Luận án tiến sĩ Công nghệ thực phẩm: Nghiên cứu quá trình lên men bia nồng độ cao sử dụng nấm men cố định trên Alginate

Sản xuất bia nồng độ cao với nấm men cố định trong gel alginate sẽ làm giảm khả năng tạp nhiễm vi sinh vật lạ; tăng mật độ tế bào trong một đơn vị thể tích dịch lên men, tăng số lần tái

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

2 TS Hoàng Kim Anh

NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH LÊN MEN BIA NỒNG ĐỘ CAO SỬ DỤNG NẤM MEN CỐ ĐỊNH TRÊN ALGINATE

Phản biện độc lập 1: GS.TS Hoàng Đình Hòa Phản biện độc lập 2: TS Phan Thế Đồng

Phản biện 1: PGS.TSKH Ngô Kế Sương Phản biện 2: PGS.TS Đồng Thị Thanh Thu Phản biện 3: TS Trần Bích Lam

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Những kết quả trình bày trong luận án này chưa được một tác giả nào khác công bố

Nghiên cứu sinh

Trần Quốc Hiền

LỜI CẢM ƠN

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các giảng viên hướng dẫn khoa học là PGS TS Lê Văn Việt Mẫn và TS Hoàng Kim Anh đã tận tình chỉ dẫn, giúp đỡ và động viên em trong suốt thời gian thực hiện luận án

Tôi xin chân thành cám ơn những người thân trong gia đình đã động viên và tạo điều kiện cho tôi thực hiện luận án này

Xin chân thành cám ơn Thầy Ngô Đăng Nghĩa, Viện Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Thủy sản Nha Trang đã hỗ trợ phân tích các chỉ tiêu hóa lý của chế phẩm alginate; xin cảm ơn các chuyên viên Phòng phân tích sắc ký, Trung tâm Hóa dầu, Khoa Kỹ thuật Hóa học, Đại học Bách khoa TP Hồ Chí Minh đã hỗ trợ phân tích sắc ký ethanol và một số sản phẩm phụ có trong dịch lên men Đồng thời xin gửi lời cảm ơn tới các chuyên viên Phòng thí nghiệm kính hiển vi điện tử, Viện Công nghệ Hóa học, Trung tâm KHTN & CN QG đã giúp đỡ nhiệt tình trong phần nghiên cứu về thay đổi hình dạng nấm men dưới tác động của áp lực thẩm thấu và nồng độ ethanol cao trong quá trình lên men

Xin gửi lời cám ơn tới Quý thầy cô và các bạn trong Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh đã hết sức giúp đỡ và ủng hộ trong suốt thời gian thực hiện luận án

NCS Trần Quốc Hiền

TÓM TẮT LUẬN ÁN

Lên men bia nồng độ cao là kỹ thuật lên men dịch nha với nồng độ chất khô ban đầu rất cao (> 15oPt), sau đó pha loãng sản phẩm bia thu được để đạt nồng độ ethanol theo giá trị mong muốn Sản xuất bia nồng độ cao với nấm men cố định trong gel alginate sẽ làm giảm khả năng tạp nhiễm vi sinh vật lạ; tăng mật độ tế bào trong một đơn vị thể tích dịch lên men, tăng số lần tái sử dụng nấm men trong phương pháp lên men chu kỳ; tiết kiệm chi phí năng lượng, chi phí lao động; tăng năng suất của thiết bị lên men; giảm bớt lượng nước cần sử dụng trong sản xuất

Đối với phương pháp lên men chu kỳ, khi nồng độ dịch nha tăng từ 12 lên 28oBx, thời gian lên men sẽ tăng theo Tuy nhiên thời gian lên men của nấm men cố định thấp hơn so với nấm men tự do từ 26,2-46,2% Trong quá trình lên men, nấm men cố định sinh trưởng tốt hơn và có tỷ lệ tế bào sống cao hơn nấm men tự do Nhìn chung, hoạt tính lên men của nấm men cố định luôn tốt hơn nấm men tự do trong lên men bia nồng độ cao Đó là do chất mang alginate có khả năng bảo vệ tốt tế bào nấm men trước tác động của stress áp lực thẩm thấu và stress ethanol

Sự thay đổi mật độ nấm men và nồng độ alginate trong hạt gel sẽ ảnh hưởng đến hoạt tính lên men của nấm men cố định khi lên men dịch nha 24oBx từ malt đại mạch Khi tăng mật độ nấm men trong hạt gel từ 25x106-100x106tb/mL gel thì tổng số chu kỳ lên men thực hiện được sẽ giảm, thời gian lên men trung bình và hàm lượng ethanol trong bia non tăng Tuy nhiên, tốc độ sinh tổng hợp ethanol sẽ giảm mạnh Khi nồng độ alginate trong hạt gel thay đổi trong khoảng 0,5-1,0% w/v, độ bền gel sẽ yếu, hạt gel sẽ bị dễ vỡ trong quá trình lên men Do đó, nồng độ alginate trong khoảng trên không thích hợp để cố định nấm men ứng dụng trong lên men bia nồng độ cao Khi nồng độ alginate trong hạt gel thay đổi từ 1,5-3,0%w/v, thời gian lên men trung bình của các chu kỳ giảm nhẹ nhưng hàm lượng ethanol trung bình trong bia non và tốc độ sinh tổng hợp ethanol tăng lần lượt từ 9,59 lên 10,22%v/v và từ 0,47 lên 0,72g/L.h

Việc tăng tỷ lệ giống cấy để lên men dịch nha 24oBx từ malt đại mạch là không phải giải pháp mang lại hiệu quả kinh tế cho quá trình lên men bia nồng độ cao sử dụng nấm men cố định trong gel alginate Giải pháp này tuy có rút ngắn được thời gian lên men chính nhưng sẽ làm cho hàm lượng ethanol trong bia non giảm đi đáng kể so với mẫu đối chứng Điều này không có lợi bởi vì hệ số pha loãng sẽ thấp khi pha bia thành phẩm về độ cồn 5%v/v Đối với giải pháp cung cấp oxy vào dịch nha,

khi thời gian sục không khí tăng từ 0 đến 20 giờ lên men đầu tiên thì thời gian lên men giảm 41,7%; tuy nhiên, hàm lượng ethanol trong bia non giảm 9,5% Trong quá trình lên men bia nồng độ cao, thời gian sục khí thích hợp cho dịch nha sau khi cấy giống là 12 giờ, hàm lượng oxy hòa tan trong dịch lên men trong suốt thời gian sục khí là 7,5 ppm

Khi lên men dịch nha 24oBx có 30% suyrup maltose, giải pháp bổ sung Tween 80 và ergosterol sẽ ảnh hưởng đến hoạt tính lên men của nấm men cố định trong gel alginate Từ kết quả quy hoạch thực nghiệm, hàm lượng Tween 80 và ergosterol tối ưu cần bổ sung vào dịch nha lần lượt là 0,3%v/v và 18mg/L Khi đó, thời gian lên men chính giảm 22,2% và hàm lượng ethanol trong bia non không thay đổi khi so sánh với mẫu đối chứng

Các tế bào nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate đã chuyển hóa hoặc hấp thu cả 4 loại đường trong dịch nha là glucose, fructose, saccharose và maltose trong những giờ lên men đầu tiên Việc cố định nấm men trong gel Ca-alginate làm cho các tế bào có thể sử dụng maltotrisoe từ những giờ lên men đầu tiên, trong khi nấm men tự do chỉ bắt đầu sử dụng maltotriose sau giờ lên men thứ 48 Ngoài ra, hiệu suất sinh tổng hợp ethanol tính theo đường lên men của nấm men cố định thấp hơn 8,3% so với nấm men tự do Trong khi đó, hiệu suất sinh tổng hợp các sản phẩm phụ khác trong bia như glycerol, acid hữu cơ và rượu cao phân tử của nấm men cố định lần lượt thấp hơn 39,1; 13,7 và 53,8% so với nấm men tự do

Việc gia tăng tỷ lệ giống cấy từ 1,0x107 tb/mL (mật độ giống cấy thông thường) lên 7,0x107 tb/mL (mật độ giống cấy cao) sẽ làm tăng tỷ lệ pha loãng trong phương pháp lên men liên tục lên 3,2 lần, từ đó làm tăng năng suất sử dụng thiết bị lên men Tuy nhiên, việc tăng tỷ lệ giống cấy sẽ làm giảm hàm lượng ethanol trong bia non nên làm giảm thể tích bia được tạo thành sau khi pha loãng bia về độ cồn 5% Ngoài ra, nấm men cố định với tỷ lệ giống cấy cao chỉ có thể sử dụng liên tục trong 24 ngày; trong khi đó nấm men cố định ở tỷ lệ giống cấy thông thường có thể sử dụng trong 44 ngày Việc tăng tỷ lệ giống cấy làm giảm hàm lượng các sản phẩm phụ trong bia non, ngoại trừ diacetyl Tuy nhiên, hàm lượng acetaldehyde, rượu cao phân tử và ethylacetate trong bia non sau khi pha loãng về độ cồn 5% ở hai nghiệm thức 1,0x107 tb/mL và 7,0x107 tb/mL đều nằm trong ngưỡng cho phép

MỤC LỤC

Trang

1.3.2.6 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol trong dịch lên men 13 1.4 Ứng dụng nấm men cố định trong quá trình lên men bia nồng độ cao 13

1.4.4 Khả năng sinh tổng hợp các sản phẩm trao đổi chất 15

1.5 Chất mang alginate 16

1.6 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về kỹ thuật lên men bia nồng độ 19cao sử dụng nấm men cố định trong gel alginate

3.1 Ảnh hưởng của việc cố định tế bào trong gel alginate đến hình thái và 50 khả năng lên men bia nồng độ cao của nấm men cố định

3.1.1 So sánh hoạt tính lên men của nấm men tự do và nấm men cố định khi 50

nồng độ dịch nha thay đổi 3.1.2 Quan sát hình thái của nấm men trong điều kiện stress áp lực thẩm thấu 62

và stress ethanol tăng cao 3.1.3 Xác định mật độ tế bào và nồng độ alginate thích hợp trong 1mL gel để 65

cố định nấm men ứng dụng trong quá trình lên men bia nồng độ cao 3.1.4 Quan sát hình thái hạt gel trong quá trình lên men bia nồng độ cao theo 68

phương pháp chu kỳ 3.1.5 So sánh hoạt tính lên men của nấm men cố định và nấm men tự do 70

trong quá trình tái sử dụng để lên men bia nồng độ cao theo phương pháp chu kỳ

3.2 Nghiên cứu ứng dụng nấm men cố định để lên men dịch nha 24oBx từ 75 malt đại mạch

3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy đến khả năng lên men của 75

nấm men cố định 3.2.2 Đánh giá ảnh hưởng của thời gian sục khí trong giai đoạn đầu của 84

quá trình lên men đến khả năng lên men của nấm men cố định 3.3 Sử dụng nấm men cố định để lên men dịch nha có bổ sung thế liệu syrup 93

maltose 3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ thế liệu đến hoạt tính lên men của nấm 93

men cố định trong quá trình lên men bia nồng độ cao 3.3.2 Đánh giá ảnh hưởng của phương pháp bổ sung Tween 80 vào dịch nha 98

đến hoạt tính lên men của nấm men cố định 3.3.3 Đánh giá ảnh hưởng của phương pháp bổ sung ergosterol vào dịch nha 100

đến hoạt tính lên men của nấm men cố định 3.3.4 Đánh giá ảnh hưởng của phương pháp bổ sung kết hợp Tween 80 và 102

ergosterol đến hoạt tính lên men của nấm men cố định 3.3.5 Thiết lập phương trình cân bằng vật chất của quá trình lên men chính 110

khi sử dụng nấm men cố định và nấm men tự do 3.4 Bước đầu thử nghiệm sử dụng nấm men cố định lên men dịch nha có bổ 118

sung thế liệu bằng phương pháp lên men liên tục 3.5 So sánh các phương án lên men bia nồng độ cao sử dụng nấm men cố định 126

trong gel alginate

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ ĐỊNH NGHĨA

A.CHỮ VIẾT TẮT

- oBx: Độ Brix

- oPt: Độ Plato

- DEAE: Diethylaminoethyl

- DCM (Delignified cellulose materials): Nguyên liệu cellulose đã tách lignin

- EDTA: Ethylen diamin tetraacetic acid

- FAN (Free amino nitrogen): Nitơ amin tự do

- SEM (Scanning electron microscope): Kính hiển vi điện tử quét

- VDK: Vicinal diketones

- YE (Yeast extract): Chất chiết nấm men

- YPC (Yeast peptide complex): Hỗn hợp peptide được trích ly từ nấm men

- M/G: Tỷ lệ D-mannuronic acid/L-guluronic acid của chế phẩm alginate

B.ĐỊNH NGHĨA

- Độ Brix: là đơn vị đo hàm lượng đường hòa tan trong dung dịch Một độ

Brix tương ứng với 1 gam saccharose hòa tan trong 100 gam dung dịch ở 20oC Theo lý thuyết, 1oBx tương đương với 1oPt và tương đương với

1%w/w

- Nấm men cố định: là nấm men được gắn trên chất mang hoặc được nhốt

trong chất mang hoặc có vị trí hoạt động bị giới hạn trong một vùng không gian nhất định của bình lên men nhưng vẫn có khả năng duy trì được hoạt

tính trao đổi chất

- Khả năng sinh trưởng thực của nấm men hay số lượng tế bào nấm men sinh trưởng thực: là hiệu số giữa tổng số tế bào nấm men cực đại trong quá trình lên men bia và số lượng tế bào nấm men gieo cấy ban đầu

- Lên men bia nồng độ cao: là kỹ thuật lên men dịch nha với nồng độ chất

khô ban đầu rất cao (>15oPt), sau đó pha loãng sản phẩm bia thu được để đạt

nồng độ ethanol theo giá trị mong muốn

và hàm lượng đường khử ban đầu của dịch nha Độ lên men được tính theo

đơn vị là phần trăm khối lượng (%w/w)

- Lên men chính: là quá trình chuyển hóa dịch nha thành bia non Phần lớn

các đường lên men trong dịch nha sẽ được chuyển hóa thành ethanol, CO2,

aldehyde, rượu cao phân tử, ester, acid hữu cơ

- Bia non: là bia được hình thành sau quá trình lên men chính.

- Tỷ lệ pha loãng: là tỷ lệ giữa lưu lượng dịch nha được bơm vào bình lên

men và thể tích sử dụng của bình lên men Trong phương pháp lên men liên tục chemostate, lưu lượng dịch nha được bơm liên tục vào bình lên men sẽ bằng với lưu lượng dịch lên men được tháo liên tục ra khỏi bình

DANH MỤC CÁC BẢNG

trang

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN Bảng 1.1: Các phương pháp và chất mang cố định ứng dụng trong lên men bia 7

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Bảng 2.1: Một số chỉ tiêu chất lượng của malt sử dụng trong luận án 26

Bảng 2.2 Ma trận thực nghiệm trong phương án cấu trúc có tâm, trực giao bậc 2 41 – hai yếu tố

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Bảng 3.1: Mật độ tế bào cực đại và tỷ lệ sống sót của nấm men tự do và nấm men 50

cố định khi quá trình lên men kết thúc (Nồng độ dịch nha thay đổi từ 12 đến 28oBx)

Bảng 3.2: Nồng độ của một số sản phẩm phụ trong bia non (mg/L) sau khi pha loãng 61 về 5% ethanol khi sử dụng nấm men cố định và nấm men tự do với nồng độ dịch nha thay đổi từ 12-28oBx

Bảng 3.3: Mật độ tế bào nấm men trong 1mL gel ảnh hưởng đến hoạt tính lên men 65 của nấm men cố định với dịch nha 24oBx (Thời gian khảo sát là 150 ngày)

Bảng 3.4: Ảnh hưởng của nồng độ alginate trong 1mL gel alginate-nấm men đến khả 66 năng lên men của nấm men cố định với dịch nha 24oBx

Bảng 3.5: Thời gian lên men và hàm lượng ethanol có trong bia non theo phương pháp 71

lên men chu kỳ khi sử dụng nấm men cố định và nấm men tự do

Bảng 3.6: Nồng độ của một số sản phẩm phụ trong bia non (mg/L) trong quá trình 74 tái sử dụng nấm men cố định và nấm men tự do

Bảng 3.7: Nồng độ của một số sản phẩm phụ trong bia non (mg/L) khi sử dụng nấm 91 men cố định và thời gian sục khí thay đổi (dung dịch bia non được pha loãng với hàm lượng ethanol là 5%v/v)

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của tỷ lệ thế liệu syrup maltose đến quá trình lên men dịch nha 94 24oBx với nấm men cố định trong gelalginate

Bảng 3.9: Nồng độ của một số sản phẩm phụ trong bia non (mg/L) khi lên men dịch 97 nha 24oBx, sử dụng sử dụng thế liệu maltose syrup với các tỷ lệ khác nhau

Bảng 3.10: Ảnh hưởng của việc bổ sung Tween 80 vào dịch nha trong quá trình lên men 99

bia nồng độ cao sử dụng nấm men cố định trong gel alginate (Dịch nha 24oBx có sử

dụng 30% thế liệu syrup maltose)

Bảng 3.11: Ảnh hưởng của việc bổ sung ergosterol vào dịch nha trong quá trình lên men bia 101 nồng độ cao sử dụng nấm men cố định trong gel alginate (Dịch nha 24oBx có sử dụng 30% thế liệu syrup maltose)

Bảng 3.12 Ma trận bố trí thí nghiệm và kết quả quy hoạch thực nghiệm ảnh hưởng 102 của Tween 80 và ergosterol đến quá trình lên men bia nồng độ cao sử dụng

nấm men cố định trong gel alginate

Bảng 3.13: Coefficient, effects, standard errors and P-value đối với hàm mục tiêu 103 là hàm lượng ethanol trong bia non (YE) khi sử dụng phương pháp quy hoạch

thực nghiệm hàm lượng ethanol trong bia non (YE) sử dụng phương pháp quy hoạch thực nghiệm

Bảng 3.14: Nồng độ của một số sản phẩm phụ trong bia non (mg/L) khi sử dụng nấm 109

men cố định trong lên men bia nồng độ cao với sự bổ sung thành phần Tween 80 và ergosertol (dung dịch bia non được pha loãng với hàm lượng ethanol là 5%v/v)

Bảng 3.15: Thành phần acid amin trong dịch nha (mg/100g) và trong bia non (mg/100g)114

được lên men bởi nấm men cố định trong gel alginate và nấm men tự do (Dịch nha

24oBx, tỷ lệ thế liệu syrup maltose là 30%)

Bảng 3.16: Tỷ lệ thành phần nguyên tố của nấm men bia, các đường lên men, 115 các acid amin trong dịch nha, rượu cao phân tử và acid hữu cơ trong bia non

khi lên men bia nồng độ cao sử dụng nấm men cố định và nấm men tự do

Bảng 3.17: Lượng cơ chất đã được nấm men sử dụng hoặc hàm lượng sản phẩm do 116 nấm men sinh ra trong bia non trong quá trình lên men bia nồng độ cao sử dụng nấm men cố định trong gel alginate và nấm men tự do

Bảng 3.18: Số mole cơ chất hoặc sản phẩm tính theo 1 mole đường lên men trong quá 116

trình lên men bia nồng độ cao sử dụng nấm men cố định và nấm men tự do

Bảng 3.19: Hiệu suất (%) tổng hợp sinh khối và sản phẩm tính theo đường lên men 117 trong quá trình lên men bia nồng độ cao sử dụng nấm men cố định và nấm men tự do

Bảng 3.20: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy đến khả năng lên men liên tục của nấm men 121

cố định trong gel alginate

Bảng 3.21: Nồng độ của một số sản phẩm trong bia non (mg/l) khi sử dụng nấm men 125

cố định và mật độ giống cấy thay đổi (dung dịch bia non được pha loãng với hàm lượng ethanol là 5%v/v)

DANH MỤC CÁC HÌNH

trang

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN Hình 1.1: Sản lượng bia của Việt Nam từ năm 2003 đến năm 2010 3

Hình 1.3: Sự hình thành gel của alginate với Ca 2+ 18

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Hình 2.1: Bình lên men sử dụng cho phương pháp lên men chu kỳ 28

Hình 2.2: Hạt gel có chứa nấm men sử dụng trong luận án 28

Hình 2.3: Bình lên men sử dụng cho phương pháp lên men liên tục 29

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Hình 3.1: Tốc độ sử dụng đường khử của nấm men tự do và nấm men cố định khi 53

nồng độ chất khô ban đầu của dịch nha thay đổi 12-28oBx

Hình 3.2: Tốc độ sử dụng FAN của nấm men tự do và nấm men cố định khi nồng độ 55 chất khô ban đầu của dịch nha thay đổi 12-28oBx

Hình 3.3: Tốc độ sinh ethanol của nấm men tự do và nấm men cố định khi nồng độ 55 chất khô ban đầu của dịch nha thay đổi 12-28oBx

Hình 3.4: Thời gian lên men của nấm men tự do và nấm men cố định khi nồng độ 57 chất khô ban đầu của dịch nha thay đổi 12-28oBx

Hình 3.5: Nồng độ diacetyl trong bia non khi sử dung nấm men tự do và nấm men 58 cố định khi nồng độ chất khô ban đầu của dịch nha thay đổi 12-28oBx

Hình 3.6: Nồng độ acetaldehyde trong bia non khi sử dung nấm men tự do và nấm 59 men cố định khi nồng độ chất khô ban đầu của dịch nha thay đổi 12-28oBx

Hình 3.7: Nồng độ propanol trong bia non khi sử dung nấm men tự do và nấm men 60 cố định khi nồng độ chất khô ban đầu của dịch nha thay đổi 12-28oBx

Hình 3.8: Nồng độ isoamyl alcohol trong bia non khi sử dung nấm men tự do và nấm 60 men cố định khi nồng độ chất khô ban đầu của dịch nha thay đổi 12-28oBx

Hình 3.9: Nồng độ ethyl acetate trong bia non khi sử dung nấm men tự do và nấm men 61

cố định khi nồng độ chất khô ban đầu của dịch nha thay đổi 12-28oBx

Hình 3.10: Hình ảnh của nấm men cố định và nấm men tự do được chụp bởi SEM 63 Nồng độ Alginate trong hạt gel là 2,0% (w/v) và mật độ nấm men là 2,5x107 tb/mL gel: (A1) (B1) và (C1): hình ảnh ban đầu của nấm men tự do, nấm men cố định trên bề mặt của hạt gel và bên trong của hạt gel; (A2) (B2) và (C2) hình ảnh của nấm men tự do, nấm men cố định trên bề mặt của hạt gel và bên trong của hạt gel sau 30 phút tiếp xúc với dung dịch sorbitol (24oBx); (A3), (B3) and (C3) hình ảnh của nấm men tự do, nấm men cố trên bề mặt của hạt gel và bên trong của hạt gel sau 30 phút tiếp xúc với dung dịch ethanol (10% v/v)

Hình 3.11: Tế bào nấm men S cerevisiae cố định trong gel alginate được chụp bởi 70 SEM Nồng độ alginate là 2,5% (w/v) và mật độ nấm men ban đầu là 5,0x107 tb/mL gel: (a1) và (a2) bề mặt bên ngoài và mặt cắt bên trong hạt gel trước lên men; (b1) và (b2) bề mặt bên ngoài và mặt cắt bên trong hạt gel sau một chu kỳ lên men; (c1) và (c2) bề mặt bên ngoài và mặt cắt bên trong hạt gel sau 5 tháng lên men (hạt gel được tái sử dụng 30 chu kỳ trong lên men bia nồng độ cao)

Hình 3.12: Sự biến đổi mật độ tế bào trong quá trình lên men khi mật độ giống cấy 75 thay đổi từ 1,0 đến 4,0x107 tb/mL (dịch nha 24oBx & được nấu từ malt đại mạch)

Hình 3.13: Sự biến đối hàm lượng đường khử trong quá trình lên men chính, sử dụng 77 dịch nha 24oBx và mật độ nấm men thay đổi từ 1,0 x107 tb/mL đến 4,0x107 tb/mL

Hình 3.14: Sự biến đối FAN trong quá trình lên men chính, sử dụng dịch nha 24oBx 79 và mật độ nấm men thay đổi từ 1,0 x107 tb/mL đến 4,0x107 tb/mL

Hình 3.15: Tốc độ trung bình sử dụng cơ chất của nấm men cố định khi mật độ tế bào 79

gieo cấy thay đổi từ 1,0 x107 tb/mL đến 4,0x107tb/mL

Hình 3.16: Sự biến đổi nồng độ ethanol trong quá trình lên men chính khi mật độ 80 giống cấy thay đổi từ 1,0 x107 tb/mL đến 4,0x107 tb/mL

Hình 3.17: Tốc độ sinh ethanol và nồng độ ethanol trong bia non khi mật độ tế bào 81 gieo cấy thay đổi từ 1,0 x107 tb/mL đến 4,0x107 tb/mL

Hình 3.18: Sự biến đổi nồng độ diacetyl ethanol trong bia non khi mật độ tế bào 83 gieo cấy thay đổi từ 1,0 x107 tb/mL đến 4,0x107 tb/mL

Hình 3.19: Sự biến đổi mật độ tế bào trong quá trình lên men chính khi thời gian 85 sục khí đổi từ 0 đến 20 giờ lên men đầu tiên

Hình 3.20: Sự biến đổi hàm lượng đường khử của canh trường trong quá trình lên 86 men chính khi thời gian sục khí thay đổi từ 0 đến 20 giờ lên men đầu tiên

Hình 3.21: Tốc độ trung bình sử dụng cơ chất của nấm men trong quá trình lên men 87 chính khi thời gian sục khí thay đổi từ 0 đến 20 giờ lên men đầu tiên

Hình 3.22: Sự biến đổi hàm lượng FAN của canh trường trong quá trình lên men 88 chính khi thời gian sục khí thay đổi từ 0 đến 20 giờ lên men đầu tiên

Hình 3.23: Sự Sự biến đổi hàm lượng ethanol của canh trường trong quá trình lên men 89

chính khi thời gian sục khí thay đổi từ 0 đến 20 giờ lên men đầu tiên

Hình 3.24: Tốc độ sinh ethanol và nồng độ ethanol trong bia non khi thời gian sục 90 khí đổi từ 0 đến 20 giờ lên men đầu tiên

Hình 3.25: Sự biến đổi hàm lượng diacetyl của canh trường trong quá trình lên men 91 chính khi thời gian sục khí thay đổi từ 0 đến 20 giờ lên men đầu tiên

Hình 3.26: Sự biến đổi hàm lượng đường khử của canh trường trong quá trình lên 94 men chính khi tỷ lệ thế liệu thay đổi 0-45% (w/w)

Hình 3.27: Sự biến đổi hàm lượng FAN của canh trường trong quá trình lên men 96 chính khi tỷ lệ thế liệu thay đổi 0-45% (w/w)

Hình 3.28: Nồng độ ethanol trong bia non trong thí nghiệm tối ưu hóa quy hoạch 103 thực nghiệm (Y: nồng độ ethanol (%v/v), X1: hàm lượng Tween 80 (%v/v) bổ

sung vào dịch nha và X2: hàm lượng ergosterol (mg/L) bổ sung vào dịch nha

Hình 3.29: Sự biến đổi mật độ tế bào nấm men của canh trường trong quá trình lên 104 men khi dịch nha được bổ sung 0,3%(v/v) Tween 80 và 0,18 (mg/L) ergosterol

(Dịch nha 24oBx với tỷ lệ thế liệu syrup maltose 30%w/w, sử dụng nấm men cố định trong gel alginate)

Hình 3.30: Sự biến đổi hàm lượng đường khử của canh trường trong quá trình lên 105 men khi dịch nha được bổ sung 0,3%(v/v) Tween 80 và 0,18 (mg/L) ergosterol

(Dịch nha 24oPt với tỷ lệ thế liệu syrup maltose 30%w/w, sử dụng nấm men cố định trong gel alginate)

Hình 3.31: Sự biến đổi hàm lượng FAN trong quá trình lên men khi dịch nha được bổ 106

sung 0,3%(v/v) Tween 80 và 0,18 (mg/L) ergosterol (Dịch nha 24oBx với tỷ lệ thế liệu syrup maltose 30%w/w, sử dụng nấm men cố định trong gel alginate)

Hình 3.32: Sự biến đổi nồng độ ethanol của canh trường trong quá trình lên men 107

khi dịch nha được bổ sung 0,3%(v/v) Tween 80 và 0,18 (mg/L) ergosterol (Dịch nha 24oBx với tỷ lệ thế liệu syrup maltose 30%w/w, sử dụng nấm men cố định trong gel alginate)

Hình 3.33: Sự biến đổi nồng độ diacetyl của canh trường trong quá trình lên men 107 khi dịch nha được bổ sung 0,3%(v/v) Tween 80 và 0,18 (mg/L) (Dịch nha 24oBx với tỷ lệ thế liệu syrup maltose 30%w/w, sử dụng nấm men cố định trong gel alginate)

Hình 3.34: Sự biến đổi nồng độ một số sản phẩm phụ của canh trường trong quá trình 109

lên men khi dịch nha được bổ sung 0,3%(v/v) Tween 80 và 0,18 (mg/L) (Dịch nha 24oBx với tỷ lệ thế liệu syrup maltose 30%w/w, sử dụng nấm men cố định

trong gel alginate)

Hình 3.35: Sự thay đổi hàm lượng các đường lên men trong quá trình lên men bia 110 nồng độ cao khi sử dụng nấm men tự do (Dịch nha 24oBx, tỷ lệ thế liệu syrup

maltose là 30%)

Hình 3.36: Sự thay đổi hàm lượng các đường lên men trong quá trình lên men bia 110 nồng độ cao khi sử dụng nấm men cố định trong gel alginate (Dịch nha 24oBx,

tỷ lệ thế liệu syrup maltose là 30%)

Hình 3.37: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy đến sự biến đổi mật độ tế bào tự do trong 119 dịch lên men trong quá trình lên men liên tục

Hình 3.38: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy đến sự biến đổi hàm lượng ethanol trong 122 dịch lên men trong quá trình lên men liên tục

Hình 3.39: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy đến sự biến đổi hàm lượng diacetyl trong 123 dịch lên men trong quá trình lên men liên tục

Hình 3.40: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy đến sự biến đổi hàm lượng ethyl aceate, 124 rượu cao phân tử và acetaldehyde trong dịch lên men trong quá trình lên men liên tục

MỞ ĐẦU

Bia được con người sản xuất và sử dụng từ 7000 năm trước công nguyên Thành phần hóa học chính của bia gồm có nước, ethanol và CO2 Ngoài ra, bia còn chứa nhiều loại muối vô cơ và hơn 800 hợp chất hữu cơ khác [1] Hiện nay, nguyên liệu chính để sản xuất bia là malt đại mạch, thế liệu, hoa houblon và nước [2], [3]

Sản phẩm bia đã trở nên phổ biến trên toàn cầu Nhu cầu về bia của người tiêu dùng và sự cạnh tranh sản xuất của các doanh nghiệp ngày càng gia tăng Hiện nay, các nhà sản xuất đã và đang tìm nhiều giải pháp để nâng cao năng suất và chất lượng bia

Trong nhóm kỹ thuật mới được áp dụng để gia tăng năng suất sản xuất bia thì kỹ thuật lên men bia nồng độ cao ngày càng trở nên phổ biến [4], [5]

Thành công của kỹ thuật lên men bia nồng độ cao phụ thuộc vào khả năng của nấm men bia chịu được 2 kiểu stress: stress áp lực thẩm thấu do nồng độ chất khô tăng cao trong dịch nha ban đầu và stress ethanol do nồng độ ethanol tăng cao trong dịch lên men Hiện nay, việc sản xuất bia nồng độ cao đã được triển khai ứng dụng ở nhiều nơi trên thế giới và hàm lượng chất khô có thể gia tăng đến 18-24oPt [6], [7], [8]

Trong những năm gần đây, có rất nhiều loại vật liệu được sử dụng để cố định nấm men như các polymer (alginate, agar, gelatin, κ-carrageenan, chitosan, pectin, polyacrylamide, epoxy resin, silica sol) và vật liệu xốp (dăm bào, đá núi lửa, vải cotton, mẫu thủy tinh xốp, ceramic, diatomite) Alginate là vật liệu được sử dụng

phổ biến nhất để cố định tế bào Nedovic & cộng sự (2005) cho rằng có hơn 80%

các nghiên cứu trên thế giới về cố định tế bào đã sử dụng chất mang alginate [9] Dựa trên kết quả nghiên cứu của nhiều nhà khoa học, hãng Proenol-Industria Biotechnologica, Ltd (Bồ Đào Nha) đã thương mại hóa các chế phẩm nấm men cố định trong gel alginate để ứng dụng trong sản xuất ethanol, bia và rượu vang với các sản phẩm như ProDessert® QA23 (S bayanus), ProRestart® QA23 (S bayanus),

ProDessert® BA11 (S cerevisiae), ProELIF® DV10 (S bayanus) và ProRestart®DV10 (S bayanus) [10], [11] Trong lĩnh vực sản xuất bia, chế phẩm nấm men cố

định trong gel alginate được sử dụng chủ yếu trong quá trình lên men bia truyền thống với dịch nha từ malt đại mạch có nồng độ chất khô dao động trong khoảng 10-12oPt [12], [12], [14], [15]

Ở nước ta hiện nay, ngành công nghiệp Bia-Rượu-Nước giải khát đã được quy hoạch phát triển thành một ngành kinh tế mạnh Các doanh nghiệp sản xuất bia trong nước đã và đang từng bước hiện đại hóa công nghệ để nâng cao sản lượng bia sản xuất Một số công ty bia ở Việt Nam như Tổng công ty Bia-Rượu-Nước giải khát Sài Gòn và công ty Bia Việt Nam đã áp dụng kỹ thuật sản xuất bia nồng độ cao với hàm lượng chất khô từ 13-16oPt, sử dụng thế liệu gạo chiếm từ 20-30% Cần lưu ý là các nhà máy sản xuất bia Việt Nam áp dụng kỹ thuật lên men bia nồng độ cao với hàm lượng chất khô thấp hơn nhiều so với thế giới và chưa sử dụng nấm men cố định trong quy trình sản xuất bia nồng độ cao

Dựa trên những phân tích về nhu cầu thị trường, tình hình nghiên cứu và sản xuất bia trong nước, cũng như định hướng phát triển của ngành bia trong những năm tới, chúng tôi thực hiện đề tài nghiên cứu quá trình lên men bia nồng độ cao sử dụng nấm men cố định trong gel alginate nhằm mục đích nâng cao năng suất sản xuất, tiết kiệm nhân công, năng lượng và chi phí đầu tư cho ngành công nghiệp sản xuất bia

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tình hình phát triển của ngành công nghiệp sản xuất bia Việt Nam

Hiện nay, Việt Nam có khoảng 350 nhà máy sản xuất bia và tiếp tục tăng về số lượng Trong số này, có hơn 20 nhà máy đạt công suất trên 20 triệu lít/năm; 15 nhà máy có công suất lớn hơn 15 triệu lít/năm và có tới 268 cơ sở có năng lực sản xuất dưới 1 triệu lít/năm Lượng bia Việt Nam sản xuất tăng dần trong những năm qua: từ 1,29 tỷ lít trong năm 2003 tăng đến 2,7 tỷ lít trong năm 2010 (Hình 1.1)

Mức tiêu thụ bia bình quân đầu người của Việt Nam vào năm 2010 là 28 lít/năm, tương đối thấp so với Hàn Quốc, Nhật Bản (43 lít/năm) và Ireland, Đức, Séc (88 lít/năm) Mức tiêu thụ bia ở nước ta dự kiến sẽ gia tăng trong thời gian tới nhờ vào mức thu nhập của người dân tăng lên và sự thay đổi tập quán uống (chuyển từ uống rượu sang uống bia) của người dân ở nhiều vùng nông thôn… [16]

Ở nước ta hiện nay, ngành Bia-Rượu-Nước giải khát đã được quy hoạch phát triển thành một ngành kinh tế quan trọng Bộ trưởng Bộ Công thương đã ra quyết định số 2435 vào năm 2009, theo đó đến năm 2015 sản lượng bia đạt khoảng 4,0 tỷ lít với lượng vốn đầu tư dự kiến cho ngành khoảng 18.042 tỷ đồng và đến năm 2025 sản lượng sản xuất đạt 6,0 tỷ lít với lượng vốn đầu tư dự kiến khoảng 24.056 tỷ đồng [17]

1.501.70

2.402.70

0.01.02.03.0

1.2 Nấm men bia cố định 1.2.1 Định nghĩa

Nấm men cố định là nấm men được gắn trên chất mang hoặc được nhốt trong chất mang hoặc có vị trí hoạt động bị giới hạn trong một vùng không gian nhất định của bình lên men nhưng vẫn có khả năng duy trì được hoạt tính trao đổi chất [18]

Cố định nấm men là sự mô phỏng những gì xảy ra trong tự nhiên khi nấm men phát triển trên bề mặt hoặc bên trong cấu trúc vật liệu tự nhiên [19] Nấm men cố định có thể được sử dụng với những mục đích khác nhau trong quá trình lên men bia như lên men chính hoặc lên men phụ trong phương pháp lên men bia truyền thống, lên men bia không cồn hoặc bia có độ cồn thấp, lên men bia nồng độ cao [9], [19], [20]

Trong quá trình lên men bia, việc sử dụng nấm men cố định có những thuận lợi như: Ổn định hoạt tính lên men của nấm men trong một khoảng thời gian dài [21], [22], [23]; tăng mật độ tế bào trong một đơn vị thể tích dịch lên men [24], [25]; sử dụng phương pháp lên men liên tục [24], [25]; tăng số lần tái sử dụng nấm men trong phương pháp lên men chu kỳ [26]; giảm khả năng tạp nhiễm của vi sinh vật [27]; tăng năng suất của thiết bị lên men [24]

Tuy nhiên, sử dụng nấm men cố định có một số nhược điểm như: Một số loại chất mang có thể giới hạn sự truyền khối của cơ chất và sản phẩm trao đổi chất [24]; cấu trúc của chất mang có thể bị thay đổi và/hoặc phá vỡ trong quá trình lên men [24]

1.2.2 Yêu cầu đối với chất mang và phương pháp cố định nấm men bia

Chất mang cố định nấm men bia phải thỏa mãn một số yêu cầu như: Có diện tích bề mặt lớn và có khả năng kết dính tế bào; có khả năng chứa lượng sinh khối nấm men càng cao càng tốt; có độ bền cao về vật lý (cơ học, áp lực thẩm thấu, nhiệt độ), hóa học và sinh học; độ xốp của chất mang tương đối đồng nhất và cho phép cơ chất, sản phẩm trao đổi chất và khí di chuyển dễ dàng trong quá trình lên men; chất mang dễ bảo quản và tái sinh, không ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm và được người tiêu dùng dễ dàng chấp nhận [9], [18], [24], [28]

Yêu cầu chung của phương pháp cố định nấm men bia là phải đơn giản, chi phí thấp và phù hợp với quy mô sản xuất, không gây tạp nhiễm vi sinh vật có hại; nấm men có khả năng phát triển tốt và hoạt động ổn định trên hoặc trong chất mang trong thời gian dài; dễ dàng tách chất mang với nấm men cố định ra khỏi dịch lên men [9], [18], [24], [28]

1.2.3 Chất mang cố định nấm men bia

Chất mang cố định nấm men bia thường là những polymer tự nhiên, polymer tổng hợp hoặc các vật liệu vô cơ có trong tự nhiên [18]

1.2.3.1 Chất mang vô cơ

Chất mang vô cơ có ưu điểm là chi phí thấp và đa dạng về chủng loại Vật liệu vô cơ được sử dụng để cố định nấm men là polygorskite, montmorilonite, hydromica, porcelain xốp, đá bọt[18], hạt γ-alumina [29], [30], [31], ceramic [32] và hạt thủy tinh xốp [5], [26], [33], [34], [35]

1.2.3.2 Chất mang hữu cơ Chất mang tổng hợp

Chất mang hữu cơ tổng hợp có thành phần hóa học ổn định, phổ biến nhất là màng hoặc vòng polyethylene, hạt gel polyvinyl alcohol, polyacrilamide, polyurethane và polyethylenimine [18], [36], [37]

Chất mang tự nhiên

Chất mang hữu cơ tự nhiên đa dạng về cấu trúc, chi phí thấp, an toàn và được người tiêu dùng chấp nhận làm vật liệu cố định tế bào [18], [20] Các loại chất mang tự nhiên để cố định nấm men bia được phân thành 3 nhóm:

• Nhóm chất mang giàu cellulose gồm có vỏ trấu, than từ thân cây bắp, thân tre, thân cây cọ [38], [39]; xơ mướp [40]; dăm bào [41]; mẫu táo [42], [43], [44],

[45]; mẫu quince (Cotoneum malum) [44], [46]; mẫu lê [46], [47], vỏ nho [48], [49]; vỏ cam [50], mẫu sung [51]; bã mía [39], [52]; bã malt [20], [42], [53], [54], [55], [56]; DEAE cellulose và cellulose đã tách lignin DCM [18], [22], [43], [57], [58], [59], [60], [61], [62], [63], [64]

• Nhóm chất mang giàu các thành phần polysaccharides khác là agar [13], [65]; alginate [13], [15], [66], [67], [68]; chitosan [69], [70]; pectin [66], [68], [71] và κ-carrageenan [13], [19], [66], [68], [72], [73], [74]

• Chất mang tự nhiên giàu protein gồm có hạt gluten [59], [75] và gelatin [76]

Phương pháp cố định nấm men có thể được chia thành bốn nhóm chính [25]:

• Cố định nấm men trên bề mặt chất mang rắn

Nấm men được gắn trên bề mặt vật liệu rắn là nhờ vào các tương tác vật lý như liên kết tĩnh điện, liên kết ion, liên kết kỵ nước [77] hoặc liên kết cộng hóa trị giữa tế bào và bề mặt chất mang [18], [78], [79], [80]

Chất mang rắn sử dụng trong cố định tế bào bằng phương pháp hấp phụ có thể là vật liệu bản chất là cellulose [49], [54], [55], [56], [81], [82], [83], [84], [85], [86]; vật liệu bản chất là protein [59] và vật liệu là dẫn xuất silicat [18], [35], [83], [87]

• Nhốt nấm men bên trong vật liệu xốp

Nấm men được nhốt bên trong cấu trúc mạng lưới nhằm ngăn cản sự khuếch tán tế bào ra môi trường xung quanh nhưng vẫn cho phép chúng phát triển sinh khối và trao đổi chất [18], [78] Sự phát triển của tế bào trong chất mang phụ thuộc vào độ xốp của vật liệu và khả năng khuếch tán của các chất dinh dưỡng có trong môi trường [18], [88]

Để cố định nấm men bia, người ta thường sử dụng gel polysaccharides như alginate, κ-carrageenan, agar, chitosan, polygalacturonic; gel protein như gelatin, collagen hoặc gel polymer tổng hợp như polyvinyl alcohol [13], [15], [18], [66], [79], [89], [90], [91]

• Hai phương pháp: kết bông tế bào [18], [77], [92] và giữ tế bào trong màng bán thấm [18], [80] rất ít được sử dụng để lên men bia

• Phương pháp hấp phụ nấm men trên bề mặt chất mang rắn

Hạt ceramic 1,0x108 tb/gam chất mang Hạt ceramic (Ø 8 mm, tính chất xốp 58%, d=0,8g/cm3; lên men tĩnh

có tuần hoàn dịch nha

[94] • Phương pháp nhốt tế bào trong chất mang xốp

1,0x109 tb/mL gel Hạt gel (Ø3mm, 25g/L Na-alginate, 0.1 M CaCl2); lên men liên tục [66]

0,16 gam tb/mL gel Hạt gel (Ø3mm, 1% Na-alginate, 0.05 M CaCl2); lên men liên tục [96] 9

Bảng 1.1: Các phương pháp và chất mang cố định nấm men ứng dụng trong lên men bia

• Phương pháp nhốt tế bào trong chất mang xốp (tt)

Ca-alginate 0,65x106 tb/mg gel Hạt gel (Ø3mm, 4% Na-alginate, 04% CaCl2); lên men tĩnh và lên

men liên tục

[97]

1,0x108 tb/mL gel Hạt gel (3% Na-alginate, 1% w/v CaCl2); lên men tĩnh có tuần hoàn

dịch nha

[94]

1,0x109 tb/mL gel Hạt gel (Ø2mm, 50g/L K-pectate, 0.1M CaCl2); lên men liên tục [66]

1,0x109 tb/mL gel Hạt gel (Ø2mm, 50g/L K-pectate, 0.1M CaCl2); lên men tĩnh, lên

men liên tục

[68]

1,0x109 tb/mL gel Hạt gel (Ø2mm, 40g/L k-carrageenan, 0.1M NaCl); lên men liên

tục

[66] 1,0x109 tb/mL gel Hạt gel (Ø2-4mm, 3%w/v k-carrageenan, 1,5g/L KCl); lên men

tĩnh

[73] 1,0x109 tb/mL gel Hạt gel (Ø2mm, 40g/L k-carrageenan, 0.1M NaCl); lên men tĩnh,

lên men liên tục

[68]

1.3 Lên men bia nồng độ cao 1.3.1 Định nghĩa

Lên men bia nồng độ cao là kỹ thuật lên men dịch nha với nồng độ chất khô ban đầu rất cao (>15oPt), sau đó pha loãng sản phẩm bia thu được để đạt nồng độ ethanol theo giá trị mong muốn [6], [101]

Sản xuất bia nồng độ cao sẽ có một số điểm thuận lợi liên quan đến quy trình sản xuất như: Giảm khả năng tạp nhiễm vi sinh vật [102], [103]; tiết kiệm chi phí năng lượng, chi phí lao động [101], [104]; giảm bớt lượng nước cần sử dụng trong sản xuất [104], [101], [102]; sử dụng thiết bị hiệu quả [101], [104], [105] Ngoài ra, sản xuất bia nồng độ cao có một số điểm thuận lợi liên quan đến chất lượng sản phẩm như: Gia tăng độ bền hóa lý của bia [6], [101], [102], [103], [104]; gia tăng nồng độ ester của bia thành phẩm (ethyl acetate, ethyl caproate, isoamyl aceate, isobutyl acetate) [7], [101]

Tuy nhiên, lên men bia nồng độ cao gặp một số khó khăn liên quan đến quy trình sản xuất như: Mất cân đối hoặc thiếu hụt thành phần dinh dưỡng trong dịch nha (sử dụng thế liệu syrup để làm tăng nồng độ chất khô của dịch nha) [101], [105], [106], [107], [108]; gia tăng stress cho nấm men [108]; kéo dài thời gian lên men [101], [108], [109]; cần tăng nồng độ oxy hòa tan trong môi trường lên men [6], [110], [105]; giảm khả năng tái sử dụng nấm men: [7], [101], [104], [108], [109] Ngoài ra, sản xuất bia nồng độ cao sẽ gặp một số điểm khó khăn liên quan đến chất lượng sản phẩm như: Giảm độ bền bọt [104], [109], [111]; tăng giá trị pH [101]; thay đổi mùi vị [8], [104], [112]

1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men bia nồng độ cao 1.3.2.1 Ảnh hưởng của nồng độ chất khô ban đầu trong dịch nha

Dịch nha được sử dụng trong nghiên cứu lên men bia nồng độ cao có nồng độ chất khô ban đầu thường dao động trong khoảng 15-24oPt [4], [6], [7], [8], [48], [104], [106], [108], [100], [105], [109], [110], [111], [113], [114], [115], [116], [117], [ [118], [119], [120], [121], [122], [123] Cũng có một vài nghiên cứu lên

men bia với nồng độ chất khô ban đầu của dịch nha gia tăng lên tới 28oPt [102], [124], 35oPt [125] hoặc 39oPt [126]

Trong quá trình lên men bia nồng độ cao, stress áp lực thẩm thấu làm cho tế bào co lại và giảm thể tích [127] Tuy nhiên, thể tích không bào của nấm men lại gia tăng [120]; tỷ lệ tế bào sống trong bia non sẽ giảm mạnh [106], [114], [125], [128]

Casey G P & cộng sự (1983, 1984, 1985) cho rằng quá trình lên men diễn ra

chậm hẳn khi gia tăng hàm lượng chất khô ban đầu của dịch nha cao hơn 18oPt [106], [125], [128] Tuy nhiên, McCaig R (1992) và Majara M (1996) kết luận rằng quá trình lên men bia diễn ra chậm hẳn khi nồng độ dịch nha gia tăng trên 24oPt Nhìn chung, ngưỡng giá trị nồng độ chất khô ban đầu của dịch nha làm cho quá trình lên men diễn ra chậm lại sẽ phụ thuộc vào chủng nấm men sử dụng [7], [48]

1.3.2.2 Ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng trong dịch nha

Khi bổ sung các thành phần dinh dưỡng với hàm lượng thích hợp vào dịch nha sẽ cải thiện hoạt tính lên men của nấm men và rút ngắn thời gian lên men bia nồng độ cao [100], [106], [115], [117], [118], [129], [130], [131], [132]

Những nguồn dinh dưỡng được bổ sung gồm có: các hợp chất nitơ [70], [100], [115], [117], [118], [131]; chất béo [116], [133], [134], [135]; chất khoáng [101], [136], [137], [138]; vitamin [101] hoặc hỗn hợp các chất dinh dưỡng [105], [126], [125]

Đặc biệt, các acid béo chưa bão hòa (acid oleic, linoleic, arachidinic) và sterol là yếu tố sinh trưởng quan trọng của nấm men trong điều kiện kỵ khí Việc bổ sung các acid béo chưa bão hòa và sterol vào dịch nha sẽ rút ngắn thời gian lên men bia nồng độ cao với nấm men tự do [116], [133], [134], [135]

1.3.2.3.Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy ban đầu

Khi gia tăng tỷ lệ giống cấy ban đầu thì nấm men sẽ sử dụng nhiều FAN hơn [80], [139] và tổng số tế bào nấm men cực đại trong dịch lên men sẽ gia tăng [52], [140] Tuy nhiên, số tế bào được sinh ra trong quá trình lên men hầu như không

tăng [21] hoặc có xu hướng giảm dần [139], [141]

Casey G P & Ingledew W M (1983) thấy rằng việc tăng tỷ lệ giống cấy sẽ làm tăng tỷ lệ sống sót của tế bào trong quá trình lên men Sau 0,5 giờ lên men dịch nha 39oPt, tỷ lệ sống sót của nấm men từ 12,6 % tăng lên 17,7 % và 65% khi mật độ nấm men gieo cấy ban đầu từ 6,0x106 tăng lên 1,5x107 và 4,0x107 tb/mL [128]

Tuy nhiên, Verbelen P J & cộng sự (2008b) đã thay đổi tỷ lệ giống cấy từ

1,0x107 tb/mL đến 1,2x108 tb/mL để lên men dịch nha 16oPt thì tỷ lệ sống sót của tế bào không có sự khác biệt và luôn đạt giá trị trên 90% [141]

Đối với quá trình hình thành ethanol, O’Connor-Cox & Ingledew (1991) nhận thấy rằng khi tăng tỷ lệ giống cấy từ 1,6 ×107 tb/mL lên 8,0x107 tb/mL thì nồng độ ethanol trong bia non gia tăng [118] Tuy nhiên, một số tác giả lại thu được kết quả

ngược lại [142], [143], [139], [141] Ví dụ như Verbelen P J & cộng sự (2008b)

lên men dịch nha 15oPt với tỷ lệ giống cấy ban đầu thay đồi từ 1,0x107 tb/mL lên 1,2x108 tb/mL thì nồng độ ethanol trong bia non chỉ dao động trong khoảng 6,61-6,69%v/v [141]

Đối với các cấu tử dễ bay hơi trong bia non, việc tăng tỷ lệ giống cấy trong quá trình lên men bia nồng độ cao không làm thay đổi nồng độ acetaldehyde [68], [146]; n-propanol [143]; ethylacetate [143] Tuy nhiên, một số tác giả khác thu được kết quả trái ngược như nồng độ acetaldehyde [188], n-propanol [145] trong bia non sẽ tăng, còn nồng độ ethylacetate trong bia non [139], [142], [146] sẽ giảm khi tăng tỷ lệ giống cấy

Ngoài ra, Verbelen P J & cộng sự (2008a,b) cho rằng bia non sẽ chứa nhiều diacetyl khi tăng mật độ giống cấy [139], [141] Ngược lại, Erten H & cộng sự

(2007) lại khẳng định rằng sự gia tăng mật độ giống cấy sẽ làm giảm nồng độ diacetyl trong bia non [143]

Như vậy, khi tăng mật độ giống cấy sẽ làm tăng hoạt tính lên men của nấm men trong quá trình lên men bia nồng độ cao Tuy nhiên, sự ảnh hưởng của mật độ giống cấy đến tỷ lệ sống sót của nấm men và hàm lượng các cấu tử dễ bay hơi trong bia lại diễn ra theo những quy luật khác nhau tùy theo chủng nấm men sử dụng

O’Connor-Cox E S C & cộng sự (1990) nhận thấy rằng môi trường thiếu oxy

và lipid sẽ làm giảm khả năng sinh trưởng và hoạt tính trao đổi chất của nấm men [124], [147] Trong lên men bia công nghiệp hiện nay, người ta thường nạp oxy tinh khiết vào dịch nha 10-12oPt trước khi cấy giống với hàm lượng dao động trong khoảng 6-8 ppm [101]

Nếu cung cấp oxy cho dịch nha với nồng độ 25 ppm từ giờ lên men thứ 10 đến giờ lên men thứ 14 thì tốc độ sử dụng đường khử và nitơ amin tự do cũng như tốc độ sinh ethanol của nấm men sẽ gia tăng so với trường hợp cung cấp oxy sớm hơn (vào giờ lên men thứ 0, 2, 4 hoặc 6 sau khi cấy giống) hoặc sau 14 giờ lên men

O’Connor-Cox E S C & cộng sự (1990) cho rằng việc cung cấp oxy với nồng độ

25ppm tại giờ lên men thứ 12 sẽ làm tăng hoạt tính lên men nhưng không làm gia tăng sinh khối nấm men trong canh trường [124]

Trong một nghiên cứu khác lên men dịch nha 22oPt, nếu sục oxy vào dịch nha với hàm lượng 25ppm ở giờ lên men thứ 12 thì thời gian lên men chỉ còn 96 giờ, tức giảm 33% so với mẫu đối chứng được cung cấp oxy tại thời điểm cấy giống nấm men Nồng độ ethanol trong bia non của các mẫu thí nghiệm trên lại không có sự khác biệt đáng kể (84,3 g/l và 84,7g/L) [110]

Tóm lại, bổ sung oxy vào dịch nha ở thời điểm thích hợp với hàm lượng phù hợp sẽ làm gia tăng hoạt tính trao đổi chất của nấm men và sẽ rút ngắn thời gian lên men [129], [148] Ngược lại, việc cung cấp oxy tại thời điểm không phù hợp sẽ

không mang lại hiệu quả trên

Khi lên men dịch nha 15oPt và 20oPt, Dragone G & cộng sự (2003) thấy rằng

nếu gia tăng nhiệt độ lên men từ 10oC lên 15oC thì tốc độ lên men từ 0,33 và 0,21g/L sẽ gia tăng lần lượt lên 0,56 và 0,37 g/L.h Đó là do sự gia tăng tốc độ trao đổi chất của nấm men [6]

Kết quả nghiên cứu của Vesely P & cộng sự (2004) cũng cho thấy khi lên men

dịch nha 15oPt và nhiệt độ gia tăng từ 10oC đến 15oC thì mật độ sinh khối nấm men

cực đại gia tăng 100%, đồng thời thời gian lên men được rút ngắn từ 10 ngày xuống còn 6 ngày [149]

Sự tăng nhiệt độ lên men, còn làm cho quá trình hình thành và khử VDK diễn ra nhanh hơn [101] Khi nhiệt độ lên men bia gia tăng từ 10oC lên 15oC, Vesely P &

cộng sự (2004) nhận thấy nồng độ diacetyl trong bia non giảm 70%, rượu cao phân

tử trong bia non tăng 21% còn nồng độ ester hầu như không thay đổi [149]

Ethanol trong dịch lên men sẽ ảnh hưởng đến hình thái và sinh lý của nấm men [127], [150], [151], [152] Khi ngâm nấm men trong môi trường ethanol 10% (v/v),

Pratt P L & cộng sự (2003) nhận thấy sự co rút tế bào nấm men trong quá trình

ngâm Sau 96 giờ ngâm trong môi trường ethanol 10%v/v, thể tích của tế bào nấm men giảm 35-47% và tỷ lệ sống sót của tế bào nấm men giảm 15-18% [127] Trong

khi đó, Boswell C D & cộng sự (2002) thấy rằng tỷ lệ sống sót của tế bào nấm

men giảm mạnh từ 95,3% xuống còn 35,0% khi nồng độ ethanol trong môi trường lên men tăng từ 76 g/L lên 126,7 g/L [150]

Tóm lại, lên men bia nồng độ cao là một giải pháp kỹ thuật mới nhằm gia tăng

năng suất sản xuất và mang lại hiệu quả kinh tế cao cho các nhà máy bia Nồng độ chất khô ban đầu của dịch nha trong các nghiên cứu thường dao động trong khoảng 15-24oPt Trong quá trình lên men bia nồng độ cao, nấm men bia bị stress áp lực thẩm thấu, stress ethanol, thành phần dinh dưỡng trong dịch nha bị mất cân đối (đặc biệt là sự thiếu hụt chất béo và nitơ đồng hóa) và thiếu hụt oxy Đây là những nguyên nhân làm giảm khả năng phát triển và tỷ lệ sống sót của nấm men; do đó, thời gian lên men bị kéo dài và độ lên men thấp Ngoài ra, lên men bia nồng độ cao còn làm thay đổi hàm lượng các sản phẩm trao đổi chất của nấm men như ester, rượu cao phân tử và diacetyl trong bia Việc bổ sung các nguồn dinh dưỡng khác nhau vào dịch nha, gia tăng mật độ giống cấy, cấp oxy đầy đủ tại thời điểm phù hợp và kiểm soát nhiệt độ lên men là những giải pháp đã được sử dụng để làm tăng hiệu quả của quá trình lên men bia nồng độ cao

1.4 Ứng dụng nấm men cố định trong quá trình lên men bia nồng độ cao

1.4.1 Tính chất sinh lý của nấm men cố định

Nhìn chung, nấm men cố định có tính chất sinh lý tốt hơn nấm men tự do

Patkova J & cộng sự, (2000) thấy rằng tỷ lệ sống sót của nấm men cố định trong

gel alginate gần như không đổi và không thấp hơn 95% khi nồng độ dịch nha ban đầu dao động trong khoảng 12-24oPt Trong khi đó, tỷ lệ sống của nấm men tự do giảm dần trong cùng điều kiện thí nghiệm và chỉ đạt giá trị là 74 và 69% khi nồng độ dịch nha ban đầu là 12 và 24oPt [15]

Dragone G & cộng sự (2007) cũng thu được kết quả tương tự về tỷ lệ sống sót

của tế bào nấm men khi sử dụng nấm men cố định trên bã malt để lên men bia nồng độ cao theo phương pháp liên tục [21]

1.4.2 Khả năng sử dụng cơ chất

Một số tác giả nhận thấy nấm men cố định trong gel Ca-alginate [15], Ca-pectate

và κ-carragenan [68] sử dụng ít FAN hơn so với nấm men tự do Trong khi đó,

Smogrovicova D & cộng sự (1999) nhận thấy khả năng sử dụng FAN của nấm men

cố định trên DEAE-cellulose và nấm men tự do là tương đương [68]

Tốc độ sử dụng đường khử của nấm men cố định trên các chất mang khác nhau thì khác nhau Tuy nhiên, tốc độ sử dụng đường khử của nấm men cố định luôn cao hơn so với nấm men tự do [66] Ví dụ như để đạt độ lên men là 73%, tốc độ sử dụng đường của nấm men cố định trong gel Ca-aginate, Ca-pectate, Na-carrageenan lần lượt là 0,125; 0,127 và 0,111 g/L.h Trong khi đó, tốc độ sử dụng đường khử của nấm men tự do chỉ đạt 0,074 g/L.h

Sự thay đổi nồng độ chất khô ban đầu của dịch nha cũng ảnh hưởng đến tốc độ sử dụng đường của nấm men cố định Ví dụ như trường hợp nấm men cố định trên hạt thủy tinh xốp Siran SIKUG 023/02/300/A (Schott engineering GmbH, Mainz, Germany), tốc độ sử dụng đường của nấm men đạt giá trị cao nhất là 0,40 g/L.h đối với dịch nha 18oPt, tiếp theo là 0,37 g/L.h đối với dịch nha 21oPt; 0,35 g/L.h đối với dịch nha 15oPt và 0,30 g/L.h đối với dịch nha 24oPt [5]

1.4.3 Khả năng chịu đựng những yếu tố bất lợi

Nhìn chung, nấm men cố định chịu stress áp lực thẩm thấu và stress ethanol tốt hơn nấm men tự do [15], [153], [154] Có nhiều cách giải thích hiện tượng này Ví

dụ như đối với stress ethanol, Norton S & cộng sự (1994, 1995); Desimone M F (2002); Shen H Y & cộng sự (2003b) cho rằng chính chất mang đã bảo vệ nấm

men chống lại những tác động của ethanol trong dịch lên men [73], [90], [155], [156] Sự gia tăng thành phần acid béo chưa bão hòa hoặc phopholipid và streol trong màng tế bào chất làm thay đổi tính thấm của màng, từ đó làm giảm sự ức chế hoạt tính lên men của tế bào cố định bởi ethanol [90], [157] Tuy nhiên, một số tác giả khác lại thấy rằng việc giảm sự ức chế hoạt tính lên men của tế bào cố định bởi ethanol là do tăng tỷ lệ acid béo bão hòa/chưa bão hòa trong màng tế bào chất [93]

1.4.4 Khả năng sinh tổng hợp các sản phẩm trao đổi chất a Sự hình thành ethanol

Đối với phương pháp lên men chu kỳ, Bardi E P (1996) báo cáo rằng nồng độ ethanol trong bia non khi sử dụng nấm men cố định trên cellulose đã tách lignin luôn cao hơn so với nấm men tự do khi lên men ở các giá trị nhiệt độ khác nhau 30, 10 và 0oC [58]

Còn đối với phương pháp lên men liên tục với nấm men cố định trên bã malt, khi nồng độ dịch nha từ 13,4 tăng lên 18,5oPt (tức tăng 27,6%) thì nồng độ ethanol trong bia non từ 5,9 tăng lên 7% (v/v) (tức tăng 18,6%) [21]

b Sự hình thành rượu cao phân tử

Ryder D S & cộng sự (1985) nhận thấy rằng tổng hàm lượng rượu cao phân tử

được sinh tổng hợp bởi nấm men tự do cao hơn xấp xỉ 20% so với nấm men cố định trong gel alginate, nguyên nhân là do sinh trưởng của nấm men tự do cao hơn so với nấm men cố định [97]

Theo Dragone G & cộng sự (2007), nồng độ chất khô của dịch nha có ảnh

hưởng đến sự hình thành rượu cao phân tử của nấm men bia cố định trên bã malt Khi tăng nồng độ chất khô của dịch nha từ 13,4oPt lên 18,5oPt, tổng hàm lượng rượu cao phân tử trong bia non có xu hướng giảm từ 122,9 mg/L xuống 95,1 mg/L

Trong đó, nồng độ của isobutanol, amyl và isoamyl alcohol thì giảm nhưng nồng độ n-propanol lại gia tăng [21]

c Sự hình thành ester

Sử dụng nấm men cố định trong quá trình lên men bia nồng độ cao làm cho hàm lượng ester trong sản phẩm thay đổi và điều đó phụ thuộc vào loại chất mang và điều kiện lên men [158] Nhìn chung, nấm men cố định tạo ra ester trong bia non với nồng độ thấp hơn so với nấm men tự do, đặc biệt là isoamyl acetate [19], [159]

Trong quá trình lên men bia liên tục với nấm men cố định trên bã malt, nồng độ diacetyl trong bia non sẽ gia tăng khi tăng nồng độ chất khô ban đầu của dịch nha và đạt giá trị cao nhất là 0,77 mg/L đối với dịch nha 18,5oPt [21]

Trong quá trình lên men theo phương pháp chu kỳ với nấm men cố định trong

gel Ca-alginate, Patkova J & cộng sự (2000) nhận thấy rằng nồng độ diacetyl trong

bia non giảm khi dịch nha tăng nồng độ chất khô ban đầu Cụ thể là khi tăng nồng độ chất khô của dịch nha từ 12 lên 20oPt, nồng độ diacetyl trong bia non giảm từ 0,23 mg/L xuống 0,1 mg/L Tuy nhiên, khi gia tăng nồng độ dịch nha từ 20 lên 30oPt thì nồng độ diacetyl trong bia non tăng lên 0,12 mg/L Cần lưu ý là nồng độ diacetyl trong bia non khi sử dụng nấm men cố định trong gel alginate luôn thấp hơn khi sử dụng nấm men tự do trong cùng điều kiện khảo sát [15]

Tóm lại, lên men bia nồng độ cao sử dụng nấm men cố định mang lại một số hiệu quả kỹ thuật cao hơn khi so sánh với nấm men tự do Nhìn chung, chất mang và phương pháp cố định có ảnh hưởng đến tính chất sinh lý, khả năng sử dụng cơ chất và sinh tổng hợp các sản phẩm trao đổi chất của nấm men Nhờ tác dụng bảo vệ của chất mang trước tác động stress của áp suất thẩm thấu và ethanol, tốc độ lên men của nấm men sẽ gia tăng; đồng thời có thể gia tăng được mật độ nấm men và tỷ lệ tế bào sống trong một đơn vị thể tích dịch lên men

1.5.Chất mang alginate

Alginate hay algin là muối của alginic acid Alginate hiện diện trong thành tế

bào của các loài rong nâu (Phaeophyceae) và thường ở dạng muối Ca, Mg và

Na-alginate [160], [161] Gel Ca-Na-alginate được ghi nhận là chất mang rất thích hợp cho quá trình lên men ethanol [18], [67], [162], [163], [164]

1.5.1 Cấu trúc của alginic acid

Alginic acid là polymer của β-D-mannuronic acid và α-L-guluronic acid Cấu trúc cơ bản của mỗi monomer là vòng tetrahydropyran Polymer alginate được hình thành bởi liên kết C-1 và C-4 của những monomer với cầu nối etheroxygen Chuỗi polymer được tạo thành từ 3 loại block: block G chủ yếu là L-guluronic acid, block M chủ yếu là D-mannuronic acid và block MG chứa hỗn hợp của D-mannuronic acid và L-guluronic acid Block M hình thành từ những nhóm D-mannuronic acid liên kết với nhau tại vị trí carbon C-1 và C-4 tạo nên mạch polymer thẳng Block G hình thành từ những nhóm L-guluronic acid tại vị trí carbon C-1 và C-4 tạo nên chuỗi gấp khúc [160], [165], [166]

1.5.2 Khả năng tạo gel của alginate

Ca2+ là ion hóa trị 2 phổ biến nhất cho quá trình hình thành gel vì rẻ tiền, dễ sử dụng và an toàn Nếu phối trộn dung dịch CaCl2 với dung dịch Na-alginate, gel Ca-alginate nhanh chóng được hình thành Cấu trúc gel phụ thuộc vào nguồn alginate,

Hình 1.2: Phân tử acid aginic [165]

mức độ trùng hợp, nồng độ của alginate, nồng độ Ca2+ Alginate từ những nguồn rong nâu khác nhau có tỷ lệ mannuronic acid (M) và guluronic acid (G) khác nhau; tỷ lệ block M, G và MG khác nhau Tỷ lệ của những thành phần này trong chuỗi acid ảnh hưởng rõ rệt đến quá trình hình thành gel và độ bền gel [160]

Với alginate có thành phần chính là block G, gel hình thành cứng hơn và quá trình hình thành gel nhanh hơn khi nồng độ Ca2+ gia tăng Ngược lại, với alginate có thành phần chính là block M, gel hình thành chậm và mềm hơn Trong quá trình hình thành gel, ion Ca2+ đổi chỗ ion H+ trên nhóm carboxylic của những gốc acid alginic liền kề và hình thành cầu nối ion giữa các gốc trong cùng một chuỗi polymer Quá trình hình thành gel cũng có thể xảy ra theo cơ chế hoạt động cầu nối của 2 hoặc nhiều chuỗi Các chuỗi gấp khúc của guluronic acid được xem như là những vỉ trứng (egg-box) với những hốc là nơi ion Ca2+ có thể kết hợp Alginate gel được hình thành như là mạng lưới cấu trúc của những chuỗi phân tử dài kết hợp với nhau [160]

Tóm lại, phần tổng quan tài liệu ở trên cho thấy rằng có nhiều loại chất mang và

phương pháp cố định tế bào được ứng dụng để lên men bia Tùy theo loại chất mang

Hình 1.3: Sự hình thành gel của alginate với Ca2+ [160]

và phương pháp cố định nấm men mà lượng sinh khối nấm men cố định được cũng sẽ khác nhau

Alginate là chất mang polymer đảm bảo vấn đề an toàn thực phẩm và được sử dụng phổ biến nhất hiện nay để cố định tế bào nấm men bia Ngoài ra, phương pháp nhốt tế bào trong vật liệu xốp là kỹ thuật cố định được sử dụng rộng rãi trong quá trình lên men bia vì cấu trúc lưới gel không cản trở quá trình trao đổi chất của tế bào, nấm men cố định được tách ra khỏi canh trường một cách dễ dàng để tái sử dụng

1.6 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về kỹ thuật lên men bia nồng

độ cao sử dụng nấm men cố định trong gel alginate

1.6.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Tại Việt Nam, các kết quả nghiên cứu về lên men bia nồng độ cao sử dụng nấm men cố định trong gel alginate hầu như chưa được công bố Tuy nhiên, khi sử dụng nấm men tự do để lên men bia nồng độ cao, các kết quả nghiên cứu trong nước đã khẳng định ưu điểm nổi bật là làm tăng năng suất của nhà máy mà không đòi hỏi nhiều chi phí đầu tư thiết bị [167], [168], [169], [170]

Nhìn chung, dịch nha được sử dụng trong các nghiên cứu lên men bia nồng độ cao có nồng độ chất khô ban đầu thường dao động trong khoảng 16-24oPt Việc bổ sung chất dinh dưỡng vào dịch nha có sử dụng thế liệu, đặc biệt là nguồn nitơ [167], [169] cũng như tuyển chọn được các chủng nấm men thích hợp [168] sẽ giúp cho quá trình lên men bia nồng độ cao diễn ra nhanh hơn

Khi bổ sung ammonium sulphate (90 mg nitơ/L) [167] hoặc chất chiết nấm men (90mg nitơ/L) [169] sẽ làm cho thời gian lên men giảm và tốc độ sinh tổng hợp ethanol gia tăng so với mẫu đối chứng

Lại Q Đạt & cộng sự (2005) nhận thấy rằng sục không khí vô trùng trong 12 giờ

lên men đầu tiên vào dịch nha 20oPt (có sử dụng 20% thế liệu gạo) sẽ làm cho tốc độ sử dụng cơ chất của nấm men gia tăng, thời gian lên men được rút ngắn và hàm lượng ethanol trong bia non đạt giá trị 10% (v/v) [167]

Nghiên cứu của Nguyễn T Hải & cộng sự (2010) kết luận rằng việc sử dụng

mật độ giống cấy cao (7,5x107 tb/mL) làm thời gian lên men chính giảm 27%, hàm lượng ethanol trong bia non gia tăng 9,2% Đặc biệt, giải pháp sử dụng mật độ giống cấy cao sẽ làm giảm sự ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng trong dịch nha đến khả năng sinh trưởng của nấm men khi so sánh với mật độ giống cấy thường (1,5x107 tb/mL) Tuy nhiên, hàm lượng diacetyl trong bia non khi sử dụng mật độ giống cấy cao tăng 87,2% so với mẫu đối chứng [171]

Khi ứng dụng kỹ thuật lên men tĩnh có bổ sung cơ chất để lên men dịch nha 16oPt, Vũ T K Linh & cộng sự (2007) nhận thấy rằng bia non tạo thành có hàm

lượng ethanol cao hơn 32% và hàm lượng diacetyl trong bia non giảm 25% so với lên men theo phương pháp tĩnh [170] Cũng theo những tác giả trên, khi ứng dụng kỹ thuật lên men tĩnh có bổ sung cơ chất đối với dịch nha 20oBx (sử dụng 30% thế liệu maltose syrup), nếu thêm 0,25% (w/v) chất chiết nấm men vào dịch châm thì thời gian lên men giảm 11,8% trong khi hàm lượng ethanol trong bia non không có sự khác biệt so với mẫu lên men theo phương pháp tĩnh Đặc biệt, khi bổ sung 0,25% (w/v) chất chiết nấm men và 0,8% (v/v) Tween 80 vào dịch châm thì hàm lượng ethanol trong bia non gia tăng 9,7 % so với trường hợp lên men tĩnh [172]

Đối với nấm men cố định trong gel alginate, những kết quả nghiên cứu trong

nước cũng chứng minh được ưu điểm của nó so với nấm men tự do Lê T L Chi &

cộng sự (2000, 2001) đã xác định điều kiện kỹ thuật thích hợp cố định nấm men

trong gel Ca-alginate để lên men dịch nha 12oBx: mật tế bào trong gel là 4,6x107 tb/mL; nồng độ alginate trong gel là 2,0% w/v và nồng độ dung dịch CaCl2 là

1%w/v [172], [174] Nghiên cứu của Phạm T Khoa & cộng sự (2003) cho thấy

rằng nấm men cố định trong gel alginate có thể sử dụng trong quá trình lên men sản xuất ethanol theo phương pháp liên tục trong khoảng thời gian 36-40 ngày với tốc độ pha loãng là 0,0125h-1 Sản phẩm tạo thành có hàm lượng ethanol dao động trong khoảng 6,8-7,4 % (v/v) [175]

Khi nghiên cứu về quá trình sản xuất ethanol theo phương pháp tĩnh, Bùi T

Huyền & cộng sự (2008) kết luận rằng khi nồng độ glucose ban đầu thay đổi trong

khoảng 140 - 200 g/L, nấm men cố định luôn có tốc độ lên men cao hơn khoảng

1,3-2,5 lần và nồng độ ethanol trong dịch dấm chín cao hơn khoảng 1,7-2,2 lần so với nấm men tự do [176]

Tôn N M Nguyệt & cộng sự (2008a) đã nghiên cứu ứng dụng nấm men cố định

trong gel alginate để lên men rượu vang Khi hàm lượng sulfure dioxide ban đầu trong dịch nho thay đổi trong khoảng 12-312 ppm, nấm men cố định trong gel alginate có tốc độ sử dụng đường và tốc độ sinh tổng hợp ethanol lần lượt cao hơn từ 1,2-1,9 lần và 1,2-1,8 lần so với nấm men tự do [177] Ngoài ra, khi môi trường lên men rượu vang có hàm lượng tannin cao (9,8 và 17,8 g acid tannic/L) thì mật độ tế bào cực đại, tốc độ sinh trưởng riêng cực đại cũng như tốc độ sử dụng đường khử và tốc độ sinh tổng hợp ethanol của nấm men cố định trong gel alginate luôn cao hơn so với nấm men tự do [92] Các tác giả trên cũng nhận thấy rằng khi pH của dịch nho thay đổi trong khoảng 3,5-4,5, tốc độ sinh trưởng riêng cực đại của nấm men cố định trong gel alginate thấp hơn nhưng hoạt tính lên men lại cao hơn so với nấm men tự do [178] Đồng thời, khi nồng độ đường của dịch nho ban đầu tăng cao (320-360 g/L), tốc độ sử dụng đường và sinh tổng hợp ethanol của nấm men cố định trong gel alginate sẽ cao hơn nấm men tự do từ 1,5 đến 2,5 lần [145]

1.6.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Krish J (1997) nhận thấy nấm men S cerevisiae cố định trong gel alginate có tỷ

lệ tế bào sống là 72% khi hàm lượng ethanol trong canh trường là 20% (v/v), trong khi tỷ này của nấm men tự do là 0% [179]

Domezy Z & cộng sự (1998) đã sử dụng nấm men cố định trong gel alginate với

mật độ tế bào 1,0x109 tb/mL gel để lên men bia theo phương pháp liên tục và thấy rằng thời gian lên men giảm so với trường hợp dùng nấm men tự do Tốc độ sử dụng đường khử của nấm men cố định cao hơn hẳn so với nấm men tự do Theo các tác giả trên, nồng độ nitơ amin tự do còn lại trong bia khi sử dụng nấm men cố định trong gel alginate là cao hơn 24,8% so với nấm men tự do [160] Nghiên cứu của

Patkova J & cộng sự (2000) sử dụng nấm men cố định trong gel alginate để lên

men dịch nha 24oPt theo phương pháp chu kỳ cũng thu được kết quả tương tự Hàm

lượng nitơ amin tự do còn lại trong bia non khi sử dụng nấm men cố định cao hơn 30% so với nấm men tự do [15]

Patkova J & cộng sự (2000) sử dụng thành công nấm men cố định trong gel

alginate để lên men dịch nha 24oPt trong thời gian 8 ngày, giảm 50% thời gian lên men so với mẫu đối chứng sử dụng nấm men tự do Hàm lượng ethanol của bia non đạt giá trị 9,5% (v/v) và tăng 53,2% so với khi sử dụng nấm men tự do [15]

Ngoài ra, sử dụng nấm men cố định trong gel alginate cũng ảnh hưởng đến hàm

lượng các sản phẩm phụ có trong bia Nghiên cứu của Domezy Z & cộng sự (1998)

nhận thấy rằng khi sử dụng nấm men cố định trong gel alginate thì hàm lượng rượu cao phân tử trong bia sau lên men phụ cao hơn so với trường hợp sử dụng nấm men

tự do [66] Kết quả nghiên cứu của Patkova J & cộng sự (2000) cho thấy nồng độ

diacetyl trong bia non giảm khi gia tăng nồng độ chất khô ban đầu của dịch nha trong trường hợp sử dụng nấm men cố định trong gel alginate Khi gia tăng nồng độ chất khô ban đầu của dịch nha từ 12 lên 30oPt, nồng độ diacetyl trong bia non khi sử dụng nấm men cố định trong gel alginate luôn thấp hơn so với nấm men tự do trong cùng điều kiện khảo sát [15]

1.7 Nội dung nghiên cứu của luận án

Những kết quả nghiên cứu trong nước về lên men bia nồng độ cao sử dụng nấm men cố định trong gel alginate hầu như chưa được công bố Đối với những kết quả đã công bố ở nước ngoài, những nghiên cứu về lên men bia nồng độ cao sử dụng

nấm men cố định trong gel alginate vẫn chưa đề cập đến các vấn đề sau đây:

i Các thông số kỹ thuật của quá trình cố định nấm men trong gel alginate để lên men bia nồng độ cao: Trước đây, một số tác giả đã xác định các thông số kỹ thuật tối ưu của quá trình cố định nấm men trong gel alginate với mục đích sử dụng để lên men sản xuất cồn, lên men rượu vang, lên men bia với dịch nha 10-12oPt Một số tác giả khác đã sử dụng những kết quả nói trên để cố định nấm men bia trong gel alginate và ứng dụng để lên men bia nồng độ cao mà chưa xem xét đến sự ảnh hưởng của các thông số trong quá trình cố định tế bào tới hoạt tính lên men của nấm men cố định khi nồng độ dịch nha

tăng cao hơn 12oPt Cần lưu ý là điều kiện lên men bia nồng độ cao khác hẳn so với điều kiện lên men bia theo phương pháp thông thường, điều kiện lên men sản xuất cồn hay lên men rượu vang Do đó, các thông số kỹ thuật thích hợp để cố định nấm men cho các trường hợp ứng dụng nói trên sẽ phải khác nhau

ii Sự thay đổi hình thái nấm men cố định trong gel alginate trong quá trình lên men bia: Hiện tượng này được xem là sự phản ứng của nấm men bia trước những tác động ức chế từ môi trường bên ngoài Do đó, tìm hiểu về sự thay đổi hình thái của nấm men cố định trong gel alginate là cần thiết để làm sáng tỏ khả năng ứng dụng của nó trong sản xuất thực tiễn

iii Các giải pháp kỹ thuật nhằm nâng cao hiệu quả lên men bia nồng độ cao trong trường hợp sử dụng nấm men cố định nói chung và nấm men cố định trong gel alginate nói riêng: chọn tỷ lệ giống cấy thích hợp, xác định thời gian sục không khí vào dịch nha trong quá trình lên men, khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung chất dinh dưỡng vào dịch nha Sử dụng các giải pháp kỹ thuật nói trên trong quá trình lên men bia nồng độ cao có thể làm tăng hoạt tính lên men của nấm men cố định trong gel alginate

iv Phương trình cân bằng vật chất cho quá trình lên men bia nồng độ cao sử dụng nấm men tự do và cố định: Đây là cơ sở lý thuyết để đánh giá và so sánh một cách hệ thống về khả năng chuyển hóa cơ chất thành các sản phẩm trao đổi chất của nấm men tự do và nấm men cố định

Trên cơ sở phân tích tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước cũng như những ưu, nhược điểm của kỹ thuật lên men bia nồng độ cao với nấm men cố định trong gel alginate, nội dung nghiên cứu của luận án sẽ tập trung vào những vấn đề sau đây:

1.7.1 Ảnh hưởng của việc cố định nấm men trong gel alginate đến hình thái và

khả năng lên men bia nồng độ cao của nấm men

Trong phần thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành khảo sát các nội dung sau: