Nghiên cứu quá trình lên men bia nồng độ cao sử dụng nấm men cố định trên alginate

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TRẦN QUỐC HIỀN NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH LÊN MEN BIA NỒNG ĐỘ CAO SỬ DỤNG NẤM MEN CỐ ĐỊNH TRÊN GEL ALGINATE Chuyên ngành: Chế biến thực phẩm đồ uống Mã số chuyên ngành: 62 54 02 01 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ KỸ THUẬT Cơng trình hồn thành tại: Trường Đại học Bách khoa Đại học Quốc gia -HCM Người hướng dẫn khoa học 1: PGS TS Lê Văn Việt Mẫn Người hướng dẫn khoa học 2: TS Hoàng Kim Anh Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Trường họp Trường Đại học Bách khoa TP HCM vào lúc giờ, ngày tháng năm 201 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Khoa học Tổng hợp Tp HCM - Thư viện Trường Đại học Bách khoa – ĐHQG -HCM DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Tran Q Hien et al “Comparison of the fermentation performance by free and immobilized yeast in high gravity brewing”, Hội nghị khoa học tồn quốc lần thứ IV-Hóa sinh sinh học phân tử phục vụ nông, sinh, y học công nghiệp thực phẩm, Nxb Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, 2008a, tr 290-293 Tran Q Hien et al “Influence of yeast and alginate concentrations in alginate gel beads on the fermentation characteristics of immobilized yeast in high gravity brewing” Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ IV-Hóa sinh sinh học phân tử phục vụ nông, sinh, y học công nghiệp thực phẩm, Nxb Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, 2008b, tr 294-297 Tran Q Hien et al “Influence of aeration time on fermentation performance of the immobilized yeast in high gravity brewing”, Journal of science & technology, vol 72A (ISSN 0868-3980), pp 23-27, 2009 Tran Q Hien et al “Effect of Tween 80 and ergosterol supplementation on fermentation performance of the immobilized yeast in high gravity brewing”, International Food Research Journal, vol 17, no.2 (ISSN 22317526), pp 309-318, 2010 Tran Q Hien et al “High gravity brewing with immobilized yeast in calcium alginate gel: effect of pitching rate on yeast metabolic activities in continuous fermentation”, Tạp chí Khoa học Công nghệ, Vol 49(5A) (ISSN 0866708X), pp 298-304, 2011 -1- A PHẦN MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Lượng bia Việt Nam sản xuất tăng dần năm qua: từ 1,29 tỷ lít năm 2003 tăng đến 2,7 tỷ lít năm 2010 Ngành cơng nghiệp Bia-Rượu-Nước giải khát phủ quy hoạch phát triển thành ngành kinh tế mạnh Để nâng cao suất bia, nhiều giải pháp kỹ thuật nước giới nghiên cứu ứng dụng, có kỹ thuật lên men bia nồng độ cao Ở nước ta, số công ty bia áp dụng kỹ thuật lên men bia nồng độ cao với nấm men tự hàm lượng chất khô dịch nha dao động khoảng o 13-16 Bx Đề tài luận án trình lên men bia nồng độ cao sử dụng nấm men cố định gel alginate góp phần nâng cao suất sản xuất, tiết kiệm nhân công, lượng chi phí đầu tư cho ngành cơng nghiệp sản xuất bia Mục tiêu Xác định giải pháp kỹ thuật để nâng cao hiệu lên men bia nồng o độ cao, sử dụng dịch nha 24 Bx nấm men cố định gel alginate Nội dung nghiên cứu - Xác định thông số kỹ thuật trình cố định nấm men gel alginate ảnh hưởng việc cố định tới hình thái khả lên men bia nồng độ cao nấm men - Xác định giải pháp kỹ thuật để nâng cao hiệu lên men bia nồng độ cao với nấm men cố định gel alginate, sử dụng dịch nha có khơng liệu syrup maltose - Thiết lập phương trình cân vật chất cho trình lên men bia nồng độ cao sử dụng nấm men tự nấm men cố định Những đóng góp luận án - Đã xác định thông số kỹ thuật trình cố định nấm men gel alginate để lên men bia nồng độ cao giải pháp kỹ thuật nhằm nâng cao hiệu lên men trường hợp sử dụng nấm men cố định o gel alginate để lên men dịch nha 24 Bx - Đã xác định quy luật biến đổi loại đường lên men trình lên men bia nồng độ cao sử dụng nấm men tự nấm men cố định - Đã xây dựng phương trình cân vật chất cho trình lên men bia nồng độ cao sử dụng nấm men cố định gel alginate nấm men tự Bố cục luận án Luận án bao gồm 145 trang (khơng kể phụ lục), 24 bảng, 46 hình 211 tài liệu tham khảo (11 tiếng việt, 196 tiếng anh trang web); trình bày phần: mở đầu, tổng quan, nguyên liệu phương pháp, kết bàn luận, kết luận kiến nghị, tài liệu tham khảo B NỘI DUNG LUẬN ÁN Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Tình hình phát triển ngành công nghiệp sản xuất bia Việt Nam Mức tiêu thụ bia bình quân đầu người Việt Nam 28 lít/năm - tương đối thấp so với nước khu vực giới Tuy nhiên, Việt Nam quốc gia có dân số trẻ, nhiều người độ tuổi sử dụng bia thường xuyên, người tiêu dùng nơng thơn có xu hướng thay đổi thói quen uống rượu sang uống bia Theo định hướng phát triển ngành bia đến năm 2025 Bộ trưởng Bộ Công thương phê duyệt, sản lượng bia sản xuất đạt 6,0 tỷ lít/năm 1.2 Nấm men bia cố định Nấm men cố định nấm men gắn chất mang nhốt chất mang có vị trí hoạt động bị giới hạn vùng khơng gian định bình lên men có khả trì hoạt tính trao đổi chất Chất mang cố định nấm men phổ biến thường polymer tự nhiên, polymer tổng hợp vật liệu vơ có tự nhiên Kỹ thuật cố định tế bào nấm men chia thành bốn nhóm chính: Cố định nấm men bề mặt chất mang rắn; nhốt nấm men vật liệu xốp; kết tế bào giữ tế bào không gian hệ thống màng bán thấm 1.3 Lên men bia nồng độ cao Lên men bia nồng độ cao kỹ thuật lên men dịch nha với nồng độ o chất khô ban đầu cao (>15 Pt), sau pha lỗng sản phẩm bia thu để đạt nồng độ ethanol theo giá trị mong muốn Nhìn chung, trình lên men bia nồng độ cao bị ảnh hưởng bởi: Nồng độ chất khô ban đầu dịch nha; thành phần dinh dưỡng dịch nha; mật độ nấm men gieo cấy ban đầu; hàm lượng oxy dịch nha ban đầu; nhiệt độ lên men nồng độ ethanol dịch lên men 1.4 Ứng dụng nấm men cố định trình lên men bia Việc sử dụng nấm men cố định trình lên men bia nồng độ cao làm thay đổi tính chất sinh lý nấm men cố định; khả sử dụng chất; khả chịu đựng yếu tố bất lợi khả sinh tổng hợp sản phẩm trao đổi chất 1.5 Chất mang alginate Chuỗi polymer alginate tạo thành từ loại block: block G chủ yếu L-guluronic acid, block M chủ yếu D-mannuronic acid block MG chứa hỗn hợp D-mannuronic acid L-guluronic acid Việc phối trộn dung dịch CaCl2 với dung dịch Na-alginate, gel Ca-alginate nhanh chóng hình thành 1.6 Tình hình nghiên cứu nước kỹ thuật lên men bia nồng độ cao sử dụng nấm men cố định gel alginate Tại Việt Nam, kết nghiên cứu lên men bia nồng độ cao sử dụng nấm men cố định gel alginate chưa công bố Tuy nhiên, sử dụng nấm men tự để lên men bia nồng độ cao, nghiên cứu tập trung vào vấn đề như: bổ sung chất dinh dưỡng vào dịch nha có sử dụng liệu; lựa chọn chủng nấm men thích hợp; sử dụng mật độ giống cấy cao; ứng dụng kỹ thuật lên men tĩnh có bổ sung chất Đối với nấm men cố định gel alginate, nhiều nghiên cứu khảo sát: điều kiện cố định nấm men gel alginate để lên men dịch o nha 12 Bx; ứng dụng nấm men cố định gel để lên men sản xuất ethanol theo phương pháp liên tục theo phương pháp tĩnh, ảnh hưởng stress pH, tanin, sulfure dioxide áp lực thẩm thấu đến hoạt tính nấm men cố định Các cơng trình nghiên cứu ngồi nước cho thấy nấm men cố định gel alginate làm giảm thời gian lên men bia nồng độ cao, làm tăng hàm lượng ethanol bia non so sánh với nấm men tự Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Nguyên liệu Sử dụng chủng nấm men bia thuộc lồi S cerevisiae cơng ty Foster Tiền Giang cung cấp; chất mang Na-alginate chiết xuất từ rong mơ Viện CN sinh học-Trường ĐH Thủy sản Nha Trang cung cấp; Malt vàng có nguồn gốc từ Australia công ty Đường malt cung cấp; syrup maltose công ty cổ phần Bibica cung cấp Cơ chất bổ sung vào dịch nha Tween 80 ergosterol có xuất xứ từ Sigma Chemical Co., hóa chất phân tích có nguồn gốc từ Merck & Co., Inc Sigma Chemical Co 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp thực nghiệm Sử dụng phương pháp cổ điển phương pháp quy hoạch thực nghiệm 2.2.2 Bố trí thí nghiệm 2.2.3 Một số quy trình chuẩn bị ngun liệu cho thí nghiệm 2.3 Phương pháp phân tích 2.3.1 Phương pháp phân tích vi sinh Đếm trực tiếp số tế bào nấm men buồng đếm Thoma; phân biệt tế bào nấm men sống/chết xanh methylen; quan sát hình thái tế bào nấm men kính hiển vi điện tử qt (SEM) 2.3.2 Phương pháp phân tích hóa lý Sử dụng khúc xạ kế để xác định hàm lượng chất khô; phương pháp quang phổ so màu để xác định lượng đường khử nitơ amin tự do; phương pháp sắc ký lỏng cao áp để định lượng glucose, fructose, saccharose, maltose maltotriose, phương pháp quang phổ UV để xác định diacetyl; phương pháp sắc ký khí để định lượng ethanol chất dễ bay bia non; phương pháp chuyển hóa mẫu sinh khối nấm men thành nguyên tố dạng khí buồng kín nhiệt độ cao để định lượng nguyên tố C, H, N O sinh khối nấm men 2.4 Phương pháp xử lý số liệu thực nghiệm Tất thí nghiệm thực 2-3 lần lặp lại để tính kết trung bình, xử lý thống kê phương pháp phân tích phương sai Analysis of Variance phần mềm Statgraphics plus (version 3.2) 2.5 Cơng thức tính tốn Luận án có sử dụng cơng thức tính độ lên men; tốc độ sử dụng chất (đường khử nitơ amin tự do) tốc độ sinh tổng hợp ethanol nấm men; tỷ lệ pha loãng dịch nha q trình lên men liên tục; cơng thức phân tử nấm men, chất sản phẩm lên men Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Ảnh hưởng việc cố định tế bào gel alginate tới hình thái khả lên men bia nồng độ cao nấm men 3.1.1 So sánh hoạt tính lên men nấm men tự nấm men cố định nồng độ dịch nha thay đổi Chúng khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất khô dịch nha (12o 28 Bx) đến động học trình lên men chính, sử dụng nấm men cố định gel alginate nấm men tự to với tỷ lệ giống cấy 1,0x10 tb/mL Kết thực nghiệm cho thấy phát triển sinh khối nấm men, tốc độ sử dụng đường khử nitơ amin tự do, tốc độ sinh tổng hợp ethanol nấm men cố định gel alginate cao so với nấm men tự từ 18,8-35,7%; 39,0-85,4% 114,2-377,3%; 35,9-55,3% Đồng thời, thời gian lên men nấm men cố định thấp khoảng 26,246,2% so với nấm men tự tất nồng độ chất khơ khảo sát 3.1.2 Quan sát hình thái nấm men điều kiện stress áp lực thẩm thấu stress ethanol tăng cao Tế bào nấm men cố định tự ngâm dung dịch sorbitol o (24 Bx) dung dịch ethanol (10%v/v) thời gian 30 phút; sau sử dụng SEM để quan sát hình thái nấm men Đối với stress áp lực thẩm thấu, sau 30 phút tiếp xúc với dung dịch o sorbitol 24 Bx, nấm men tự có bề mặt trở nên nhăn nheo co rút, số tế bào có bề mặt lõm sâu vào bên (hình 3.10 A2) Tuy nhiên, tế bào gắn bề mặt hạt gel cố định bên hạt gel alginate khơng xảy tượng (hình 3.10 B2, C2) Đối với stress ethanol, sau 30 phút ngâm dung dịch ethanol 10% (v/v), tế bào nấm men tự tế bào cố định bề mặt hạt gel alginate bị co rút, nhăn nheo, bề mặt tế bào bị lõm sâu vào bên (hình 3.10 A3, B3) Ngược lại, hình dạng tế bào nấm men cố định bên hạt gel không bị thay đổi trước tác động dung dịch ethanol (hình 3.10 C3) A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3 Hình 3.10: Hình ảnh nấm men cố định nấm men tự chụp SEM Nồng độ Alginate hạt gel 2,5% (w/v) mật độ nấm men 5,0x10 tb/mL gel: (A1) (B1) (C1): hình ảnh ban đầu nấm men tự do, nấm men cố định bề mặt hạt gel bên hạt gel; (A2) (B2) (C2) hình ảnh nấm men tự do, nấm men cố định bề mặt hạt gel bên hạt gel sau 30 phút tiếp xúc với dung dịch sorbitol - 12 - 9.9 8.77 8.54 6.6 6.17 5.00 4.71 4.96 3.3 Tốc độ sử dụng chất Mật độ tế bào (tr tb/mL) Chúng khảo sát ảnh hưởng thời gian sục không khí giai đoạn đầu q trình lên men (0, 4, 8, 12, 16 20 giờ) đến sinh trưởng, sử dụng chất hình thành sản phẩm nấm men Nồng độ oxy dịch lên men hiệu chỉnh ổn định 7,5 ppm suốt giai đoạn sục khí 3.43 3.18 3.9 2.37 2.6 1.97 1.95 1.66 1.66 1.36 0.95 1.3 1.27 1.14 1.15 0.0 12 24 36 48 60 72 144 84 96 108 120 132 0h 4h 8h 12h 16h 20h Thời gian sục khơng khí (giờ) Thời gian lên men (giờ) 0h 4h 8h 12h 16h Hình 3.19: Sự biến đổi mật độ tế bào trình lên men thời gian sục khí đổi từ đến 20 lên men 8.20 8.16 7.83 0.74 0.47 0.54 0.54 7.75 0.73 0.60 0h 4h 8h 12h 16h 20h 1.8 0.9 0.0 1.8 Nồng độ Diacetyl (mg/L) 8.24 1.2 0.6 0 12 24 36 Nồng độ Ethanol (%v/v) Tốc độ sinh ethanol (g/L.h) 48 60 72 84 96 108 120 132 144 Thời gian lên men (giờ) Thời gian sục khơng khí (giờ) Hình 3.24: Tốc độ sinh ethanol nồng độ ethanol bia non thời gian sục khí đổi từ đến 20 lên men Tốc độ sử dụng N-amin (mg/L.h) Hình 3.21: Tốc độ trung bình sử dụng chất nấm men trình lên men thời gian sục khí thay đổi từ đến 20 lên men 2.7 8.56 Tốc độ sinh Ethanol (mg/L.h) Nồng độ Ethanol (%v/v) Tốc độ sử dụng đường khử (g/L.h) 0h 4h 8h 12h 16h Hình 3.25: Sự biến đổi hàm lượng diacetyl canh trường trình lên men thời gian sục khí thay đổi từ đến 20 lên men Cung cấp oxy vào dịch nha sau thời điểm cấy giống mang lại số tác động tích cực lẫn tiêu cực cho trình lên men bia nồng độ cao với nấm men cố định gel alginate Nếu thời gian sục khơng khí kéo dài từ đến 20 sau thời điểm cấy giống lượng sinh khối cực đại thu tăng 90,2% (hình 3.19); tốc độ sử dụng đường khử FAN tăng 74,0% 122,8% (hình 3.21); tốc độ sinh tổng hợp ethanol nấm men cố định tăng 55,5% (hình 3.24) thời gian lên men rút ngắn 60 Tuy nhiên, hàm lượng ethanol bia non giảm 9,5% (hình 3.24) nồng độ diacetyl bia non tăng 20% (hình 3.25) Từ nhận xét trên, chúng tơi cho thời gian sục khơng khí thích hợp 12 đầu q trình lên men sử dụng nấm men o cố định gel alginate để lên men dịch nha 24 Bx 3.3 Sử dụng nấm men cố định để lên men dịch nha có bổ sung liệu syrup maltose 3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ liệu đến hoạt tính lên men nấm men cố định trình lên men bia nồng độ cao Tỷ lệ liệu syrup maltose (0, 15, 30 45% w/w) ảnh hưởng đến động học trình lên men o Bảng 3.8 Ảnh hưởng tỷ lệ liệu syrup maltose đến trình lên men dịch nha 24 Bx với nấm men cố định gel alginate Mức liệu (%w/w) 15 30 45 Nồng độ N-amin có dịch nha (mg/L) 559,71 ± 4,16 a1 480,72 ± 4,03 b1 394,90 ± 4,32 c1 309,34 ± 3,61 Nồng độ N-amin có bia non (mg/L) 280,04 ± 6,39 a2 227,06 ± 4,35 b2 172,91 ± 7,49 c2 125,64 ± 7,86 Thời gian lên men (giờ) 108 ± 7.02 Mật độ tế bào cực đại (tr tb/mL) 73,61 ± 1,96 Tốc độ sử dụng đường khử (g/L.h) 1,27 ± 0,01 Tốc độ sử dụng N-amin (mg/L.h) 2,59 ± 0,06 Nồng độ Ethanol bia non (%v/v) 8,52 ± 0,03 Tốc độ sinh tổng hợp Ethanol (g/L.h) 0,62 ± 0,00 a3 a4 108 a3 72,08 ± 4.00 a4 ± 1,90 a5 1,29 ± 0,01 a6 2,35 ± 0,03 a7 8,36 ± 0,04 a8 0,61 ± 0,00 108 a3 72,64 ± 4.00 a4 ± 1,87 a5 1,29 ± 0,00 b6 2,05 ± 0,07 d1 d2 132 b3 60,52 ± 6.00 b4 ± 1,87 a5 0,97 ± 0,00 a6 1,39 ± 0,06 a7 8,39 ± 0,04 a8 0,62 ± 0,00 b5 b6 a7 7,79 ± 0,04 b7 a8 0,53 ± 0,06 c8 Các ký tự khác thể giá trị hàng có khác biệt có nghĩa mức p=0,05 Kết bảng 3.8 cho thấy tỷ lệ liệu sử dụng thay đổi từ 0% đến 30% (w/w) mật độ tế bào cực đại canh trường khơng khác biệt có nghĩa Tuy nhiên, tỷ lệ liệu dịch nha tăng từ 30% lên 45% (w/w) mật độ tế bào cực đại canh trường giảm 16,7% Khi tăng tỷ lệ liệu dịch nha từ 0% lên 30% (w/w) tốc độ trung bình sử dụng đường khử nấm men cố định không thay đổi đạt giá trị khoảng 1,27-1,29 g/L.h Tuy nhiên, tỷ lệ liệu dịch nha tăng từ 30% lên 45% (w/w) tốc độ sử dụng đường khử nấm men cố định giảm 24,8% Cần lưu ý tỷ lệ liệu sử dụng tăng lên 45%, sau 132 lên men, độ lên men đạt 71,7%, thấp giá trị yêu cầu 75% Trong đó, tỷ lệ liệu dịch nha thay đổi từ 0% (w/w) tăng lên 15%; 30% 45% (w/w) tốc độ sử dụng FAN nấm men giảm tương ứng 8,9%; 20,5% 40,5% so với mẫu đối chứng không sử dụng liệu Hàm lượng ethanol bia non không thay đổi tỷ lệ liệu sử dụng từ 0% tăng lên 30% (w/w) dao động khoảng 8,39-8,52 % (v/v) Nếu tăng tỷ lệ liệu sử dụng từ 30 lên 45% (w/w) hàm lượng ethanol bia non tốc độ sinh tổng hợp ethanol giảm tương ứng 8,7% 7,6% Ngoài ra, hàm lượng sản phẩm phụ diacetyl, ethylacetate, propanol isoamyl alcohol bia non có xu hướng giảm dần tăng tỷ lệ syrup maltose dịch nha, đặc biệt nghiệm thức sử dụng liệu với tỷ lệ cao (45%w/w) (Bảng 3.9) Bảng 3.9 Nồng độ số sản phẩm phụ bia non (mg/L) lên men dịch nha o 24 Bx, sử dụng liệu maltose syrup với tỷ lệ khác Sản phẩm phụ (mg/L) Mức liệu (%w/w) a1 Diacetyl 1,06 ± 0,04 Propanol 29,37 ± 0,51 Isoamyl alcohol 15 ab1 0,99 ± 0,05 a2 26,07 ± 0,13 a3 87,60 ± 2,64 a4 30,41 ± 0,26 a5 50,35 114,80 ± 2,73 Actaldehyl 30,61 ± 0,84 Ethyl acetate 51,99 ± 0,85 30 b1 0,80 ± 0,06 b2 25,00 ± 1,46 b3 83,40 ± 0,53 b4 26,45 ± 0,34 0,96 ± 0,05 b2 25,57 ± 0,25 b3 87,70 ± 2,65 a4 27,73 ± 0,55 ab5 ± 0,24 45 b5 48,97 ± 1,40 c1 b2 b3 b4 b5 48,37 ± 0,55 Các ký tự khác thể giá trị hàng có khác biệt có nghĩa mức p=0.05 Tóm lại, tỷ lệ liệu sử dụng khoảng 0-30% (w/w) khả lên men nấm men cố định gel alginate không thay đổi so với dịch nha không bổ sung liệu, hàm lượng ethanol sản phẩm phụ khác bia non tương đương khác biệt 3.3.2 Đánh giá ảnh hưởng phương pháp bổ sung Tween 80 vào dịch nha đến hoạt tính lên men nấm men cố định Chúng khảo sát ảnh hưởng hàm lượng Tween 80 bổ sung (0%-mẫu o đối chứng; 0,12; 0,24; 0,36 0,48% v/v) vào dịch nha 24 Bx (sử dụng 30% syrup maltose) đến động học trình lên men bia Tất hàm mục tiêu khảo sát mẫu đối chứng mẫu bổ sung 0,12%v/v Tween 80 mẫu bổ sung 0,24% (v/v) 0,36% (v/v) Tween 80 khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê Khi hàm lượng Tween 80 bổ sung vào dịch nha gia tăng từ (mẫu đối chứng) lên 0,48% v/v, thời gian lên men giảm 11,1% (mẫu bổ sung 0,24 0,36% v/v Tween 80) 22,2% (mẫu bổ sung 0,48% v/v Tween 80) Nồng độ ethanol bia non giảm 6,7% (mẫu bổ sung 0,24 0,36%v/v Tween 80) 13,9% (mẫu bổ sung 0,48%v/v Tween 80) Chúng chọn hàm lượng Tween 80 cần bổ sung vào dịch nha 0,24% v/v để thực thí nghiệm tối ưu hóa theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm phần 3.3.4 Bảng 3.10 Ảnh hưởng việc bổ sung Tween 80 vào dịch nha đến trình lên men bia nồng độ cao o sử dụng nấm men cố định gel alginate (Dịch nha 24 Bx có sử dụng 30% liệu syrup maltose) Hàm lượng Tween 80 bổ sung (%v/v) a1 108 ±1,23 Thời gian lên men (h) 0.12 0.24 a1 96 ±1,57 c2 8,8 ±1,46 108 ±,.97 0.36 b1 96 ±1,83 b2 9,0 ±1,46 0.48 b1 84 ±0,88 c1 b2 a2 9,8 ±1,04 Mật độ tế bào cực đại (10 tb/mL) 7,6 c2 ±1,68 Tốc độ sử dụng đường c3 khử (g/L.h) c3 1,28 ±0,02 Tốc độ sử dụng FAN c4 (mg/L.h) Nồng độ ethanol bia 7,7 ±0,83 1,29 ±0,10 c4 2,35 ±0,08 2,39 ±0,04 a5 a5 non (% v/v) Tốc độ sinh tổng hợp c6 ethanol (g/L.h) 8,47 ±0,05 8,41 ±0,05 c6 0,62 ±0,00 0,62 ±0.00 b3 1,44 ±0,08 b4 3,12 ±0,06 b5 7,95 ±0,21 b6 0,65 ±0,02 b3 1,44 ±0,12 3,15 ab4 ±0,08 b5 7,90 ±0,12 b6 0,65 ±0,01 a3 1,66 ±0,05 a4 3,27 ±0,08 c5 7,29 ±0,04 a6 0,68 ±0,00 Các ký tự khác thể giá trị hàng có khác biệt có nghĩa mức p=0,05 3.3.3 Đánh giá ảnh hưởng phương pháp bổ sung ergosterol vào dịch nha đến hoạt tính lên men nấm men cố định Trong thí nghiệm này, hàm lượng ergosterol bổ sung vào dịch nha thay đổi 0% (mẫu đối chứng), 12, 24 36 mg/L Bảng 3.11 Ảnh hưởng việc bổ sung ergostero-l 1v6ào- dịch nha đến trình lên men bia nồng độ o cao sử dụng nấm men cố định gel alginate (Dịch nha 24 Bx có sử dụng 30% liệu syrup maltose) Hàm lượng ergosterol bổ sung (mg/L) a1 96 ±1,39 c2 7,7 ±0,84 108 ±1,57 Thời gian lên men (h) 12 Mật độ tế bào cực đại (10 tb/mL) 7,5 ±0,24 Tốc độ sử dụng đường khử (g/L.h) 1,32 ±0,02 Tốc độ sử dụng FAN (mg/L.h) 2,61 ±0,02 Nồng độ ethanol bia non (%v/v) 8,41 ±0,04 Tốc độ sinh tổng hợp ethanol (g/L.h) 0,62 ±0,01 b1 b2 b3 1,48 ±0,02 b4 2,82 ±0,06 a5 8,36 ±0,08 b6 0,69 ±0,01 24 b1 96 ±0,98 7,8 ab2 ±0,96 a3 1,49 ±0,02 a4 2,82 ±0,01 a5 8,33 ±0,05 a6 0,69 ±0,01 36 b1 96 ±1,05 a2 7,9 ±0,87 a3 1,50 ±0,02 a3 a4 2,87 ±0,02 a5 8,33 ±0,09 a6 0,68 ±0,01 a4 a5 a6 Các ký tự khác thể giá trị hàng có khác biệt có nghĩa mức p=0,05 Khi lượng ergosterol bổ sung vào dịch nha 12mg/L, số tế bào cực đại, tốc độ sử dụng chất tốc độ sinh tổng hợp ethanol nấm men cố định tăng cao so với mẫu đối chứng Điều làm cho thời gian lên men giảm 11,1% Bên cạnh đó, hàm lượng ethanol bia non mẫu có bổ sung ergosterol 12 mg/L tương tự mẫu đối chứng (Bảng 3.11) Kết bảng 3.11 cho thấy hàm mục tiêu khảo sát khơng có khác biệt hàm lượng ergosterol bổ sung vào dịch nha gia tăng từ 12 mg/L lên 36 mg/L Như vậy, hàm lượng ergosterol bổ sung 12 mg/L chọn để thực thí nghiệm tối ưu hóa theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm phần 3.3.4 3.3.3 Đánh giá ảnh hưởng phương pháp bổ sung kết hợp Tween 80 ergosterol đến hoạt tính lên men nấm men cố định 3.3.4.1 Tối ưu hóa hàm lượng Tween 80 ergosterol bổ sung kết hợp vào dịch nha phương pháp quy hoạch thực nghiệm Thí nghiệm bố trí theo phương pháp trực giao bậc hai, hai yếu tố 1/2 (với α = ± ), thí nghiệm lặp lại tâm Chúng sử dụng phần mềm thực nghiệm Moode-Design (Version 5.0) để thiết kế thí nghiệm xử lý số liệu Hai yếu tố khảo sát hàm lượng Tween 80-X1 (%v/v) ergosterol-X2 (mg/L) bổ sung vào dịch nha Hàm mục tiêu Y (E% v/v) hàm lượng ethanol bia non độ lên men canh trường đạt 75% - 17 - Sự ảnh hưởng thành phần Tween 80 ergosterol bổ sung vào dịch nha đến hàm lượng ethanol bia non (YE) biểu diễn phương trình (*) trình bày hình 3.28 Chúng ta nhận thấy điều kiện tối ưu ghi nhận phương trình (*) X1=1, X2=1, tương ứng hàm lượng Tween 80 bổ sung 0,3% (v/v) hàm lượng ergosterol bổ sung 18 mg/L Trong điều kiện này, hàm lượng ethanol bia non đạt giá trị tối đa 8,28 % (v/v) Bảng 3.12 Ma trận bố trí thí nghiệm kết thực nghiệm ảnh hưởng Tween 80 ergosterol đến trình lên men bia nồn ST T 0,24 3,5 -21/2 7,80 10 0,24 12,0 0 8,13 11 0,24 12,0 0 8,12 12 0,24 12,0 0 8,14 Biến khảo sát Biến mã hóa Tween80 (%v/v) ergosterol (mg/L) 0,18 6,0 0,30 6,0 0,18 18,0 0,30 18,0 0,16 12,0 0,32 12,0 X1 X2 -1 +1 -1 +1 -21/2 +21/2 -1 -1 +1 +1 0 Hàm mục tiêu E (%v/v) 8,01 7,90 8,10 8,25 8,10 8,20 Hình 3.28: Nồng độ ethanol bia non thí nghiệm tối ưu hóa quy hoạch thực nghiệm (Y: nồng độ ethanol 1/2 X : hàm 0,24 lượng Tween 20,5 80 (%v/v) bổ +2 8,20 nha X2: hàm lượng ergosterol (mg/L) bổ sung vào dịch (%v/v), sung vào dịch nha 0,24 12,0 0 8,12 Ghi chú: (-1): mưc dưới; (0): tâm; (+1): mức Phương trình hồi quy: YE = 8,128 + 0,023X + 0,126X2 – 0,066X2 + 0,065X1X2 (*) 3.3.4.2 Khảo sát khả lên men nấm men cố định dịch nha bổ sung Tween 80 ergosterol Chúng bổ sung Tween 80 (0,3% v/v) ergosterol (18 mg/L) vào o dịch nha 24 Bx (tỷ lệ maltose syrup 30%) để lên men bia Mẫu đối chứng không bổ sung Tween 80 ergosterol o Việc bổ sung Tween 80 ergosterol vào dịch nha 24 Bx có sử dụng liệu làm cho lượng sinh khối nấm men cực đại tăng 17,6% cao so với mẫu đối chứng Bên cạnh đó, giảm hàm lượng đường khử FAN canh trường diễn nhanh Điều làm cho mẫu dịch nha bổ sung Tween 80 ergosterol có thời gian lên men - 18 - giảm 22,2% so với mẫu đối chứng Ngoài ra, bổ sung Tween 80 ergosterol vào dịch nha nấm men cố định gel alginate sinh tổng hợp ethanol nhanh Nồng độ ethanol bia non hai mẫu khảo sát khơng có khác biệt mặt phân tích thống kê Việc bổ sung Tween 80 ergosterol vào dịch nha có ảnh hưởng đến hình thành sản phẩm phụ trình lên men Nhìn chung, hàm lượng diacetyl, rượu cao phân tử ester bia non cao so với mẫu đối chứng Tuy nhiên, hàm lượng chúng nằm ngưỡng cho phép mà số tác giả khuyến cáo 3.3.4 Thiết lập phương trình cân vật chất q trình lên men sử dụng nấm men cố định nấm men tự 3.3.4.1 Sự thay đổi hàm lượng chất canh trường trình lên men bia nồng độ cao sử dụng nấm men cố định gel alginate 12 Hàm lượng đường (g/100mL) Hàm lượng đường (g/100mL) 12 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 156 168 180 Thời gian lên men (giờ) Sucrose Maltose Fructose Maltotriose 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 Thời gian lên men (h) Glucose Hình 3.35: Sự thay đổi hàm lượng đường lên men trình lên men bia nồng độ cao sử dụng nấm o men tự (Dịch nha 24 Bx, tỷ lệ liệu syrup maltose 30%) Sucrose Maltose Fructose Maltotriose Glucose Hình 3.36: Sự thay đổi hàm lượng đường lên men trình lên men bia nồng độ cao sử dụng nấm o men cố định (Dịch nha 24 Bx, tỷ lệ liệu syrup maltose 30%) Đối với chủng nấm men sử dụng luận án, tế bào nấm men tự cố định chuyển hóa hấp thu loại đường dịch nha glucose, fructose, saccharose maltose lên men Ngoài ra, việc gắn nấm men vào gel alginate làm cho tế bào cố định sử dụng maltotriose từ lên men (Hình 3.36) so với nấm men tự bắt đầu sử dụng maltotriose sau lên men thứ 48 (hình 3.35) Nhìn chung, tốc độ sử dụng đường lên men nấm men cố định nhanh so với nấm men tự 3.3.4.2 Thiết lập phương trình cân vật chất cho trình lên men bia nồng độ cao sử dụng nấm men cố định nấm men tự Phương trình cân vật chất tổng quát trình lên men bia có dạng sau: a(Đường lên men) + b(Acid amin đồng hóa) + cH2O d(Nấm men bia)+ (1) e(ethanol) + fCO2 +g (glycerol) + h(Acid hữu cơ) + i(Rượu cao phân tử) Trong phương trình (1) chất “đường lên men” chọn với hệ số mole Việc xác định hệ số phương trình dựa kết thực nghiệm hàm lượng chất nấm men sử dụng, hàm lượng sinh khối hàm lượng sản phẩm trao đổi chất nấm men sinh q trình lên men kết thúc Số mole H2O suy từ cân H O theo vế phương trình Bảng 3.16: Tỷ lệ thành phần nguyên tố nấm men bia, đường lên men, acid amin dịch nha, rượu cao phân tử acid hữu bia non lên men bia nồng độ cao sử dụng nấm men cố định nấm men tự Tỷ lệ thành phần nguyên tố Nấm men bia Đường lên men Acid amin đồng hóa Acid hữu Rượu cao phân tử Nấm men tự Nấm men cố định CH1.890O0.624N0.081 CH1.846O0.924 CH1.886O0.442N0.217 CH1.600O CH2.459O0.229 CH1.890O0.624N0.081 CH1.846O0.924 CH1.886O0.442N0.217 CH1.570O CH2.438O0.219 Bảng 3.19: Hiệu suất (%) tổng hợp sinh khối sản phẩm tính theo đường lên men trình lên men bia nồng độ cao sử dụng nấm men cố định nấm men tự Thành phần Hiệu suất (%) tổng hợp sinh khối sản phẩm tính theo đường lên men Nấm men tự Sinh khối nấm men Ethanol Carbon dioxide Glycerol Nấm men cố định Rượu cao phân tử Acid hữu 3,14 45,60 47,18 7,39 0,13 2,99 6,03 41,8 52,4 4,50 0,06 2,58 Tỷ lệ thành phần nguyên tố nấm men bia sử dụng luận án, đường lên men, acid amin dịch nha, acid hữu rượu cao phân tử bia non trường hợp sử dụng nấm men tự cố định tính tốn trình bày kết bảng 3.16 Ngoài ra, giá trị hiệu suất sinh tổng hợp sinh khối hiệu suất sinh tổng hợp sản phẩm trao đổi chất bia non tính theo đường lên men trình bày bảng 3.19 Từ kết thực nghiệm, xây dựng phương trình cân vật chất cho trình lên men bia nồng độ cao sử dụng nấm men tự (2) nấm men cố định (3) CH1.846O0.924 + 0.006 CH1.886O0.442N0.217 + 0.009 H2O 0.036 CH1.890O0.624N0.081 + (2) 0.284 C2H5OH + 0.307 CO2 + 0.023 C3H8O3 + 0.029 CH1.600O + 0.002 CH2.459O0.229 CH1.846O0.924 + 0.009 CH1.886O0.442N0.217 + 0.009 H2O 0.069 CH1.890O0.624N0.081 + (3) 0.260 C2H5OH + 0.341 CO2 + 0.014 C3H8O3 + 0.025 CH1.570O + 0.001 CH2.438O0.219 Kết thực nghiệm cho thấy hiệu suất sinh tổng hợp ethanol tính theo đường lên men nấm men cố định thấp 8,3% so với nấm men tự Trong đó, hiệu suất sinh tổng hợp sản phẩm phụ khác bia glycerol, acid hữu rượu cao phân tử nấm men cố định thấp 39,1; 13,7 53,8% so với nấm men tự 3.4 Bước đầu thử nghiệm sử dụng nấm men cố định lên men dịch nha có bổ sung liệu phương pháp lên men liên tục Đánh giá ảnh hưởng tỷ lệ giống cấy (tỷ lệ giống cấy thông thường 7 1,0x10 tb/mL tỷ lệ giống cấy cao 7,0x10 tb/mL) đến động học q trình lên men theo phương pháp lên men liên tục, sử dụng o dịch nha 24 Bx có bổ sung 30% syrup maltose nấm men cố định gel alginate 7 Với tỷ lệ giống cấy 1,0x10 tb/mL 7,0x10 tb/mL, mật độ tế bào bia non suốt trình lên men liên tục hai nghiệm thức 6 khảo sát dao động khoảng 3,8x10 -4,9x10 tb/mL (hình 3.37) Kết thực nghiệm cho thấy việc tăng tỷ lệ giống cấy làm tăng tỷ lệ pha loãng 220,0% phương pháp lên men liên tục, từ làm tăng suất sử dụng thiết bị lên men Tuy nhiên, việc tăng tỷ lệ giống cấy làm hàm lượng ethanol trung bình bia non giảm từ 9,13% (v/v) xuống 6,28 % (v/v) (hình 3.38) Điều làm giảm thể tích bia tạo thành sau pha lỗng bia độ cồn 5% Ngồi ra, hình 3.38 cho thấy việc tăng tỷ lệ giống cấy làm giảm thời gian lên men liên tục làm tăng chi phí chuẩn bị nấm men cố định 6.0 12 Hàm lượng ethanol (% v/v) Mật độ tế bào (1,0x10 tb/mL) Mật độ giống cấy thông thường 4.0 2.0 0.0 Mật độ giống cấy thông thường 0 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 12 16 6.0 Hàm lượng ethanol (% v/v) Mật độ tế bào (1,0x10 tb/mL) 24 28 32 36 40 44 48 52 12 Mật độ giống cấy cao 4.0 2.0 0.0 20 Thời gian lên men (ngày) Thời gian lên men (ngày) Mật độ giống cấy cao 0 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 Thời gian lên men (ngày) Thời gian lên men (ngày) Thời điểm bắt đầu thực trình lên men liên tục Thời điểm bắt đầu thực trình lên men liên tục Hình 3.38: Ảnh hưởng tỷ lệ giống cấy đến biến đổi hàm lượng ethanol dịch lên men trình lên men liên tục Hình 3.37: Ảnh hưởng tỷ lệ giống cấy đến biến đổi mật độ tế bào tự bia non trình lên men liên tục Bảng 3.21: Nồng độ sản phẩm bia non (mg/l) sử dụng nấm men cố định mật độ giống cấy thay đổi (dung dịch bia non pha loãng với hàm lượng ethanol 5%v/v) Nồng độ sản phẩm * bia non (mg/l) Diacetyl Acetaldehyde Ethyl acetate 1-Propanol Isoamyl alcohol Mật độ giống cấy 1,0x10 tb/mL b2 0,74 ± 0,02 a2 16,68 ± 0,11 a3 32,62 ± 0,53 a4 13,47 ± 0,30 b5 36,11 ± 1,01 7,0x10 tb/mL a2 1,04 ± 0,00 b2 15,35 a3 29,32 a4 12,45 a5 41,98 ± 0,08 ± 3,18 ± 0,26 ± 0,93 Các ký tự khác thể giá trị hàng có khác biệt có nghĩa mức p=0,05 (*): giá trị trung bình mẫu lấy phân tích q trình lên men liên tục Đối với sản phẩm phụ q trình lên men chính, việc tăng tỷ lệ giống cấy làm giảm hàm lượng cấu tử bia non Tuy nhiên, hàm lượng cấu tử bia non sau pha loãng độ cồn 5% hai 7 nghiệm thức 1,0x10 tb/mL 7,0x10 tb/mL nằm ngưỡng cho phép (bảng 3.21) 3.5 So sánh phương án lên men bia nồng độ cao sử dụng nấm men cố định gel alginate Luận án khảo sát phương án: A, B, C phương pháp lên men chu kỳ; D phương pháp lên men chu kỳ có tái sử dụng nấm men; E phương pháp lên men liên tục o Phương án A: Sử dụng dịch nha 24 Bx từ malt đại mạch; mật độ giống cấy 1,0x10 tb/mL o Phương án B: Sử dụng dịch nha 24 Bx từ malt đại mạch sục khơng khí suốt 12 đầu q trình lên men; mật độ giống cấy 1,0x10 tb/mL o Phương án C: Sử dụng dịch nha 24 Bx (30% liệu syrup maltose) bổ sung Tween 80 (0,3% v/v) ergosterol (18 mg/L); mật độ giống cấy 1,0x10 tb/mL o Phương án D: Sử dụng dịch nha 24 Bx từ malt đại mạch; mật độ giống cấy 1,0x10 tb/mL tái sử dụng nấm men cố định chu kỳ o Phương án E: Sử dụng dịch nha 24 Bx (30% liệu syrup maltose); mật độ giống cấy 1,0x10 tb/mL Chúng nhận thấy phương án C có thời gian lên men rút ngắn, hàm lượng ethanol bia non không khác biệt, đồng thời chi phí cho việc chuẩn bị dịch nha giảm xuống so với phương án A Bên cạnh đó, việc sử dụng phương án D cho hàm lượng ethanol trung bình bia non cao hàm lượng diacetyl trung bình bia non thấp so với phương án E Như vậy, việc kết hợp phương án C (bổ sung Tween 80 ergosterol vào dịch nha có sử dụng 30% syrup maltose) phương án D (tái sử dụng nấm men cố định theo phương pháp chu kỳ) mang lại hiệu cao lên men bia nồng độ cao - 23 - KẾT LUẬN Từ kết thu luận án, rút kết luận sau: A Các kết có ý nghĩa học thuật: Đã xác định quy luật biến đổi loại đường lên men trình lên men bia nồng độ cao: - Các tế bào nấm men tự nấm men cố định gel alginate chuyển hóa hấp thu loại đường dịch nha glucose, fructose, saccharose maltose từ lên men - Sự cố định nấm men gel alginate làm cho tế bào nấm men sử dụng maltotriose từ lên men đầu tiên, nấm men tự bắt đầu sử dụng maltotriose sau lên men thứ 48 Đã xây dựng phương trình cân vật chất cho trình lên men bia nồng độ cao sử dụng nấm men cố định gel alginate nấm men tự do: - Hiệu suất sinh tổng hợp sinh khối tính theo đường lên men nấm men cố định gel alginate cao 92,0% so với nấm men tự - Hiệu suất sinh tổng hợp ethanol nấm men cố định thấp 8,3% so với nấm men tự - Hiệu suất sinh tổng hợp sản phẩm phụ khác bia glycerol, acid hữu rượu cao phân tử nấm men cố định thấp 39,1; 13,7 53,8% so với nấm men tự B Các kết có ý nghĩa ứng dụng thực tiễn: Nấm men cố định gel alginate sinh trưởng & có hoạt tính lên men cao nấm men tự Khi tăng nồng độ chất khô dịch nha từ o o 12 Bx lên 28 Bx thì: - Mật độ tế bào cực đại nấm men cố định cao nấm men tự khoảng 18,8-35,7% tỷ lệ tế bào sống nấm men cố định cao 97% - Tốc độ sử dụng đường khử FAN nấm men cố định cao nấm men tự từ 39,0 đến 85,4% từ 114,2 đến 377,3% - Tốc độ sinh tổng hợp ethanol nấm men tự nấm men cố định khơng có ý nghĩa khác biệt mặt thống kê nồng độ chất khô o dịch nha 12 Bx Khi nồng độ chất khô chất khơ dịch nha tăng o lên 16-28 Bx tốc độ sinh tổng hợp ethanol nấm men cố định cao nấm men tự khoảng 35,9-55,3% - Điều kiện thích hợp cố định nấm men gel alginate để lên men bia nồng độ cao là: mật tế bào gel 5,0x10 tb/mL & nồng độ alginate gel 2,5% w/v Khi nấm men cố định lên men dịch o nha 24 Bx với 30 chu kỳ liên tiếp thời gian 150 ngày với hoạt tính ln cao nấm men tự Trường hợp sử dụng nấm men cố định gel alginate để lên men o dịch nha 24 Bx từ malt đại mạch: - Mật độ giống cấy thích hợp 1,0x10 tb/mL - Thời gian sục khơng khí thích hợp 12 đầu q trình lên men Nồng độ oxy dịch nha giai đoạn sục khí 7,5 ppm Khi đó, thời gian lên men giảm 25% so với mẫu đối chứng sục khơng khí trước cấy giống nấm men; nhiên, nồng độ ethanol bia non bị giảm 4,7% so với mẫu đối chứng o Trường hợp sử dụng nấm men cố định để lên men dịch nha 24 Bx có bổ sung 30% liệu syrup maltose: - Đối với phương pháp lên men chu kỳ: việc bổ sung kết hợp Tween 80 o (0,3% v/v) ergosterol (18 mg/L) vào dịch nha 24 Bx làm thời gian lên men giảm 22,2% so với mẫu đối chứng Hàm lượng ethanol bia hai mẫu khảo sát khơng có ý nghĩa khác biệt mặt thống kê - Đối với phương pháp lên men liên tục, việc gia tăng tỷ lệ giống cấy từ 7 1,0x10 tb/mL lên 7,0x10 tb/mL làm tăng tỷ lệ pha loãng lên 220,0% làm giảm hàm lượng ethanol bia non 30,9% giảm thời gian sử dụng nấm men cố định 45,5% ... nồng độ ethanol dịch lên men 1.4 Ứng dụng nấm men cố định trình lên men bia Việc sử dụng nấm men cố định trình lên men bia nồng độ cao làm thay đổi tính chất sinh lý nấm men cố định; khả sử dụng. .. xác định quy luật biến đổi loại đường lên men trình lên men bia nồng độ cao sử dụng nấm men tự nấm men cố định - Đã xây dựng phương trình cân vật chất cho trình lên men bia nồng độ cao sử dụng nấm. .. theo phương pháp lên men chu kỳ sử dụng nấm men cố định nấm men tự Chu kỳ lên men Thời gian lên men (giờ) Nấm men cố định Nồng độ ethanol (%v/v) Nấm men tự Nấm men cố định Nấm men tự A B C A B