Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Thử nghiệm tạo chế phẩm synbiotic từ chủng Lactobacillus Fermentum bằng phương pháp sấy phun và ứng dụng

Probiotic là những vi sinh vật có lợi cho sức khỏe của con người như hỗ trợviệc tiêu hóa thức ăn được tốt hơn và giam su roi loan trong hệ đường ruột, cải thiện sự dung nạp lactose, cải

NGUYÊN THẢO HẠ VY

THU NGHIEM TAO CHE PHAM SYNBIOTIC TỪCHUNG LACTOBACILLUS FERMENTUM BANG

PHUONG PHAP SAY PHUN VA UNG DUNG

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học

TRUONG ĐẠI HỌC BACH KHOA - ĐHQG - HCM

Công trình được hoàn thành tại:- Phòng BioLab 108B2, Bộ môn Công nghệ Sinh học, Trường Dai học Bách Khoa,

Thành phố Hồ Chí Minh.Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS NGUYEN THUY H ONG

TS NGUYÊN THỊ BÍCH HỎNGCán bộ chấm nhận xét 1:

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá luận văn và Trưởng Khoa quản lý chuyên

ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nêu có).

CHỦ TỊCH HỘI ĐÔNG TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIEM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Nguyễn Thảo Hạ Vy MSHV: 13310323

Ngày, thang, năm sinh: 27/10/1985 Nơi sinh: Bến TreChuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60420201I TEN DE TÀI:

“Thử nghiệm tao chế phẩm synbiotic từ chủng Lactobacilus fermentumbằng phương pháp sấy phun và ứng dụng”

NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

- Khảo sát một số đặc điểm của vi khuẩn Lfermentum: đặc tính sinh hoc,

hoạt tính probiotic.

- Khảo sát ảnh hưởng của prebiotic đến tỉ lệ sống của vi khuẩn probiotic

- Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, lưu lượng trong quá trình sấy phun tạochế phẩm synbiotic

- Vi gói băng phương pháp say phun

- Thử nghiệm tạo sản phẩm kẹo dẻo synbiotic

Il NGÀY GIAO NHIỆM VU: 19/01/2015Ill NGÀY HOÀN THÀNH NHIEM VU: 14/6/2015IV CAN BO HUONG DAN:

PGS.TS NGUYEN THUY H ONGTS NGUYEN THI BICH HONG

Tp HCM,ngay thang năm 2015

CAN BO HUONG DAN CHU NHIEM BO MON DAO TAO

TRUONG KHOA KY THUAT HOA HOC

LỜI CÁM ƠN

Đâu tiên, con xin gửi những lời cảm ơn chân thành nhat đên Ba Mẹ, người đãnuôi dưỡng, chăm sóc và day do con nên người Cam ơn Ba Me và những người thânyêu đã luôn động viên, tao mọi điêu kiện cho con học tập và luôn bên cạnh con trong

suốt thời gian qua

Bên cạnh đó, em xin bay tỏ lòng biết ơn sâu sắc tớiPGS.TS Nguyễn Thúy Hương đã hết lòng hướng dẫn, tận tình giúp đỡ em về chuyênmôn cũng như tinh than Qua những kiến thức cô truyền đạt, những lời góp ý chân tìnhcùng tâm huyết của một người thầy đã giúp em nói riêng, tập thé lớp Cao học khoá

2013 nói chung trưởng thành hơn và có được thành công như ngày hôm nay.

Xin cám ơn sự giúp đỡ của Th§ Nguyễn Thị Mỹ Lệ đã giúp đỡ em tận tìnhtrong thời gian em thực hiện đề tài

Hơn thế nữa, sự thành công của đề tài không thể thiếu sự giúp sức của các Thây

Cô trong Bộ mon Công nghệ sinh học, Khoa Kỹ thuật Hóa học, Truong Dai học Bach

Khoa Tp Hỗ Chí Minh đã tạo điều kiện về trang thiết bị và giờ làm việc phù hợp nhất

cho chúng em Xin cám ơn các em Dũng, Trung — lớp Công nghệ Sinh học khóa 2009,

em Trầm Hương, Thiên Hương - lớp Công nghệ Sinh học khoá 2013 đã nhiệt tình hỗtrợ chị trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành đề tài này

Trân trọng.

TP Hồ Chí Minh, tháng 08 năm 2015

Nguyễn Thảo Hạ Vy

TÓM TATThử nghiệm tạo chế phẩm synbiotic từ chủng Lactobacilus fermentumbằng phương pháp say phun và ứng dụng

Học viên thực hiện : Nguyễn Thảo Hạ VyGiảng viên hướng dẫn : PGS.TS Nguyễn Thúy Hương

TS Nguyễn Thị Bích Hồng

Bao gói vi khuẩn probiotic bằng vật liệu vi gói là whey protein và prebioticđược bồ sung trong quá trình tạo chế phẩm synbiotic nhằm bảo toàn và cải thiện khảnăng song của vi khuẩn probiotic vượt qua điều kiện cực đoan của hệ tiêu hóa(pH thấp của dạ dày, muối mật ở ruột non ) Tạo chế phẩm synbiotic từ chủngL.fermentum bang phương pháp sấy phun và thử nghiệm ứng dụng tạo kẹo dosynbiotic là mục tiêu của dé tài này Với ty lệ bố sung chế phẩm bột synbiotic là 1%vào kẹo d o đã tạo sản phẩm kẹo d o synbiotic có mật độ khoảng 10° (CFU/ g) vakhông làm ảnh hưởng chất lượng cảm quan cua sản phẩm

ABSTRACTText create synbiotic preparation from Lactobacilus fermentum by spraydrying methods and applications.

Student’s name : Nguyen Thao Ha VySupervisor : Associate Professor Dr Nguyen Thuy Huong

Dr Nguyen Thi Bich HongProbiotic microencapsulation by capsulation materials which arewhey protein and prebiotic, is added for process to create synbiotic preparationand improve viability of probiotic barteria when they overcome extremeconditions such as digestive tract (low pH and bile salts) To create synbioticpreparation from L.fermentum strain by spray drying method and applicationtest to create synbiotic marshmallow is goal of this topic With rate addsynbiotic power is | percent to marshmallow created marshmallow production

have density about 10° (CFU/g) and not affective to perceptible quality of

production.

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các sô liệu vàkêt quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa có ai công bô trong bâtkỳ công trình nào khác Mọi trích dân trong luận văn được chỉ rõ nguồn gôc.

Tác giả

Nguyễn Thảo Hạ Vy

MỤC LUC

TOM TT ẮITT << 4 S6 Sé S4 S4 CS SE 4S SE S4 SE eeeeseseseeeesesesee H

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU <-55-5° 5< << s2 SE E3ESESEESESESESSE SE 5s s08E 1

1.1 DAT VẤN ĐỀ 20 cccccccssccccsccccccccccsccccscccccscccceccaescccsnccceseccasccuesecensceceaeseeunscascess 11.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CUU cccscccccccccccccccccccccceccccscscccetceccccusececuescecuacseseeaueeecs 21.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - - - CS 3080306008003 80 3011385110381 1 11985111 s2 3

CHƯƠNG 2 TỎNG QUAIN 2-5 5-5 4 4 30933 3 8289899556540 4

2.1 PROBIOTICC - - -GG c G0 0090009 00090000 00 00300 00 nu nu nh nu uy sa 42.1.1 Lich SỬ - c1 1111111 2303311111119 11K kg 9k rrt 42.1.2 Khai NEM 06i9ii 2 52.1.3 Vai trO ccccccccccccsseccccccccccccccccccuscceecccccecaceecccscuauscesceccuuacceeececcuaaccesceceuuececeeens 52.2 PREBIOTIC VA SYNBIOTIC cccccccssseccccceccccccecsccccceccccccsececccueeecccuucccceaccececauececs 82.3 VIKHUAN LACTOBACILLUS FERMENTUM SG GGG G1103 1111 11v 1s vs 11

2.3.1 DAC GIGI 0 11

2.3.2 Vai UO cccccccccccccsccesccccccccccecccccccuccseccecccauccecccccuuacceecccccuuceescesesaucceesceceuuenscs 112 A VI GÓI PROBIOTICC CC E00 938880 8083888080051 1810 9 51 1k 91 1k se 12"5/80 n.ố vẻ Ả 132.4.2 Các phương pháp VI QO - - < c HH ng, 142.4.2.1 Phương pháp nhũ hóa - ng kh reg 142.4.2.2 Phương pháp nhỏ BIỌ( - - . - 5c 000g re 16

2.4.2.3 Phương pháp say phun (spray — drying) c.cccceeessesseseseeeseeeeeeeen 172.4.3 Ưu nhược điểm của các phương pháp Vi gói - 5 2 55s5s+s+cscee: 19

2.5 KEO SYNBIOTIC ccccsccsccescescescesccsccsccsccsccsccsccsscsscescscescescescescescessessessenseuses 212.6 CÁC NGHIÊN CUU TRONG VÀ NGOÀI NUOC cc ceseeecccccccctscecccccescecccccceeceeceees 222.6.1 Nghiên cứu trong ƯỚC - - << 0 222.6.2 Nghiên cứu ngoài NƯỚC - - G5 0000 nà 23

CHƯƠNG 3 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP 5-5- 5 5s 5s scsssses 26

3.1 DIA DIEM VA THỜI GIAN THỰC HIEN DE TÀI E - c2 11131 sss 263.2 THIẾT BỊ VA DỰNG CỤU - - - cc c0 0000001000060 80 8035811100351 1 10 11 89111 1 11x sss 26

3.3 NGUYEN VAT LIEU, HÓA CHAT VA MOI TRUONG -ccccccccceeeeeees 263.3.1 Nguyên vật LEU Ăn nọ re 26

3.3.2 Hóa chất, môi tTường ¿+ + SE +E+E£ES E1 1 1115151121211 7112 21x cxe 273.3.2.1 Hóa chất -. - c1 22 1 3 1115111111 1111511 111101151111 11 0170101011110 Hye 27

3.3.2.2 Môi trường :- -ks S113 1115111 111111111101 0111011111111 11 11T 273.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CUU - ¿+ + 2111111313223 1 8E E251 Eeerrzs 28

3.4.1 Sơ đỗ nghiên cứu tong quát ¿- - + 2+ 2 £+E+E£££+E+E£E+EeErerrererered 283.4.2 Phương pháp bồ trí thí nghiệm - - 2 2 2£ £E+E£E+E+Ez£Ezxzereeree 293.4.2.1 Khảo sát một số đặc tính sinh học của vi khuan L.fermentum 293.4.2.2 Khảo sát một số đặc điểm và hoạt tính probiotic cua vi khuẩn

In 2n nnn:cctttiididđiđdidididddd 29

3.4.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của các loại prebiotic FOS, GOS, Inulin đến tỉ lệsống của L.fermentum trong điều kiện lên men +5- 55c+c+czcscs¿ 3l3.4.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của lưu lượng dòng vào, nhiệt độ say phun đến tỉlệ sống của vi khuẩn prObiOfiC ¿-¿- + 2252 S22 SE2E#EEE2EEEErkrrkrerrrrees 323.4.2.5 Vi gói chế phẩm synbiotic bang phương pháp say phun 333.4.2.6 Khảo sát một số đặc điểm và hoạt tính L.fermentum sau khi vi góibăng phương pháp sấy phun - ¿5-2-5252 SE 2EE+E£EEEE£E£E£EEEEEEEErErErEerrrered 34

3.4.2.7 Thử nghiệm Ung dụng ng re 353.5 CÁC PHƯƠNG PHAP PHAN TICH - 2 + 11% 91 91 E1 9v 931 9v nh vn 37BSL VI SUD oo elles 37

¬ 37

3.5.1.2 Phương pháp xác định số lượng vi khuẩn ee +52 5s 55552 37

3.5.1.3 Phương pháp xác định đường cong tăng trưởng của vi sinh vat 38

3.5.1.4 Phương pháp kiểm tra khả năng sống của probiotic trong môi trường

3.5.1.5 Phương pháp kiểm tra khả năng sống của probiotic trong môi trườngMUL MAL O3% 7 383.5.1.6 Phương pháp tính hiệu suất vi gói wee csceeescscscseeseseseeeeeeeee 39

3.5.2 Xác định giá tri pHH Ăn re 39

3.5.3 Phương pháp đánh g1á cảm Quan - - << 5 11111 1 11 rec 39

3.5.4 Phương pháp thống kê và xử lý số liệu + ¿2 5+s+s+c+czcezsccee 39

CHUONG 4 KET QUÁ VA BAN LUẬN 2 5-5 5s 2 scsssssesseses 40

4.1 KHẢO SÁT MOT SO ĐẶC TÍNH SINH HOC CUA VI KHUÂN L.FERMENTUM 40

4.1.1 Quan sát hình thái đại thé và vi thỂ se xxx SE EeEseserees 40

4.1.2 Khảo sát đường cong sinh trưởng của L.ferMentum «<<- 404.2 KHẢO SÁT MOT SO ĐẶC DIEM VÀ HOAT TÍNH PROBIOTIC CUA VI KHUANL FERMENTUM 008088 e 42

4.2.1 Khảo sát khả năng thích ứng pH thấp của L.fermentum - 424.2.2 Khảo sát khả năng chịu muối mật của L ÍCTIHCHÍHH QQQ Q4 434.2.3 Khảo sát khả năng kháng khuẩn của L ƒ@rmenfUn -5- 5-5-5555: 4

4.3 KHẢO SÁT ANH HUONG CUA CÁC LOẠI PREBIOTIC FOS, GOS, INULIN DEN TiLE SONG CUA L.FERMENTUM TRONG DIEU KIEN LEN MEN -<<<<5- 464.4 KHẢO SAT ANH HUONG CUA LƯU LUGNG DONG VÀO, NHIỆT DO SAY PHUN DENTI LỆ SONG CUA VI KHUAN PROBIOTIC (<< +11 1333333325553 sse 47

4.4.1 Khảo sát ảnh hưởng của lưu lượng dòng vào của dịch huyền phù đến tỉ lệsống của vi khuẩn L,ƒ€FII€HfHIN + 5 S552 S£SE‡EEE‡EEEEEEEEEEEEEekrerrrerered 474.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ sấy phun đến tỉ lệ sống của vi khuẩn

LL,ÍCTHHICHIẨHHHN SG G G0000 3000 0 vn 484.5 VI GÓI CHE PHAM SYNBIOTIC BẰNG PHƯƠNG PHAP SAY PHUN - 50

4.5.1 Khảo sát đặc điểm cau trúc hạt vi gói, hiệu suất vi gói - 504.5.2 Khảo sát một số đặc điểm và hoạt tính L.fermentum sau khi vi gói bangphương pháp sấy phun ¿2 6E SE SE 2E E9 9E E1 1511511111111 711113111 e 52

4.6 THU NGHIỆM UNG DUNG - 2111111112233 1 1111119993151 1k ng ke 55

4.6.1 Khảo sát mật độ sông của tế bao vi khuẩn L.fermentum trong thời gianbảo quản sản phẩm kẹo d 0 synbiOfÍC - 5: 55525222 ‡EvEErkerersrrerered 554.6.2 Đánh giá cảm quan sản phẩm kẹo d 0 synbiotiC -s55- 56

CHƯƠNG 5 KET LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ 5-5 5s 2 se sscsseses 58

5.2 KIÊN NGHỊ, - -.- 5 TH HH 58

vi

TÀI LIEU THAM KHẢO << < 5° < 5£ se se se se sesssesessesers 59

PHU ILỤC 2° EEE# E29 SE EEEdeEEAdeEEeEEE2ee2E24222eee 67

vii

Bang 2.1.Bang 3.1.Bang 4.1.Bang 4.2.Bang 4.3.Bang 4.4.Bang 4.5.Bang 4.6.Bang 4.7.

DANH MUC BANGƯu và nhược điểm 3 phương pháp Vi gói - 5-5-5 s+s+csczcszsccee 21

Mỗi trường sử dụng trong nghiÊn CỨU - «<< s11 + se 27

Khả năng kháng khuẩn của L.fermentum dạng tự do - 45Ảnh hưởng của prebiotic đến mật độ L.ƒermmenun - - - 55: 46

Tương quan giữa lưu lượng dịch phun và các chỉ tiêu thí nghiệm 47

Tương quan giữa nhiệt độ say phun và các chỉ tiêu thí nghiệm 48Hiệu suất vi gói của chế Pham c.cecccccccsscscssssessssssesscsesessesssessesssesseseseeseees 52Khả năng kháng khuẩn của L.fermentum dang Vi gói - 34Kết quả đánh giá cảm quan phép thử tam giác - 25s +: 56

vill

DANH MỤC HÌNHHình 2.1 Cau tạo hạt bao vi gÓi - + 252212 1 E2 1 121 1511111111111 1111 cxe 13Hình 2.2 Sơ đồ trình bay các bước nhũ hóa ¿ - 52 2 252+E+£+£z£zzszxceee l6Hình 2.3 Các bước tạo vi bao gói tế bào bằng phương pháp nhỏ giọt 17Hình 2.4 Sơ đồ vi bao gói bang phương pháp sấy phun . -5- 5+: 18Hình 2.5 Một số sản phẩm kẹo probiotic trên thị trường - - + 55s: 22Hình 3.1 Sơ d6 nghiên cứu tong quát ¿+ 525222522 £E£EvEEckerxrkrerreee 28Hình 3.2 Sơ đô bó trí thí nghiệm tạo chế phẩm vi gói 2-5-5 + 2552: 34Hình 3.3 Sơ dé tạo kẹo d o 41010 36Hình 4.1 Hình dang dai thé (a) và vi thé (b) của vi khuẩn L.fermentum 40Hình 4.2 Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn LferMmentum -. 5-5-: 41Hình 4.3 Kha năng sống sót của L.fermentum trong môi trường pH khác nhau theo

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

CFU Colony Forming UnitFAO Food and Agriculture OrganizationWHO World Health Organization

MRS deMan, Rogosa and SharpeSEM Scanning Electron MicroscopeGOS Galactooligosaccharide

FOS Fructooligosaccharide

Probiotic là những vi sinh vật có lợi cho sức khỏe của con người như hỗ trợ

việc tiêu hóa thức ăn được tốt hơn và giam su roi loan trong hệ đường ruột, cải thiện

sự dung nạp lactose, cải thiện chức năng miễn dịch, ngăn chặn các chứng viêm

nhiễm, giảm cholesterol, ức chế các vi khuẩn gây hại trong ruột Thuật ngữprobiotic được Parker đề nghị sử dụng lần đầu tiên vào năm 1974 dé chi những visinh vật sống hữu ích nhằm cải thiện sự cân bang hệ vi sinh vật đường ruột theohướng có lợi cho vật chủ (Fuller, 1989) Có nhiều báo cáo cho thấy, những sảnphẩm có chứa vi khuẩn probiotic dạng tự do sau khi qua hệ tiêu hóa thì mật độ cuavi khuẩn probiotic còn rất thấp khả năng tôn tại và hoạt tính probiotic của chúng lạicó xu hướng giảm mạnh [32] Day là những hạn chế của các sản phẩm có bố sung

probiotic dạng tự do khi qua hệ tiêu hóa.

Đề phát huy được các công dụng hữu ích của những vi sinh vật sống có hoạttính probiotic, các vi sinh vật phải hiện diện với SỐ lượng sống thích hợp từ khi sảnxuất cho đến khi tới tay người tiêu dùng và duy trì khả năng tổn tại cao trong suốtquá trình tiêu hóa của người Phương pháp vi gói để bảo vệ tế bào vi khuẩn đã cókết quả lớn về tăng cường khả năng sống của những vi sinh vật trong sản phẩm thựcphẩm cũng như trong hệ tiêu hóa Vi gói được sử dụng rộng rãi hiện nay giúp tế bảovi sinh vật cách ly với môi trường xung quanh, làm giảm sự tốn thương cũng như sựton thất số lượng tế bào, tế bào sẽ được bảo vệ tốt hơn trong các môi trường cựcđoan như pH thấp, muối mật, sốc nhiệt, và nâng cao hoạt tính probiotic Ngoài ra,vị gói còn cải thiện khả năng ton tại của probiotic giúp ôn định, tăng gia tri vé matcảm quan cho sản phẩm Nhằm tăng khả năng tôn tại của vi khuẩn probiotic trong

điêu kiện cực đoan, su kêt hợp probiotic với prebiotic cải thiện sự sông sót của

chung loi khuẩn khi qua hệ dạ dày và ruột non, gia tăng hiệu quả của chủngprobiotic trong ruột già Hơn nữa, prebiotic còn giúp chủng probiotic sống lâu hơntrong hệ tiêu hóa để hiệu quả có lợi được tối ưu hơn.

Prebiotic là các thành phần thực phẩm không tiêu hoá được chủ yếu làoligosaccharide, có tác dụng kích thích sự phat triển và hoạt động một số loài vikhuẩn có lợi cho sức kho đồng thời ức chế một số loài vi khuẩn khác trong ruột kết(ruột già) góp phần tăng cường sức kho cải thiện hệ tiêu hóa cho vật chủ Cácoligosaccharide này không được thủy phân trong ruột non nên còn được gọi là chấtxo trong khẩu phần ăn |49]

Các sản phẩm probiotic được sử dụng như chất hoạt hoá tăng cường nhờ cókhả năng đồng hoá lactose, kháng khối u và làm giảm cholesterol Những yêu cầuđặt ra đối với chủng probiotic dùng cho sản xuất thực phẩm chức năng như: nhữngvi sinh vật phải ton tai trong diéu kién cuc doan trong ruột non, hỗ trợ các chứcnăng về tiêu hóa và miễn dịch và chúng phải được chứng minh là an toàn khi sử

dụng.

Lactobacillus fermentum là vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn probiotic,L.fermentum có khả năng chịu axit, khả năng chịu nhiệt cao hơn các vi khuẩn lactickhác [51] Các hoạt chất bacteriocin và các chất khác tương tự bacteriocin đượcsinh ra từ chủng L.fermentum có vai trò như một kháng sinh nhằm làm giảm nguycơ nhiễm tr ng đường ruột [48] Nhóm nghiên cứu của Nguyễn Thị Mỹ Lệ và cộngsự (2014) đã tiến hành nghiên cứu đặc tính probiotic của Lactobacilus phân lập từcác loại thực phẩm lên men truyền thống ở Việt Nam đã sàng lọc 48 chủnglactobacilli Trong cac thu nghiệm kháng khuẩn chủngLactobacillus fermentum 39-183 có kha năng kháng khuẩn mạnh [55]

Để bảo toàn, cải thiện khả năng sống và đa dạng hóa các dòng sản phẩmprobiotic, chúng tôi thực hiện dé tài “Thử nghiệm tạo chế phẩm synbiotic từchủng Lactobacilus fermentum bang phương pháp sấy phun và ứng dụng”

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Tạo chế phẩm synbiotic từ chủng L.fermentum bang phương pháp say phun

và thử nghiệm ứng dung tạo kẹo d o synbiotic.

1.3 Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát một số đặc điểm của vi khuẩn 7, fermentum: đặc tính sinh học,

hoạt tính probiotic.

- Khảo sát ảnh hưởng của prebiotic đến tỉ lệ sống của vi khuẩn probiotic.- Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, lưu lượng trong quá trình sấy phun tạochế phẩm synbiotic

- Vi gói băng phương pháp say phun.- Thử nghiệm tao sản phẩm kẹo d o synbiotic

CHƯƠNG 2

TỎNG QUAN

2.1 Probiotic2.1.1 Lịch sử

Một sự giải thích khoa học cho ảnh hưởng có lợi của các vi khuẩn lactic cótrong sữa lên men được cung cấp lần đầu tiên vào năm 1907 bởi người đoạt GiảiNobel, nhà sinh lý học người Nga, Eli Metchnikoff Trong bài thảo luận xuất sắccủa ông "Việc kéo dài cuộc sống", Metchnikoff đã tuyên bố rằng sự phụ thuộc củahệ vi sinh vật trong ruột đối với thực phẩm làm cho nó có khả năng chấp nhận biệnpháp thay đổi hệ vi sinh vật trong người của chúng ta, tức là thay thé vi sinh vật cóhại bởi vi sinh vật hữu ích (Metchnikoff, 1907) Cũng vào thời điểm đó,

Henry Tissier, một bác sĩ khoa nhi người Pháp, đã quan sat trong phân những đứa

tr bị tiêu chảy có một số lượng ít vi khuẩn lạ, hình Y, là những vi khuẩn “bifid”ngược lại chiếm số lượng lớn trong những đứa tr khỏe mạnh Ông cho rằng nhữngvi khuẩn này có khả năng chống lại bệnh tiêu chảy giúp khôi phục hệ thống vi sinh

vật đường ruột khỏe mạnh.

Năm 1965 thuật ngữ “probiotic” đã được sử dụng dau tiên bởi Lily vaStillwell để mô tả “những cơ chất” được tiết ra bởi một vi sinh vật kích thích sựphát triển của những vi sinh vật khác

Năm 1975, Parker cho rằng probiotic là những vi sinh vật và những cơ chấtmà giúp cân bang hệ vi khuân đường ruột

Năm 1989, Fuller cho rang probiotic là những chất bố sung thực phẩm chứavi khuẩn sống ảnh hưởng có lợi cho sức kho nhờ cải thiện sự cân băng hệ vi khuẩn

đường ruột.

Nghiên cứu về việc sử dụng vi khuẩn lactic trong chế độ ăn uống đã đượctiếp tục suốt cả thế kỷ vừa qua Trong khi công việc ở giai đoạn trước của thế kỷ làdé cap dén viéc str dung sữa lên men dé diéu tri bénh lay nhiém đường ruột, cácnghiên cứu gần đây đã tập trung vào lợi ích sức khỏe khác của các vi sinh vật này

cũng như về việc bảo đảm sự sông sót của các vi khuân này khi ở trong vùng dạ

dày-ruột và các loại thực phẩm để vận chuyển chúng vào trong cơ thé

con người [11].

Theo tổ chức Y tế thế giới (WHO, 2001), probiotic là “các vi sinh vật songkhi đưa vào cơ thể theo đường tiêu hoá với một SỐ lượng đủ sẽ đem lại sức kho tốt

cho vật chủ”.2.1.2 Khái niệm Probiotic

Có thé định nghĩa probiotic như sau: “Probiotic là một hay hỗn hợp nhiều vikhuẩn mà khi cung cấp cho người hay động vật thi mang lại những hiệu quả có lợicho vật chủ bằng cách tăng cường các đặc tính của vi sinh vật trong hệ tiêu hóa”

Đặc điểm cơ ban probiotic: probiotic là những vi sinh vật sống Khi cácprobiotic được cung cấp với liều lượng thích hợp thì mang lại những hiệu quả mongmuốn Vi khuẩn ở dạng probiotic có hoạt tính sinh học cao, an toàn, là nguồn visinh vật hữu ích, duy trì trạng thái cân băng của khu hệ vi sinh vật đường ruột,chúng tạo thành khu hệ vi sinh vật, cản trở sự phát triển của một số vi sinh vật gâybệnh, cung cấp cho cơ thể một số chất có lợi, ảnh hưởng tốt đến hệ miễn dịch

2.1.3 Vai trò

4 Thuy phân lactose và tăng sự hấp thu lactoseTrong suốt quá trình lên men vi khuẩn lactic sinh lactase để thủy phânlactose thành glucose và galactose Vi khuẩn đường ruột giúp chuyến hóa hau hếtlượng đường lactose trong ruột non [42] Dé cải thiện van đề kém tiêu hóa và khôngdung nạp lactose người ta chứng minh được răng nên tiêu thụ sản phẩm probiotic,những vi khuẩn này có hoạt tính của -galactosidase được tiết ra ngoài giúp thủy

phân lactose ở ruột non Trong nghiên cứu cua Lin (1991), chỉ có một chủng thuộc

L.acidophillus có hoạt tính B-galactosidase nhưng khả năng kháng lại muối mật củachúng rất thấp và đạt được hiệu qua trong cải thiện tiêu hóa lactose khi su dụng ởnồng độ cao (10° CFU/ml sữa) Bifidobacterium thường không hoặc ít có hiệu quả

sử dụng hơn so với Lactobacillus.

4 Tang cường hệ thong miễn dịchMiễn dịch là trạng thái bảo vệ đặc biệt của cơ thé song chéng lai cac yếu tốgây bệnh khi chúng xâm nhập vào cơ thé Khang thé là các globulin trong máu củađộng vật, có khả năng liên kết đặc hiệu với kháng nguyên đã kích thích sinh ra nó,

hay còn gọi là kháng thể miễn dịch hoặc kháng thể đặc hiệu Kháng thể chủ yếuđược tim thấy trong huyết thanh IgA được tổng hợp chủ yếu nhờ tế bào B trongniêm mạc ruột, đường hô hấp và thực hiện chức năng chống vi khuẩn trên bề mặt

niêm mạc ruột.

Các vi khuẩn làm tăng hệ miễn dịch bang cách:- Tăng cường chức năng chống virus của hệ miễn dịch.- Tăng hoạt động của tế bào NK (natual killer) nhằm diệt trực tiếp tế bàonhiễm khuẩn bang cách tiết những chất độc dé phân giải chúng hoặc bang cách tiết

IFN — gamma (một loại cytokine).

- Tăng S-IgA, sinh cytokine, điều khiến đáp ứng miễn dịch tế bào.- Sinh nitric oxit, có vai trò quan trọng trong việc dẫn truyền thông tin ở hệthân kinh và đặc biệt có tác dụng làm thư giãn

- Tăng khả năng đề kháng chống lại một số quá trình tự miễn

- Giảm đáp ứng trung gian IgE (IgE-mediated respones).

- Gián tiếp chống lại hiện tượng radiation-included depression in white bloodcells: đây là hiện tượng các tế bao bạch cầu bị ức chế và tiêu diệt khi chiếu xạ Hiệntượng này thường xảy ra trong khi điều trị ung thư băng chiếu xạ [38]

% Giảm hàm lượng cholesterol

Các chủng vi khuẩn probiotic, đặc biệt là vi khuẩn sinh axit lactic có một vaitrò quan trọng trong việc giảm mức cholesterol gián tiếp bởi sự chuyển hóacholesterol để tạo ra axit mật Do đó, làm giảm hàm lượng cholesterol tổng số củacơ thé Sữa chua có chứa hai loại vi khuẩn probiotic là Lactobacillus acidophilus và

Bifidobacterium lactis có tac dụng làm giảm cholesterol trong mau có mức

cholesterol cao Các bệnh nhân d ng thuốc c ng với Lactobacillus sporogenesovermột khoảng thời gian 3 tháng cho thấy giảm 32% trong tổng số cholesterol [38]

% Giảm viêm loét dạ day

Helicobacter pylori là một vi khuan Gram (-) gây bệnh viêm loét và ung thuda day, Helicobacter pylori có thê tồn tại ở niêm mạc dạ day (FAO/WHO, 2001).Nghiêm cứu in vitro cho thấy vi khuẩn sinh axit lactic có thé chống lại sự phát triểncủa Helicobacter pylori (Midolo va cộng su, 1995) Sữa chua uống của Yakult đã

sinh ra chất ức chế chống sự tăng trưởng của vi khuẩn gây loét dạ day

Helicobacter pylori [3S].

% Ngăn ngừa ung thư

Các chủng vi khuẩn probiotic có kha năng kết hợp, ngăn chặn hoặc làm mathoạt tính của các yếu tố gây ung thư; kích thích hệ thống miễn dịch, ngăn chặn sựtạo thành khối u; làm giảm hoạt tính của các enzym ở phân, đây là nơi khơi nguồncủa các mâm bệnh gây ung thư

Một số chủng của vi khuẩn lactic (L.bulgaricus, S.thermophilus hayL.acidophilus và Bifidobacteria) sử dung trong các sản phẩm sữa lên men có théxem như là một chất chống ung thư và chống gây đột biến Các vi khuẩn có lợi cóthé giảm các enzym liên quan đến các tác nhân gây ung thư (B-gulucoronidase,

azoreductase, nitrosuctase và B-glucosidase) và do đó làm giảm nguy cơ gây ung

thư ruột kết Bifidobacteria ngăn chặn các yếu tố tiền ung thư như nitrat vanitrosamin thông qua cơ chế nội bao và non-enzymeatic Chúng cũng có thé kết hợpvới các heterocylic amin (các chất gây ung thư trong quá trình nau thịt) sau đó đượcbài tiết theo phân [38]

+ Chống viêm nhiễm hệ thông niệu sinh dụcViệc viêm nhiễm đường sinh dục là sự mất cân bang hệ vi sinh vật đườngruột, do sử dụng thuốc kháng sinh, các chất khử tr ng, hormone va các yếu tô khác.Các vi khuẩn probiotic hiệu quả trong quá trình giành chỗ cư trú va ngăn chặn sựphát triển của các vi sinh vật gây bệnh Một số chủng thuộc Lactobacillus có khảnăng ngăn chặn sự phát triển và bám chặt của nam Candida albican và các chủngCandida khác Việc sử dụng Lactobacillus giảm nguy cơ nhiễm nắm trở lại, giảmnắm âm đạo Ngoài ra một số chung Lactobacillus GR-1 và RC-14 ngăn chặn sựnhiễm đường tiết niệu do Escheriachia coli gây ra (FAO va WHO, 2001) [38]

Hiện nay, các chủng vi khuẩn được sử dụng với vai trò là các probiotic chủyếu thuộc Lactobacillus và Bifidobacterum, ngoài ra Enterococcus và Streptococus

cũng được sử dụng nhưng it hon Lactobacillus có mặt trong ruột và trong 4m đạo

là vi khuẩn kị khí tùy ý Gram (+), không tạo bào tử Hiện nay có khoảng 56 loàiLactobacillus được phân lập Lactobacillus được sử dụng như probiotic bao gồm

Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus bulgaricus,

Lactobacillus casei, Lactobacillus celloBblosus Lactobacillus CFISDdFMS,Lactobacillus curvatus, Lactobacillus fermentum [2].

Bifidobacterium tồn tại ở phân của tr ngay từ những ngày dau sau sinh, đặcbiệt là tr được bú me Bifidobacterium lần đầu tiên được phân lập từ phân của trđược bú mẹ, số lượng các vi khuẩn nảy là tương đối 6n định và giảm đi khi lớn tudi.Quân thé vi khuẩn Bifidobacterium chịu ảnh hưởng của các yếu tố như khẩu phanăn, thuốc kháng sinh và sự căng thang Bifidobacterium là vi khuân ki khí Gram (+),không chuyển động, không tạo bào tử, catalase-âm tính, hình dạng của chúng khácnhau Chúng cũng được phân loại là vi khuẩn tạo axit lactic Hiện nay có khoảng 30

loài Bifidobacterium được phan lập Bifidobacterium được sử dụng như probiotic là:Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium animalis,Bifidobacterium thermophilum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum

Bên cạnh những vi khuẩn còn có nấm men Saccharomyces boulardii cũng được

xem là probiotic.

2.2 Prebiotic và Synbiotic

Prebiotic được Gibson GR, Roberfroid MB định nghĩa lần đầu tiên vàonăm 1995 Ké từ đó, prebiotic đã thu hút sự chú ý của giới khoa học cũng như như

các nhà công nghệ Định nghĩa của prebiotic được Gibson và Roberfroid đưa ra khá

giống định nghĩa chất xơ trong thực phẩm, chỉ có sự khác biệt là prebiotic có khanăng kích thích sự phát triển của một số vi khuẩn có lợi cho sức kho [33] Đếnnăm 2007, Gibson và Roberfroid khang định rang không phải bất cứ loạicarbonhydrate nào cũng có thé xếp vào nhóm prebiotic mà chúng cần thoả mãn cácyêu cau sau:

- Chống chịu được môi trường axit của dạ dày, không bị phân giải bởi enzymđộng vật và không bị hấp thu ở ruột

- Có khả năng lên men bởi các vi khuẩn đường ruội.- Kích thích có chọn lọc sự phát triển và/hoặc hoạt tính của các vi khuẩn có

lợi cho sức kho.

Các prebiotic thường được sử dụng là FOS, GOS va Inulin.Một sô đặc điêm chính của prebiotic:

- Kháng tiêu hóa (hoặc chỉ một phan bi tiêu hóa).- Không bị hấp thu ở ruột non.

- Không lên men bởi các vi khuẩn trong miệng.- Có khả năng lên men tốt bởi vi khuẩn có lợi trong ruột.- Lên men kém hoặc không lên men bởi vi khuẩn có hại trong ruột.FOS (Fructo - oligosaccharid): là một prebiotie có nguồn gốc từ thực vật.FOS tôn tại trong nhiều loại thực phẩm như măng tây, chuối, yến mach, tỏi, atisO vàrau diép xoăn nhưng hàm lượng lại khá thấp Cau trúc hóa hoc của FOS bao gồmglucose và fructose liên kết với nhau

T y vào độ dài của mạch liên kết này mà FOS chia thành hai loại:- FOS có cau trúc mạch dài gọi là Inulin

- FOS có cau trúc mạch ngăn gọi là oligofructose.FOS có khả năng chống chịu và không bị tiêu hóa trong dạ dày do đó có khảnăng kích thích sự phát triển của chủng Bifidobacteria va Lactobacilli ở ruột già.FOS làm tăng hấp thụ Canxi và Magie đồng thời làm giảm triglycerid

GOS (Galacto- oligosaccharid): là một prebiotic có nguồn gốc từ động vật.GOS được chiết xuất từ lactose có trong sữa bò, dé Cau trúc hóa học của GOSgồm galactose va lactose liên kết với nhau GOS được sử dụng rộng rãi vì có khảnăng kích thích hoạt động của các vi khuẩn có lợi trong hệ tiêu hóa, kích thích việcsản xuất các axit béo mạch ngăn, làm tăng khả năng hấp thu Canxi và Magie [33]

Inulin được chiết tách từ thực vật thuộc họ Composithae như rau diép xoan.Inulin có nguồn gốc tự nhiên là những inulin không phân nhánh thường được táchchiết từ rễ Loại Inulin nay có đơn phân là glucose, fructose, sucrose Mức độpolymer hoá (DP) của inulin từ rau diép xoăn từ 2 đến 60 với giá trị polymer hoátrung bình (DP,,) là 12 Sở di có chỉ số polymer hoá trung bình vì inulin có nguồngốc thực vật thường là một hỗn hợp có mức độ polymer hoá khác nhau Chỉ có10% Inulin từ rau diép xoăn có chỉ số DP từ 2(F;¿) đến 5(GF;) [34]

Ngoài ra, còn có một số prebiotic khác như Lactulose, Xyloligosaccharide,

Lactosucrose.

Prebiotic là những thành phan thực phẩm không tiêu hóa được, nhưng có thể

được lên men bởi hệ vi sinh vật đường ruột, mang lại nhiều tác động có lợi trên cơ

thể vật chủ [15] Prebiotie đóng vai trò là nguồn dinh dưỡng giúp cho probiotic sửdụng nguồn chất xơ prebiotic, bằng cách b6 sung dinh dưỡng cho vi khuẩn có lợi sẽgiúp lợi khuẩn phát triển ưu thế, và ức chế vi sinh vật gây hại.

Những vi khuẩn có lợi là nguồn thức ăn cho vi khuẩn probiotic, giúp duy trìcân băng môi trường vi sinh vật trong đường ruột và cải thiện khả năng tiêu hóa củađường ruột, giúp cải thiện khả năng hấp thu dinh dưỡng của con người Prebioticđược kết hợp với probiotic nhằm tăng kha năng ton tại vi khuẩn probiotic trong điềukiện cực đoan Sự kết hợp probiotic với prebiotic cải thiện sự sống sót của chủng vikhuẩn có lợi khi qua hệ dạ dày và ruột non, vì vậy gia tăng hiệu quả của chủngprobiotic trong ruột già Ngoài ra, prebiotic còn giúp chủng probiotic sống lâu honvà tăng khả năng bám dính, hình thành hàng rào sinh học trong hệ tiêu hóa để hiệuquả có lợi được tối ưu hơn Các nghiên cứu chỉ ra rằng, sự kết hợp probiotic vớiprebiotic (được gọi là synbiotic) làm tăng tác dụng có ích của probiotic đối với cơthé [43]

Synbiotic là sự kết hop probiotic va prebiotic [35] Synbiotic là sự kích thíchcác hoạt động của vi khuan gốc Lactobacilli va Bifido bang cách sử dụng một lượngcarbonhydrat cho sẵn kết hợp với một hay vài chủng probiotic Trong đó, probioticchính là những vi khuẩn tốt, có vai trò tăng cường hệ miễn dịch của cơ thể, giúp cơthé nâng cao khả năng phòng chống bệnh tật Prebiotic là thức ăn lý tưởng cho cácvi khuẩn probiotic và giúp các vi sinh vat phát triển tốt hơn trong điều kiện cực

đoan.

Các nhà khoa học đã tìm thay tác dụng của synbiotic mang lại cho con ngườinhiều tác động tích cực hon so với khi sử dụng từng chất riêng 1 như khả năngchồng vi khuẩn gây hại, khả năng chống tiêu chảy, điều hòa hệ miễn dịch, chống lạicác chất sinh ung thư, chống dị ứng, giảm mỡ trong máu, giảm hàm lượng

cholesterol, giảm hàm lượng đường trong máu, ngăn ngừa loãng xương Theo

nghiên cứu cua Rowland và cộng sự (1998) về sự ảnh hưởng của synbiotic đến hoạtđộng enzym và trao đôi chất của các vi khuẩn trong phân chuột khi cho chúng ănB.longum, inulin hoặc ca hai Kết quả cho thấy, việc sử dụng riêng B.longum làm

giảm 30% hoạt động beta-glucuronidase, nhưng khi sử dụng cả hai tac nhân là

B.longum và Inulin thì giảm được đến 55% [65]

10

2.3 Vi khuẩn Lactobacillus fermentum2.3.1 Đặc điểm

L.fermentum là một vi khuan Gram dương ki khí, không có khả năng di động

và không sinh bào tử, có dạng hình que.1 Gidi (regnum) Bacteria 5.Họ (familia) Lactobacillaceae2.Nganh (phylum) Firmicutes 6.Chi (genus) Lactobacillus3.Lớp (class) Bacilli 7.Loai (species) Lactobacillus fermentum4.Bộ (ordo) Lactobacillales

L.fermentum được phân lập từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau như sanphẩm lên men từ nguồn nguyên liệu động vật hay thực vật, các loại kháng sinh cónguôn gốc tự nhiên [5]

Hầu hết các chủng L.fermentum có thê lên men galactose, glucose, fructose,

mannose, mannitol L.fermentum khu trú trong đường ruột, có kha nang chịu được

axit và muối mật, kháng lại các vi sinh vật gây bệnh [47]

2.3.2 Vai trò

Các vi sinh vật có trong đường tiêu hóa là một hỗn hợp rất phức tạp bao gồmnhiều loại: vi khuẩn, sinh vật nguyên sinh, nam, vi khuẩn ki khí, và có cả vi rút Nócó một số chức năng như phân hủy các chất dinh dưỡng, kích thích sự trưởng thànhcủa các té bao đường ruột, kích thích hệ miễn dịch, làm giảm lipit máu va ức chếcác loại vi khuẩn có hại Số lượng vi khuẩn trong cơ thể con người là rất lớn Mốitương quan giữa cơ thé và số lượng vi khuẩn có liên quan đến sức khỏe và bệnh tật

cua con nguoi.

L.fermentum có khả năng chịu axit, khả năng chịu nhiệt cao hơn các vi khuẩnaxit lactic khác Nó cải thiện quá trình trao đối lipit trong huyết thanh và kha năngmiễn dịch bằng việc giảm nồng độ cholesterol toàn phần, giảm xơ cứng động mạch,tăng khả năng chống oxy hóa đồng thời cải thiện chức năng đường ruột [47]

Tính an toàn của L.fermentum đã được chứng minh qua rất nhiều các nghiêncứu trên chuột Những con chuột được bố sung L.fermentum với những nồng độkhác nhau được tiễn hành quan sát sau 28 ngày Kết quả phân tích mẫu máu chothay răng không có bất kì tac dụng phụ nao xuất hiện ở nhóm sử dụng

L.fermentum [24].

11

Từ những tai liệu trên cho thay L.fermentum có những đặc điểm đặc biệt hơnso với các vi khuẩn lactic khác như: ty lệ tồn tại khi đến ruột cao hơn các loại vikhuẩn khác, giúp kích thích sự phát triển vi khuẩn có lợi và tăng tinh 6n định, lamcho ruột khỏe mạnh; tăng cường khả năng miễn dịch và chống oxy hóa tốt; khảnăng kháng nhiệt tốt do vậy có khả năng trộn lẫn vào các loại thực phẩm thôngthường L.fermentum đã thu hút được rất nhiều sự hop tác nghiên cứu trên quốc tếvà trải qua hơn 12 năm nghiên cứu Những sản phẩm chứa L.fermentum đã đượcbán rất thành công trên thị trường Baltic và Phần Lan.

2.4 Vi gói probiotic

Phương pháp vi gói được sử dụng rộng rãi hiện nay, nhằm bảo vệ vi khuẩnchống lại các yếu tố của môi trường khắc nghiệt giúp tế bào cách ly với môi trườngxung quanh, làm giảm sự ton thương cũng như sự tốn thất số lượng tế bào, bangcách này các tế bào sẽ được bảo vệ tốt hơn trong các môi trường cực đoan như axitcao, pH thấp, muối mật, sốc nhiệt, và phóng thích tại những nơi ta mong muốn [6]

Vi gói sử dung các chất tao mang là các polymer có nguôn gốc tự nhiên nhưgelatin, alginate, chitosan, cellulose hoặc có nguồn gốc nhân tạo như polyamide,polystyrene, polyacrylate, polyacrylamide, polyester, polyethylene glycol dé bay,nhốt và bao gói các tế bảo, cơ thé vi sinh vật sông trong các nang nhỏ Ngoài ra, vigói còn giúp 6n định, tăng giá trị về mặt cảm quan cho sản phẩm [6]

Mục tiêu của vi gói là tao ra một môi trường mà trong đó các vi khuẩnprobiotic sẽ ton tại trong quá trình ché biến (nhiệt độ, oxy hóa, tác động cơ học ),bao quản (độ âm, oxy, nhiệt độ ), tiêu hóa (pH thấp, muối mật ) và phóng thích

chúng tại các vi trí thích hợp (ruột non) trong đường tiêu hóa Những lợi ich cua vi

gói dé bảo vệ probiotic chống lại pH thấp của dạ dày [20] Vi gói đề cập đến tínhchất lý hóa hoặc cơ lý để bẫy thực thể trong một vật liệu vi gói để tạo ra hạt có kíchthước nhỏ từ vai nanomet đến vai milimet Phương pháp vi gói gồm có: nén đ n,nhũ tương, say phun, sấy lạnh, say chân không Khả năng sống của vi khuẩn sau vigói và trong điều kiện cực đoan là tiêu chí quan trọng để lựa chọn vật liệu và

phương pháp ph hợp.

12

Hình 2.1 Cầu tạo hạt bao vì gói [45]

2.4.1 Vật liệu vi gói

Whey protein là vật liệu tự nhiên cho tế bào probiotic và nhờ đặc tính hóa lývà cau trúc của chúng Whey protein có thé dé tạo thành gel trong điều kiện thíchhợp Protein là chuỗi phân tử axit amin nối với nhau bằng liên kết peptide, có nhiềuloại protein do sỐ lượng cao các axit amin (22 don vi) và khả năng sắp xếp khácnhau của trình tự axit amin Whey protein có chứa các thành phan ơ-lactalbumin,B-lactoglobulin, immunoglobulin và serum albumin Trong các nguồn protein thìwhey protein rất được quan tâm làm nguyên liệu bao vi gói vì các tính lý-hóa của

này (mannuronic:guluronic axit) thường là 1:5 Calcium alginate được sử dụng rộng

rãi trong lĩnh vực bao gói vi khuẩn lactic và probiotic, nồng độ sử dụng trongkhoảng 0,5-4% Bao gói băng alginate có những ưu điểm: dễ tạo gel bao vi khuẩn,không độc cho co thể,r tiền, điều kiện xử lý dễ dàng, dễ chuẩn bi và thực hiện đơngiản, dé hoà tan trong ruột và giải phóng vi khuẩn [11] Gel alginate rất thích hợpvây quanh tế bào vi khuẩn có kích thước 1-3 micromet Tuy nhiên, một số nhượcđiểm khi sử dụng alginate: hạt alginate nhạy cảm với môi trường axit, không đảmbao hạt vi gói ton tại trong điều kiện dạ day; các vi hạt thu được là rất xốp khó màbảo vệ các tế bào trong lòng môi trường vi gói [7]

13

- Carrageenan là một chế phẩm sinh học được chiết xuất từ rêu Irish moss

(loài rong đỏ Chondrus crispus) Carrageenan là một polysaccharide cao phan tử

mạch thắng gồm các đơn vị galactose và 3,ó-anhydrogalactose, liên kết với nhaubăng liên kết a-(1,3) và Ø-(1.4) glycoside Ngoài mach polysaccharide chính còn cóthé có các nhóm sulfate được gắn vao carrageenan ở những vi trí khác nhau, với số

lượng khác nhau Vi vậy, carrageenan không phải chỉ là một polysaccharid don | ,

có một dạng cầu trúc nhất định mà là các galactan sulfat có cau trúc da dang Duavào cau trúc, người ta phân carrageenan thành các dang khác nhau là: y-, v-, 4 —,K—, ¡—, - carrageenan Trong quá trình chiết tách, do tac động của môi trườngkiềm các -,V-,À-carrapeeenan dễ chuyển hóa thành -, 1-, đ- carrageenan

tương ứng [3S].

- Xanthan là một heteropolysaccharide với cấu trúc mạch chính của nó là các

đơn vi pentasaccharide, các đơn vi pentasaccharide hình thành bởi 2 đơn vi glucose,

2 đơn vị mannose và 1 đơn vị axit glucoronic Các polysaccharide được sản xuấtbang quá trình lên men bởi vi khuân Xanthomonas campestrisand Polymer nay cóthé hòa tan trong nước lạnh Xanthan va gelan gum được sử dụng dé vi gói tế bao

probiotic [48].

Trong nhiéu loai vat liéu vi gói thông dung trên, chung tôi chon whey proteinlam vat liệu vi gói thực hiện đề tài này Theo nghiên cứu cua Heidebach năm 2009cho thay kha năng bảo vệ tốt của whey protein khi vi gói L.paracasei, mật độ tế bào

giảm 0,8 (log CFU/ml) sau thời gian 90 phút ủ trong môi trường SG pH 2,5 trongkhi L.paracasei dạng tự do giảm 5 (log CFU/g) [42].

2.4.2 Các phương pháp vi gói2.4.2.1 Phương pháp nhũ hóa

Vi gói vi khuẩn probiotic trong giọt nhũ tương được xem như một phươngthức tăng cường khả năng tổn tại của các tế bào vi sinh vật trong điều kiện khắc

nghiệt của dạ dày và ruột.

Phương pháp này đã được áp dụng thành công để vi gói vi khuẩn lactic, sovới phương pháp nén ép, phương pháp vi gói với hệ nhũ tương có nhiều ưu điểmvượt trội, cùng yêu câu kỹ thuật cao hơn

14

Trong kỹ thuật này, pha phân tán là huyền phù tế bào, alginate được thêmvào là lượng dau thực vật như dâu đậu nành, dầu hướng dương hay dau bắp, đóngvai trò như pha liên tục Dung dịch tạo thành sé đồng nhất hơn khi pha trộn với tốcđộ thích hợp cho đến khi hệ nhũ tương hình thành.

Khi đã có hệ nhũ tương, thêm dung dịch CaCl, vào ở dạng vi giọt để tạo cầutrúc hạt gel trong trong pha dầu Tốc độ khuấy hỗn hợp cũng là nhân tố quyết địnhđường kính hạt Đường kính hạt và nồng độ alginate là yếu tố quyết định khả năngsống sót của tế bào, sự trao doi chất của chúng, giá trị cảm quan của sản phẩm cuốicùng va khả năng phân tán của các hạt trong sản phẩm [45]

% Nhii tương hóa và tạo gel

Nhũ tương hóa là kỹ thuật hóa học để vi gói các tế bao probiotic sử dụng cácchất tạo gel (alginate, carrageenan va pectin) làm vật liệu bao gói Nguyên tac củakỹ thuật này được dựa trên các pha không liên tục và liên tục Dé vi gói trong nhũtương, cần có chất nhũ hóa tác nhân 6n định vi hạt (canxi clorua) thêm vào hệ nhũ

tương.

Kỹ thuật nhũ tương có thé dé dàng mở rộng quy mô và đem lại sự sống caocho vi khuẩn Khuyết điểm của phương pháp này là nó tạo ra hạt có hình dạng vàkích thước lớn Các hạt gel có thể được đưa vào dung dịch polymer thứ hai để tạo rathêm một lớp phủ bảo vệ các tế bào hoặc có thé cải thiện các đặc tính cảm quan

% Nhii tương hóa và sự đông tụ nhờ enzyme

Công nghệ bao gói cố điển có sử dụng vật liệu alginate, k-carrageenan,gellan gum hoặc xanthan mà không được cho phép có trong sản phẩm sữa ở một sốnước Khi đó, dung dịch whey protein có thể được sử dụng, probiotic sẽ được đónggói nhờ enzyme gây đông tụ Whey protein có đặc tính đông tụ tốt, chúng lai là vật

liệu tự nhiên cho probiotic.

15

-_ Bước Bước 2 Tế bào

Làm phân tán hạt Làm bền hạt vi gói

Hỗnhợp ant <_—

polyme if” Elf ft &Tếbàov |.“ | - 9 af

R ry bà” %o Orr Tế bào vi

sinh vật chim yy ~Q `

toav 4 Q99ooQ© ö sinh vật

Hình 2.2 Sơ đồ trình bày các bước nhũ hóa [19]

2.4.2.2 Phương pháp nhỏ giọt

Phương pháp nhỏ giọt lẫy nguyên ly căn ban là khi một chat long được dé rơitự do thì sẽ tạo thành giọt hình cầu do sức căng bề mặt của chất lỏng Phương phápnhỏ giọt được thực hiện theo nguyên tắc tạo giọt đồng thời và lồng vào nhau củadung dịch tế bao và dung dich tạo vỏ gói Trong điều chế vi gói, sự nhỏ giọt khôngthể thực hiện băng cách cho chảy tự nhiên nhờ vào trọng lực do các ống tạo giọt cóđường kính rất nhỏ Sự tạo giọt trong vi gói phải được thực hiện băng cách ép cácchất lỏng qua các ống đồng tâm, ở quy mô nhỏ có thể d ng bơm tiêm để ép chấtlỏng qua bộ phận tạo giọt Hệ thống còn có thé được gan thêm một thiết bị siêu âmđể ngắt giọt nên có thể điều chỉnh được kích thước của vi gói

16

Alginate Š tê bao probiotic Alginate va té bao probiotic

Không khí Chât lỏng Alginate=—== 4

Tê bao vi sinh vật

CaCl,Hat vi gói

Hình 2.3 Các bước tao vi bao gói tế bao bang phương pháp nhỏ giọt [15]

2.4.2.3 Phương pháp say phun (spray — drying)

Say phun là phương pháp thường được sử dụng rộng rãi trong sản xuất sanphẩm thực phẩm bởi vì được ứng dụng để sản xuất số lượng lớn ứng dụng trongcông nghiệp Máy sấy phun được thiết kế lần đầu vào năm 1878, đây là phươngpháp được đánh giá là kinh tế nhất và hiệu quả nhất trong công nghiệp làm khô sảnphẩm, phương pháp này đã được sử dụng lần đầu để bao gói hương vào năm 1930

Hiện tai, phương pháp này rất thích hop cho sử dụng ở quy môcông nghiệp [20] Trong quá trình say phun một hỗn hợp chất lỏng đã được phuntrong buông sấy với một đầu phun, hai đầu phun và/hoặc đĩa phun (phụ thuộc vaoloại máy sử dụng), sản phẩm tạo thành sau khi dung dịch đã được bốc hơi bởikhông khí nóng Thông thường các loại máy sấy phun được sử dụng trong côngnghiệp thực phẩm thường được thiết kế dòng không khí nóng và sản phẩm đi vào

song song nhau như hình sau (hình 2.4).

17

Khí nóng

tị Buông say

Dung dich chứa probiotic và vật

liệu vi gói

Hình 2.4 Sơ dé vi bao gói bằng phương pháp say phun [37]

Trong thiết kế trên thông thường thì lượng nước sẽ bị tách ra tế bào tiếp xúctrực tiếp với không khí nóng dẫn đến kết quả là tỷ lệ sống giảm và khả năng sốngthấp trong quá trình bảo quản, tuy nhiên có một vai dòng tế bao tôn tại tốt hơn Cácthông số như nhiệt độ sấy, thời gian sấy, nguyên liệu bao gói có tầm ảnh hưởngquan trọng trong say phun O’Riordan (2001), đã lay nguyên liệu bao gói là gelatinvà tỉnh bột biến tính dé bao gói Bifidobacterium với kết quả cho khả năng tổn tại rấttốt khi nhiệt độ đầu vào là 100°C và nhiệt độ đầu ra là 45°C Nhiệt độ đầu vào nhỏhơn 60°C sẽ làm dính sản phẩm trong cylone nhiều hơn, còn nhiệt đầu vào lớn hơn

120°C và nhiệt độ đầu ra lớn hơn 60°C thì giảm khả năng sống của vi khuẩn

Say phun là phương pháp bao gói được sử dụng khi tác nhân bao gói là thànhphan hoạt động hòa tan duoc Tac nhân hòa tan thường là gelatin, gum thực vat,tinh bột biến tính, dextrin, hoặc protein hòa tan

Tuy nhiên, phương pháp sấy phun cũng tổn tại một số nhược điểm sản phẩmthu được bị giới hạn, thiết bị say phun thường được thiết kế để sản xuất một số sảnphẩm với những tinh chất và chỉ tiêu đặc th riêng, chi phí đầu tư thiết bị say phunkhá lớn khi so sánh với các thiết bị sấy liên tục khác [1

18

Sự thành công của việc sấy phun Lactobacillus và Bifidobacterium đã đượccông bố trên những bài báo về những dòng probiotic khác nhau như: L.paracasei,

Lactobacillus curvafws L.acidophillus, kLrhamnosus và _ Bifdobacteriumruminantium Trong nghiên cứu cua Trindade va Grosso vào năm 2002 đã sử dung

kỹ thuật say phun dé bao gói vi khuan L.acidophillus va B.lastic với vật liệu bao góilà cellulose acetate phthalate Với chế độ sây nhiệt độ vào và nhiệt độ đầu ra lầnlượt là 130°C va 75°C thì mật độ B.lactic trong bột sấy bằng với mật độ B.lactistrước khi sấy, trong khi đó mật độ L.acidophilus giảm 2 log Quá trình phun và baogói bởi tác nhân polymer cellulose acetate phthalate có hiệu quả bảo vệ tốt trong

môi trường axit pH | và pH 2 trong thời gian 2 giờ [68].

Trong nghiên cứu của Desmond và cộng sự (2002) đã tiến hành thí nghiệmbao gói L.acidophilus trong B-cyclodextrin và gum Arabic bằng kỹ thuật say phundé bao gói với nhiệt độ đầu vào và ra trong quá trình sấy là 170°C và 90-85°C Kếtquả cho thấy, mật độ L.acidophilus đã giảm đi 2 log trong quá trình say [17].Sarinya và cộng sự (2013) đã tiến hành tối ưu hóa điều kiện sấy phun của vi khuẩnprobiotic kết quả nghiên cứu cho thấy điều kiện tối ưu cho sấy phun của vi khuẩn

probiotic, L.fermentum 2311M và L.casei subsp.paracasei F-19 trong 15% (w/v)

trong môi trường sữa sau khi u ở 37°C trong giai đoạn sinh trưởng Nhiệt độ tối ưuđầu vào khi sấy phun là 85°C và nhiệt độ đầu ra là 65°C Điều kiện sấy phun đượcthực hiện với 25 ml/phút của tỷ lệ môi trường tăng sinh, 15 kg/cm” của không khítrong giai đoạn say phun và nhiệt độ không khí ở đầu ra là 65°C, 75°C và 85°C Sayphun tạo chế phẩm của L.fermentum 2311M có tỷ lệ sống cao nhất 45%; 32,4% và15,5%, đối với chủng L.casei subsp paracasei F-19 có tỷ lệ sông sót ở 21,5%;

10,9% và 2,7% [66].

2.4.3 Ưu nhược điểm của các phương pháp vi gói

Phương pháp nhỏ giọt có ưu điểm về chi phí thấp, kỹ thuật đơn giản nhưngkích thước vi gói phụ thuộc lớn vào đường kính kim tiêm, quá trình tạo hạt và 6nđịnh chất lượng hạt mat nhiều thời gian hơn kỹ thuật nhũ tương hóa nên thích hợpvới quy mô sản xuất nhỏ

Với kỹ thuật tạo nhũ tương trong công nghiệp thực phẩm sẽ dễ dàng cơ giớihóa, mở rộng quy mo và tăng hiệu suất vì quá trình tạo hạt nhanh và ôn định chat

19

lượng hạt, kích thước hạt nhỏ khó nhận biết trong thực phẩm, tạo cảm giác về cảmquan tốt Tuy nhiên, quá trình thực hiện phải qua công đoạn nhũ hỗn hợp huyền phùtế bào — chất tao gel, chính chất tạo nhũ lam tăng chi phí sản xuất của kỹ thuật

này [39].

Với phương pháp sấy phun, thời gian tiếp xúc giữa các hạt lỏng và tác nhânsây trong thiết bị rất ngăn, do đó nhiệt độ của mẫu nguyên liệu đem sấy không tăngquá cao Nhờ đó, sự tôn thất các hợp chất dinh dưỡng mẫn cảm với nhiệt độ cótrong mau là không đáng kế Ngoài ra, sản phẩm sấy phun thu được là những hatnhỏ có hình dạng và kích thước tương đối đồng nhất, ty lệ khối lượng giữa các cầutử không bay hơi trong sản phẩm tương tự trong mau lỏng ban dau [33] Một ưuđiểm khác nữa là thiết bị sấy phun trong thực tế sản xuất thường có năng suất caovà làm việc theo nguyên tắc liên tục Điều này góp phân làm hiện đại hóa các quytrình sản xuất công nghiệp [1]

Mặc dù có những ưu điểm đáng kế, phương pháp sấy phun vẫn tổn tại nhữngnhược điểm: sản phẩm thu được bị giới hạn, không thé sử dụng mẫu nguyên liệu cóđộ nhớt quá cao hoặc sản phẩm thu được có ty trọng cao [1] Có nhiều nghiên cứukhăng định khi tăng nhiệt độ đầu vào sẽ ảnh hưởng đến sức sống của

vi sinh vật [24] Tuy nhiên theo Kim và cộng sự (1990) không có sự tương quan rõ

ràng về kha năng bat hoạt vi sinh vật bởi nhiệt độ không khí đầu vào và đây chỉ làyếu tô tác động nhỏ Bởi vì mức độ bất hoạt vi khuẩn trong quá trình say phun phụthuộc vào sự kết hợp giữa thời gian và nhiệt độ say [43] Một số nhà khoa học kháclại báo cáo rằng nhiệt độ không khí đâu ra tăng làm giảm sức sống của vi sinh vậtsau khi sấy phun [33] Thông số này bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ không khí đầu vào,tốc độ lưu lượng không khí, tốc độ tạo sản phẩm, thành phân của nguyên liệu vàkích thước hạt say phun [64] Tuy nhiên, rất khó dé tính toán cho van dé tối ưu hóacác biến này và điều này có thé dẫn đến sự thay đối lớn trong khả năng tổn tại củavi sinh vật đã say khô [44]

20

Bảng 2.1 Uu và nhược điểm 3 phương pháp vì gói

Các chỉ tiêu so sánh Nhỏ giọt Nhũ tương Sấy phun

-Tinh khả thi trong công nghiệp | Khó khăn Dễ dàng Dễ dàng

- Chi phí Thấp Cao Cao- Tỉ lệ sống sót của tế bào vi gói | 80 - 95% 80 - 95% 80-90%

- Kích thước hạt của vi gói 2—-5mm 25 um—2mm | vài pm — vai

Kẹo có đặc tinh dé bảo quan, tiện ích trong việc sử dung, cũng như đa dang,phong phú, có nhiều chủng loại kẹo khác nhau, nên kẹo đã được sản xuất và tiêud ng rộng rãi từ bao đời nay trên khắp thế giới và cho mọi đối tượng Để tăngcường giá trị của kẹo, nham đa dạng hóa dòng sản phẩm synbiotic cũng như đápứng nhu cầu ngay cảng cao của người tiêu d ng, mong muốn được dem lại nhữngsản phẩm không chi đảm bảo dinh dưỡng, ngon miệng ma còn mang kèm những

chức năng có lợi cho sức khỏe.

Việc nghiên cứu dé tạo ra viên kẹo synbiotic có bố sung chủng khuẩnL.fermentum va sử dụng kết hợp với prebiotic nhằm mang lại nhiều tác động tíchcực để cải thiện sức khỏe và tăng cường khả năng phòng chống bệnh tật

Trên thé giới hiện nay có một số sản phẩm kẹo synbiotic như kẹo sôcôla viênsynbiotic chocball sử dụng chủng L.acidophilus, B.lactic kết hợp với FOS, kẹo d obố sung probiotic của hãng sản xuất kẹo Nature’s Way của Úc, kẹo d o Schiff —

Gummy hỗ trợ tiêu hóa, men tiêu hóa dạng kẹo d o vị sô cô la dành cho tr em

21

AdvantageProbiotic Gummies

1 10x Better Survivability

vs Yogurt

Hình 2.5 Một số sản phẩm kẹo probiotic trên thị trườngỞ Việt Nam hiện nay chỉ có một dòng duy nhất là sản phẩm chứa probiotic làsữa chua và sữa chua uống là sản phẩm của Vinamilk và Yakult được sử dụng

chủng L.casei hỗ trợ tiêu hóa, tăng cường hệ miên dich của cơ thê người tiêu d ng.

2.6 Các nghiên cứu trong và ngoài nước2.6.1 Nghiên cứu trong nước

Nguyễn Thị Mỹ Lệ và cộng sự (2014) đã tiến hành nghiên cứu đặc tínhprobiotic của Lactobacilus phân lập từ các loại thực phẩm lên men truyền thông ở

Việt Nam đã sang lọc 48 chung lactobacilli Việc sàng lọc các chủng được dựa trên

sự phát triển sống cao lactobacilli trong môi trường dạ dày (SGJ) với pH kiểm soát= 2,0-4,0 và nông độ muối mật 0,5-3% Trong số 48 chủng, có 19 chủng cho thay tylệ sống sót rất cao trong điều kiện cực đoan Trong các thử nghiệm kháng khuan sử

dụng chung chỉ thị Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Staphylococcus

aureus và Bacillus cereus, kết quả 5 chủng vi khuan Lactobacillus plantarum subsp

.plantarum P-8, Lactobacillus brevis KB290, Lactobacillus fermentum 39-183,Lactobacillus casei ATCC 334 va Lactobacillus rhamnosus ATCC 8530 co kha

năng kháng khuẩn mạnh hơn các chủng còn lại [55]

Trong nghiên cứu của Nguyễn Thị Hồng Hà và cộng sự (2003) đã sử dụnghai chủng vi khuẩn lactic (LBA) là Bifidobacterium bifidum va Lactobacillusacidophilus dé sản xuất chế phẩm probiotic [3] Thời gian lên men tôi ưu cho việcnuôi cấy chung Bifidobacterium bifidum và L.acidophillus là 48 giờ tại 37°C, pH 7.Nhóm nghiên cứu thành công công nghệ tạo chế phẩm probiotic bang phương pháp

22

sây phun Kết quả đề tài đã nghiên cứu ảnh hưởng của công nghệ sấy phun đến mậtđộ tế bào sống của hai chủng vi khuẩn bang cách thay đổi các chế độ của công nghệsấy phun Số lượng tế bào trước khi sấy phun là 8,1 x 10'° (CFU/g) và số lượng tếbào sau khi sấy phun là 74 x 10° (CFU/g) Trong bốn tuần chế phẩm vẫn giữ ở mức10’ (CFU/g) Sau ba tháng và sáu tháng số tế bào vi sinh vật trong chế phẩmprobiotic vẫn giữ mức 10° (CFU/g) [3].

Tác giả Nguyễn Vũ Tường Vy và cộng su (2007) đã nghiên cứu “khảo sátkhả năng chịu đựng axit, muối mật và kháng sinh của một số vi sinh vật là nguyênliệu sản xuất probiotic làm đường uống” cho thấy vi sinh vat probiotic có kha năngtồn tại khi đi qua ruột non, nơi mà dịch mật toàn phan tiết ra có thé có nông độ caonhất là khoảng 2% Probiotic thường được dùng bằng đường uống nên phải có cácđặc tính như dính được vào biéu mô ruột, đảm bảo an toàn sinh học, chịu được axitvà các enzym của da dày và tụy, phải chịu được mudi mật trong đường ruột [5]

2.6.2 Nghiên cứu ngoài nước

Sarinya và cộng sự (2013) đã tiến hành tối ưu hóa điều kiện sây phun cua vikhuẩn probiotic kết quả nghiên cứu cho thay diéu kiện tối ưu cho sấy phun của vikhuẩn probiotic, L.fermentum 2311M và L.casei subsp paracasei F-19 trong

15% (w/v) trong môi trường sữa sau khi u ở 37°C trong giai đoạn sinh trưởng Nhiệt

độ tối ưu đầu vào khi say phun là 85°C và nhiệt độ đầu ra là 65°C Điều kiện sấyphun được thực hiện với 25 ml/phút của tỷ lệ môi trường tăng sinh, 15 kg/cm? củakhông khí trong giai đoạn sấy phun và nhiệt độ không khí ở đầu ra là 65°C, 75°C và85°C Say phun tạo chế phẩm của L.fermentum 2311M có tỷ lệ sống cao nhất 45%;32,4% và 15,5%: đối với chủng L.casei subsp paracasei F-19 có tỷ lệ sống sót ở

21,5%; 10,9% và 2,7% [66].

Arenahalli Ningegowda Madhu và cộng sự (2011) đã tìm hiểu tác động củaquá trình đông khô và say phun với đặc tinh probiotic của L.fermentum ở quy môphòng thí nghiệm, kết quả nghiên cứu cho thấy 4% khả năng sống sót đã đạt đượctrong L.fermentum đông khô với sữa gầy (NFSM) so với 89% kha năng sống sótcủa tế bào dạng đông khô với maltodextrin (MDX) Tỷ lệ sống sót cao hơn đáng kể(P <0,05) khi 1% tế bào (w/v) của L.fermentum được phun khô hoặc với

23

MDX (86,5%) hoặc NFSM (88,1%), trong so sánh với 3% tế bào phun khô với

MDX (81,9%) hoặc NFSM (85,7%) [12].

Dan Yang Ying và cộng sự (2012), nghiên cứu khả năng sống củaLactobacillus rhamnosus GG trong môi trường có glucose băng phương pháp sayphun với các vật liệu vi gói được kết hợp theo công thức khác nhau như: whey

protein isolate (WPI)—maltodextrin, WPI—maltodextrin—glucose, WPI-inulin va

WPI_inulin-glueose, chế phẩm sau khi sấy bảo quan ở 25 °C Thông số say phunđược cài đặt nhiệt độ không khí đầu vào va ra lần lượt là 160 °C và 65°C Kết quảnghiên cứu cho thấy công thức có chứa glucose và inulin cho khả năng sống cao và

thời gian gian bảo giản dài hon công thức con lại [26].

M.J Martin và cộng sự (2013) đã tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng của tỉnhbột khi bố sung vào alginate vi gói chủng L.fermentum CECT5716, kết quả cho thayalginate (5g/100 ml) và tinh bột (1g/100 ml) làm tăng khả năng tồn tại của chủng

L.fermentum CECT5716 so với chỉ sử dung alginate (5g/100 ml) trong quá trình vi

gói, tạo kích thước hạt vi gói ph hợp (<30 mm) và khả năng tổn tại của probioticđã không thay đối sau 45 ngày ở 4°C [48]

Likotrafiti E và cộng sự (2013) đã sử dụng các chủng tiềm năng probiotic

của L.fermentum va Bifidobacterium longum được phan lập từ phan người già khỏe

mạnh kháng lại các vi khuẩn Escherichia coli (E.coli O157: H7) và gây bệnh đườngruột E.coli (E.coli O86), mục đích thí nghiệm nhằm xác định khả năng của cácchủng được chọn để chịu đựng pH thấp và môi trường muối mật nhân tạo dé choncarbohydrate thích hợp để tăng cường sự tăng trưởng và phát huy tối đa khả năngkháng khuẩn của các sinh vật probiotic giả định và kiểm tra các đặc tính kết dínhcủa synbiotic Kết quả nghiên cứu cho thấy hai chủng L.fermentum và B.longumhoạt động ở pH 5 va mudi mật nhân tạo, L fermentum chịu được điều kiện pH thấphon chủng Bdongum Ching L.fermentum và B.longum kết hợp với

fructooligosaccharide (FOS) và isomalto-oligosaccharide (IMO) làm tăng khả năng

kháng khuẩn Độ kết dính của các tổ hợp synbiotic cho thay L.fermentum kết hợpvới FOS tạo synbiotic tốt hơn Ö longum kết hợp với glucose và IMO [46]

Caglar E và cộng sự (2007) đã nghiên cứu sự ảnh hưởng của kẹo chewing

gum có chứa xylitol hoặc vi khuẩn probiotic trên các chủng Streptococcus và

24

Lactobacillus đột biễn có kha năng chịu nông độ muối cao trong nước bọt củangười, tiễn hành bó trí thí nghiệm ngẫu nhiên với 4 nghiên cứu tiễn hành song song:

nhóm chewing gum probiotic, nhóm kẹo chewing gum xylitol, nhóm kẹo chewing

gum kết hop probiotic va xylitol và nhóm kẹo cao su có bố sung dược phẩm Kếtquả cho thay kẹo probiotic chứa hai chủng Lactobacillus reuteri (ATCC 55.730 liều1 x 10° CFU/keo cao su và ATCC PTA 5289 ở liều 1 x 10° CFU/keo cao su), vàmỗi viên của xylitol kẹo cao su có chứa khoảng 1,0 g xylitol và kẹo chewing gumcó chứa vi khuẩn probiotic hoặc xylitol chịu được chịu nông độ muối cao trongnước bọt của người tốt hơn nhóm kẹo chewing gum kết hợp probiotic và

xylitol [22|.

Wang Zhen và cộng sự (2012) đã tiến hành nghiên cứu khả năng ứng dụngcủa Bacillus coagulans trên việc sản xuất sản phẩm kẹo probiotic kết qua cho thayBacillus coagulans không bi mất hoạt tinh probiotic khi bỗ sung vao giai đoạn tao

kẹo ở nhiệt độ 70-75°C [75].

25

CHƯƠNG 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện đề tài

Nội dung luận văn được thực hiện tại phòng thí nghiệm của trườngĐại học Bách Khoa Tp.HCM.

Thời gian thực hiện từ 19/01/2015 - 14/06/2015.

3.2 Thiết bị và dụng cụ

Dụng cụ

Các dụng cụ thí nghiệm pho biến trong các phòng thí nghiệm vi sinh: pipetman, pipet vạch, ống nghiệm đĩa Petri, đèn côn, que cấy, que trải, cốc, bình tamgiác, Ống dong

Thiết bị- Nồi hap áp suất ( HV-110, Hirayyama)- Tủ cấy vi sinh (Esco)

- Tủ âm (Shellab)- Máy say phun mini (SD-06AG, Labplant, UK)- Máy khuấy từ (IKA RH bacsic 1)

- Máy ly tâm ( EBA 21, Hecttichzentrifugen)- Can kỹ thuật (Ay 220, Shimadzu)

- May do pH dé ban (Hanna)

3.3 Nguyên vật liệu, hóa chat và môi trường

3.3.1 Nguyên vật liệu

Nguyên liệu: whey protein isolate (Meggle, Đức)

Vi khuanĐối tượng trong nghiên cứu nay chúng tôi sử dung chung probioticLactobacillus fermentum 39-183 được lay từ bộ sưu tập giỗng của Bộ môn Công

nghệ sinh học trường Dai học Bách Khoa TP.HCM [55].

26

Vi sinh vật chỉ thị thir hoạt tính kháng khuẩn:

Salmonella typhimurium (Gram -), Staphylococus aureus (Gram +).

3.3.2 Hóa chất, môi trường3.3.2.1 Hóa chất

Thuốc nhuộm lugol, fushin, tím tỉnh thé, safranin, côn 70°

NaOH IN, HCI 1NĐệm pH 7 (K;HPO„/KH›;PO„ 0,1 N)

Nước muối sinh lý (0,85% NaCl)

Galactooligosaccharide (GOS) (Hà Lan)

Fructoseoli gosaccharide (FOS) (An Độ)

Inulin (Đức)3.3.2.2 Môi trường

Bang 3.1 Môi trường sử dung trong nghiên cứu

Ký Môi trường Mục đích

hiệu

MRS dịch thể:

- Peptone 10g, Cao thit 10g, Cao

nam men 5g, Glucose 20g,01 CH3COONa 5g, K›HPO/ 2g, Nuôi cấy vi khuẩn

CH;COO(NH,) 2g, MgSO,0.2g, MnSO, 02g, Tween 80 Iml,

Nước cat 1000ml, pH = 5.8MRS agar: Phan lập, giữ giống, khảo sát vi02 - MRS dịch thể có b6 sung agar | khuẩn

Môi trường LB agar: Thu nghiệm hoạt tinh bacteriocin

04 - Môi trường LB dich thé có bố sung | của vi khuẩn

agar 2%Dung dịch pH 2, pH 3, pH 4 Thử nghiệm khả năng chịu pH

05 - Nước cất thấp của vi khuẩn