Kêtbôngtê bao

ZEBLBLE Lựctnh điện d Vibaotê bao

Hình 1.1: Các phương pháp cố định tế bào [12]

1.2.3.1 Có định tế bào trên chất mang rắn (carier — binding)

Quá trình cô định tế bào trên chất mang ran là sự hấp phụ vật lý thông quacác liên kết ion, tĩnh điện, liên kết đồng hóa trị hoặc liên kết đặc trưng giữa tế bàovà chat mang Chiều dài của lớp tế bào hấp phụ thường rất mỏng vào khoảng 1 mmhoặc hơn và giảm dân trong quá trình lên men.

Các chat mang có thê sử dụng là các polysaccharide có nguôn gôc tự nhiên(DEAE-cellulose, 26, mun cua, dextran ), polysaccharide tong hop (cac dan xuat

của polystyrene, polyurethane ) hay các hợp chất vô cơ (ceramic, thủy tinh xốp,silicate ) Các chất mang này có thé được sử dụng ngay hoặc xử lý với hóa chấtnhằm làm tăng khả năng hap phụ của chúng [12].

1.2.3.2 Nhốt tế bào trong cau trúc gel

Kỹ thuật nhốt tế bào trong cau trúc gel là quá trình bao bọc té bào vào trongcau trúc gel nhăm ngăn cản tế bào khuếch tán ra môi trường xung quanh nhưng vẫncho phép tế bào trao đôi chat với môi trường xung quanh

Các loại chất mang thường sử dụng trong kỹ thuật này chủ yếu là các chấtmang có nguồn gốc hữu cơ như: polysaccharide (alginate, K-carrageenan, agar,chitosan, pectin ), protein (gelatin, collagen ) hay polymer tong hợp(polyacrylamide ) Hình dang của chat mang thường là các hat gel hình cầu cóđường kính khác nhau như: hạt carrageenan có đường kính 0,08 — 0,10 mm, hạtalginate 0,1 — 0,15 mm [12].

1.2.3.3 Kết bông tế bào (aggregation)

Nắm men là loài vi sinh vật có thuộc tính tự nhiên là tự kết cụm các tế bàovới nhau thành một khối (kết bông) Sự kết bông ở nam men là một thuộc tính cótầm quan trọng lớn đối với ngành công nghiệp sản xuất bia vì nó ảnh hưởng đếnnăng suất quá trình lên men và chất lượng bia [16] Tuy nhiên phương pháp này ítđược ứng dụng thực tế vì có nhiều yếu tố ảnh hưởng: điều kiện dinh dưỡng củanắm men, hàm lượng oxy hòa tan, pH, nhiệt độ lên men, điều kiện xử lý và bảoquản nắm men [37]

1.2.3.4 Vi bao tế bàoKỹ thuật vi bao tế bào gồm các dạng:

— Sử dụng bao vi thé (microencapsulte type): tế bào được nhốt trong cácbao vi thé bang các polymer bán thấm

— Kiểu liposome: tế bào được nhốt trong màng lỏng từ các chất mang cótính lưỡng cực (amphiphatic).

— Sử dụng membrane: tế bào được nhốt băng màng vi lọc, siêu lọc [12]

1.2.4 Yêu cau đối với chất mang và phương pháp cố định nam men

Chất mang cố định nam men bia phải thoa man một sỐ yêu cầu như: có diệntích bề mặt lớn và có khả năng kết dính tế bào; có khả năng chứa lượng sinh khốinắm men càng cao càng tốt; có độ bên cao về vật lý (cơ học, áp suất thâm thấu,nhiệt độ); hóa học và sinh học; độ xốp của chất mang tương đối đồng nhất; sảnphẩm trao đổi chất và khí di chuyển dễ dàng trong quá trình lên men; không ảnhhưởng đến chất lượng sản phẩm; chất mang phải dễ bảo quản và tái sử dụng [12]

Yêu cầu chung của phương pháp cố định nắm men bia là: phải đơn giản; chỉphí thấp và phù hợp với quy mô sản xuất; không gây tạp nhiễm vi sinh vật có hại;

nắm men có khả năng phát triển tốt và hoạt động ôn định trên hoặc trong chất mang

trong thời gian dài; dé dàng tách chất mang với nắm men cố định ra khỏi dịch lênmen [4].

1.2.5 Có định nam men trên cellulose vi khuẩn1.2.5.1 Cellulose vi khuẩn

Cellulose vi khuẩn là polymer được cấu tao bởi các gốc đường glucose liênkết với nhau bằng liên kết B- 1,4- glucoside Các chuỗi glucan liên kết với nhaubăng liên kết hydro tạo nên cấu trúc tiền sợi, rồi kết tinh thành sợi, bó (bundle), dải(ribbon) [41].

Một tế bao A xylinum có thé polymer hóa lên đến 200.000 phân tử glucosemỗi giây Trên bề mặt của vỏ tế bào cho thấy sự hiện diện của 50-80 vị trí lỗ rỗnggiống nhau sắp xếp theo một hang dọc đứng ké nhau với các dai cellulose ngoạibào Các sợi mới sinh ra của cellulose vi khuẩn kết hợp lại với nhau để hình thànhnên các soi SƠ cấp (subfiril) có chiều rộng khoảng 1,5 nm, là những sợi mảnh nhấtcó nguồn sốc tự nhiên Các sợi so cấp kết hợp lại thành các vi sợi (microfibril) Cac

vi soi năm trong các bó (bundle) va cudi cùng thành các dai (ribbon) Cac dai có

chiều dài khoảng 6-10 nm và chiều rộng khoảng 50-80 nm gấp 200 lần so với soicotton [20].

Soi sơ cấp Dải sợiTập hợp chuỗi

glucan

HO OHoO

H /n

OH

Hinh 1.2: A.xylinum va câu trúc cellulose vi khuẩn [16].Cellulose vi khuẩn là loại cellulose kết tinh tự nhiên, có thé thu được ở dạngtinh khiết và là loại cellulose sinh học không chứa lignin, pectin hay araban, vì vậyviệc thu nhận cellulose vi khuẩn không phải qua những bước xử lý phức tạp, sợicellulose bền hơn và vẫn giữ lại những đặc tính quan trọng [41]

Mang cellulose vi khuẩn do A xylinum tạo ra có cau trúc hóa học đồng nhấtvới cellulose thực vật nhưng lại có một số tính chất hóa lí tốt của một chất mangtrong cô định tế bào như: độ bền cơ học và khả năng thắm hút nước cao, đường kínhsợi nhỏ, độ tinh khiết cao, khả năng polymer hóa lớn, có khả năng hút và giữ 4m tốtnhờ cấu trúc mạng lưới cellulose, dễ dàng phù hợp với hình dạng thiết bị phản ứngsinh học, có khả năng tái sử dụng và an toàn sinh học Cellulose vi khuẩn phù hợpvới các tiêu chuan cơ bản của chat mang và có tac động bảo vệ tê bào [3 |.

1.2.5.2 Cac phương pháp cô định tế bào trên chất mang cellulose vi khuẩna Phương pháp hấp phụ

Đây là phương pháp tiêu biểu đầu tiên về sự cố định vi sinh vật Phươngpháp nay tạo nên dựa trên môi liên kêt hóa học giữa màng tê bào và bé mặt chat

10

mang Các liên kết chủ yếu được hình thành trong phương pháp hấp phụ thé hiệncác cơ chế sau:

— Tạo liên kết hóa học giữa màng tế bào và bề mặt chất mang, trên bề mặtchất mang và màng tế bào vi sinh vật hình thành các liên kết hóa học,nhờ các liên kết này mà vi sinh vật được gan vào chất mang

— Sự tương tác ion: bề mặt chất mang và vi sinh vật có mang các ion tráidau nhau, nhờ vậy mà vi sinh vật liên kết với chất mang

Quá trình thực hiện hấp phụ đơn giản: chất hấp phụ và sinh khối vi sinh vậtđược trộn lẫn với nhau trong khoảng thời gian cho phép sự hấp phụ xảy ra nhờtương tác các liên kết ion, hydrogen và lực Vander Waals

Phương pháp hấp phụ có thể thực hiện theo 3 cách:— Phương pháp cỗ điển: ngâm chat mang vào dung dịch huyền phù vi sinh

vật, vi sinh vật sẽ tự động kết lang và liên kết với chất mang bang cáchhap phụ trên chat mang đó

— Phương pháp cổ điển có cải tiến: sử dụng thêm cánh khuấy nhằm mụcđích phân bồ đều tế bào vi sinh vật và chat mang trong dung dịch dé tăngdiện tích tiếp xúc giữa chất mang và vi sinh vật, vì vậy hiệu suất gắnđược cải thiện đáng kể

— Phương pháp bơm canh trường vi sinh vật qua cột chứa chất mang,phương pháp này can có hồi lưu dòng canh trường dé nâng cao hiệu suấtgan té bao vi sinh vat vao chat mang [3]

b Phương pháp hấp phụ ủVi sinh vật cố định trên cellulose vi khuẩn sau thời gian hấp phụ có thé sửdụng chất dinh dưỡng đã được khuếch tán vào trong cấu trúc của chất mang dé tăngsinh khối trong giai đoạn ủ Sau giai đoạn hấp phụ giai đoạn ủ nhằm tăng mật độ visinh vật trong cấu trúc cellulose vi khuẩn Phương pháp hap phụ - ủ không những

đã làm tăng mật độ vi sinh vật trong chất mang lên nhiều lần, mà còn 6n định mật

độ vi sinh vật cô định trên chất mang trong một thời gian dài [3]

11

1.2.6 Ưu nhược điểm cia phương pháp cố định tế bào trên cellulose vi khuẩn

Ưu điểm: quá trình cố định dễ thực hiện, điều kiện cố định ôn hòa, khôngcần phải xử lý nhiệt hay xử lý hóa chất nên các tế bào cô định không bị mat hoạttính lên men Phương pháp hấp phụ - ủ còn tạo điều kiện cho nắm men cố định trênchất mang cellulose vi khuẩn tăng sinh khối, thích nghi với môi trường lên mennhanh hơn Chất mang cellulose vi khuẩn có tính chat cơ lý bền và 6n định, độtrương nở tốt nên vi sinh vật cỗ định trên cellulose vi khuẩn có khả năng tái sử dụngnhiều lân.

Nhược điểm: cấu trúc chất mang bị phá hủy khi cố định các vi sinh vật cóhoạt tính cellulase [6].

1.3 Ứng dụng nắm men cố định trong quá trình lên men bia nồng độ cao1.3.1 Tính chất sinh lý của nắm men cô định

Theo nghiên cứu của Patkova J (2000) khi lên men bia nông độ cao chothay rang, tỷ lệ sống sót của nam men cô định trong gel alginate gần như không đổivà không thấp hơn 95% khi hàm lượng vật chất khô trong dịch nha ban đầu daođộng khoảng 12-24°Plato Trong khi đó, ty lệ sống của nắm men tự do giảm dantrong cùng điều kiện thí nghiệm và chỉ đạt giá trị là 74% và 69% khi hàm lượngvật chất khô trong dịch nha ban đầu là 12°Plato và 24°Plato [42]

Dragone G (2007) cũng đã thu được kết quả tương tự về ty lệ sống sót củatế bao nam men khi sử dụng nắm men có định trên bã malt dé lên men bia nồng độcao theo phương pháp liên tục [25].

1.3.2 Kha năng sử dụng cơ chất

Một số tác giả nhận thay nắm men cô định trong gel Ca-alginate, Ca-pectatevà K-carragenan sử dụng ít hàm lượng acid amin tự do hơn so với nắm men tự do.Trong khi đó, Smogrovicova D (1999) nhận thay kha nang su dung acid amin tu docủa nam men có định trên DEAE-cellulose va nam men tự do là tương đương

12

Toc độ sử dụng đường khử của nam men cô định trên các chat mang khácnhau thì khác nhau Tuy nhiên, toc độ sử dụng đường khử cua nam men cô địnhluôn cao hơn so với nam men tự do [17].

1.3.3 Kha năng chịu đựng những yếu (ố bat lợi

Nhìn chung, nắm men cố định chịu stress áp suất thâm thấu và stressethanol tốt hơn nắm men tự do Nghiên cứu cua Shen H.Y (2003) cho rằng, chínhchất mang đã bảo vệ nắm men chống lại những tác động của ethanol trong dịch nhalên men bia nông độ cao Sự gia tăng thành phần acid béo chưa bão hòa hoặcphotpholipid và sterol trong màng tế bào chất làm thay đổi tính thâm của màng, từđó làm giảm sự ức chế hoạt tính lên men của tế bào có định bởi ethanol Tuy nhiên,một số tác giả lại thay rang VIỆC giảm su Uc chế hoạt tính lên men của tế bào côđịnh bởi ethanol là do tăng tỷ lệ acid béo bão hòa trong màng tế bào chat [41].1.3.4 Kha năng sinh tong hợp các sản phẩm trao đổi chất

1.3.4.1 Sự hình thành ethanol

Đối với phương pháp lên men chu kỳ, Bardi E P (1996) báo cáo răng nồngđộ ethanol trong bia non khi sử dụng nam men cố định trên cellulose đã tach ligninluôn cao hon so với nam men tự do khi lên men bia ở các giá trị nhiệt độ khác nhau[23].

Còn đối với phương pháp lên men liên tục với nam men cô định trên bã

malt khi hàm lượng vật chất khô trong dịch nha từ 13,4 tăng lên 18,5°Plato thi

nong d6 ethanol trong bia non tir 5,9 tang 7% (v/v) [21]

1.3.4.2 Sw hình thành ester

Sử dụng nam men cố định trong quá trình lên men bia nồng độ cao làm chohàm lượng ester trong sản phẩm thay đổi và điều đó phụ thuộc vào chất mang vàđiều kiện lên men Nhìn chung, nắm men cô định tạo ra ester trong bia non vớinồng độ thấp hơn so với nam men tự do, đặc biệt là isoamyl acetate [21]

13

1.3.4.3 Su hình thành diacetyl

Trong quá trình lên men bia nồng độ cao theo phương pháp liên tục với nắmmen cố định trên bã malt, nồng độ diacetyl trong bia non sẽ tăng khi tăng hàmlượng vật chất khô ban đầu của dịch nha và đạt giá tri cao nhất là 0/77 mg/L đốivới dịch nha 18°Plato

Theo Patkova J (2000) khi lên men bia nồng độ cao theo phương pháp chukỳ với nam men cô định nhận thay rang, nồng độ diacetyl trong bia non giảm khidịch nha tăng hàm lượng vật chất khô ban đầu Cụ thể là khi tăng hàm lượng vậtchất khô của dịch nha từ 12 lên 20”Plato, nồng độ diacetyl trong bia non giảm từ0.23 mg/L xuống 0,1 mg/L Tuy nhiên, khi gia tăng hàm lượng vật chất khô trongdich nha từ 20 lên 30°Plato thì nồng độ diacetyl trong bia non tăng lên 0,12 mg/L.Can lưu ý là nồng độ diacetyl trong bia non khi sử dụng nam men cô định trong gelalginate luôn thấp hơn khi sử dụng nam men tự do trong cùng điều kiện khảo sát

Tóm lại, lên men bia nồng độ cao sử dụng nắm men có định mang lại mộtsố hiệu quả kĩ thuật cao hơn so với nắm men tự do Nhìn chung, chất mang vàphương pháp cố định có ảnh hưởng đến tính chất sinh lý, khả năng sử dụng cơ chấtvà sinh tong hợp các sản phẩm trao đổi chất của nam men Nhờ tác dung bảo vệcủa chất mang trước tác động stress của áp suất thắm thấu và ethanol, quá trìnhtrao đối chất của nắm men sé tăng, đồng thời có thể làm tăng được mật độ nắmmen và ty lệ tế bào sống trong một đơn vị thé tích dịch lên men [42]

1.4 Tinh hình nghiên cứu trong và ngoài nước về kỹ thuật lên men bia nông

độ cao sử dụng nam men có định1.4.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Tại Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu về phương pháp cố địnhnắm men trong gel alginate Tran Quéc Hién (2012) đã xác định được các điều kiệnkỹ thuật dé có định nắm men trong gel alginate dé sản xuất bia nồng độ cao là: mậtđộ tế bào trong gel là 5.107 tb/mL, nồng độ alginate trong gel là 2,5% (w/v) Nammen cô định lên men dịch nha có hàm lượng vật chất khô ban đầu là 24°Plato với 30

14

chu kỳ liên tiếp trong thời gian 150 ngày và hoạt tính luôn cao hơn nắm men tự do[8] Nghiên cứu sự thay đổi một số yếu tố trong quá trình lên men chính của LạiQuốc Đạt, Lê Văn Việt Mẫn, Võ Thị Luyén cho thay khi b6 sung (NH¿)›SO¿ vớihàm lượng 90 mg nitơ/L hay sục khí vô trùng liên tục trong 12 giờ lên men đầu tiêncho dịch nha 20°Plato (80% malt, 20% gạo), nong độ ethanol trong bia non có thểđạt trên 10% (v/v) và rút ngăn thời gian lên men [1].

Ngoài ứng dụng trong lĩnh vực sản xuất bia, một số nghiên cứu trong nướccũng khảo sát ứng dụng nam men cố định trong gel alginate để lên men sản xuấtethanol Phạm Trọng Khoa (2003) đã sử dụng nam men cố định trong gel alginateđể lên men sản xuất ethanol theo phương pháp liên tục trong khoảng thời gian 36-40ngày với tốc độ pha loãng là 0.0125 h† Sản phẩm tạo thành có ham lượng ethanoldao động trong khoảng 6,8-7,4% (v/v) Bùi Thanh Huyền đã thay đổi nồng độglucose 140-220 g/L trong môi trường tong hợp và nhận thay nam men cô định luôncó tốc độ lên men cao hơn khoảng 1,3-2,5 lần và nồng độ ethanol trong dich dimchín cao hon khoảng 1 ,7-2,2 lần so với nắm men tự do [4]

1.4.2 Tinh hình nghiên cứu ngoài nước

Krish J (1997) nhận thay nắm men Saccharomyces cerevisiae cỗ định tronggel alginate có ty lệ tế bào sống là 72% khi hàm lượng ethanol trong canh trường là20% (v/v), trong khi ty lệ này cua nắm men tự do là 0% Domezy Z (1998) đã sửdụng nấm men cố định trong gel alginate với mật độ tế bào 10” tb/mL gel để lênmen bia và thay rang thời gian lên men giảm so với sử dụng nam men tự do Nghiêncứu của Patkova J (2000) sử dụng nắm men cố định trong gel alginate để lên mendịch nha với hàm lượng vật chất khô là 24”Plato theo phương pháp chu kỳ cũng thuđược kết quả tương tự Hàm lượng nitơ amin tự do còn lại trong bia non khi sử dụngnam men cô định cao hon 30% so với nâm men tự do.

Patkova J (2000) sử dụng thành công nắm men cô định trong gel alginate délên men dịch nha với hàm lượng vật chat khô 24°Plato trong thời gian 8 ngày, giảm50% thời gian lên men so với mâu đôi chứng sử dụng nâm men tự do Nông độ

15

ethanol của bia non dat giá trị 9,5% (v/v) và tăng 53,2% so với khi sử dụng nắmmen tự do [4].

Về việc sử dung nam men cô định đê ứng dung lên men:

Ngoài việc sử dụng chất mang alginate, một số nghiên cứu đã sử dụng chấtmang giàu cellulose từ thực vật để có định nắm men Kourkoutas (2001, 2006) sửdụng các miếng trái cây để làm chất mang cô định nắm men Saccharomycescerevisiae để lên men rượu vang từ dịch nho đỏ Rhotidis Nắm men cô định trênmiếng táo được tái sử dụng 30 chu kỳ, sau 5 chu kỳ lại hạ thấp nhiệt độ lên men ởcác chu kỳ đầu tiên và xuống còn 1°C ở các chu kỳ cuối Kết quả sau 30 chu kỳ,hàm lượng đường sót dưới 30 g/L, nông độ ethanol trong vang non là 12% (v/v),

hàm lượng acid dé bay hơi là 0.3g/L acetic acid

Tsakiris (2004) sử dụng chất mang là miếng nho Sultanina đã sây khô dé cố

định nắm men Saccharomyces cerevisiae dé lên men vang trắng từ dịch nho Nam

men cô định được tái sử dụng trong 12 chu kỳ Nho khô trở thành loại chất mang tốt

cho nam men khi lên men ở nhiệt độ 15-25°C Thời gian lên men ngắn (3-5 ngày),hiệu suất chuyển hóa đường là 100%, hàm lượng acid dễ bay hơi, methanol vàacetaldehyde trong dịch lên men thấp Ngoài ra, Mallios (2004) đã tái sử dụng nắmmen cô định trên miếng lê 20 chu kỳ Reddy (2006, 2008) đã tái sử dụng nắm mencố định trên miếng ôi và vỏ dưa hấu 12 chu ky [6]

Một báo cáo khác của Wanying Yao (2011) sử dung cellulose vi khuẩn làmmàng membrane cô định nam men và ứng dụng trong sản xuất ethanol Nong độethanol thu được tăng 21,2% va tốc độ sinh tong hop ethanol tang 31,3% so voinắm men tự do [44] Bardi (1996) có định nắm men trên cellulose đã loại li gnin ứngdụng lên men bia ở nhiệt độ thấp cũng cho kết quả tương tự [23]

Trong nước, nghiên cứu của Nguyễn Thúy Hương (2003, 2006) về việc cốđịnh Oenococcus oeni trên cellulose vi khuẩn bằng phương pháp hấp phụ-ủ.Nguyễn Thúy Hương (2008) cố định nam men trên cellulose vi khuẩn ứng dụng lênmen rượu vang đã là tiền dé dé tôi thực hiện nghiên cứu cô định nắm men trên chấtmang cellulose vi khuân lên men bia nông độ cao Tác giả đã so sánh khả năng cô

16

định tế bào nắm men trên hai loại cellulose vi khuẩn dạng màng và dạng hạt đồngthời tiễn hành tái sử dụng nắm men cố định qua 8 chu kỳ lên men [3] Nghiên cứucủa T6n Nữ Minh Nguyệt (2014) cô định nắm men Saccharomyces cerevisiae trêncellulose vi khuan nham ứng dụng lên men rượu vang nho Khi đó, tac gia cô địnhtrên chất mang cellulose vi khuẩn bang phương pháp hap phụ-ủ làm cho mật độ tếbào trên chất mang tăng 2,37 lần Mật độ tế bào trên chất mang sau quá trình cốđịnh bang phương pháp hấp phụ-ủ là 14.10” tb/g Ngoài ra, tác giả cũng khảo sátkhả năng tái sử dụng của nắm men cô định trên chất mang cellulose vi khuẩn làkhông it hơn 10 chu ky Thời gian lên men của nắm men cô định thấp hơn, tốc độsử dụng đường và sinh tong hop ethanol cao hon so voi nắm men tu do [6].

Kế thừa kết quả công bố cua một số nghiên cứu trong nước cũng như nướcngoài, dé tài sử dụng chất mang cellulose vi khuẩn để cố định nấm menSaccharomyces cerevisiae ứng dụng trong lên men bia nông độ cao tại cơ sở sảnxuát bia Viên Đông.

17

Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Bảng 2.1: Chỉ tiêu nước nâu bia tại cơ sở sản xuât bia Viên ĐôngChỉ tiêu kiểm soát TCCS

Mùi, vi Không có mùi, vi lạĐộ cứng tong (F) <2

pH 6,2-7,5Độ trong (%Neph) < 13,4Clo tu do (mg/L) < 0,05Tổng sat (mg/L) <0,1Ham lượng nitrit (mg/L) 0

- Hoa Houblon: có xuất xứ từ Australia do công ty Tân Việt Úc (Việt Nam)cung cấp Hàm lượng œz—acid dang là 8,24%

2.1.2 Nam men— Nâm men bia sử dụng trong dé tài là chủng thuộc loài Saccharomyces

cerevisiae chịu được nông độ cao có nguôn gôc và được lưu trữ tại cơ sởsản xuất bia Viễn Đông (Hình 2.1)

Hình 2.1: Hình đại thê, vi thé của nầm men Saccharomyces cerevisiae

18

2.1.3 Chất mang cô định cellulose vi khuẩn

Cellulose vi khuẩn được thu nhận từ quá trình lên men nước dừa già theophương pháp lên men bề mặt, sử dung Acetobacter xylinum (BC16) doPhòng thí nghiệm Bộ môn Cong nghệ Sinh học, trường Dai học Bach Khoacung cấp Sản phẩm có màu trang ngà, độ âm 93%, được cắt thành nhữngkhối hình hộp chữ nhật có kích thước 2cm x 2cm x 0,7cm theo hoạch địnhthí nghiệm.

2.2 Phương pháp thí nghiệm2.2.1 Sơ đồ thí nghiệm

Giông Xác định các điều kiện cô địnhe Khao sát các điều kiện lên nam men tren cellulose VỊ

men thích hợp cho chủng khuân

nắm men chịu được nông độ e Xác định các điều kiện thíchcao có nguồn gốc và lưu trữ hợp cô định nam men trêntại cơ sở sản xuất bia Viễn chất mang cellulose vi khuẩnĐông theo phương pháp hấp phụ

Y

Đánh gia kha năng lên men bia nông độ cao boi nam men cô định trên chat

mang cellulose vi khuan

So sánh biến động quá Khảo sát khả năng tái sử Thử nghiệm lên mentrình lên men của nắm dụng của nắm men cô bia với nằm men cômen tự do và nam men định trên chất mang định trên chất mangcô định trên chất mang cellulose vi khuẩn trong cellulose vi khuẩn quycellulose vi khuẩn trong quá trình lên men mồ phòng thí nghiệm

quá trình lên men tại cơ sở sản xuất bia

Viễn Đông

19

2.2.2 Bồ trí thí nghiệm2.2.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát các diéu kiện lên men thích hop doi với chủng

nam men Saccharomyces cerevisiae chịu được nông độ cao có nguôn gốctai cơ sở sản xuất bia Viên Dong

Thí nghiệm Yêu tô thay đối Yêu tô cô định

— Hàm lượng vật chất khô ban đầu: 20°Plato

Mật độ giỗng | — Nhiệt độ lên men: 17°C

1A cay ban đầu: | — Thể tích dịch lên men: 1 lít [1]

1I;:2;3:4.107tb/mLHàm lượng vat — Mật độ giống cấy: kết quả thí nghiệm 1A

chất khô ban — Nhiệt độ lên men: 17°C

1B dau: — Thé tích dịch lên men: 1 lít [1]

2.2.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát điều kiện thích hợp để cỗ định nam men trên

chất mang cellulose vi khuẩn** Mục dich: Xác định các điều kiện cô định nắm men trên chất mang cellulose

vi khuẩn theo phương pháp hấp phụ.%_ Bồ trí thí nghiệm

20

Thí Yêu tô thay đối Yêu tô cô địnhnghiệm

Khối lượng chất mang: 10g/100mL [6]

Mật độ tế bào trong Kích thước chất mang: 2cm x 2cm x 0/7cm

2A huyện phù giống: pH huyền phù giống: 4-5

1; 2; 3; 4; 5.10” Tốc độ lắc: 200 vòng/phút [3]tb/mL Thời gian hấp phụ trên chất mang: 30 phút

Mật độ tế bào trong huyền phù giống: chọn từ kếtquả thí nghiệm 2A

2B Khối lượng chất Kích thước chất mang: 2cm x 2cm x 0/7cm

mang pH huyền phù giống: 4-5

5; 10; 15; 20; 25 Tốc độ lắc: 200 vòng/phút [3]

g/100mL, Thời gian hấp phụ trên chất mang: 30 phút

Mật độ tế bào trong huyền phù giống: chọn từ kếtTốc độ lắc: quả thí nghiệm 2A

100; 200; 300; 400 Khối lượng chất mang: từ kết quả thí nghiệm 2B2C vong/phut Kích thước chat mang: 2cm x 2cm x 0/7cm

pH huyền phù giống: 4-5Tốc độ lắc: 200 vòng/phút [3]Thời gian hấp phụ trên chất mang: 30 phútMật độ tế bào trong huyền phù giống: chọn từ kếtThời gian hấp phụ quả thí nghiệm 2A

nam men trên chất Khối lượng chất mang: từ kết quả thí nghiệm 2B

2D mang: Tốc độ lắc: từ kết quả thí nghiệm 2C

20; 30; 40; 50; 60 Kích thước chất mang: 2cm x 2cm x 0/7cm

phút pH huyền phù giống: 4-5

¢¢ Chi tiêu theo dõi

Mật độ tế bào nam men cô định; Hình ảnh tế bao trong mạng lưới cellulosevi khuân được chụp dưới kính hiên vi điện tử; Hiệu suât cô định trên chat mangcellulose vi khuẩn

21

2.2.2.3 So sánh biến động của quá trình lên men bởi nam men cô định trên chất

mang cellulose vi khuẩn và nam men tự do trong quá trình lên menchính

s* Mục dich

Xác định và so sánh sự sinh trưởng, hoạt động trao đối chất của nắm men côđịnh trên chất mang cellulose vi khuẩn trong quá trình lên men bia

s* Yéu tố cô định> Thể tích dịch mỗi bình lên men: 2 lít> Hàm lượng vật chất khô, nhiệt độ lên men, mật độ giống cấy: từ kết quả thí

nghiệm | mục 2.2.2.1> Mật độ giống cấy ban đầu của 2 nghiệm thức như nhau: kết quả thí nghiệm

1 mục 2.2.2.1~ Yéu to thay đổi

> Nắm men tu do> Nắm men cố định

s* Khao sát

— Mật độ tế bào.— Độ Plato.

— pH.

— Ethanol2.2.2.4 Khảo sát khả năng tái sử dụng nam men cô định trên cellulose vi khuẩn

để lên men bia nông độ cao

s* Mục dich

Đánh giá kha năng tái sử dụng của nam men cô định trên cellulose vi khuẩntrong quá trình lên men bia nồng độ cao theo phương pháp nhiều chu ki

s* Yéu tố cô địnhs* Thể tích dịch mỗi bình lên men: 2 lít* Ham lượng vật chat khô, nhiệt độ lên men, mật độ giống cấy: từ kết quả thí

nghiệm | mục 2.2.2.1

22

* Tiến hành thí nghiệm— Sau mỗi chu kì lên men (6 ngày), chế phẩm nắm men cô định trên chất mang

cellulose vi khuẩn được chuyên qua bình erlen dé rửa 2 lần với 100 ml nướcmuối sinh lý chuẩn bị cho lần lên men tiếp theo để theo dõi khả năng tái sửdụng của chế phẩm

— Dự kiến tiến hành thí nghiệm tái sử dụng qua một số chu kì, lay mẫu vàocuối quá trình lên men

— Thí nghiệm cũng được tiễn hành lên men đối với nam men tự do để so sánh.* Thong số khảo sát

— Mật độ tế bào.Độ Plato.

— pH

— Ethanol.2.2.2.5 Thứ nghiệm lên men bia với nam men cô định trên chất mang cellulose vi

khuẩn quy mô phòng thí nghiệm tại cơ sở sản xuất bia Viễn Đông

— Độ dang (BU)— Độ mau (EBC)

23

— Hàm lượng CO; (g/L)2.3 Phương pháp phân tích2.3.1 Phương pháp nhân giỗng nam men

Nam men được giữ giống trên môi trường thạch nghiêng (malt-agar) ở nhiệtđộ 5°C, sau đó được nhân giống trên môi trường dịch nha được nau từ malt daimach.

Nam men được nhân giéng thành 2 cấp:— Cấp 1: Môi trường nhân giống là dịch nha 8”Plato với thé tích 15ml— Cấp 2: Môi trường nhân giống là dịch nha 8 Plato với thé tích 150mlNhiệt độ nhân giống 28-30°C, tốc độ lắc 100 rpm và thời gian nhân giống 24giờ Sau khi nhân giống, đếm số tế bào nắm men sinh trưởng trong dịch nha rôi lytâm thu sinh khối để chuẩn bị cho việc cố định tế bào [10]

2.3.2 Phương pháp co định té bào nam men trên chất mang cellulose vi khuẩn

Phương pháp có định tế bào: tế bào nam men được cố định trên chat mangcellulose vi khuẩn bằng phương pháp bay- hấp phụ (gồm 2 giai đoạn: hấp phụ vikhuẩn trên bề mặt cellulose vi khuẩn và bay tăng sinh trên va trong chất mangcellulose vi khuẩn)

— Hoạt hoá giống nam men can có định.— Bồ sung chất mang cellulose vi khuẩn vô trùng vào dịch tế bào đã hoạt hoá

Quá trình cố định trên chất mang cellulose vi khuẩn sé trải qua 2 giai đoạnliên tiếp:

Giai đoạn hấp phụ: trong khoảng 30 phút đầu tiên sau khi ngâmcellulose vi khuẩn trong dịch tế bao, cellulose vi khuẩn sẽ trương nở vềtrạng thái ban dau, đồng thời sẽ hap phụ tế bào vào hệ thống sợi bên trongcũng như trên bể mặt bên ngoài, kết hop sử dung máy lac 250 vòng/phút,dé tăng khả năng hấp phụ tế bào nam men và chất mang, thời gian ủ 4ngày, ủ ở nhiệt độ 30°C

24

Y Giai đoạn bay tăng sinh: kế tiếp giai đoạn hấp phụ Các tế bào đã đượchấp phụ giai đoạn trên tiếp tục phát triển và tăng sinh trên giá đỡcellulose vi khuẩn, ủ ở điều kiện tối ưu 28-32°C Thời gian ủ tối ưu đượcxác định khi mật độ nam men cố định cao nhất.

— Định lượng nắm men cố định trên chất mang cellulose vi khuẩn: mẫu đạidiện, dập mẫu vô trùng, xử lý bằng cellulase và định lượng bằng phươngpháp đếm gián tiếp

2.3.3 Phương pháp chuẩn bị dịch nha tại cơ sở sản xuất bia Viễn ĐôngBảng 2.2: Nguyên liệu sử dụng cho một mẻ nâu tại cơ sở sản xuât bia Viên Đông

Nguyên liệu Lượng sử dụng cho một mé nau

Malt 1 kg

Nước 3LHoublon cao 0,3 g/L dịch nha sau lọcHoublon viên 1,1 g/L dịch nha sau lọc

100 220C 78°CS0 ; 62°C

25

Hình 2.3: Bình lên men sử dụng tại cơ sở sản xuất bia Viễn Đông.“+ Cấu tạo và nguyên lý hoạt động của bình lên men:

Bình lên men làm từ thép không gỉ có dạng hình trụ đáy phăng với tỷ lệđường kính 21/30; đỉnh bình lên men được kết nỗi với các ống dẫn Os và ống thoátCO: thé tích hoạt động của bình là 15 L

2.3.5 Phương pháp phan tích vi sinh— Xác định số lượng tế bào nắm men (Phụ luc 1)

e Trong canh trường giống và dịch lên men bia: dùng phương pháp đếmtrực tiếp số tế bào trên buồng đếm Thoma dưới kính hiển vi

e Xác định số tế bào nam men sống/chết: sử dụng phương pháp nhuộm tếbào bằng dung dịch xanh methylen sau đó soi dưới kính hiến vi Thoma.— Quan sát hình thái của tế bào nắm men cô định băng kính hién vi điện tử quét

(Scanning electric microscope-SEM) (Phụ lục 1)2.3.6 Phương pháp phan tích hóa lý

— Xác định hàm lượng vật chất khô của dịch lên men bang Plato ké, don vi do°Plato

— Xác định nông độ ethanol có trong dịch lên men băng phương pháp chưngcất [5]

26